Procédures modérées

225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par chirurgie stéréotaxique une greffe intracérébrale de cellules de gliome pédiatrique du tronc cérébral, tumeur incurable, pour tester l'effet de l'inhibition du gène VRK3 sur sa progression. Le porteur indique que les animaux développeront des troubles neurologiques et une ataxie liés à la tumeur. Il décrit ces modèles, suivis par bioluminescence, comme un "outil indispensable" faute de pouvoir reproduire l'infiltration tumorale hors de l'animal.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales constituent la première cause de mortalité et de morbidité par cancer chez l'enfant et l'adulte jeune. Les gliomes malins infiltrants du tronc cérébral (ou DIPG), qui représentent 10 à 15% des tumeurs cérébrales pédiatriques, sont les formes les plus graves et les plus mal connues sur le plan biologique. Ces tumeurs sont universellement incurables et constituent le plus grand défi thérapeutique de l'oncologie pédiatrique à ce jour. Nous avons initié un programme de recherche pour caractériser ces tumeurs et montrer qu’elles sont très différentes des gliomes de l’adulte et des tumeurs corticales de l’enfant. Des mutations originales de l’histone H3, quasi-constantes dans les DIPG et jamais décrites dans aucun autre type de cancer, ont été découvertes. Il s’agit donc d’un mécanisme oncogénique complètement inédit et intimement lié au développement de cette partie du cerveau. Par ailleurs, les DIPG ne forment jamais de masse tumorale, mais infiltrent les structures cérébrales normales puis se disséminent dans la totalité du cerveau. Nous avons récemment réussi à développer des modèles expérimentaux de tumeurs cérébrales issus de tumeurs de patients atteints de DIPG. Ces modèles que l'on peut suivre par bioluminescence, développent des signes cliniques neurologiques entre deux et quatre mois post-greffe, et histologiquement la tumeur se développe en infiltrant le tronc cérébral. Ces modèles sont encore très rares et sont un outil indispensable pour l'exploration de thérapies prometteuses. Afin d’identifier les gènes nécessaires à la survie cellulaire du DIPG, une étude de screening par shARN ciblant l’ensemble des kinases humaines a été réalisé sur quatre lignées in vitro. Plusieurs gènes ont été identifiés dont VRK3. Les résultats de ce crible ont été confirmés in vitro par shARN et Crispr/Cas9 sur un plus grand nombre de lignée cellulaire de DIPG. Pour les études vivo, des constructions spécifiques de shRNA et Crispr/Cas9, dirigées vers le gène VRK3, inductibles par la doxycyline ont été réalisés afin d’éteindre le gène dans les cellules tumorales après la greffe.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la réduction ou le ralentissement du volume ou de la croissance tumorale dans le cerveau de souris, comme modèle de la maladie humaine, après inhibition du gène VRK3 par induction de 845mg/kg de doxycycline dans l'alimentation. En effet, in vitro, nous avons pu voir que l'inhibition du gène VRK3 était létal sur les cellules. Nous nous attendons à cette létalité sur les cellules tumorales in vitro ou bien un ralentissement de leur croissance.

Procédures

Chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale (durée 30 minutes). Injection de luciférase en IP 10ml/kg sous anesthésie locale à raison d'une injection tous les 15 jours pour observer la bioluminescence (durée 1 minute).

Impact sur les animaux

L’inhibition de VRK3 sera spécifique aux cellules tumorales, car les constructions seront intégrées uniquement dans ces dernières en amont de la greffe, nous ne nous attendons donc pas à observer des signes de toxicité systémique chez la souris. Les nuisances attendues chez les animaux sont celles liés aux symptômes tumoraux (trouble neurologiques perceptibles; ataxie).

Devenir

Mise à mort de tous les animaux pour prélèvements des cerveaux et analyses ex-vivo.

Remplacement

Une singularité des gliomes du tronc cérébral résulte dans leur phénotype systématique d’infiltration des structures normales, l’absence de masse tumorale et l’importante capacité d’invasion du tronc cérébral dans un premier temps, puis plus largement du cerveau au décours de la maladie. Ces particularités résultent des interactions des cellules tumorales avec leur stroma qui ne peuvent être appréhendées que dans des modèles vivo, où la variété et complexité du microenvironnement tumoral peut être reproduite.

Réduction

Nos xénogreffes intracérébrales de DIPG que nous pouvons suivre par bioluminescence, développent des tumeurs avec un temps de survie des animaux de façon reproductible. Le nombre minimal nécessaire et suffisant a été calculé au plus juste par calcul de puissance (GPower). Les contrôles ont tous été vérifiés et validés ou supprimés.

Raffinement

Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale (injections). Les animaux seront pesés deux fois par semaine et examinés trois fois par semaine au début de la maladie, puis quotidiennement avec des tumeurs au stade avancé. Ils seront hébergés au minimum par 2 avec un enrichissement de la cage type sizzlenest et recevront des anti-douleurs dès l’arrivée des premiers symptômes neurologiques ou de douleur. L'eau et la nourriture seront donnés ad libitum. La nourriture sera adaptée en cas de symptômes (DietGel).

Choix des espèces

L'utilisation de modèles de souris immunodéprimées (Swiss/Nude) permet la greffe de tumeurs humaines. Les animaux utilisés auront entre 4 et 6 semaines correspondant à l’âge du jeune adulte. Nos études préalables nous ont montrées qu'il n'y avait pas de différences de prise de greffe chez des animaux juste sevrés (3 semaines) et des animaux adultes (plus de 6 semaines). Cependant, le développement de la tumeur étant lent (entre 2 mois et 1 an selon les modèles), nous utiliserons des animaux jeunes afin de ne pas avoir un état général dégradé qui pourrait être dû à la dégénérescence du modèle en fin de protocole.

358 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue dont 144 perfusés à cœur battant sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après implantation d'un capteur de température, ils sont exposés aux radiofréquences 5G pendant six semaines puis soumis à dix tests comportementaux évaluant mémoire, anxiété, dépression et seuil douloureux, une lignée sélectionnée pour son phénotype dépressif étant comparée à une lignée saine. Le porteur cherche à comprendre l'électrohypersensibilité, qu'il qualifie lui-même de "syndrome médicalement inexpliqué", et rappelle que les études antérieures n'ont pas montré que l'humain perçoit consciemment les radiofréquences. Le bénéfice annoncé, mieux reconnaître ces patients, reste une hypothèse à explorer.

Objectifs

L’objet de ce projet est la recherche fondamentale pris au sens du 1er article R. 214-105 du Code rural et de la pêche maritime. Le contexte général est celui de l’augmentation exponentielle de l’utilisation de la téléphonie mobile et des techniques de communication et du déploiement de la 5G. Il pose la question de l’augmentation de notre exposition environnementale et de ses conséquences possibles sur notre santé physique et mentale. De plus, certaines personnes souffrent d’hypersensibilité électromagnétique (EHS) et à ce jour, aucune évidence biologique ou clinique n’explique ces symptômes, et les causes de l’EHS restent inconnues. L’implication d’un niveau d’inquiétude élevé, d’un mal-être et /ou d’états anxieux ou dépressifs est suggéré mais pas établie. L’objectif du projet est de tenter de répondre aux questions suivantes : le sujet dépressif perçoit-il les radiofréquences différemment d’un sujet sain? la dépression est-elle la cause ou la conséquence de l’EHS ? Quelles différences hommes-femmes, considérant que l’EHS concerne plutôt les femmes, comme c’est le cas pour la dépression ou l’anxiété (ratio : 2 femmes/1 homme)? Le projet propose d’étudier les effets d’une exposition chronique aux radiofréquences de la 5G (2 gammes de fréquences, 900 MHz et 26 GHz) sur le comportement et la plasticité cérébrale de rats adultes mâles et femelles, sains ou dépressifs (souche Flinders Sensitive Line ou FSL) en ciblant la sphère cognitive (mémoire à court et à long terme, flexibilité) et la sphère affective (anxiété, dépression, sensibilité à la douleur).

Bénéfices attendus

Ce projet qui vise à mieux comprendre les déterminants de l'électrohypersensibilité, doit faire progresser les connaissances sur ce syndrome encore médicalement inexpliqué dans le but notamment d'améliorer la reconnaissance et la prise en charge de ces patients.

Procédures

Les rats seront soumis à : i) une intervention chirugicale courte (10-15 min, anesthésie gazeuse, implant d'un logger température intra-abdominal), 2) une exposition aux radiofréquences de la 5G en chambre réverbérante dans une cage d'élevage pendant 6 semaines (5j/semaines, 4h/j) et 3) 10 tests comportementaux répartis sur une période de 2 mois pour évaluer la mémoire (2 tests), l'activité (2 tests), l'anxiété (3 tests), la dépression (1 test) et le seuil douloureux (2 tests), chaque session durant de 1 min à 10 min maximum avec 1 session/jour et chaque test d'une durée de 1 à 7 jours (voir détails Procédure expérimentale 1, figure 3 annexe).

Impact sur les animaux

Il n'est pas attendu de nuisances ou effets indésirables importants ou durables pouvant altérer leur bien-être, l'essentiel des interventions proposées nous sont très familières. De plus, les rats dédiés aux expériences préliminaires permettront d'affiner les protocoles pour certains tests et d'en ajuster si besoin les paramètres, il en est de même pour le protocole chirurgical (pose des 'capteurs' de température) et la période post-opératoire. Pour ce qui est de leur environnement au quotidien et la prise en charge de leur bien-être tout au long des expériences, nous avons une grande expérience de ce type de projet, une cellule SBEA présente et disponible ainsi qu'une vétérinaire pour le suivi médical. De plus, le projet scientifique a pour thème la dépression et l'anxiété et l'impact d'un facteur environnemental: nous serons donc particulièrement vigilants et réactifs sur leur bien-être car tous les résultats des tests comportementaux en dépendent.

Devenir

Procédure 1: 214 rats seront mis à mort et le cerveau récupéré pour 144 d'entre aux pour les études de la plasticité cérebrale (coloration de Golgi) et 144 rats seront gardés en vie et entreront dans la Procédure 2. Procédure 2 (sans réveil) : 144 rats perfusés en intracardiaque pour récupération du cerveau et études immunohistochimiques nécessitant une préservation uniforme et rapide de tissu cérébral.

Remplacement

L’approche chez l’animal, en particulier le Rat, est la seule permettant d’aborder la question de de l’impact des radiofréquences sur la sphère cognitive et affective/émotionnelle et les mécanismes cérébraux sous-jacent afin de comprendre un syndrome inexpliqué, l’électrohypersensibilité ou EHS. Ce projet est une première tentative de modélisation chez le rat pour tester une hypothèse originale : l’impact de troubles de l’humeur (dépression) à l’origine de l’EHS? Ce projet devrait permettre aussi de répondre à la question du rôle des radiofréquences sur l'apparition de ce syndrome: les études précédentes n’ayant pu montrer que l’humain est capable de percevoir consciemment les radiofréquences et un effet nocebo a été proposé pour expliquer l’EHS. Enfin, l'arrivée des nouveaux signaux de la téléphonie mobile 5G nécessite des études chez l'animal pour en comprendre les effets biologiques, physiologiques voire pathologiques.

Réduction

Le nombre d'animaux est calculé au plus juste en fonction des prérequis statistiques à l'aide tests paramétriques. Nous avons une grande expériences de ce type de projets et de nombreuses publications scientifiques.

Raffinement

Dès leur arrivée au laboratoire, les rats sont hébergés dans de grandes cages à 3 individus et 3 bâtons à ronger pour enrissement dans une animalerie agrée avec températire, humidité et cycle jour/nuit adaptés. L'évaluation de leur bien-être se fera au quotidien à l'aide de la grille de l'Afstal, une attention particulière sera portée à la chirurgie et la période juste après. De plus avant toute procédure, les rats seront habitués à l'expérimentateur, la salle de test et le test lui-même. L'objectif est de les amener à coopérer en réduisant le stress et l'anxiété. De plus, le thème du projet vise justement à évaluer l'impact de l'environnement (les radiofréquences) sur divers paramètres incluant l'anxiété, la dépression,et la cognition. Nous serons donc particulièrement vigilant dans le raffinement de nos procédures, essentiel pour le bien-être mais aussi la qualité de nos données scientifiques. Pour plus de détails voir Procédure 1

Choix des espèces

Le choix du Rat s’impose par l’existence de très nombreuses données anatomiques, électrophysiologiques et comportementales solides sur la cognition, mémoire, mais aussi l’anxiété, la dépression ainsi que sur les effets des radiofréquences. En effet, les bases neurobiologiques de la mémoire, de l’anxiété ou de la dépression étudiées chez le rongeur, et notamment chez le Rat, ont permis de grandes avancées dans la compréhension de ces phénomènes physiologiques et pathologiques chez l’homme. Le rat possède des capacités cognitives élaborée et un répertoire comportemental complexe. Il s’adapte bien à la vie au laboratoire et coopère facilement dans les tâches comportementales. De plus, le rat est un modèle pré-clinique validé pour la dépression ou les troubles anxieux et plusieurs souches ont été développées : le rat FSL utilisé dans ce projet en est un bon modèle depuis plus de 30 ans (241 publications 1986-2020). Ce projet propose d'étudier les effets des radiofréquences sur la sphère cognitive et affective dans 2 souches de rats, dont l’une présente un trouble de l’humeur (dépression). Ceci dans le but de montrer si ce phénotype dépressif est capable d’induire des effets biologiques et comportementaux spécifiques des radiofréquences qui ne seraient pas observés chez des sujets sains. En effet, les sujets EHS présentent tout un panel de symptômes (troubles de la mémoire, de l’attention, du sommeil, anxiété, douleurs…) qu’ils attribuent aux ondes électromagnétiques et notamment aux radiofréquences. Ce syndrome, à ce jour inexpliqué à la fois au plan scientifique et médical, est rapporté dans la très grande majorité des cas chez les adultes, très rarement chez l’enfant ou le sujet très âgé. Ceci justifie le choix du rat jeune adulte âgés de 2 à 5 mois au moment des expériences.

460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des plaies cutanées par découpe à l'emporte-pièce ou par compression à l'aimant, pour étudier le rôle d'une "protéine X" dans la cicatrisation et la fonction vasculaire. Le porteur indique qu'aucun anti-inflammatoire ne sera administré pendant la cicatrisation "car cela pourrait modifier les résultats", une douleur modérée pouvant persister plusieurs jours. Il décrit le passage par l'animal comme "indispensable" pour observer ces mécanismes dans un "organisme entier".

Objectifs

Des candidats médicaments sont en cours de développement pour traiter certains défauts de cicatrisation tels que les plaies des grands brûlés, les opacités cornéennes ou les conséquences déletères d'un infarctus au niveau cardiaque ou d'une infection au niveau hépatique ou pulmonaire. Toutes ces pathologies peuvent s'avérer mortelles ou très invalidantes et représentent un coût sociétal très important. Pour le moment, les candidats médicaments se fixent principalement sur la Protéine Y bien caractérisée mais aussi sur une protéine très semblable, appelée Protéine X, dont les fonctions sont mal connues. Pour mieux anticiper les effets secondaires des candidats médicaments et déterminer s'il faut les améliorer pour qu'ils ne reconnaissent que la Protéine X ou la Protéine Y, il est crucial de mieux comprendre les rôles précis de la Protéine X chez les mammifères. La peau et les vaisseaux sanguins seront investigués en analysant particulièrement le rôle de la Protéine X dans la cicatrisation de la peau ainsi que dans la capacité des vaisseaux sanguins à répondre aux agents qui régulent la pression artérielle ou à laisser passer des molécules dans les tissus.

Bénéfices attendus

Les expériences ne nécessitant pas de recours aux animaux ont déjà été réalisées. Ceci a permis d'identifier des mécanismes d'action possibles pour la Protéine X. L'étape suivante consiste à vérifier ce qui se passe dans un organisme entier et à confirmer les données préliminaires déjà obtenues concernant l’effet de l’absence de la Protéine X sur l’organisation de la peau normale et cicatricielle ainsi que sur la fonction des vaisseaux sanguins. Ces éléments seront étudiés indépendamment puis conjointement dans un modèle de plaie où l’apport en oxygène et nutriments est déficient (type escarre). A plus long terme, les informations collectées lors de ces expériences serviront à mieux comprendre les fonctions de la Protéine X dans la peau et à évaluer s’il est plutôt bénéfique ou délétère que les candidats médicaments reconnaissent à la fois la Protéine X et la Protéine Y. Par exemple, s'il s'avère que la Protéine X est nécessaire à la fonction vasculaire, il faudra développer des candidats médicaments qui n'affectent que la Protéine Y. Les résultats obtenus seront ainsi très importants pour optimiser leurs propriétés.

Procédures

Il n'est pas prévu de prélèvements sur animaux vigiles. Cependant, une injection de colorant (Bleu EVANS) est programmée sur certains animaux pour identifier des "fuites" éventuelles au niveau des vaisseaux sanguins. Une série d'animaux sera également soumise à des plaies réalisées soit à l'aide de "punchs" et ciseaux fins (6 mm de diamètre; 1 seule induction de plaies) soit par application de 2 aimants de 8 mm de diamètre pendant 3 fois 3h à 24h d'intervalle (plaies de compression). Les autres interventions auxquelles seront soumis les animaux sont non invasives et indolores.

Impact sur les animaux

Les souris déficientes en Protéine X sont viables, fertiles et ne semblent pas présenter de phénotype dommageable, en conditions normales, susceptible d’induire de la souffrance ou d’affecter leur comportement. La procédure visant à évaluer la fonctionnalité vasculaire utilise des techniques non invasives et indolores (laser doppler) réalisées sous anesthésie générale pour diminuer le stress des animaux. L’injection de bleu EVANS dans la veine caudale en fin de procédure peut cependant induire un stress momentané. L’induction des plaies d’excision et de compression peut aussi causer douleur et stress chez l’animal. Elles sont réalisées sous isoflurane pour diminuer ces effets et un produit analgésique sera administré avant l'induction des plaies d'excision. Une douleur modérée peut persister après l'induction de la plaie pendant quelques jours. Il n’est pas prévu d’administrer de produit anti-inflammatoire pendant l’induction des plaies ou pendant la cicatrisation car cela pourrait modifier les résultats de notre étude. L’apparition d’autres effets indésirables (perte de poids, mobilité réduite, comportement anormal etc) sera surveillée tous les 2 jours.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures car des prélèvements seront réalisés pour étudier la peau et ses différents composants cellulaires.

Remplacement

Les modèles in vitro (protéines recombinantes) et cellulaires ne permettent pas d’obtenir les informations souhaitées qui nécessitent des systèmes intégrés multi-cellulaires et multi-organes. Il n’existe par exemple pas de modèle de peau reconstruite intégrant toutes les composantes cellulaires nécessaires aux études de physiologie vasculaire ou de cicatrisation. Le recours aux modèles animaux s’avère donc indispensable.

Réduction

Dans toutes les procédures, le nombre d’animaux par lot a été défini a minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables. Pour les mesures de fonctionnalité vasculaire, il est possible de tester deux agents vaso-dilatateurs différents sur les mêmes animaux à 7 jours d’intervalle minimum. Les mêmes animaux peuvent donc être utilisés pour ces deux mesures qui sont également couplées à chaque fois à au moins une autre mesure non invasive (réponse à la pression ou perfusion cutanée). Avant la mise à mort des animaux en fin de procédure, il est également prévu de faire une injection de bleu EVANS qui permettra de mettre en évidence une augmentation éventuelle de perméabilité vasculaire au niveau de la peau. Dans les études de cicatrisation, deux plaies sont réalisées sur le même animal pour diminuer le nombre d’animaux nécessaires. Les 5 temps de mise à mort ont été soigneusement sélectionnés en fonction de la connaissance actuelle des modèles pour couvrir toutes les phases de la cicatrisation et évaluer précisément le rôle de la Protéine X dans chacune de ces phases.

Raffinement

Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée entre l’arrivée des souris dans l’animalerie et le début des expérimentations sur celles-ci. Les animaux bénéficieront tous d’une surveillance rapprochée (au moins trois fois par semaine). Des points limites (perte de poids supérieure à 20% du poids maximal atteint par la souris, état de prostration de l’animal, plaies infectées) ont été définis qui conduiront à la mise à mort immédiate de l’animal. Les animaux utilisés pour l’étude de fonctionnalité vasculaire ne subiront pas plus de deux anesthésies générales chacun. Le nombre de souris par cage sera compris entre 3 et 5, suivant la taille de la cage et en accord avec la réglementation en vigueur. Après induction des plaies ou en cas de comportement agressif d’un animal, les animaux seront isolés dans des cages individuelles pour éviter le risque de sur-blessure. Ces cages possèdent des séparations transparentes pour permettre aux animaux de continuer à communiquer et diminuer le stress lié à l’isolement. Les cages seront également enrichies avec des boules d’ouate, des bâtonnets de bois, du carton etc. Les plaies seront protégées par des pansements pour éviter les risques d'infection. Tous les changements de pansements (et les photographies permettant de suivre la fermeture des plaies) seront réalisés sous anesthésie gazeuse sur table chauffante.

Choix des espèces

La souris représente un modèle de choix car elle présente une organisation du tissu d'intérêt (peau) très semblable au tissu humain et les étapes clés du processus de cicatrisation sont conservées (phase inflammatoire et vasculaire, phase de réparation, phase de remodelage). Les souris utilisées dans ce projet seront âgées de 8-16 semaines pour rester cohérent avec les expériences préliminaires qui ont été réalisées.

768 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 48 tuées comme donneuses de moelle osseuse et 720 transférées vers un autre protocole de tests comportementaux. Rendues obèses par un régime gras pendant 18 semaines, elles reçoivent du busulfan induisant une myélodysplasie, une greffe de moelle et des prélèvements sanguins répétés, pour étudier le rôle de la protéine DNase1L3 dans le syndrome métabolique et la dépression liés à l'obésité. Le porteur décrit la perte de poids et l'anémie post-busulfan comme "transitoires". Les 720 survivantes prolongeront l'expérimentation dans une animalerie dédiée aux tests d'anxiété et de dépression, sous une autre autorisation.

Objectifs

Nous avons observé que la déficience en DNase1L3 rend les souris plus susceptibles au développement du syndrome métabolique induit par l’obésité. Un de nos objectif courant est de caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires de la DNase1L3 dans le contexte de l’obésité. De plus, l’obésité induit des troubles neuropsychiatriques comme la dépression. Un deuxième objectif de notre travail est d’évaluer l’impact de la déficience en DNase1L3 sur la survenue des syndromes neuropsychiatrique induits pas l’obésité. Tous les concepts, incluant l’état de l’art, le rationnel de notre étude ainsi que sa méthodologie sont décrits dans la section suivante.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de mettre en évidence le rôle de la DNase1L3 dans la régulation de l’inflammation chronique induite par l’obésité ainsi que ces mécanismes d’actions. De plus, il nous permettra de déterminer si une dérégulation de la DNase1L3 peut contribuer aux troubles neuropsychiatriques induits par l’obésité. Ainsi notre projet pourra conduire aux développements de nouvelles approches thérapeutique basées sur la supplémentation en DNase1L3 afin de limiter l’inflammation chronique induite par l’obésité qui est à l’origine du syndrome métabolique et des troubles neuropsychiatriques.

Procédures

Les souris sont soumises à un régime riche normal et riche en graisse durant 18 semaines. Une myélodysplasie est induite par le Busulfan durant 4 jours. Une reconstitution des souris myélodysplasique est faite par transfer de cellules de moelle osseuses . La reconstitution se fait par une seule injection et a lieu en 1 mois. Des prises de sang retroorbitaires sont effectué toutes les six semaines. Un test de tolérance au glucose par injection i.p de glucose et prise de sang a la base de la queue est effectué toutes les 6 semaines aussi.

Impact sur les animaux

1. Placer les animaux sur un régime riche dans le temps imparti pour l’expérimentation augmente leur poids d’une manière considérable sans causer une altération significative de l’état général de l’animal. 2. La génération de souris chimérique nécessite l’induction d’une myélodysplasie par un traitement aux Busulfan. Ce traitement induit une perte de poids

Devenir

Procédure 1 : 288 animaux sont inclus dans cette procédure. 48 animaux sont utilisés en tant que donneur de moelle osseuse et sont euthanasiés par dislocation cervicale a l’issue de cette procédure. Le prélèvement de la moelle osseuse ne peut être effectue que sur des animaux morts. Le reste des animaux (240), constituent les animaux chimériques receveur de moelle osseuse qui seront gardés en vie et donc inclus dans les procédures qui suivent. Procédure 2. Dans cette procédure 720 animaux sont inclus et sont soumis à un régime normal (360) et un régime riche en graisse (360). Tous les animaux de cette procédure sont gardés en vie en passent dans la procédure 3. Procédure 3. Dans cette procédure 720 animaux sont inclus et sont soumis à des prises de sang. Tous les animaux de ces procédures sont gardés en vie en passent dans la procédure 4. Procédure 4. Dans cette procédure 720 animaux sont inclus et sont soumis à un test de tolérance au glucose. Tous les animaux de ces procédures sont gardés en vie et transférés dans l’animalerie NutriNeuro ou ils seront soumis à des tests comportementaux. Une autre DAP a été soumise pour cela.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode alternative à ce projet car seul un modèle murin récapitulant les éléments de la physiopathologiques observés chez l'homme, peut apporter la preuve du rôle de la DNase1L3 dans le développements d’un syndrome métabolique et dans la régulation des troubles neuropsychiatriques qui découlent de l’inflammation induite par l’obésité. De plus les études comportementales afin d’évaluer le développent de l’anxiété et des états dépressifs ne peuvent être réalisé que sur des animaux vivants. Les conclusions recherchées ne peuvent pas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro ou ex vivo, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité de la régulation des états mentaux par les processus inflammatoires.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Afin de réduire le nombre d’animaux nous avons également optimisé leur utilisation. En effet sur les mêmes animaux nous allons à la fois évaluer la survenue du syndrome métabolique et des troubles neuropsychiatriques. Cela nous permet de réduire l’utilisation des animaux d’un facteur deux.

Raffinement

1.Hébergement : les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bienêtre (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention : les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise des méthodes de préhensions douces, les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur : Les prises de sang retro-orbitaires sont réalisés sur des animaux anesthésiés afin de réduire l’inconfort de cette procédure. De plus, les prises de sang réalisées à l’extrémité de la queue incluent une anesthésie locale pour réduire la douleur qui peut être induite par cette procédure.

Choix des espèces

Nous utiliserons les souris C57Bl/6 pour cette expérimentation. Les souris déficientes pour la DNase1L3, DNase1, TLR9 et IFNAR sont uniquement disponibles dans cette espèce et sur ce fond génétique. De plus, elles sont très sensibles aux régimes alimentaires pour l'induction de l’obésité (Surwit et al., Diabetes, 1988). Comme l’Homme, elles développent une obésité, un diabète de type II, une stéatose hépatique et des troubles neuropsychiatriques (dépression et anxiété) un fois exposées à un régime riche en graisse, alors qu’avec une alimentation standard, elles restent minces et ne développent pas de problèmes métaboliques ni de troubles neuropsychiatriques. En plus des souris congénique B6/SJL (pep boy, CD45.1) seront utilisées pour réaliser des chimères de moelle osseuse. Leur utilisation est necessaire afin d'évaluer l'efficacité de nos greffes qui est rendu possible par l'analyse de l'expression du variant de la molécule CD45. Les souris seront nourries dès l’âge de 12 semaines par HFD. L’exposition des souris C57BL/6 de cet age à un régime HFD ad libidum conduit à une obésité et au développent du syndrome métabolique et des troubles neuropsychiatriques assez proche de ceux se développant chez l’homme. Les premières manifestations apparaissent environ 6 semaines après l’introduction du régime HFD mais l’hyperglycémie, l’insulino-résistance, la stéatose hépatique ainsi que les troubles neuropsychiatriques sont observées vers 18 semaines post régime HFD (Surwit et al. ; Diabetes, 1988).

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit jusqu'à huit prélèvements sanguins sur une journée, aux veines mandibulaire, saphène et fémorale, pour mettre au point une technique de micro-prélèvement. Le porteur admet que des sites de prélèvement seront "abîmés" puisqu'il s'agit d'une mise au point, et fixe la validation à 90% d'animaux aux sites corrects. Il justifie le projet par la réduction du nombre d'animaux dans de futures études, tout en qualifiant le recours à l'animal d'"indispensable".

Objectifs

Ce projet consiste à effectuer huit prélèvements sanguins par animal en vigile via la technique du micosampling. Les prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile par microsampling c'est à dire prélèvement à la veine mandibulaire, à la veine saphène et/ou à la veine fémorale (2 prélèvements maximum par site de 40 μl maximum). Nombre maximal de prélèvement par animal: 8

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus pour ce projet sont de développer une nouvelle technique de prélèvement, via le microsampling, qui permettra de faire 8 prélèvements de 40 µL maximum et donc de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés pour les prochaines études

Procédures

La veille des prélèvements de sang, les animaux seront anesthésiés (anesthésie gazeuse: Isoflurane) pour pouvoir raser les pattes arrières des animaux. Avant de commencer les prélèvements, les cages hébergeant les animaux seront placées sous lampes chauffantes pendant environ 15 minutes pour faciliter les prélèvements et dilater les veines. Cette opération peut être renouvellée autant que nécessaire si besoin. Les sites de prélèvement sanguin ( veine mandibulaire, saphène ou fémorale droite ou gauche) seront alternés au maximum. 4 prélèvements seront fait au niveau des mandibules droites et gauche et 4 autres prélèvements seront réalisés au niveau des saphènes droite et gauche et fémorales droite et gauche (1 prélèvement par site) Les temps de prélèvement seront: T5min, T15min, T30 min, T1h, T2h, T4h, T6h, T8h. Volume de sang prélevé: 40 µL par temps de prélèvement

Impact sur les animaux

Il est probable d'avoir des sites de prélèvement abimés car c'est une mise au point de technique... Un suivi quotidien (voire plusieurs fois par jour, à chaque temps de prélèvement) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et pour une prise en charge rapide si besoin. Cette technique sera validée si 90 % des animaux présentent des sites de prélèvements convenables, non abîmés avec un bon aspect général des animaux.

Devenir

A la fin de cette procédure , les animaux seront anesthésiés et euthanasiés par dislocation cervicale (possibilité d'exsanguination précédant la dislocation).

Remplacement

Le but de ce projet est de mettre en place une nouvelle technique de prélèvement sanguins ( le microsampling) chez la souris. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de valider cette technique sur un autre support , il est indispensable de recourir à l'animal de laboratoire.

Réduction

Dans ce projet, 40 animaux seront inclus pour une durée de 1 an. C'est le nombre d'animaux nécessaire et minimal requis pour obtenir des résultats fiables et reproductibles. Les animaux seront divisés en 2 groupes de 6, et les essais seront fait sur trois souches de souris différentes (souris SWISS, C57Bl6 et les souris SCID). Douze animaux seront utilisés pour chaque souche.

Raffinement

Durant toute la phase expérimentale, les animaux seront hébergés par groupe de 6 maximum dans une même cage comprenant de la litière et du matériel d'enrichissement (ex: nid, bois à ronger). Un suivi quotidien (à chaque temps de prélèvement) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et pour une prise en charge rapide si besoin.

Choix des espèces

La souris est l'espèce utilisée dans ce projet. Les souches SWISS, C57BL6 seront particulièrement utilisées . La souche SCID, pourra aussi être utilisée. Majoritairement adultes. Souris d'environ 20-40g

36 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Vaccinés puis inoculés par voie trachéale avec un virus grippal sur animaux vigiles, sans anesthésie, ils subissent des écouvillonnages nasaux et des prélèvements sanguins répétés sur plusieurs semaines, avant d'être tués pour l'examen des lésions pulmonaires. Le porteur indique que l'infection provoque hyperthermie, baisse d'appétit et troubles respiratoires. Le projet vise à comprendre la diffusion d'un nouveau virus dans la filière porcine, enjeu sanitaire, "économique" et de santé publique.

Objectifs

Chez le porc, la grippe est une affection respiratoire touchant près de la moitié des élevages français. Cette infection virale a des conséquences sanitaires et économiques importantes pour la filière porcine, mais a également un impact en termes de santé publique. En effet, les virus influenza ont un caractère zoonotique, c’est-à-dire qu’ils peuvent se transmettre de l’animal à l’homme. En 2020, la surveillance des virus influenza porcins dans les élevages de porcs français a montré l’émergence d’un nouveau virus H1avN2, appelé H1avN2 #E. Ce virus est désormais responsable de la majorité des infections grippales, supplantant le virus H1avN1 qui était prépondérant depuis plus de 40 ans. L'analyse de son génome a montré de nombreuses spécificités génétiques qui pourraient avoir un impact, entre autre, sur sa virulence, sa capacité de transmission ou son échappement à la couverture vaccinale. Ce projet expérimental a trois objectifs : 1/ comparer les réponses de porcs infectés par le nouveau virus H1avN2 #E à celles observées chez des porcs infectés par le virus H1avN1, 2/ évaluer la protection conférée par le vaccin trivalent actuellement disponible sur le marché français vis-à-vis de ce nouveau virus, en comparaison à celle conférée vis-à-vis du virus H1avN1, et 3/ comparer la protection induite par une primo-infection H1avN1, à celle d’une primo-infection H1avN2 #E, vis-à-vis d’une ré-infection par un virus H1avN2 #E chez les animaux vaccinés ou non.

Bénéfices attendus

Les données obtenues aideront à comprendre pourquoi le virus H1avN2#E a pu se propager si rapidement dans la population porcine et quel est le risque potentiel pour la filière. Ce projet ne peut se faire sans un recours à l’expérimentation animale mais des travaux menés in vitro par ailleurs permettront de compléter les données obtenues ici afin d’apporter de nouvelles connaissances sur le phénotype de ce nouveau virus.

Procédures

Tous les actes prévus sur les animaux se feront sur animaux vigiles. Aucune anesthésie n’est prévue dans ce protocole lors des différentes interventions du fait de leur rapidité (moins d’une à deux minutes) et de leur caratère peu invasif. La moitié des animaux (3 lots vaccinés) recevront deux doses de vaccin contre la grippe en intramusculaire à 3 semaines d’intervalle. Une semaine après l’injection de la deuxième dose de vaccin, tous les animaux (36 animaux) recevront du virus ou du milieu de culture (lots témoins) par voie trachéale (jour 0 (J0)). Trois semaines plus tard, les animaux ayant reçu du virus seront de nouveau inoculés par voie trachéale. Les prélèvements prévus sur animaux sont : 1/ un écouvillonnage nasal à J0, J1, J3, J5, J7, J9, J11,J14, J21, J22, J24, J26, J28, J30, J32 et J35 pour les lots infectés par un virus ou à J0, J7 et J14 pour les lots témoins, 2/ un prélèvement de salive quotidien de J0 à J14 puis de J21 à J25 pour les lots infectés par un virus ou uniquement à J0, J7 et J14 pour les lots témoins, 3/ une prise de sang (2 ou 3 tubes en fonction des jours) avant la vaccination (uniquement pour les lots vaccinés) puis à J0, J7, J14 et J21, pour tous les lots, et J28 et J35 pour les quatres lots ayant reçu du virus. Le prélèvement de salive de nécessite pas de contention des animaux. Les vaccinations, les inoculations, les écouvillonnages nasaux et les ponctions sanguines nécessitent une contention des animaux. Ces actes sont réalisés par un personnel très expérimenté et sont effectués le plus rapidement possible afin de réduire au maximum le temps de contention. A l’issu de ces actes, les animaux sont récompensés par la distribution d’une friandise type sirop de grenadine.

Impact sur les animaux

Suite aux inoculations par un virus grippal, une hyperthermie transitoire est attendue, ne persistant guère plus de 2 jours, ainsi qu’une baisse d’appétit pendant les 3 - 4 jours suivant l’infection et des troubles respiratoires (dyspnée, toux, éternuements). Dans les lots vaccinés contre la grippe, moins de symptômes devraient être observés.

Devenir

Les deux lots qui ont reçu du milieu de culture ne seront pas nécessaires pour répondre au 3eme objectif ; ils seront donc mis à mort à 12 semaines de vie. Les quatre lots primo-infectés par H1avN1 ou par H1avN2 seront quant à eux re-infectés par H1avN2 et mis à mort deux semaines plus tard, soit à 14 semaines de vie. Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour pouvoir récolter des prélèvements de poumons et scorer les lésions macroscopiques pulmonaires potentiellement causées par le virus grippal.

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer/comparer les manifestations cliniques, l’excrétion virale et les réponses inflammatoire, anti-virale et immunitaire (humorale et cellulaire) de l’hôte, vacciné ou non, après infection par des virus influenza. Ceci nécessite donc de passer par des expériences sur l’animal vivant, des analyses in vitro ne permettraient pas de répondre aux objectifs.

Réduction

Il est nécessaire d’avoir 6 lots d’animaux au total. En effet, pour répondre au premier objectif qui est d’étudier les réponses du porc à l’infection par ce nouveau virus, il est nécessaire d’avoir 3 lots d’animaux à comparer : 1 lot inoculé par le virus H1avN2#E, 1 lot inoculé par le virus H1avN1 et 1 lot inoculé par du milieu de culture (témoin). Le deuxième objectif de ce projet est d’évaluer la protection des animaux vaccinés (vaccin trivalent Respiporc Flu 3) vis-à-vis de ce virus, comparativement au virus H1avN1. Le même dispositif sera donc appliqué sur des animaux vaccinés. Il y aura donc : 1 lot vacciné puis inoculé par le virus H1avN2#E, 1 lot vacciné puis inoculé par le virus H1avN1 et 1 lot vacciné puis inoculé par du milieu de culture (témoin). Ainsi, ces 3 lots seront comparés entre eux mais aussi avec les 3 lots non vaccinés jusqu’à 21 jours après l’inoculation. Enfin, pour répondre au troisième objectif, les quatres lots vaccinés ou non ayant reçu du virus grippal seront de nouveau inoculés par le virus H1avN2#E 3 semaines après la 1ere inoculation. Les lots primo-infectés par le virus H1avN1 seront comparés aux lots primo-infectés par le virus H1avN2#E. Aucun lot supplémentaire ne sera nécessaire pour répondre à cet objectif. Chaque lot comprendra le même effectif, à savoir 6 animaux. Ce nombre est le minimum pour obtenir des données statistiquement fiables.

Raffinement

L’expérimentation sera conduite dans le respect de l’éthique et du bien-être des animaux. Chaque lot sera dans une animalerie différente contenant 2 parcs, soit 3 porcs par parc jusqu'à la fin du projet. Ils seront alimentés à volonté et auront accès à discrétion à de l’eau. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes. Enfin, ils auront accès à des jouets. Un soin particulier sera apporté au suivi clinique de chaque animal au quotidien pendant toute la durée de la procédure expérimentale.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible des virus influenza porcins H1avN1 et H1avN2#E Les animaux seront sevrés à 4 semaines d’âge et auront une semaine pour s’acclimater à leur lieu d’hébergement avant la vaccination. La moitié des animaux sera vaccinée contre la grippe à 5 et 8 semaines d’âge pour que les animaux vaccinés aient développé une réponse post-vaccinale au moment de l’inoculation du virus grippal. Tous les animaux seront inoculés à 9 semaines d’âge. Cet âge correspond à la fin de la période de post-sevrage, à un moment où le système immunitaire est considéré comme mature. Suite aux projets expérimentaux d’infections grippales menés précédemment avec des animaux de différents âges, nous savons que le stade physiologique de l’animal influe sur le développement ou non des signes cliniques de la grippe. Dans nos conditions expérimentales, nous savons que des animaux de 9 semaines développent des symptômes grippaux lorsqu’ils sont inoculés par voie trachéale avec une souche H1avN1, c’est pourquoi nous prévoyons d’inoculer les animaux à cet âge (par cette même voie) afin de savoir si une souche H1avN2 #E induit ou non la même sévérité de signes cliniques. Les animaux infectés par un virus grippal seront inoculés une seconde fois avec une souche H1avN2 #E, 3 semaines après la première inoculation, une fois que la réponse immunitaire mémoire est établie.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un traumatisme crânien est provoqué chez des souriceaux de 17 jours, suivi pendant six mois d'une batterie de tests comportementaux (open field, poutre, échelle, test de Von Frey, labyrinthe en croix surélevé, labyrinthe de Barnes) et d'IRM sous anesthésie, pour étudier le rôle du facteur HIF1. Le porteur qualifie le traumatisme de "léger" et affirme que l'animal "ne montre aucun signe de douleur" une fois réveillé, alors que la procédure est classée en gravité modérée. Le bénéfice annoncé, cerner les conditions de séquelles après un traumatisme crânien pédiatrique, reste une perspective de recherche.

Objectifs

Chaque année 1,5 millions d'européens sont victimes d'un traumatisme crânien (TC) le plus souvent subit lors d'un accident de la route, d'une chute ou au cours de pratiques sportives. 70 000 personnes perdent la vie des suites du traumatisme et environ 100 000 ne présentent pas de récupération totale et demeurent handicapées, notamment chez les enfants et les jeunes adultes qui représentent une population particulièrement vulnérable en regard de ce type de traumatisme. Bien qu'au cours des dernières années un raffinement des procédures de prise en charge par les urgences et les hôpitaux a permis de réduire la mortalité des traumatisés crâniens, il est apparu qu'un grand nombre de patients souffrent par la suite de désordres chroniques invalidants tels que : épilepsie, dépression, démence progressive, etc. À ce jour, aucun traitement ne permet d'empêcher la mise en place de tels désordres à la suite d'un traumatisme crânien. Après un TC, les atteintes des vaisseaux ont pour conséquence de diminuer l’apport en oxygène aux cellules du cerveau. Cette baisse en oxygène (hypoxie) peut aller jusqu’à provoquer la mort de certaines cellules du cerveau. La réponse de l’organisme face à l’hypoxie est régulée par le facteur HIF1 (Hypoxia Inducible Factor). Nous voulons tester si ce facteur joue un rôle délétère dans les évènements cellulaires après un TC. Si tel est le cas, ce facteur représenterait une cible potentielle de traitement innovante et à fort intérêt thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les mécanismes physiopathologiques découlant d’un traumatisme survenant pendant l’enfance sont encore assez peu connus. Ainsi on ne sait pas pourquoi seule une partie des enfants souffrant d’un traumatisme crânien léger vont développer à plus ou moins long terme des symptômes tels que des maux de tête, pertes d’équilibre, problèmes de concentration ou retards d’apprentissage… De plus il n’existe à ce jour aucun traitement efficace pour prévenir les conséquences d’un traumatisme crânien survenant chez l’enfant. Notre étude permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à ces traumatismes et devrait permettre de mieux cerner les conditions propices au développement de symptômes post-trauma (notamment l’influence du sexe de l’individu). D’autre part ce projet déterminera si la protéine HIF1 représente une cible thérapeutique intéressante dans le cadre du développement de traitements post-trauma chez l’enfant.

Procédures

Les 640 animaux subiront tous les procédures non-terminales suivantes : 1. traumatisme crânien léger unique sous anesthésie générale courte (5 minutes) pour moitié des animaux et anesthésie générale courte seule pour l’autre moitié (animaux contrôles dits « sham ») à 17 jours après la naissance. 2. Exploration comportementale sur animal vigile répétée à 1 et 7 jours après le trauma. Chaque série comportementale comprendra 1 test d’exploration de 5 minutes (Open Field) et un test de coordination motrice sur échelle (Foot Fault) réalisés la même journée. 3. Exploration comportementale sur animal vigile répétée à 1 mois, 3 mois et 6 mois après le trauma. Chaque série comportementale comprendra 1 test d’exploration de 5 minutes (Open Field), 2 tests de coordination motrice sur poutre et échelle (Beam walk et Foot Fault) d’environ 5 minutes chacun, 1 test de sensibilité tactile (Von Frey test) d’environ 5 minutes, 2 tests d’évaluation de l’état anxieux (Elevated Plus Maze et White/Black box) de 5 minutes et un test d’apprentissage spatial (Barnes Maze) qui nécessite des sessions quotidiennes de 5 minutes sur 5 jours. Chaque test sera effectué à un jour différent, ainsi chaque série comportementale comprendra 11 tests quotidiens d’environ 5 minutes répartis sur 2 semaines. 4. Exploration d’imagerie fonctionnelle par IRM réalisée sous anesthésie générale d’environ 1 heure répétée à 1, 3 et 6 mois après le trauma, un jour après le dernier test comportemental.

Impact sur les animaux

Notre projet repose sur l’utilisation d’un modèle léger de traumatisme crânien chez l’animal juvénile. Le traumatisme est réalisé chez l’animal anesthésié, et une fois réveillé l’animal ne montre aucun signe de douleur, il reprend immédiatement un comportement normal. Comme il s’agit d’un traumatisme léger, les conséquences à long terme ne sont pas anxiogènes ou douloureuses pour l’animal. Ces conséquences sont principalement des retards/défauts d’apprentissage et une légère altération de la coordination motrice, sans altération de la mobilité de l’animal. De plus, le modèle murin utilisé n’engendre pas de phénotype dommageable.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure, soit 640 animaux.

Remplacement

Le projet vise à caractériser les atteintes du tissu cérébral suite à un TC ainsi qu’à évaluer l’intérêt d’une cible thérapeutique sur la récupération post TC. À ce jour, aucun modèle in vitro ou informatique ne permet de simuler la complexité des interactions cellulaires mise en jeu, tant nos connaissances demeurent encore superficielles en la matière. Notre recherche sur des bases de données (PubMed, Web of science, …) permet d’affirmer qu’à notre connaissance, il n’existe pas d’autre modèle expérimental que l’animal afin d’étudier ces réactions tissulaires dans leur ensemble. Par conséquent, notre projet ne peut pas se passer de l’expérimentation animale.

Réduction

Le projet concerne 640 souris mais permet de réduire le nombre d'animaux utilisés sans compromettre les objectifs du projet en effectuant un suivi longitudinal non invasif par imagerie. Nous planifions des groupes expérimentaux correspondant au nombre minimal permettant l'utilisation de tests statistiques visant à comparer les différents groupes : analyses multi-ANOVA avec répétition / analyses de régression entre les différents paramètres mesurés pour des tests comportementaux / IRM (voir annexes pour le plan expérimental).

Raffinement

Le projet permet de raffiner l'expérimentation animale en utilisant un modèle pertinent par rapport à la situation chez l'homme, en s'appuyant sur la mise en place d'une démarche de suivi des animaux permettant de limiter et traiter la souffrance éventuelle des animaux, et en employant les méthodes d'imagerie les plus sensibles disponibles actuellement. L'ensemble des procédures mises en place dans le projet sera assuré par des personnes qualifiées en expérimentation animale. Le stress des animaux sera limité à son maximum, avec un sevrage mis en place à 25 jours post-natal, et des conditions d'hébergement enrichies (matériels de nidification) et permettant les interactions sociales en adéquation avec les directives européennes. La réalisation du projet repose sur l'établissement de points-limites et de pratiques permettant de minimiser au maximum le stress, la détresse et la souffrance des animaux. Les traumatismes crâniens seront réalisés sur animal anesthésié en utilisant des impacts calibrés. De plus, la cage de réveil est placée sur un tapis chauffant afin de prévenir toute hypothermie. Lors de la réalisation des tests comportementaux, les animaux ne se retrouveront isolés que peu de temps : 5mn pour la plupart des tests et 1h au maximum. Les protocoles expérimentaux s'appuient notamment sur l'utilisation d'un agoniste opioïde, la Buprénorphine, afin de prévenir ou traiter la manifestation de douleurs.

Choix des espèces

Le système nerveux central de la souris est parmi les mieux connus et les plus étudiés. Son organisation est aussi très proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus permettent ainsi de proposer des hypothèses de dysfonctionnement du cerveau humain suite à un traumatisme crânien et de proposer des pistes thérapeutiques pour leur traitement. De plus, le modèle murin permet l’utilisation de souches génétiquement modifiées. Notre projet s'appuie sur l'utilisation d’une de ces souches : des souris pour lesquelles le gène codant pour le facteur HIF1-alpha a été inactivé dans les astrocytes. Cette invalidation de gène n'induit pas d'effet sur le développement, la survie, la croissance et les fonctions neuromusculaires. Dans ce projet, les traumatismes crâniens seront réalisés sur des souris juvéniles à 17 jours post natal, ce qui nous permet de modéliser les effets d’un TC en pédiatrie chez des enfants de 4 à 6 ans. Nous conserverons les animaux jusqu’à 6 mois après le TC afin d’évaluer les conséquences à long-terme.

630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ovariectomie puis une greffe de cellules tumorales dans l'utérus, suivie de plusieurs semaines d'imagerie sous anesthésie, pour tester un anticorps anti-Netrin-1 contre le cancer de l'endomètre. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer des douleurs abdominales et que les métastases pulmonaires peuvent entraîner des difficultés respiratoires, les animaux étant alors mis à mort. Le bénéfice annoncé, "améliorer la prise en charge" des patientes, reste général, et il affirme que le recours à l'animal est "nécessaire".

Objectifs

Le cancer de l'endomètre est le cancer gynécologique le plus diagnostiqué dans les pays développés, et son incidence ne cesse d'augmenter. L'objectif de ce projet est de créer un modèle de greffe de cellules tumorales dans l’endomètre des souris pour mimer au mieux les conditions micro-environnementales dans le but de caractériser l’action de l’anticorps anti-Netrin-1 sur la croissance tumorale. il permettra également par la suite d’utiliser ce modèle pour tester l’efficacité de l’anticorps anti-Netrin-1 en le combinant avec des traitements anti-cancéreux connus.

Bénéfices attendus

Améliorer la prise en charge et le traitement du cancer de l’endomètre chez les patientes atteintes de tumeurs avancées et/ou métastatiques.

Procédures

Ovariectomie et xénogreffes de cellules tumorales en orthotopique (1à à 15 minutes, une fois). Imagerie par ultrason (10 à 20 minutes, 1 à 2 fois par semaine pendant 7-8 semaines). Imagerie de la luminescence (10 à 15 minutes, 1 à 2 fois par semaine pendant 7-8 semaines).

Impact sur les animaux

Bien que la publication dans laquelle cette procédure est décrite ne fasse pas état d’effets indésirables particuliers, la croissance tumorale des tumeurs de l’endomètre peut générer des douleurs abdominales qui seront atténuées par traitement analgésique si l’animal montre des signes de souffrance. Si les signes de douleurs se poursuivent et sont accompagnés d’une baisse d’appétit et une perte de poids > 20%, l’animal sera mis à mort. Suivant la taille des tumeurs, il est possible que la mobilité des animaux soit réduite du fait de la localisation des tumeurs. La présence de métastases pulmonaires peut générer des difficultés respiratoires chez l’animal. Le comportement et la respiration de l’animal seront monitorés régulièrement et l’animal sera mis à mort si l’atteinte respiratoire devient trop grave.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, ou si un point limite est atteint en cours de procédure, par dislocation cervicale après anesthésie à l’isoflurane. Cela est nécessaire afin d'une part de limiter la souffrance de l'animal en cas d'atteinte de point limite et d'autre part de valoriser l'expérience par des analyses immuno-histochimiques et biochimiques sur différents tissus (sains et tumoraux) récoltés après la mise à mort de l'animal et d'ainsi identifer les mécanismes moléculaires impliqués.

Remplacement

Une attention particulière sera accordée à la règle des 3R afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en s’assurant de la reproductibilité des résultats. Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire pour valider l’observation clinique et analyser les effets de la thérapie ciblée. Ces méthodes sont complémentaires d’expérimentations sur des cellules en culture qui sont largement utilisées en parallèle pour cette étude.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, l’abrasion puis l’injection de cellules tumorales seront réalisées au niveau des cornes utérines droite et gauche de l’animal, afin de générer 2 tumeurs par animal et ainsi réduire le nombre total d’animaux par deux. De plus, les procédures se feront de façon séquentielle et donc en fonction des premiers résultats, les expérimentateurs pourront réduire le nombre d'animaux nécessaires au total.

Raffinement

Toute manipulation susceptible d’entraîner du stress sera réalisée par un expérimentateur formé aux techniques de contention et de manipulation des animaux. L’ovariectomie et l’injection de cellules tumorales seront réalisées par un expérimentateur habitué et formé aux techniques de chirurgie expérimentale et l’animal sera anesthésié à l’isoflurane. Il est important de noter qu'en cas d’atteinte d’un point limite, les animaux seront euthanasiés dans le respect de la réglementation en fonction des signes de souffrance. Le suivi de la croissance tumorale sera réalisé, de manière non-invasive, soit par échographie soit par imagerie de fluorescence non-invasive, sous anesthésie, une fois par semaine tant que la taille de la tumeur est inférieure à 2 mm, puis tous les 3 jours jusqu'à ce que la tumeur atteigne le point limite de 50mm3. Ces techniques d'imagerie non-invasive permettent de réduire les manipulation et le stress de l'animal. Pour le traitement de la douleur, de la buprenorphine sera administrée avant le début de la procédure chirurgicale afin de prévenir toute douleur opératoire. Pour le traitement des douleurs post-opératoires, l'eau de boisson sera additionnée de paracétamol.

Choix des espèces

La souris immunodéficiente est le modèle le plus approprié pour greffer des cellules cancéreuses humaines afin qu’il n’y ait pas de rejet des cellules. De plus, la souris immunocompétente permettra d’analyser la contribution du système immunitaire dans les effets observés après xénogreffes de lignées tumorales murines. Par ailleurs, les schémas d’administration des chimiothérapies (voie, doses, posologies) sont bien standardisés chez la souris, contrairement à d’autres modèles tels que le Zebrafish. L’expérimentation sera effectuée sur des souris femelles d’au moins 8 semaines, possédant un utérus mature et fonctionnel.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de l'oreille interne puis une bio-impression assistée par laser via la fenêtre ronde de la cochlée, sous deux anesthésies générales, pour mettre au point une technique d'injection intra-cochléaire. Le porteur décrit la bio-impression et les mesures auditives comme ne générant "aucune douleur ou traumatisme", alors que la chirurgie reste classée en gravité modérée. Sur le remplacement, il affirme que ces mesures ne peuvent se faire sur des animaux non-mammifères, au système auditif jugé "trop éloigné" de celui de l'homme.

Objectifs

L'oreille interne représente l'un des organes cibles les plus difficiles pour l'administration de médicaments. Les voies conventionnelles, telles que l'administration orale et les injections, ont une efficacité limitée, principalement en raison de la barrière hémato-cochléaire qui bloque la plupart des molécules provenant de la circulation sanguine. L’une des voies d’accès la plus étudiée et la plus prometteuse comme « porte d’entrée » de l’oreille interne repose sur la fenêtre ronde à la base de la cochlée (1.5 mm de diamètre environ). Elle constitue une membrane souple, relativement perméable, de 40 à 60 µm d'épaisseur et est composée de 3 couches cellulaires. Son rôle est de vibrer de manière opposée aux vibrations acoustiques qui entrent dans l’oreille interne, jouant ainsi le rôle de soupape de pression et permettant aux ondes sonores de se propager dans la cochlée. Cette membrane permet d’avoir un accès privilégié aux fluides internes de la cochlée. L’objectif du projet est donc de développer un nouveau dispositif permettant de délivrer un agent thérapeutique en intra-cochléaire, via la fenêtre ronde, de manière atraumatique et contrôlée. Pour cela, l’équipe s’est orientée vers la bio-impression assistée par laser, déjà utilisée au laboratoire dans des protocoles de régénération osseuse in situ chez l’animal, qui ne produit pas de souffrance apparente des animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer une technique pour réaliser des injections de substances thérapeutiques dans l’oreille interne, avec une grande précision et sans risque de lésions des structures sensorielles cochléo-vestibulaires contrairement aux stratégies développées à ce jour.

Procédures

Les 4 groupes d’animaux (soit 100 souris) seront soumis à une procédure chirurgicale et aux mesures de PEAs. La bio-impression assistée par laser ne concernera que les groupes 2 à 4 (soit 90 souris sur les 100 prévues). Ces procédures seront réalisées sous anesthésie générale (mélange Kétamine-Xylazine) accompagnée d’une analgésie dans le cas de la chirurgie (Carprofène). Les procédures de mesure de PEAs pré-opératoire, de chirurgie et de bio-impression seront réalisées en continuité directe lors de la première anesthésie (10 min pour les mesures de PEAs, 15 min pour la chirurgie et 10 min pour la bio-impression, soit 35 min de procédure sur souris anesthésiées). Une seconde anesthésie sera réalisée, 48h à 7 jours après l’intervention (post-opératoire), pour mesurer les PEAs. A la fin de la seconde mesure de PEAs post-opératoire, les animaux seront mis à mort selon la procédure prévue. Ainsi, sur les 100 souris qui subiront la procédure chirurgicale et les mesures de PEAs (pré- et post-opératoire), 90 souris subiront également la bio-impression assistée par laser. Les 4 groupes d’animaux seront donc soumis à 2 anesthésies générales au total, pour une durée maximale de 35-40 min par anesthésie (cf. frise chronologique en annexe). Un délai de 48h minimum sera respecté entre les anesthésies.

Impact sur les animaux

La durée des procédures n’excède pas 40 minutes maximum permettant de limiter la durée de l’anesthésie. Un délai de 48h minimum sera respecté entre les anesthésies. Les procédures de bio-impression et de mesure des PEAs ne génèrent aucune douleur ou traumatisme chez l’animal, et seront réalisées sous anesthésie générale car elles nécessitent une immobilisation complète de l’animal. Lors de la chirurgie (niveau de sévérité modéré), un analgésique sera également utilisé pour limiter le niveau de douleur de l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie après les différentes procédures excepté après la seconde mesure de PEAs (post-op) où les animaux seront mis à mort selon la procédure prévue. Les tissus de l’oreille interne seront prélevés pour analyse.

Remplacement

L'application de substances thérapeutiques sur la fenêtre ronde s'insère dans un projet d'application clinique future. Il faut dans un premier temps démontrer son efficacité et son innocuité sur un modèle animal. Par ailleurs, ces mesures ne peuvent se faire sur des animaux non-mammifères car leur système auditif est trop éloigné de celui de l'homme. Toutes les manipulations préalables de calibration par exemple seront effectuées dès que possible sur matériel inerte (gélose).

Réduction

Chaque souris sera utilisée pour toute la série de procédures (chirurgie, bio-impression assistée par laser et mesures de PEAs) afin d'en limiter leur nombre. Les souris seront donc soumises à 2 anesthésies au total : une première anesthésie pour la mesure pré-opératoire des PEAs, la chirurgie et la bio-impression puis une seconde anesthésie pour la mesure post-opératoire des PEAs (cf. frise chronologique en annexe). Nous utiliserons le plus petit nombre possible de souris par conditions de bio-impression, conformément aux limites biostatistiques nous permettant une fiabilité des résultats. Pour les tests statistiques, nous utiliserons essentiellement des tests non paramétriques (type Wilcoxon-Mann-Whitney) puisque les échantillons seront petits et que les pré-requis des tests paramétriques (distributions normales, variances égales) ne seront pas satisfaits. Le nombre total de 100 souris utilisées sur l’ensemble du projet permet un traitement statistique significatif des données obtenues en se laissant une marge de manœuvre en cas d’échecs. Une phase de mise au point de bio-impression in vivo sera nécessaire, nécessitant des animaux surnuméraires (pris en compte dans nos lots). Un nombre minimum de 15 souris/groupe de bio-impression sera nécessaire pour assurer la fiabilité des tests statistiques. Ainsi, en fonction des résultats obtenus, un nombre plus faible d'animaux pourrait permettre d’avoir des résultats statistiquement fiables.

Raffinement

Une analgésie adaptée sera appliquée en pré- et post-opératoire ainsi que des conditions de stabulation appropriées. Pour soulager l’inconfort et le stress des souris, nous hébergerons les souris dans une cage à milieu enrichi (tunnel carton, aspen bois, fibres de papier et abri) dans un local à ventilation, température et éclairage contrôlés. Pendant les différentes procédures, l’animal sera profondément anesthésié avec une surveillance des points vitaux (fréquence cardiaque et respiration, couleur des muqueuses, température corporelle). Des points limites seront définis afin de respecter le bien-être animal et pourront entraîner l’arrêt immédiat des manipulations. Trois expérimentateurs impliqués dans le projet possèdent l’expérimentation animale niveau concepteur (un expérimentateur supplémentaire fera la formation en mars 2022). Concernant les 2 expérimentateurs principaux (possédant l’EA concepteur), l’un a également suivi la formation chirurgie (octobre 2021) et l’autre suivra la prochaine formation chirurgie prévue en mars 2022. Concernant la formation continue, ces 2 expérimentateurs ont accumulé respectivement 26h sur 6 ans et 18h sur 4 ans (notamment sur le bien-être animal, la règle des 3R, les points limites, la gestion de la douleur…).

Choix des espèces

Les mesures de PEA ne peuvent se faire sur des animaux non-mammifères car leur système auditif est trop éloigné de celui de l'homme. L’anatomie cochléaire est également similaire, et la fenêtre ronde est bien accessible. Les souris utilisées auront entre 2 et 4 semaines, c’est-à-dire à un stade de développement postnatal où l’appareil auditif a atteint sa maturité.