Procédures modérées
Caractérisation de la lignée Pde2a2 +/-
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 48 dans des procédures classées sévères. Cette lignée modifiée pour réduire une protéine liée à l'autisme et à la déficience intellectuelle subit des tests sociaux et cognitifs, dont certains précédés de deux heures d'isolement, avant l'euthanasie et le prélèvement du cerveau, de la moelle épinière, des surrénales, des testicules et des ovaires, 120 animaux mourant au cours d'une perfusion intracardiaque. Le porteur qualifie les tests comportementaux de classiques et indolores et signale une anxiété possible liée au nouvel environnement et à l'isolement. Il indique avoir d'abord travaillé sur des lignées cellulaires et poursuivre directement chez la souris pour étudier les comportements.
Objectifs
Des mutations du gène PDE2A ont été découvertes chez des patients atteints d’autisme et de déficience intellectuelle, qui sont des maladies du développement du cerveau . La protéine PDE2A est très fortement présente dans le cerveau et a un rôle clé dans le développement des neurones, leur morphologie et fonctionnement. Ceci explique que des altérations de sa quantité puissent avoir un impact négatif sur le fonctionnement neuronal et induire des maladies du cerveau. La PDE2A regroupe trois protéines variantes qui se retrouvent à des emplacements distincts dans les neurones, dont la PDE2A2 que l’on retrouve spécifiquement dans la mitochondrie. Les mitochondries sont des petites unités présentes dans les cellules qui produisent de l'énergie sous forme d'ATP grâce au processus de respiration cellulaire. Des altérations de la mitochondrie sont d’ailleurs retrouvés chez les patients ayant des mutations sur le gène PDE2A ainsi que chez d'autres patients atteints de trouble du spectre de l'autisme. Nous avons récemment étudié la souris Pde2a+/- qui, comme les patients, a une quantité diminuée de tout les variants PDE2A. Nos récentes données montrent que cette souris est un bon modèle de maladie du cerveau, et qui présente des troubles socio-cognitifs similaires aux patients. Nous voulons à présent commencer l’étude de la souris Pde2a2+/- qui aura uniquement une quantité diminuée de PDE2A2, donc seulement au niveau de la mitochondrie. En effet, cela nous permettra de savoir si une atteinte unique au niveau de la mitochondrie est suffisante pour induire des troubles comportementaux.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre le rôle spécifique de la PDE2A2 au cours du développement du cerveau, et le lien entre la dérégulation de l'activité de cette enzyme au niveau de la mitochondrie et les troubles du neuro-développement comme la déficience intellectuelle, l'autisme et les troubles moteurs. Finalement, l'évaluation de la pertinence de ce modèle par rapport aux patients atteints d'une mutation permettra de mettre à disposition de la communauté scientifique un potentiel nouveau modèle de maladie du neurodeveloppement.
Procédures
Différents tests sociaux et cognitifs seront réalisés ponctuellement et qui dureront, selon les tests, de 3 minutes à 2 heures. Ces tests se feront chez les souriceaux, à l'adolescence (un mois) et à l'âge adulte (dès deux mois). Certains animaux seront soumis à une perfusion intra-cardiaque, et une injection d'anesthésique et une d'antalgique seront effectuées sur chaque animal.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une contention plusieurs fois au cours de leur vie, que ce soit pour des pesées ou pendant les différents tests. Les tests comportementaux réalisés sont classiques et indolores. De l'anxiété peut être attendue lors des différents tests liée à un nouvel environnement notamment pour les tests d'anxiété ou lors de l'isolement dans l'actimètre ou pendant le test d'interaction sociale avec 2h d'isolement auparavant.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort à l'issue des procédures expérimentales. Nous récupérerons différents organes (cerveau, moelle épinière, surrénales, testicules et ovaires) afin de réaliser des études moléculaires. 120 de ces animaux subiront une perfusion intra-cardiaque, sous anesthésie générale, au cours de laquelle ils décèderont afin de pouvoir réaliser une étude sur les coupes de cerveau.
Remplacement
Avant de réaliser cette étude, nous avons préalablement travaillé sur des lignées cellulaires, ce qui nous a permis de confirmer le rôle de PDE2A2. Notre étude portant globalement sur des maladies du neurodéveloppement et sur le déficit intellectuel et les troubles du spectre de l'autisme, nous devons poursuivre ce projet directement chez la souris pour étudier les différents comportements associés à ces maladies afin de valider le rôle de la forme mitochondriale de PDE2A.
Réduction
Dans un objectif de réduction, nous analyserons nos résultats après chaque groupe expérimental. Si les résultats des 2 premiers groupes expérimentaux sont significatifs et identiques, nous n'utiliserons pas le 3ème groupe. De plus, les organes de tous les animaux utilisés au cours de ce projet seront récupérés pour réaliser des études moléculaires, ce qui évitera l'emploi d'animaux supplémentaires. Pour garantir une puissance statistique (t test) suffisante à cette étude tout en minimisant le nombre d’animaux à utiliser, nous prévoyons un minimum de n=10 animaux par groupe, avec 3 expériences indépendantes. Chaque expérience sera réalisée 3 fois afin de garantir la reproductibilité des résultats, et pour chaque répétition, nous avons besoin d'un minimum de 10 animaux par groupe afin d'obtenir un résultat significatif.
Raffinement
Lors des procédures chirurgicales, les animaux seront au préalable anesthésiés, accompagné d'un analgésique et d'un antalgique afin de réduire la douleur de l'animal.
Choix des espèces
Travailler avec des souris permet de comparer un phénotype "sauvage" avec des modèles transgéniques disponibles, comme les souris Pde2a+/-. De plus, le modèle murin permet d'étudier à la fois les comportements sociaux, cognitifs, anxieux ou sensorimoteurs que l'on peut retrouver chez les patients atteints de troubles du neuro-développement. Des tests seront réalisés au 7ème, 10ème et 14ème jour après la naissance, ce qui correspond à l'enfance chez l'humain. Puis nous réaliserons d'autres tests à 1 mois, ce qui correspond à l'adolescence. Enfin, nous réaliserons des tests à l'âge adulte d'une souris (à partir de 8 semaines). Cela permettra d'évaluer l'impact de l'extinction partielle du gène Pde2a2 au cours du développement, et d'identifier les moments clefs où la protéine PDE2A2 est impliquée dans la pathologie.
Etude d’un gène protecteur de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
58 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris Tau22, modifiées pour développer une pathologie de type Alzheimer, subissent une biopsie de la queue pour génotypage, une injection intracérébrale de vecteur de thérapie génique sous anesthésie, puis des tests de mémoire de reconnaissance d'objet et de labyrinthe en Y avant l'euthanasie et le prélèvement des tissus. Le porteur nomme les tests comportementaux et les qualifie de non invasifs, et indique que la chirurgie peut provoquer, rarement, infection ou convulsions. Il justifie l'euthanasie par le fait que ces animaux transgéniques ne peuvent être replacés ou relâchés.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une pathologie qui se caractérise par des troubles de la mémoire et par une perte progressive des facultés cognitives. Le processus de la maladie débute avec l’accumulation d’agrégats toxiques dans le cerveau. En particulier, la mort des cellules nerveuses est due à une accumulation de protéines toxiques. À ce jour, les traitements sont donnés aux patients à des stades trop avancés de la maladie. Il est donc important de développer des approches thérapeutiques qui peuvent agir plus tôt dans le processus de la pathogenèse et en particulier qui peuvent favoriser l’élimination de ces agrégats toxiques. En ce sens, le projet vise à étudier l'action de la protéine «protectrice» dans la maladie d'Alzheimer. Des résultats préliminaires indiquent qu’un variant naturel de cette protéine en question s'est avérée très efficace pour éliminer les agrégats toxiques dans les cellules neuronales. Avec ce projet nous envisageons de démontrer que ce variant présent dans une partie de la population ralentit l’avancée de la maladie d’Alzheimer.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra démontrer pour le première fois, l'efficacité d’une protéine à dégrader des agrégats toxiques dans le cerveau de souris utilisé comme modèle de la maladie d’Alzheimer. Il pourra déboucher à terme sur des avancées thérapeutiques utiles pour l’homme.
Procédures
Les animaux Tau22 hétérozygotes auront été génotypés par PCR suite à une biopsie de la queue. Les animaux seront soumis à des anesthésies (1 fois pendant 30 min) puis à une procédure chirurgicale d’injection intracérébrale d’un vecteur de thérapie génique (1 fois, durée d’environ 25-30 minutes). A l’âge de 9 mois, ils seront soumis à des tests de comportements non invasifs afin de tester leur mémoire. Les différents tests seront réalisés une fois par animal et seront réalisés les uns à la suite des autres (test de reconnaissance de l’objet puis le Y-Maze), avec un temps de pause entre chaque d'au moins une semaine afin de limiter le stress éventuel des animaux. Aucun test comportemental réalisé ne peut être considéré comme invasif. Toutefois, une attention particulière sera accordée à chaque animal lors de chaque expérimentation. Les males seront testés en premier (ex en matinée) afin d’éviter toute attirance par le passage des femelles dans le support de test, ce qui pourrait biaiser l’interprétation. Les femelles du groupe seront ensuite testées dans l’après-midi qui suit le test des males. Il faudra compter 30 minutes / individu par test.
Impact sur les animaux
Une partie des animaux développera selon leur génotype des lésions histologiques qui entraînent des perturbations de la mémoire à partir de 6 à 9 mois. Les animaux de génotype mutant auront une moins bonne performance d’apprentissage. Les animaux subiront une chirurgie qui peut dans de très rare cas et malgré les mesures d’asepsie entraîner une infection au site chirurgical, avec des complications telles que douleur et inflammation. Il n’est pas attendu de problèmes neurologiques liés au modèle, ni aux injections dans le cerveau, néanmoins des troubles neurologiques (ataxie et convulsion) pourraient survenir de façon accidentelle suite à l’injection dans le cerveau. La manipulation des animaux pour les tests de comportement peut engendrer un stress. Les biopsies pour le génotypage entraîneront une douleur.
Devenir
Mort (tous les animaux). Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. En effet, ces animaux Tau22 hétérozygotes souffrent de la pathologie d’Alzheimer, une maladie qui est accompagnée de déficits de mémoire qui pourraient s’aggraver davantage avec l’âge. Les animaux seront donc mis à mort en fin de procédure (âgés de 9 mois) pour prélèvement des tissus désirés.
Remplacement
A l’heure actuelle il n’est pas possible de reproduire les déficits d’apprentissage retrouvés chez les patients Alzheimer sans recourir à l’expérimentation in vivo. Des premières expériences sur cultures cellulaires de type neuronales ont permis de démontrer l'effet bénéfique de la protéine étudiée sur la réduction des agrégats toxiques. Les expériences chez la souris seront le complément nécessaire de ce travail. Cette évaluation garantira l'efficacité et la sécurité avant de passer aux essais sur l'homme.
Réduction
Le nombre d’animaux sera limité au strict nécessaire par une gestion appropriée des plannings de reproduction et des accouplements réalisés afin de maximiser la production du génotype utile. Le nombre d'animaux qui sera utilisé pour évaluer le rôle de la protéine étudiée en tant que stimulateur de d’agrégats toxiques dans les neurones est un nombre utile pour cette tâche. Les procédures expérimentales ont été choisies pour obtenir des résultats statistiquement valides avec le plus petit nombre d'animaux, sans pour autant sacrifier la portée scientifique du projet. Pour atteindre cet objectif, nous travaillerons à augmenter la puissance statistique de nos expériences et en même temps à réduire au minimum les animaux utilisés au cours de l'étude en : 1) lorsque l'animal sera mis à mort, nous prélèverons le cerveau afin d'extrapoler toutes les informations et données possibles à partir du nombre minimum d'animaux. Bien que l'étude in vitro soit une stratégie valable pour réduire le nombre d'animaux, il est important de ne pas oublier les limites de cette approche. Si l'utilisation de cultures cellulaires peut donner des informations utiles d'un point de vue mécaniste, l'étude in vivo implique un animal dans son intégralité et peut donc fournir des informations imprévisibles (effets indésirables/inattendus) en ce qui concerne à une étude impliquant uniquement l'utilisation de cultures cellulaires. Toutes les procédures expérimentales seront menées par du personnel hautement qualifié dans un environnement contrôlé afin de minimiser les erreurs aléatoires. Le nombre d'animaux qui seront inclus dans chaque groupe a été défini sur la base de l'analyse statistique décrite dans la littérature et le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été déterminé avec des outils statistiques. Enfin, notre collaborateur a procédé à la cryoconservation de cette lignée transgénique, ce qui permettra de ne pas maintenir les animaux qui n’entreront plus dans le cadre des expériences en cours pendant plus de 12 mois.
Raffinement
Les animaux seront mis à mort selon des méthodes conformes à la recommandation de la Commission européenne chaque fois que des souffrances sont visibles chez l'animal (déshydratation, impossibilité de mouvement). Afin d’éviter que l’animal se blesse, avant qu’il ne se réveille, nous couperons la pointe des griffes avec un petit ciseau ou coupe-griffe. À la fin de la chirurgie, les animaux seront réchauffés selon une méthode appropriée dans l’animalerie Ils seront surveillés périodiquement jusqu'à leur réveil. Dans les jours suivant l'intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés afin de vérifier la récupération complète des fonctions physiologiques de base (urine et nutrition). Au réveil complet et pendant les 12-20 heures suivantes (dans la mesure du possible dès leur réveil, dès que les animaux auront repris leur activitées physiologiques (urine, alimentation), afin d'éviter des dommages accidentels par les congénères, l'animal sera logé individuellement avec de la nourriture humide répartie uniformément dans la cage pour faciliter son accès. Apres cela, les souris seront remises dans leur cage pré-chirurgie.
Choix des espèces
La maladie d’Alzheimer (MA) est une pathologie qui apparaît tardivement, insidieusement, mais progressivement et irréversiblement. Elle va détruire petit à petit les neurones de l’hippocampe qui gèrent la mémoire. La lignée de souris utilisée dans cette étude reproduit ces caractéristiques de la maladie humaine. En particulier ces animaux, à 9 mois, subissent une perte de mémoire qui est accompagnée de la mort neuronale dans une région ciblée du cerveau. L’injection du vecteur pour l’expression de notre protéine d’intérêt sera réalisée à 3 mois, avant le développement des symptômes liés à l’âge, pour tester un effet protecteur de cette protéine. Choix de l’espèce : l’introduction de la protéine Tau mutée chez la souris constitue une approche directe afin de mimer la maladie d’Alzheimer et notamment la parte de mémoire liée à cette pathologie. Les génomes murins et humains étant relativement proches dans leur structure, la souris est l’animal de choix pour ce type d’approche.
Etude de l’effet du Givinostat et du Bortezomib sur des modèles de myopathies chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
254 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles transgéniques de myopathies, elles subissent jusqu'à quatre prélèvements sanguins, des gavages quotidiens pendant quinze semaines et des tests d'effort et d'agrippement, pour évaluer deux molécules candidates. Le porteur indique que ces modèles développent faiblesse et lésions musculaires dès les premières semaines de vie, et que les gavages et tests peuvent provoquer inconfort et fatigue. Il décrit des essais préalables sur cellules et affirme que l'étape animale reste indispensable pour confirmer les résultats sur des organismes entiers.
Objectifs
Les myopathies des ceintures se caractérisent par une dégénérescence progressive des muscles du bassin et des muscles des épaules conduisant à une perte de motricité des membres supérieurs et inférieurs. Elles évoluent de façon extrêmement variable. L'atteinte musculaire s'étend progressivement vers les muscles du tronc et les muscles distaux qui s'affaiblissent. Une atteinte cardiaque et/ou respiratoire affecte l'espérance de vie. Il n’existe aucun traitement spécifique. Ces pathologies sont dues à des anomalies sur certaines protéines qui assurent la contraction du muscle. Chez des souris modélisant la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), un traitement pharmacologique (molécule 1) a réduit les symptômes. Ici, nous souhaitons évaluer l’efficacité de ce traitement sur des modèles murins de myopathies des ceintures, car les patients ont un tableau clinique similaire aux patients DMD. Le but étant que cette molécule réduise l’atteinte musculaire chez les patients. Dans un second temps, nous allons évaluer la possibilité de stopper la dégradation des protéines anormales présentes dans ces modèles. Nous souhaitons ici sélectionner la dose efficace d'un traitement (molécule 2) engendrant le moins d’effets toxiques/secondaires. L’étape suivante sera de combiner les deux molécules (molécules 1 et 2) pour restaurer les protéines fonctionnelles dans le muscle dans les modèles de myopathies (demande d’autorisation de projet à part).
Bénéfices attendus
Nous pensons que le traitement avec la molécule 1 aura un effet bénéfique sur les souris atteintes de myopathies des ceintures, en améliorant l’état des muscles squelettiques, aussi bien au niveau de l’architecture des muscles que de la force musculaire. La combinaison avec la molécule 2 pourrait plus tard permettre la restauration des protéines dans le muscle. De tels résultats ouvriraient la porte à des essais cliniques sur des patients souffrant de ces maladies, pour lesquelles il n’existe actuellement aucun traitement.
Procédures
Les animaux subiront : - au maximum 4 prélèvements sanguins chacun durant environ 20 minutes - des gavages 1 fois par jour pendant 15 semaines (durée : quelques minutes) - 2 tests d'effort (durée cumulée maximale 110 min) et 2 tests d'agrippement (durée : 3x 60 secondes)
Impact sur les animaux
Le test d'effort peut entrainer une fatigue de l'animal (musculaire et/ou cardiaque). Les gavages quotidiens avec la molécule 1 peuvent entrainer un inconfort. A partir de trois semaines d’âge les souris MDX (modèle DMD) présentent une faiblesse musculaire et des lésions musculaires. Concernant les souris alpha sarcoglygane, les muscles squelettiques sont fonctionnellement altérés à partir de l'âge de 2 mois et un schéma dystrophique modéré est présent à partir de l'âge de 6 mois. Les souris gamma sarcoglygane développent une dégénérescence et régénération du muscle squelettique dès 4 semaines et une fibrose précoce.
Devenir
A l'issue des procédures, les animaux seront euthanasiés et les muscles seront prélevés pour des analyses histologiques.
Remplacement
Des premières études avec les deux molécules ont été préalablement réalisées sur des modèles cellulaires. Cela a permis d’étudier leurs effets et leur mécanisme d’action. Néanmoins, notre étude préclinique est indispensable pour confirmer les résultats préalablement observés et les confirmer sur des organismes entiers (mammifères comme la souris). Cela permettra d’ouvrir la porte à des essais cliniques chez l’humain.
Réduction
Pour la première étude avec la moléculé 1 nous utiliserons 8 souris par groupe. Ce nombre nous confère une force statistique suffisante afin de comparer les résultats obtenus dans chaque groupe et condition de traitement. Par ailleurs, dans la suite de notre stratégie de réduction, les groupes témoins (non porteurs du gène de la maladie) ne seront pas exposés aux doses croissantes du traitement expérimental. Pour la deuxième étude avec la molécule 2, nous utiliserons 6 souris saines par dose. Les résultats des études sur les groupes d’animaux traités ou non avec la molécule d’intérêt seront analysés au moyen de tests statistiques paramétriques ou non en fonction de la distribution des données. Ceci permettra de déterminer si le traitement induit des différences significatives.
Raffinement
Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel.
Choix des espèces
Dans le cadre des 2 études, le choix s’est porté sur la souris principalement car il s’agit d’une part d’un modèle mammifère vivant qui présente beaucoup de similitudes avec l’être humain notamment au niveau de la composition et la structure du muscle squelettique. D’autre part, la disponibilité de certains modèles murins de maladies musculaires commerciaux particulièrement d’intérêt dans cette étude ont participé à orienter le choix sur la souris pour ces études précliniques. Par ailleurs, les modèles utilisés sont des modèles transgénique et la souris est un modèle de choix pour la génération de ces derniers. Les animaux seront reçus à l’âge de 4 semaines, ils seront habitués au nouvel environnement pendant une semaine et les premiers tests (comportementaux) commenceront à 5 semaines d’âge. Le traitement quant à lui sera initié à 6 semaines d’âge. Au vue de la physiopathologie étudiée et des études préliminaires avec ces modèles et les drogues choisies, il est important de faire ces études à un âge ou les symptômes sont réversibles et sur des animaux qui sont dans un développement qui sera proche des populations ciblés chez l’humain (adolescent/adulte).
Etude des lésions inflammatoires du cervelet après traumatisme crânien chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
1 182 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures classées sévères et l'autre modérées. Des souriceaux de 7 jours subissent un traumatisme crânien par lâcher de poids sous anesthésie, puis certains une chirurgie crânienne pour imagerie, avant une perfusion intracardiaque mortelle et le prélèvement du cerveau. Le porteur décrit un modèle de traumatisme crânien pédiatrique visant à comprendre l'atteinte du cervelet, et indique que les effets sur la croissance des souriceaux ne sont pas encore décrits ni connus. Il justifie le recours à l'animal par l'impossibilité de reproduire in vitro les interactions entre cellules du cerveau.
Objectifs
Le traumatisme crânien (TC) correspond aux lésions cérébrales traumatiques et aux altérations des fonctions cérébrales qui en résultent. Les TC sont fréquents chez les enfants et sous-diagnostiqués. Le traumatisme crânien pédiatrique est pourtant un enjeu de santé publique et social majeur. En effet, il est potentiellement responsable de troubles cognitifs et comportementaux, d’échecs scolaires puis de désinsertion sociale à l’âge adulte. Alors que le cervelet est rarement touché directement (3,3% des TC), des lésions indirectes provenant de la zone lésée dans le reste du cerveau peuvent être observées, notamment chez l’enfant. Ces atteintes participent aux handicaps moteur et cognitif. En revanche, les mécanismes mis en cause dans la génération de ces lésions sont mal connus et semblent reposer sur l’inflammation qui survient dans le cerveau lors du TC. Notre hypothèse est que le TC, même isolé, peut être à l’origine de lésions du cervelet, à cause de l’inflammation. Nous utiliserons un modèle de TC modéré par lâcher de poids d'une faible hauteur chez le souriceau 7 jours, sous anesthésie générale, pour étudier les phénomènes inflammatoires potentiellement impliqués dans les lésions du cervelet dans les suites de l'impact.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de compendre de manière plus précise comment le traumatisme crânien chez l’enfant peut conduire à des troubles à long terme, et quel rôle le cervelet joue dans ce phénomène. La fonction du cervelet est de plus en plus étudiée, mais la manière dont il participe à certaines maladies neurologiques, ou neurodégénératives, n’est pas encore totalement élucidée.
Procédures
Les souriceaux subiront un traumatisme crânien sous anesthésie générale. Après ce traumatisme, un groupe d’animaux de 10 jours de vie sera anesthésié, et une perfusion intra-cardiaque sera réalisée post-mortem pour éliminer le sang des vaisseaux des organes qui seront prélevés et étudiés post-mortem. Cette perfusion sera également réalisée chez des animaux à 45 jours de vie et à 6 mois, sous anesthésie générale et avec analgésie. Deux groupes de souris, l’un à 45 jours de vie et l’autre à 6 mois subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie pour réaliser des mesures d’imagerie sur le cerveau (durée : une heure maximum). Ces animaux seront ensuite euthanasiés sans réveil.
Impact sur les animaux
Les effets de cette procédure de traumatisme crânien sont partiellement connus . On rapporte ainsi une mortalité́ estimée à moins de 4%, principalement due à un éventuel rejet du souriceau par la mère, ainsi que dans quelques cas par le traumatisme lui-même. La chirurgie crânienne pour l’imagerie peut entraîner dans de rares cas la mort de l’animal. Les effets sur la croissance et le développement des souriceau ne sont pas encore décrits ni connus.
Devenir
L'euthanasie des animaux après imagerie répond à une nécessité d'ordre éthique puisque celle-ci impose une chirurgie au niveau du crane de l'animal, et rend l’utilisation du cerveau impossible pour toute autre analyse. Tous les autres animaux seront euthanasiés et les cerveaux prélevés pour analyses.
Remplacement
L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'implication du cervelet dans l’inflammation du cerveau après traumatisme, et dans le développement de lésions plus tardives. Cela suppose des interactions complexes entre les différents types de cellules qui constituent le cerveau, à savoir les neurones (qui transmettent les informations nerveuses), les microglies (cellules immunitaires du cerveau), les astrocytes (qui contrôlent le métabolisme), et les oligodendrocytes (qui produisent une gaine de protéine autour des neurones). Il y a également une rupture de la barrière hémato-encéphalique, qui filtre habituellement le sang avant qu’il entre dans le cerveau. Cette lésion secondaire au traumatisme est à l’origine d’une communication entre le système immunitaire périphérique (c’est-à-dire les globules blancs qui circulent dans le sang) et le système immunitaire du cerveau. Il n'est pas possible de reproduire ces interactions in vitro, et il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal présentant un cerveau fonctionnel, dont la structure est proche de celle de l'homme pour reproduire ce système.
Réduction
Le nombre d'animaux estimé et les tests statistiques utilisés sont basés sur notre expérience pour ce type d'étude. Ce nombre minimum nous permettra d'être certains de répondre aux questions scientifiques de ce projet. L'analyse statistique de nos données peut nécessiter plus ou moins d'animaux en fonction du type d’analyse réalisé. Pour autant, les tests étant organisés en plusieurs séries, si une différence assez importante pour conclure à un effet réel est observée avant la fin de toutes les séries, les expérimentations seront interrompues.
Raffinement
Hébergement : Les animaux seront hébergés en groupe, en milieu enrichi (sopalin , maisons en plexiglas) pour minimiser leur stress. Dans les jours suivant le traumatisme crânien, on veillera quotidiennement au bien-être des animaux et on surveillera que leur retour au sein du nid se fait bien. Des arbres décisionnels cliniques seront proposés en fonction de l'âge des animaux. Avant sevrage, sur les très jeunes animaux, les soins maternels constituent la meilleure prise en charge de la souffrance chez le souriceau. Après le 15ème jour de vie, une réhydratation sera réalisée si l’animal présente des signes d’inconfort ou de douleur. A partir du sevrage, les douleurs éventuelles seront traitées à l’aide d’un analgésique. En cas d’atteinte des points limites l’animal sera euthanasié. Tous les gestes invasifs (trauma et imagerie) seront réalisés sous anesthésie générale. A la fin de l'étude les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires.
Choix des espèces
Afin d'étudier les interactions entre les cellules du cerveau sur un modèle de traumatisme, il est nécessaire d'utiliser une espèce animale qui présente un système nerveux central proche de celui de l'homme. La souris remplit très bien cette condition. Le modèle de traumatisme crânien utilisé est bien connu développé et étudié au sein de notre laboratoire. Notre objectif étant l'étude du rôle du cervelet dans les lésions induites par un trauma crânien, nous nous intéresserons à 3 temps de vie plus tardifs de nos animaux : 10 jours (petit enfant), 45 jours (jeune adulte) et 6 mois de vie (adulte).
Mise au point d’un modèle de greffe de cellules souches hématopoïétiques dans des souris immunodéficientes BRGS dans le but d’étudier le développement des lymphocytes B
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes immunitaires, dont la rate et les ganglions, la déclaration en comptant 340 en souffrance modérée et 200 en souffrance sévère. Les souris immunocompétentes sont irradiées sur tout le corps, parfois à dose létale, avant une greffe de cellules souches du sang, les souris immunodéficientes BRGS reçoivent des cellules souches humaines, et toutes subissent une prise de sang toutes les quatre semaines. Après une irradiation létale, le porteur cite comme signes possibles un affaiblissement, une perte de poids, une léthargie et un dos courbé, et prévoit la mise à mort au-delà d'un score de grimace de 1,5 ou d'une perte de 20 % du poids. Le but est de repérer des gènes impliqués dans la prolifération des lymphocytes B et de tester l'insertion de gènes d'anticorps dans ces cellules. Pour limiter le nombre de souris, le porteur annonce des groupes de cinq, et prévoit de répéter une expérience quand une différence apparaît sans être significative, "afin d'obtenir une significativité".
Objectifs
Le but de ce projet est double. Tout d'abord un objectif fondamental qui sera d'évaluer le rôle de différents gènes dans le développement et la maturation des lymphocytes B. Cette partie sera réalisée grâce à des cellules souches hématopoïétiques (CSH) murines qui seront immortalisées in vitro. Ainsi, ces CSH murines pourront recevoir à façon des mutations génétiques avant d'être injectées aux souris. Ces dernières auront reçu une forte irradiation afin d'éliminer le système hématopoïétique de la souris. Les CSH ayant la capacité de reconstituer tous les composants du système hématopoïétique, nous pourrons alors suivre dans les souris l'effet des mutations sur le comportement des lymphocytes B. L'objectif étant de repérer les gènes impliqués dans l'hyperprolifération des lymphocytes B, afin de mieux comprendre les mécanismes ayant lieu dans les lymphomes. Ensuite un objectif plus translationnel avec l'évaluation de l'efficacité de l'insertion de gènes d'immunoglobuline dans les lymphocytes B. Les lymphocytes B sont capables de produire des anticorps (appelés aussi immunoglobulines) qui seront spécifiques d'un pathogène ou d'un antigène tumoral donné. Nous voulons donc modifier génétiquement les lymphocytes B ou les CSH humaines afin d'obtenir des lymphocytes B (après reconstitution hématopoïétique dans des souris dans les cas des CSH) qui produiront un anticorps spécifique donné. Pour cela, un gène codant pour une immunoglobuline définie sera inséré soit directement dans des CSH humaines soit dans des lymphocytes B purifiés à partir de souris reconstituées à partir de CSH humaines. Les cellules seront alors reinjectées dans des souris et la production de l'immunoglobuline sera alors monitorée. Les souris utilisées dans ce projet sur les CSH ou lymphocytes B humain sont des souris immunodéficientes (BRGS) qui ne peuvent pas détruire les cellules humaines injectées. Une fois que les CSH sont injectées dans ces souris, elles reconstituent un nouveau système immunitaire humain dans la souris.
Bénéfices attendus
Concernant le projet CSH souris, de nombreux résultats seront attendus sur le rôle de différents gènes dans la survenue de syndromes lymphoprolifératifs (prolifération excessive des lymphocytes) et ainsi une évolution dans la compréhension des leucémies et lymphomes. Pour le projet CSH humain, nous testons la faisabilité d'une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à faire produire par des lymphocytes B une immunoglobuline (anticorps) thérapeutique.
Procédures
Notre modèle de greffe de CSH murines dans des souris immunocompétentes implique une irradiation (parfois à dose léthale) préalable à l'injection des cellules afin d'obtenir une hypoplasie complète. La greffe des cellules se fera ensuite par injection intraveineuse dans la veine caudale. Des prélèvements sanguins itératifs (toutes les 4 semaines) seront ensuite réalisés sur tous les animaux et dans toutes les procédures afin d'évaluer et de suivre la reconstitution au cours du temps. Enfin des immunisations pourront être appliquées sur les animaux en post-greffe si la reconstitution a été jugé optimale.
Impact sur les animaux
Peu de nuisances ou d'effets indésirables sont à attendre à la suite d'injection de cellules souches hématopoïétiques. Les souris seront suivies de façon hebdomadaire afin de repérer tout signe indiquant un inconfort ou une douleur. Des nuisances plus importantes viendront de l'irradiation corps entier léthale. Le développement d'une immunodépression complète induite par l'irradiation léthale peut engendrer un affaiblissement notable de l'animal, c'est pourquoi les souris expérimentées seront observées très régulièrement pour détecter une potentielle absence de reprise de l'hématopoïèse (qui devrait être obtenues suite à la greffe des cellules souches hématopoïétiques murines) avec l'apparition de signes de l'immunodépression (perte de poids, léthargie, dos courbé...).
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêts (organes de l'immunité, ganglions, rate notamment). L'exploration de ces organes est indispensable afin d'apporter des conclusions fiables sur la reconstitution hématopoïètique et sur développement de la réponse immunitaire.
Remplacement
Le projet est basé sur le pouvoir de reconstitution des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Ces dernières sont en effet capables de se différencier en de nombreux précurseurs hématopoïétiques dans la moelle osseuse. Ces précurseurs vont ensuite continuer de se différencier soit dans la moelle osseuse soit dans d’autre organes du système immunitaire et ainsi reconstituer un système immunitaire entier et compétent. Il est actuellement possible de différencier des CSH in vitro mais uniquement vers une voie donnée, ce qui permet d’obtenir qu’un type de cellules immunitaires. Aucun modèle ne permet une différenciation complète des CSH. Seul un environnement complet (moelle osseuse, facteurs de croissance, signaux de survie, organes du système immunitaire…) permettra d’obtenir les conditions idéales pour reconstituer un système immunitaire compétent. C’est pourquoi l’utilisation de souris immunodéficientes ou de souris immunocompétentes irradiées léthalement reste l’unique modèle utilisable aujourd’hui.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (moelle osseuse, rate et sang) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Avant d’aborder les greffes des CSH, le maximum de validation aura été fait in vitro et optimisé en préalable à toute injection chez l’animal (notamment vérification in vitro des mutations après CRISPR-Cas9). Lors de chaque expérimentation, des groupes de 5 souris seront formés afin de comparer les différentes conditions utilisées ou de comparer l'effet des mutations réalisées sur les CSH avant l'injection. Lorsque deux groupes de souris seront comparés, un test de Student (two-tailed) sera utilisé alors qu'un test One-Way ANOVA sera utilisé pour comparer plusieurs groupes ensemble. Si une différence apparaît mais qu'elle n'est pas significative, l'expérimentation sera répétée afin d'obtenir une significativité.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage. Aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Également, afin de raffiner les conditions de vie des souris, des soins adaptés sont mis en place afin de permettre une bonne récupération des animaux et un suivi optimal est instauré afin de soulager voire supprimer l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Le raffinement est aussi obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel. Toutes les procédures ne seront réalisées que par des personnes ayant une excellente maîtrise des gestes. Les animaux seront suivis quotidiennement selon une surveillance de l’état général des animaux (posture et comportement) par le personnel de l’établissement ou le responsable du projet. De plus, une surveillance hebdomadaire sera réalisée par le responsable du projet selon les mêmes critères généraux cités précédemment en plus de critères spécifiques: suivi du poids et mesure du score grimace permettant d’évaluer l’état de santé des animaux. Le « score de grimace » (MGS) (Langford et al. 2010, Nature Methods) correspond a une échelle permettant d’évaluer la douleur chez l’animal, en particulier chez la souris. Cinq paramètres sont évalués et un score allant de 0 (normal) à 2 (modification sévère) est attribué pour chaque paramètre : ouverture des yeux, gonflement du museau, gonflement des joues, position des oreilles, position des moustaches. Si le MGS excède 1.5, les animaux seront alors euthanasiés. Également si la perte de poids excède 20% du poids de référence alors les animaux seront alors euthanasiés. Si des effets secondaires ou signes d'inconfort non soulagés par l’administration de buprénorphine (buprénorphine 0.1 mg/kg en sc, aiguille 30G) ainsi que des changements perceptibles (aspect, comportement, poids, isolement dans la cage, déplacements limités) sont observés, les animaux seront alors euthanasiés.
Choix des espèces
Les souris BRGS (BALB/c_RAG2-/- IL2GammaC-/-_SIRPA.NOD) choisies pour ce projet sont complètement dépourvues de lymphocytes T, B et de cellules NK, ce qui permet donc d'éviter le rejet de la xénogreffe de cellules humaines. Ces souris permettent la croissance de nombreuse lignées lymphoïdes humaines et l'utilisation d'effecteurs d'origine humaine. Elles sont donc parfaitement adaptées à la nature de ce projet de par leur taux élevé́ de prise de xénogreffes. Cependant, l’utilisation d’animaux immunodéprimés exposent au risque de l’expression d’un phénotype dommageable car les souris ne sont plus capables de combattre les pathogènes environnementaux. Ce risque sera parfaitement maîtrisé par la mise en place de précautions sanitaires adaptées. Le maintien de ces souris en hébergement protégé de type A2 permettra de prévenir tout risque d’infection. Les utilisateurs se muniront d'une combinaison recouvrant tout le corps ainsi que d'un masque chirurgical et d'une 2eme pair de gant. Enfin, les souris seront manipulées sous hotte à flux laminaire. L’expérimentation sera commencée chez des animaux de 5 semaines à 3 mois. La durée de l’expérimentation chez ces animaux n’excèdera pas 6 mois.
Caractérisation des lésions vasculaires induites par l’infection de SARS-CoV-2 dans un modèle murin humanisé et nouvelles approches thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour exprimer le récepteur humain ACE2, elles sont infectées par le SARS-CoV-2 par voie nasale ou intraveineuse, reçoivent des injections intrapéritonéales et subissent des prélèvements de sang au sinus rétro-orbital, pour étudier les atteintes vasculaires de la Covid-19. Le porteur indique que l'infection peut provoquer microthromboses, perte de poids de 10 à 20 pour cent et anomalies de comportement, les souris perdant plus de 20 pour cent de leur poids étant mises à mort. Il présente les retombées thérapeutiques comme des pistes et reconnaît utiliser en parallèle des cultures de cellules humaines, tout en affirmant que l'étude ne peut être menée sans administration du virus à l'animal vivant.
Objectifs
La COVID-19 est une maladie virale aiguë causée par le coronavirus de type 2 du syndrome aigu respiratoire sévère (SARS-CoV-2). Le premier site d'infection chez les patients atteints de la COVID-19 est l'appareil respiratoire. Le SARS-CoV-2 infecte les cellules de la muqueuse nasale en se liant à une enzyme appelée ACE2. Outre le poumon, une atteinte multi-organes a été décrite dans les formes graves de la COVID-19, témoignant d’une diffusion du virus dans l’ensemble de l’organisme. Les examens anatomiques après le décès des patients atteints de la COVID-19 ont mis en évidence une atteinte isolée ou prédominante des cellules endothéliales (cellules qui tapissent l’intérieur des vaisseaux en contact avec le sang). Cette atteinte se caractérise par l’apparition de petits caillots sanguins, perturbant l’apport sanguin dans les tissus en aval. Bien que mal comprises, ces observations impliquent fortement les cellules endothéliales dans les atteintes multi-organes sévères de la COVID-19. Plusieurs études scientifiques attestent de la pertinence et de l’intérêt des modèles rongeurs pour l’étude de l’infection SARS-CoV-2, la compréhension des mécanismes responsables de la COVID-19 et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques. La souris n’est naturellement pas sensible à l’infection SARS-CoV-2 car l’ACE2 murine ne reconnait pas le SARS-CoV-2. Afin d’étudier l’infection SARS-CoV-2 chez la souris, un modèle murin de souris humanisée pour l’ACE2 humaine a été développé permettant d’exprimer l’ACE2 humaine en lieu et place de l’ACE2 murine dans un tissu que nous choisissons. Deux modèles de souris transgéniques ACE2 humanisées ont ainsi été générées : 1. une souris humanisée exprimant l’ACE2 humaine dans toutes les cellules de l’organisme et 2. une souris humanisée exprimant l’ACE2 humaine uniquement dans les cellules endothéliales vasculaires de la souris. En utilisant ces deux modèles, notre projet a pour objectifs : 1) d’établir les conditions expérimentales de l’infection au SARS-CoV-2 en utilisant des doses croissantes de virus à court terme, 2) de caractériser les atteintes des petits et gros vaisseaux par le SARS-CoV-2 à long terme, et 3) d’évaluer l’efficacité d’un traitement visant à diminuer les atteintes vasculaires liées à l’infection SARS-CoV-2 à long terme.
Bénéfices attendus
L’étude chez le rongeur des infections à SARS-CoV-2 est déterminante pour l’élaboration de stratégies de lutte contre la COVID-19 et de ses formes graves. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt d’urgence et de priorité nationale du gouvernement et des organismes publiques de recherche en regard de la pandémie mondiale de la COVID-19. Ce travail offrira une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels l’infection SARS-CoV-2 altère la fonction endothéliale, conduit à une atteinte vasculaire multi-organes et offrira de nouvelles pistes de traitements pour lutter contre les atteintes vasculaires graves de l’infection SARS-CoV-2.
Procédures
Pour la réalisation des infections virales, les animaux seront anesthesiés sous anesthesie générale et soumis à des injections intranasales ou intraveineuses du SARS-CoV-2. Les administrations des molécules pharmacologiques à visée thérapeutique seront réalisées par voie intrapéritonéale chez la souris vigile. Les prélèvements sanguins seront réalisés au sinus rétroorbital sous anesthésie générale et collyre anesthésique. La durée de chaque intervention décrite est inférieure à 1 minute.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : 1. Anesthésie à l'isoflurane pour l'infection SARS-CoV2 (variant français du Wuah, D614G ou variant Omicron B.1.1.529) = stress léger de la contention et de l'anesthésie (dont le reveil) 2. Administration du virus par voie intranasale = stress et inconfort légers de l'animal 3. Administration du virus par voie intraveineuse = stress et douleur légère de la piqure de l'aiguille 4. Prélèvement de sang au niveau du sinus rétro-orbital de l'animal anesthésié sous isoflurane = stress léger de la contention et de l'anesthésie (dont le réveil), douleur légère possible au reveil 5. Atteintes macro- et micro-vasculaire du SARS-CoV-2 = douleur legère à modérée notamment en cas de microthrombose vasculaire et d'altérations locales de l'apport sanguin pouvant conduire à une perte de poids (de 10 à 20%), une altération de l'apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale) ou un comportement anormal (mobilité réduite, agressivité) de l'animal.
Devenir
La mise à mort des animaux à la fin de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques et moléculaires nécessaires pour atteindre les objectifs de notre étude.
Remplacement
L’étude de l’infection SARS-CoV-2 ne peut être menée sans avoir recours à l’administration du virus à l’animal vivant. De plus notre projet s’intéresse à l'évolution des atteintes tissulaires sur le long terme (2 mois post-infection) de la COVID-19 et aux variations de sensibilité de l’infection SARS-CoV-2 avec l’âge (souris jeunes vs âgées) qui ne peuvent être mimées in vitro. En revanche, des résultats préliminaires de notre laboratoire montrent que le récepteur ACE2 (porte d'entrée du virus dans l'organisme) est fortement exprimé à la surface des cellules endothéliales qui bordent l'intérieur des vaisseaux à l'échelle des petits et des gros vaisseaux chez la souris. La culture cellulaire de cellules endothéliales humaines restera un outil que nous utiliserons au cours de ce projet pour des tests viraux et fonctionnels préliminaires et complémentaires à l’utilisation des souris.
Réduction
Dans le but de suivre le principe des 3R et de réduire l’utilisation excessive d’animaux, le nombre d’animaux par groupe a été calculé sur la base de notre expérience acquise précédemment et de protocoles publiés. Un des enjeux est de pouvoir obtenir suffisamment de matériels biologiques pour réaliser l’ensemble des analyses prévues. Dans notre expérience, des groupes infectés de 6 animaux pour les études virologiques à court terme et de 10 animaux pour les études histologiques et moléculaires à long terme sont suffisants pour répondre à nos questions scientifiques. De le même façon, un nombre d’animaux de n=4 est amplement suffisant pour les groupes non infectés contrôles.
Raffinement
Pour minimiser le stress des animaux, l'inoculation intranasale ou intraveineuse du virus sera réalisée sur des souris anesthésiées. Après l'infection, une surveillance quotidienne effectuée par une personne compétente sur le projet nous permet de savoir si un animal souffre et ainsi de pouvoir envisager une mort anticipée. La mort anticipée sera envisagée sur l'animal a une perte de poids de plus de 20% et présente également une altération de son apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale) et/ou un comportement anomal (mobilité réduite, agressivité). Dans notre expérience, passées les premières 72h post-infection, il est rare d’observer des signes de souffrance chez l’animal.
Choix des espèces
La souris a l’avantage indéniable de permettre l’utilisation de lignées génétiquement modifiées afin d'identifier les mécanismes responsables des effets délétères de l’infection SARS-CoV-2. Elle constitue également un outil essentiel pour la recherche par sa facilité de manipulation, sa petite taille et ses cycles de reproduction courts. Les souris transgéniques humanisées pour l'ACE2 humaine développées pour ce projet seront sensibles à l’infection SARS-CoV-2 du fait de l’expression du récepteur humain du SARS-CoV-2 et permettront de mieux comprendre les atteintes vasculaires multi-organes de l’infection SARS-CoV-2. Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris mâles agées de 6 semaines ou de 8 mois pour répondre à la question de l’influence de l’âge sur le risque accru d’atteintes vasculaires de l’infection SARS-CoV-2.
Exploration chez la souris des mécanismes cellulaires impliqués dans le déconditionnement musculaire, le vieillissement et les mécanismes de protection induits par l’activité physique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'un anti-inflammatoire et d'un inducteur de mutation, sont soumises à des tests d'effort sur tapis roulant jusqu'à l'épuisement et à des périodes d'isolement en cage métabolique pouvant provoquer perte de poids et détresse, pour étudier la fonte musculaire liée aux traitements anti-inflammatoires et au vieillissement. Le porteur reconnaît que l'isolement est stressant mais le juge obligatoire pour mesurer l'activité de chaque souris. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut créer des fibres musculaires adultes et conclut que l'étude ne peut être conduite qu'in vivo.
Objectifs
Le projet se propose de mettre en évidence les mécanismes cellulaires impliqués dans les pertes de masse et de fonctions musculaires induites par les traitements aux antiinflammatoires et le vieillissement ainsi que les mécanismes de protection induit par l’activité physique (endurance et résistance). Le muscle squelettique est composé de fibres à contraction lente, peu fortes et résistantes à la fatigue et des fibres de types rapide, très forte et très fatigables. Basés sur la littérature nous faisons l’hypothèse que : i) les fibres rapides sont plus sensibles à l’atrophie et résistantes à l’hypertrophie , ii) que la sédentarité est un facteur aggravant la perte de masse musculaire, iii) inversement, l’entraînement d’endurance protégerait le muscle de la perte de masse musculairet et favoriserait l’hypertrophie , iiii) une souris génétiquement modifiée qui possède des caractéristiques de souris entraînées va être moins vulnérable face à la perte de masse musculaire et plus sensible à l’hypertrophie induite par les efforts de force et de résistance. Nous proposons ensuite de décrire les mécanismes moléculaires . Nous étudierons également l’effet de l’activité et de la sédentarité exacerbée sur l’atrophie des fibres rapides et la mort des neurones moteurs au cours de la perte de masse musculaire liée à l'âge.
Bénéfices attendus
Ce projet aura pour but de mettre en évidence les mécanismes mis en jeu dans la prévention du déconditionnement musculaire induit par un traitement anti-inflammatoire très utilisé chez l’homme. En effet il est connu que le déconditionnement musculaire peut être un facteur d’aggravation de certaines pathologies, ainsi la compréhension des mécanismes de déconditionnement musculaire est de nos jours d’un intérêt socio-économique très important. C'est la raison pour laquelle ce projet est financé en partie par L'Assication Française contre les myopathies. D’autres parts ce projet permettra de mettre en évidence des mécanismes expliquant la mort spécifique des fibres musculaire de type II (permettant les contractions rapides) lors du vieillissement.
Procédures
Les souris subiront les injections de l'inducteur de la mutation génétique et de l'antiinflammatoire. Une contention courte sera effectuée lors de la mise en évidence du rapport de masse maigre/masse grasse par IRM. Les animaux seront soumis à un isolement durant leur entraînement et lors de l’analyse métabolique. L'analyse métabolique n’induit pas de douleur à l’animal, elle ne nécessite pas de médicamentation. Elle est non invasive pour l’animal et limite au maximum le stress de l’animal. Les animaux seront monitorés et pesés: 3 fois/ semaine (2 minutes/animal) lors de l'individualisation, puis 1 fois à l'entrée et à la sortie des cages calorimétriques. Leur composition corporelle analysée (3 minutes/animal) de manière non invasive 1 fois au début de l'individualisation puis à l'entrée et à la sortie des cages calorimétriques.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances vont être : le test de capacités fonctionnelles sur les tapis et l’isolement dans les cages métaboliques qui pourraient engendrer du stress chez les animaux, l’injection intra-péritonéale de l'anti-inflammatoire. Les effets indésirables pour le test d’activité sur tapis roulant peuvent être: l’épuisement de l’animal, une blessure à la patte. Les effets indésirables de l’isolement peuvent être: la perte de poids et la détresse. Les effets indésirables du traitement avec l'anti-inflammatoire sont les modifications de poids et de comportement, ces derniers seront vérifiés tous les jours lors du traitement à l'antiinflammatoire qui sera arrèté si un changement important de comportement est observé. Les animaux seront soumis à un isolement. L’analyse métabolique n’induit pas de douleur à l’animal, elle ne nécessite pas de médicamentation. Elle est non invasive pour l’animal et limite au maximum le stress de l’animal. Aucun prélèvement n'auront lieu sur animal vigile.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Nous avons besoin de réaliser des expériences dans un modèle de souris où un gène d’intérêt pour le contrôle génétique de l'expression des différents types de fibres musculaires a été invalidé. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude des effets dépendant du type de fibre musculaire. En effet aucun modèle in vitro à ce jour peut créer des fibres musculaires adultes compte tenu que la formations fibres sont dépendantes des autres cellules de l'organiqme.
Réduction
Les tests statistiques utilisés dans ce projet seront choisis afin de mettre en évidence les effets de l'activité par rapport à la sédentarité ou bien les effets de la modification génétique du type de fibres afin de contrer les effets des anti-inflammatoires. Ensuite chacun des sous groupes seront comparés deux à deux. Les différences seront considérées comme significatives pour une valeur de p
Raffinement
Les animaux isolés en cages métaboliques ou durant la période de 8 semaines d'entraînement auront pour enrichissement la présence de roues dans les cages. L'isolement est obligatoire pour notre expérience car nous devons être sûrs de mesurer l'activité de chaque souris. La période de familiarisation au tapis de course permettra réduire le stress des animaux lors des tests. Lors de l'exercice les souris seront en permanence sous la surveillance de l'expérimentateur qui arrêtera le tapis lorsque la souris se laisse emporter par le tapis trois fois de suite et ne peut plus le remonter. Le tapis sera arrêter si la souris semble gênée dans sa course et qu'elle semble s'être blessée à la patte. Par expérience avec ce tapis de course nous n'avons jamais vu de blessure, cependant dans le cas où cela arriverait elle sera soignée avec de la bétadine et recommencera le test une fois la blessure cicatrisée ou bien retirée du protocole. La déxaméthasone induit une perte de masse musculaire et donc une perte de poids qui est l'effet escompté. Les souris seront réunies par cages de 4 après l'activité pour le traitement à l'anti-inflammatoire afin de ne plus subir l'isolement car il n'est plus nécessaire pour ces expériences. L’enrichissement consistera à placer des nids végétaux, des maisonnettes et bâtonnets à ronger dans les cages. Le comportement général des animaux sera suivi.
Choix des espèces
L’atrophie musculaire induite par les antiinflammatoires et l'adaptation à l'exercice d'endurance (présentes chez l’homme) sont bien démontrées dans le modèle souris. La souris modifiée génétiquement , choisie pour cette étude, est connue pour mimer naturellement en partie les caractéristiques musculaires liées à un entraînement d'endurance. Leur utilisation nous permettra de mieux comprendre les effets de l'activité physique sur la réponse aux traitements aux antiinflammatoires. Les animaux sont utilisés au stade adulte (8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. En effet, il a été démontré que chez la souris la structure musculaire adulte est observée dans les 7 à 8 semaines après la naissance. D'autre part, des souris âgées (24 mois) seront utilisées dans un deuxième temps. Il a été montré qu’à cet âge les mécanismes induisant le dysfonctionnement musculaire.
Évaluation de l’efficacité de candidats vaccins recombinants contre le COVID-19, la grippe et la rage, basés sur le vaccin vivant contre la rougeole
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
3 930 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales, intramusculaires, intranasales ou intracérébrales de candidats vaccins ou de virus d'épreuve, dont la grippe et la rage qui peuvent provoquer une pneumonie et une perte de poids jusqu'à 25 %, voire la mort. Le projet évalue chez la souris des vaccins recombinants contre le COVID-19, la grippe et la rage, dérivés du vaccin contre la rougeole. Le porteur indique qu'aucun animal ne peut être réutilisé ou sorti de l'animalerie confinée, et affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit l'interaction hôte-pathogène.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de réaliser l’évaluation préclinique chez la souris de candidats vaccins élaborés dans notre laboratoire. Ces candidats vaccins sont dérivés du vaccin vivant atténué contre la rougeole, qui est l’un des vaccins humains les plus sûrs et efficaces. Pour bénéficier des grands avantages de ce vaccin, nous développons des nouveaux vaccins recombinants ou chimériques construits à partir du génome de la souche Schwarz du virus vaccinal de la rougeole (MV) qui est modifiée pour exprimer un ou plusieurs antigènes des agents pathogènes ciblés. Ces antigènes sont exprimés à partir d’unités additionnelles de transcription (stratégie vaccin recombinant) ou à la place d’antigènes du vaccin contre la rougeole (stratégie vaccin chimère). Ces stratégies ont déjà fait l’objet de nombreuses publications scientifiques par notre équipe et par d’autres. Plusieurs programmes sont poursuivis en parallèle dans le laboratoire. Dans ce projet, nous développons des vaccins recombinants ou chimériques MV-COVID, MV-grippe et MV-rage. Pour chacun des agents pathogènes ciblées, une série de plusieurs candidats vaccins sont construits, produits et caractérisés en faisant varier le choix et la forme des antigènes vaccinaux, la conception du/des transgènes et leur insertion dans le génome de la souche Schwarz avant l’étude in vivo. Les candidats vaccins sont évalués pour leurs capacités immunogènes et protectrice chez des souris de laboratoire ou des souris génétiquement modifiées qui présentent une meilleure susceptibilité aux faibles doses à l’infection par les souches atténuées du virus de la rougeole. En fonction des résultats obtenus chez la souris, des séries successives de candidats vaccins sont produites afin d’aboutir à la sélection d’un ou deux candidats par pathogène ciblé. Cette sélection réduite fera l’objet d’une validation préclinique complémentaire chez le primate non humain puis d’études cliniques chez l’homme.
Bénéfices attendus
Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins prophylactiques efficaces et améliorés contre plusieurs pathologies infectieuses graves.
Procédures
Une identification par marquage à l’oreille (quelques secondes) en début d’expérimentation. Une à trois administrations de substance par injection intrapéritonéale / intramusculaire sur animaux vigiles (20 secondes) ou instillation intranasale (60 secondes) sur animaux préalablement anesthésiés par injection intrapéritonéale (20 secondes), avec des intervalles de 1 mois. Alternativement, une à deux administrations de substance par injection intrapéritonéale / intramusculaire sur animaux vigiles (20 secondes) puis une seule injection intracérébrale (20 secondes) sur animaux préalablement anesthésiés par injection intrapéritonéale (20 secondes), avec des intervalles de 1 mois. Une à trois prises de sang (10 secondes), avec des intervalles de 1 mois.
Impact sur les animaux
Selon notre expérience antérieure, l'injection de vecteurs dérivés du vaccin vivant atténué contre la rougeole n’induit aucun signe clinique chez les souris. Il en est de même pour l’inoculation par voie intranasale du vecteur Ad5-hACE2 suivie de celle du SARS-CoV-2. A l’opposé, l’inoculation de virus grippaux H1N1/H3N2 adaptés à la souris, du virus H1N1 pandémique (2009) ou du virus de la rage (souche CVS) peuvent provoquer une maladie symptomatique, entraînant potentiellement la souffrance. Les virus grippaux induisent une pneumonie virale primaire de symptômes modérés à sévères selon la souche et la dose d’épreuve utilisée, dont les manifestations cliniques vont d’une gêne respiratoire / mobilité réduite / perte de poids transitoire à la mort. La perte de poids peut être importante, jusqu’à 25% du poids d’une souris mâle adulte, tout en restant transitoire et en l’absence de toute autre manifestation clinique chez des souris vaccinées. Le virus de la rage est fortement neurotrope et induit une encéphalite létale après inoculation intracérébrale à la souris, dont les premières manifestations cliniques peuvent être la perte de poids, l’ataxie, un comportement agité et rotatoire, un manque de coordination des pattes et la paralysie. L’inoculation intramusculaire périphérique (membre inférieur) peut provoquer une neuropathie et/ou une paralysie progressive à mesure que le virus progresse vers le système nerveux central (SNC), puis une encéphalite ultimement létale. Pour éviter que les animaux souffrent, des points limites seront établis préalablement à la réalisation des expériences et les animaux seront mis à mort immédiatement après avoir atteint ces points.
Devenir
Une grande partie des animaux seront mis à mort afin d’être prélevés de multiples organes nécessaires pour l’évaluation de l’efficacité des candidats vaccins. Tous les autres animaux survivants seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils auront été immunisés par des vaccins vivants recombinants ou infectés par des virus d’épreuve pathogènes pour l’homme dans une animalerie confinée (A3) : il n’est donc pas possible de les réutiliser dans d’autres projets ou de les transférer en dehors de l’animalerie.
Remplacement
Ce programme préclinique est au centre de l’activité de notre équipe. Il est primordial car il produit les premières preuves de concept de l’immunogénicité et de l’efficacité des candidats vaccins qui déterminent les phases ultérieures du développement, susceptibles de produire des nouveaux vaccins humains. Aucun système in vitro ne permet à ce jour d'englober tous les aspects de l'interaction hôte-pathogène qui aboutissent à l’induction d’une réponse immunitaire par les candidats vaccins vivants puis à la protection contre l’infection pulmonaire par les coronavirus ou les virus grippaux ou contre l’infection du système nerveux central par le virus rabique. En particulier, l'évaluation de l'impact vaccinal sur le contrôle de la charge virale et l’appréciation de l’histopathologie des organes cibles ne peuvent se réaliser que dans des modèles in vivo pertinents qu’il n’est à l’heure actuelle pas possible de remplacer par des essais in vitro. Par ailleurs, avant d’entreprendre des études cliniques de phase 1 permettant de cerner l’éventuelle toxicité d’un produit vaccinal administré à l’homme ou de phase 2 permettant d’évaluer son efficacité, c’est une obligation des agences règlementaires de procéder à des études précliniques chez l’animal. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme.
Réduction
Sur la base de discussion avec un biostatisticien, et des tests statistiques appropriés, nous avons planifié d’inclure le nombre minimal d’individus par groupe expérimental qui permette une analyse statistique pertinente et concluante. Pour calculer la taille des groupes de souris injectées par les candidats vaccins, nous avons utilisé les moyennes et écart-types géométriques d’expériences antérieures obtenues dans un projet précédent. Les tests considérés sont un test de comparaison de deux moyennes indépendantes pour comparer 2 groupes et un test Anova à un facteur suivis de tests multi-comparaisons pour comparer plusieurs groupes. Grâce à ces données, un logiciel statistique a déterminé la taille optimale des groupes pour un risque alpha de 5% et une puissance de 80-90% : le nombre d’animaux sera ainsi réduit à 6 pour les études d’immunogénicité et 7 pour les études de protection. Par ailleurs, nous utiliserons un modèle d’épreuve par le SARS-CoV-2 déjà mis au point qui ne nécessitera pas de mise au point supplémentaire pour le choix des doses.
Raffinement
Les opérations de vaccination, d’infection, de prélèvement de sang, ainsi que la mise à mort et le prélèvement d’organes seront réalisés par des expérimentateurs formés. La cage des animaux comportera, comme élément d’enrichissement, du coton dentaire, pour que les animaux puissent construire un nid et, dans le cas des animaux infectés, du Diet Gel pour faciliter la prise de nourriture et l’hydratation. La température dans la cage d’animaux infectés sera améliorée au début des symptômes cliniques. Une évaluation clinique sera mise en place à raison de 2 fois par semaine dans le cas des animaux immunisés avec les vaccins rougeole recombinants et une évaluation quotidienne dans le cas des animaux infectés. Si les animaux deviennent cliniquement malades, leur souffrance sera abrégée par leur mise à mort. Selon notre expérience antérieure, l'injection de vecteurs dérivés du vaccin vivant atténué contre la rougeole n’induit aucun signe clinique chez les souris. Il en est de même pour l’inoculation par voie intranasale du SARS-CoV-2 jusqu’au 4ème jour après l’épreuve où les animaux seront mis à mort pour le prélèvement des organes. Pour les procédures d’épreuve de classe sévère (virus grippaux, virus de la rage), nous prendrons soin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux : tout en respectant les conditions qui permettent au projet de recherche d’atteindre ses objectifs, nous définirons à l’avance des points limites spécifiques de chaque agent infectieux et les animaux seront mis à mort dès que les points limites seront atteints.
Choix des espèces
Le virus de la rougeole (sauvage ou vaccinal) n’infecte efficacement que les primates. Un modèle rongeur pertinent a donc été développé. Les souris déficientes pour le gène du récepteur d’un médiateur de l’inflammation, les interférons de type I (IFNAR) sont susceptibles à l’infection par les souches vaccinales du virus de la rougeole. Elles peuvent également exprimer le récepteur humain de ce virus, améliorant encore leur susceptibilité aux faibles doses. Nous pensons que certains candidats vaccins basés sur le vaccin contre la rougeole seront capables de se multiplier chez la souris non génétiquement modifiée . Dans ce cas, nous aurons principalement recours à plusieurs lignées de souris de laboratoires qui sont des modèles reconnus pour le SARS-CoV-2, les virus grippaux et le virus rabique. Des souris de 5-7 semaines d’âge seront commandées. Après une semaine de stabulation, les souris seront immunisées pour l’étude de l’immunogénicité des vecteurs vaccinaux ou immunisées et infectées pour l’évaluation de l’efficacité vaccinale. Il est admis qu’à partir de l’âge de 6 à 7 semaines, le système immunitaire de ces petits rongeurs est considéré comme mature et que les réponses immunitaires induites peuvent être considérées comme comparables à celles induites pendant leur vie d’adulte.
Identification des réseaux neuronaux impliqués dans la douleur cornéenne grâce à l’imagerie fonctionnelle ultrasonore, chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
260 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. On leur induit une douleur cornéenne chronique, soit par excision des glandes lacrymales sous anesthésie, soit par dépôt répété de chlorure de benzalkonium, avant imagerie fonctionnelle du cerveau et prélèvement. Le projet vise à identifier les réseaux neuronaux de la douleur cornéenne, que le porteur décrit lui-même comme provenant du "générateur de douleur le plus puissant" de l'organisme. Il affirme que cette douleur chronique ne peut être modélisée qu'au niveau de l'animal entier.
Objectifs
La cornée est le tissu le plus innervé de l’organisme et le générateur de douleur le plus puissant. La sécheresse oculaire est une pathologie liée à une diminution de la production de larmes. Elle engendre des douleurs, picotements, sensation de brûlure oculaire et sensibilité à la lumière (photophobie) avec des atteintes cornéennes. C’est une douleur chronique qui affecte de façon dramatique la qualité de vie des patients (anxiété, dépression) et qui en fait l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie. Les douleurs oculaires sub-aigües et chroniques sont les plus difficiles à traiter notamment car les circuits neuronaux impliqués sont encore très mal identifiés en raison des difficultés techniques en recherche préclinique où l’étude des réseaux neuronaux chez le petit animal reste complexe. Ce projet a pour but de mettre en évidence et mieux comprendre les réseaux de neurones et leurs dysfonctionnements en lien avec une douleur cornéenne chronique et sub-aigüe. A cette fin, nous enregistrerons les activités cérébrales suite à des stimulations cornéennes, dans des modèles murins d’une douleur oculaire sub-aigüe ou d’une douleur oculaire chronique.
Bénéfices attendus
La prise est charge de la douleur oculaire est actuellement un enjeu majeur alors que les traitements restent peu efficaces notamment dans le cadre de douleurs sub-aigües ou chroniques. Le bénéfice attendu de ce projet est d’aboutir à une meilleure caractérisation des circuits neuronaux de la douleur cornéenne et de permettre d’améliorer notre compréhension de ses mécanismes d’initiation et de maintien, encore largement inconnus, afin de faire le lien entre manifestations cliniques et mécanismes neurologiques fin de développer des traitements réellement efficaces.
Procédures
Les animaux subiront soit une chirurgie pour le modèle de sécheresse oculaire par défaut de production de larmes soit le dépôt d’une goutte de chlorure de benzalkonium pour le modèle de douleur oculaire inflammatoire. Ils seront ensuite passés en imagerie fonctionnelle ultrasonore puis les cerveaux seront prélevés. Deux modèles animaux seront utilisés dans ce projet : 1) Modèle de sécheresse oculaire par défaut de production de larmes Les animaux développant une sécheresse oculaire sont des modèles d’une maladie humaine. Elle sera induite chez l’animal par excision des glandes lacrymales. Il s’agit d’une douleur cornéenne difficile à soigner. Les animaux sham subiront la chirurgie sans excision et donc ne développeront pas la maladie. Les animaux « naïfs » ne subiront aucune chirurgie. La chirurgie se fait sous anesthésie générale avec une analgésie appliquée en pré-, per- et post-opératoire. La chirurgie ne se fait que sur un des deux yeux. Elle dure 15 minutes et n’est réalisée qu’une seule fois par animal. Les animaux seront suivis régulièrement après la chirurgie pour vérifier leur état général (poids) et l’état de la plaie. 2) Modèle de douleur oculaire inflammatoire par instillation du chlorure de benzalkonium Les animaux contrôles de ce modèle recevront une goutte deux fois par jour de tampon phosphate salin (solution neutre) dans l’œil droit durant 7 jours. Les animaux modèles recevront une goutte de chlorure de benzalkonium deux fois par jour dans l’œil droit durant 7 jours. Le dépôt de la goutte se fait sur un animal vigile en contention manuelle et le temps pour réaliser le dépôt et la contention de l’animal est de 20 secondes. Ces animaux modèles développeront une douleur oculaire. - IMAGERIE fUS : L’ensemble des animaux auront une session d’imagerie fonctionnelle ultrasonore qui durera 2h par animal et qui se fera sous anesthésie générale. L’ensemble des tests réalisés durant l’imagerie seront donc fait sous anesthésie générale. Toutes les procédures comprennent une euthanasie qui sera réalisé selon une méthode réglementaire effectuée sous anesthésie générale et analgésie.
Impact sur les animaux
- Dans le modèle de sécheresse oculaire, Les nuisances attendues seront celles observées dans la sécheresse oculaire à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brulure, de corps étrangers dans l’œil, une sensibilité accrue à la lumière. Toutes ces manifestations sont imputables à la composante inflammatoire de la maladie. La chirurgie qui permet de mettre en place le modèle de sècheresse oculaire entrainera une douleur post-opératoire qui disparaitra en quelques jours. La douleur post-opératoire sera prise en charge par un traitement adapté. - L’instillation topique bi-quotidienne du chlorure de Benzalkonium durant 7 jours correspondent classiquement aux traitements (collyres) donnés aux patients en clinique humaine. C’est un conservateur. Son application topique sur le long terme est connue en clinique humaine pour être toxique pour la surface oculaire et engendrer des gènes ou des irritations : sensation de corps étranger, de picotement ou brûlure, d’œil sec voir une inflammation d’intensité variable. - Imagerie fUS : l’anesthésie prolongée des animaux pourrait induire des effets indésirables notamment sur les constantes vitales de l’animal : température, fréquences cardiaques et respiratoires.
Devenir
Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires ce qui implique l’euthanasie des animaux par une procédure réglementaire à la fin de chaque procédure.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants se justifie par la nécessité de mettre en évidence des circuits neuronaux complexes impliqués dans la douleur cornéenne et qui impliquent l’ensemble de l’encéphale. Le modèle que nous utilisons ne peut pas être remplacé par une approche alternative in-vitro car la douleur cornéenne chronique est une pathologie complexe qui ne peut être modélisée qu’au niveau de l’animal entier. Une approche intégrative sur l’animal entier reste incontournable. Notre projet de recherche porte sur les l’étude de réseaux neuronaux complexes présents dans un cerveau entier. Bien que ces questions soient posées pour aider à une meilleure compréhension des pathologies humaines et l’amélioration de leur traitement, une première étape nécessite l’utilisation de rongeurs.
Réduction
Nous utiliserons 260 animaux dans ce projet. Afin de respecter la règle de réduction, nous utiliserons un nombre limité de souris et de groupes tout en gardant la significativité des résultats via une analyse statistique adaptée. Ce nombre sera gardé le plus petit possible et a été estimé grâce aux outils disponibles de calcul de puissance statistique.
Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. L’hébergement des animaux est effectué en confinement adapté à la stabulation de lignés de souris. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compacté, tube en carton) et maintien des animaux en groupe de 5 congénères afin d’éviter le stress de l’isolement. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. La température de la zone d’hébergement est maintenue à 22+/-2 degrésCelsius et suit un cycle d’éclairage non inversé 12h jour et 12h nuit. Les animaux seront observés et manipulés quotidiennement afin de minimiser le stress et la douleur qui seront évalués à l’aide de points limites (grille de suivi). Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons définie. L’application de cette échelle permettra de modifier la procédure en cours avec l’administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou enfin de mettre à mort l’animal en dernier recours. Pour éviter toute souffrance les procédures de chirurgie se feront sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique en pré-, per- et post-opératoire. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes. Si un animal anesthésié (chirurgie ou imagerie fonctionnelle ultrasonore fUS) présente une détresse respiratoire ou cardiaque ou s’il se trouve en hypothermie, nous procéderons à un arrêt immédiat du protocole en cours et en l’absence de rétablissement l’euthanasie de l’animal sera envisagée par l’administration d’une dose létale d’euthanasiant chimique.
Choix des espèces
Dans la littérature, les modèles de douleur oculaire ont majoritairement été développés chez des souris mâles et femelles adultes. Ce projet de recherche portant sur la douleur oculaire nécessite d’utiliser des animaux adultes, âgés de plus de 6 semaines dont les circuits neuronaux sont établis. Les animaux arriverons donc à l’âge de 7 semaines dans notre animalerie. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation de 7 jours. Le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l'animal de choix car (1) elle possède les structures cérébrales adéquates, (2) nous avons accès à tous les outils génétiques requis.
EU1/2: Evaluation immunopathologique de l’impact de la comorbidité cardiovasculaire sur le développement d’une forme grave de la Covid-19.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
180 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent l'implantation chirurgicale d'une mini-pompe qui induit une hypertension et une insuffisance cardiaque, puis une infection au SARS-CoV-2 par voie intranasale, avec échographies et prélèvements sanguins. Le porteur indique que les souris sont transférées vivantes à des partenaires avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Il présente ce modèle comme une future plateforme d'évaluation préclinique à proposer aux laboratoires académiques et industriels.
Objectifs
Les coronavirus constituent une grande famille de virus à l'origine de maladies allant du simple rhume à des maladies plus graves comme le MERS ou le SRAS. La pandémie du coronavirus 2019 (COVID-19), causée par le coronavirus 2 (SARS-CoV-2) a touché des millions de personnes dans le monde entier, déclenchant un effort sans précédent de la part de la communauté scientifique pour comprendre le fondement biologique de la physiopathologie du SARS-CoV-2. Au 2 février 2022, sur un total de plus de 376 millions d'infections liées au coronavirus (COVID-19) dans le monde, 5,6 millions sont décédées à ce jour, dont plus de 128 000 en France. 73% des victimes du coronavirus en France étaient âgées de 75 ans ou plus. Dans le contexte d'une infection au SARS-CoV-2, une association d'une maladie grave avec l'âge et/ou les comorbidités préexistantes comme l'hypertension, les maladies cardiaques mais aussi le diabète/obésité et les maladies respiratoires chroniques associée peut entraîner le décès. En outre, près d'un quart des personnes décédées du COVID-19 souffraient d'hypertension artérielle, et un tiers de maladies cardiovasculaires, parmi lesquelles l'insuffisance cardiaque était majoritaire. Dans ce contexte, l'objectif du projet est de profiter de la complémentarité des centres de recherches nationaux pour évaluer les effets des comorbidités liées aux maladies cardiovasculaires (MCV) sur la sévérité de l'infection par COVID-19 et l'efficacité des thérapies antivirales dans ces condition en utilisant un modèle préclinique de souris humanisé par le récepteur aux virus du COVID-19. Ce modèle animal de souris humanisés sera fourni par nos partenaires à Marseille et ils nous aidera à mieux comprendre l’évolution de cette pathologie et les facteurs influençant sa gravité du point de vue des réponses immunitaires innées et adaptatives suscitées par l'infection par le SARS-CoV-2 afin de connaitre les réponses conduisant à une amélioration des symptômes mais aussi celles susceptibles de contribuer à la maladie, la gravité et la mort.
Bénéfices attendus
Les modèles de souris fourniront non seulement des informations clés sur les mécanismes pathogènes de la maladie COVID-19 chez les malades atteints de maladies cardiovasculaires et d'hypertension, mais pourront également servir de plateformes d'évaluation préclinique à haut débit pour identifier des antiviraux et des vaccins performants, essentiels pour les essais humains en aval. Ces modèles seront proposés aux laboratoires académiques et industriels comme modèle d’étude préclinique en vue de mise en place de prestation de service.
Procédures
Les animaux subiront 2 échographies de 10 à 15 minutes, une avant et une après challenge pharmacologique sous anesthésie gazeux pour étudier leurs fonctions cardiaques. Des prélèvements sanguins de 2 minutes seront réalisés à la veine temporale superficielle sur animaux vigiles après chaque echographie. Une implantation de mini pompe sera réalisée sous la peau lors d'un geste chirurgical pour diffuser le traitement pharmacologique, cette procédure peut prendre jusqu'à 20 minutes par animal. Celui-ci sera couplé à l'utilisation d'antalgiques avant, pendant et après l'incision pour éviter toute souffrance aux souris. Après l'envoie des animaux à Marseille, ils subiront une infection au SARS-CoV-2 par injection intra-nasal pour chaque animal, c'est une procédure qui peut prendre jusqu'à 30 min car elle sera couplé à l'utilisation de l'anesthésie et la manipulation dans la plateforme BSL3 dédié à l'utilisation des virus de ce type. A la fin du protocole, le sang et les organes des animaux seront perfusés et prélevés pour réaliser un immunophenotypage complet.
Impact sur les animaux
Les souris subiront des injections intrapéritonéales et des incisions sur la peau pour l'implantation de mini pompes en sous cutanée. Ce traitement induira de l'hypertension artérielle et une insuffisance cardiaque et peut causer des symptômes d'hyperthermie et de gêne respiratoire. Les souris subiront par la suite une infection avec le virus SarsCov2 et des symptômes de la maladie peuvent apparaitre. En fin d'expérimentation et selon les protocoles mis en place, elles peuvent subir une perfusion intracardiaque afin de récupérer des tissus sans globules rouges (poumons, cœur, cerveau) pour réaliser des immunomarquages et visualiser spécifiquement dans la cellule en microscopie optique.
Devenir
Toutes les souris seront transférées en vie à nos partenaires, les souris seront mises à mort après pour prélèvements d'organes et de tissus afin d'étudier le profil de leur système immunitaire.
Remplacement
Outre la production d'un modèle préclinique de souris pour le Sars-CoV-2, nous voulons tester l'impact de la comorbidité cardiovasculaire sur la gravité de la maladie après infection. Ce modèle murin donnera non seulement des informations clés sur la physiopathologie du COVID19 et l'impact de la comorbidité, mais servira également de plateforme d'évaluation préclinique à haut débit pour identifier des antiviraux et des vaccins performants, essentiels pour les essais humains en aval. À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans un procès d’infection de l’initiation au développement de la pathologie et au suivie de la réponse immunitaire. Ces différents arguments soulignent la nécessité de réaliser notre étude in vivo avec des modèles animaux.
Réduction
Dans la mesure du possible les témoins infectés sans traitement seront utilisés pour plusieurs prestations. Cela permettra de diminuer le nombre d'animaux utilisés. Dans ce protocole, nous avons planifié d'utiliser 45 animaux par groupes expérimentaux. En effet, nos études précédentes nous ont montré que l'effectif idéal se situe entre 40 et 50 animaux par groupe expérimental selon la variabilité de la réponse au mélange pharmacologique observée. De ce fait, nous prévoyons un total de 180 animaux (90 souris hétérozygote K18-hACE2 et 90 WT) dans chaque groupe on aura 45 souris mâles et 45 souris femelles, recevant une mini pompe, pour obtenir des conclusions statistiques tout en anticipant une variabilité possible. Les données générées seront analysées par des tests paramétriques (analyse de variance et test de Student).
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe de 5 pour éviter le stress de l’isolement et les cages seront systématiquement enrichies par l’ajout de plusieurs éléments : un dôme en carton pour leur procurer un abri, de la nourriture hydratée dès que nécessaire pour pallier toute perte de poids et/ou déshydratation durant leur hébergement. Comme notre objectif final est d'étudier la réponse immunitaire, aucun anti-inflammatoire ne pourra être administré aux souris. En effet, ces molécules pourraient interférer avec nos résultats et masquer l’expression des marqueurs d’intérêt. Avant l'expérimentations les souris seront traités avec un morphinique antidouleur et les expérimentations seront réalisée sous anesthésie. Après la mise en place des mini pompes et tout au long de l'expérience, un antalgique sera mis dans l'eau de boisson et les animaux seront observées quotidiennement par le personnel formé et qualifié en charge de l’expérimentation et selon les recommandations vétérinaires. Chaque semaine, les souris seront pesées et évaluées pour constater leur état général et s'assurer qu'aucune dégradation de celui-ci n'est constatée. Si ce cas se présentait, un protocole spécifique et une grille de score serait mis en place avec une surveillance quotidienne approfondie. En cas de perte de poids supérieure à 10% sur une semaine, prostration avec vocalisation, lésion du site d'implantation, hypothermie, et/ou un score à partir de 12 sur la grille de score entrainera une mise à mort immédiate de l'animale.
Choix des espèces
Nous utilisons le modèle souris car il nous offre un accès à de nombreuses lignées génétiquement modifiées et que le système cardiaque peut être étudié et est suffisamment proche de l'humain pour offrir une valeur prédictive dans notre approche translationnelle. Les animaux seront âgés de 9 semaines, afin d'être dans des conditions similaires à notre étude précédente sur le même modèle
Etude de pharmacocinétique et pharmacodynamie avec collecte de noeuds lymphatiques périphériques chez le chien
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
20 chiens vont être utilisé·es, gardés en vie pour une réutilisation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit des administrations intraveineuses d'un produit vétérinaire à jeun, subit huit prélèvements de nœuds lymphatiques aux membres postérieurs et vingt-cinq prélèvements sanguins répartis sur cinquante jours. Le projet évalue la pharmacocinétique et la tolérance de quatre produits testés, avec des vomissements et des modifications cardiaques déjà observés lors d'un projet antérieur. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'évaluer l'efficacité et la sécurité d'un produit chez le chien et conclut au recours "indispensable" à l'animal entier.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d'évaluer les paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamique de quatre éléments d'essai testés ( efficacité et sécurité de chaque produit test).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont de pouvoir démontrer l'efficacité des produits tests et d'identifier si des signes cliniques apparaissent, d'évaluer le composé le mieux toléré par les animaux sans présenter de signe clinique et sans modifications des paramètres sanguins mais également de démontrer l'efficacité du produit administré grace aux prélèvements des cellules sanguines et des noeuds lymphatiques.
Procédures
Dans ce projet les nuisances sont: 1) l'administration des éléments tests par voie intraveineuse pendant 30 minutes avec mise à jeun au moins 10h avant. Aministration répétée 14 jours aprés la première administration 2) huit prélèvements au niveau des noeuds lymphatiques des membres posterieurs. Durée d'un prélèvement de l'ordre de la minute 3) Vingt-cinq prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigiles répartis sur 50 jours au total. Durée de l'ordre de la minute. 4) la manipulation et la pose d'appareillages non invasif pour la mesure de l'oxygène, de la tension et du rythme cardique.
Impact sur les animaux
L'effet indésirable susceptible d'être observé suite aux traitements est un vomissement et ou une modification des paramètres cardio-circulatoires, qui a été observé en dans un projet antérieur. Dans ce projet les nuisances sont: 1) l'administration des éléments tests par voie intraveineuse avec mise à jeun au moins 10h avant. Cela necessite une contention legère des animaux. Effets indésirables susceptibles, vomissement . 2) Prélèvements aux niveaux des noeuds lymphatiques des membres posterieurs. Cela necessite une contention legère des animaux. Effets indésirables irritation et inflammation post ponction au niveau du site de prélèvement. 3) Les prélèvement sanguins seront réalisés. Stress liée à la contention, manipulation des animaux. On ne s'attend pas à d'autre effet indésirable en particulier.
Devenir
Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure. Les animaux auront un examen clinique général réalisé par le veterinaire désigné. Les actes réalisés dans cette procédure ne justifie pas d'un sort particulièrement prévu aux animaux.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier. Aucune méthode alternative ne permet d'évaluer l'efficacité et la sécurité d'un produit test chez le chien.
Réduction
Dans ce projet , 20 animaux seront inclus. En tenant compte de la variabilité intra et inter individuelle, c'est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats représentatifs et interprétables. Pas de test statistique réalisé au préalable.
Raffinement
Pendant la période d'acclimatation, les animaux seront hébergés par groupe de 2 ou 3. Puis ils seront hébergés en condition individuelle à partir de l'administration jusqu'à 24h aprés. Cet hebergement en individuel est necessaire pour faciliter l'observation des animaux. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires. De l'enrichissement (exemple: balle, corde) sera présent autant que possible dans les boxes.
Choix des espèces
Espèce cible pour ce produit vétérinaire Adultes. Animaux adultes necessaire pour ce type de projet. Animaux qui ont fini leur croissance.
Impact d’un complexe organométallique à base de fer sur la réponse immunitaire antitumorale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
42 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses au flanc, puis des injections intraveineuses d'un complexe à base de fer, la croissance de la tumeur étant suivie au pied à coulisse quatre fois par semaine et limitée à 1 000 mm3. Le projet vise à évaluer l'effet de ce composé sur la réponse immunitaire face à un cancer du sein. Le porteur affirme qu'aucune méthode de remplacement ne permet d'étudier le microenvironnement tumoral et retient un modèle de souris à système immunitaire fonctionnel.
Objectifs
Les cancers du sein représentent la première cause de mortalité induite par cancer chez la femme (INCA, 2022). Malgré les progrès dans leur diagnostic et leur traitement, certains ont encore un pronostic défavorable notamment lié à l’apparition de résistances aux thérapies associées à une baisse de l’efficacité du système immunitaire antitumoral. Parmi les cellules immunitaires, les macrophages infiltrent rapidement la tumeur. A l’issue de leur activation, les macrophages peuvent acquérir soit des capacités antitumorales, soit propriétés pro- tumorales. Au sein d’une tumeur, le microenvironnement tumoral favorise les propriétés pro-tumorale des macrophages et ces derniers sont donc associés à un mauvais pronostic. C’est pourquoi, trouver de nouvelles pistes thérapeutiques favorisant les propriétés antitumorales de macrophages constitue un enjeu majeur en cancérologie. Dans ce contexte, nos travaux actuels sur de nouveaux complexes organométalliques à base de fer montrent une activité anticancéreuse intéressante. Parmi ces composés, un entraîne un arrêt de la prolifération cellulaire et favorise les capacités des macrophages à éliminer les cellules cancéreuses. C’est pourquoi, il est désormais fondamental de faire la preuve de concept de l’efficacité de ce composé sur organisme vivant (souris) afin d’évaluer son impact sur la réponse immunitaire antitumorale, notamment des macrophages, mais également des autres cellules du système immunitaire.
Bénéfices attendus
L’étude de l’impact de ce composé sur le système immunitaire et plus particulièrement sur les macrophages lors de la mise en place d’une réponse immunitaire antitumorale permettra, en parallèle, d’appréhender l’action de ce composé sur le microenvironnement tumoral, avec une potentialisation du système immunitaire, pouvant conduire à une résorption de la tumeur.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection unique de cellules cancéreuses au niveau du flanc pour développer le modèle. Une fois que les tumeurs auront atteint un volume d’environ 200 mm3, les souris recevront une injection unique (0,5 mg/kg) ou trois injections à 4 jours d’intervalle (0,15mg/kg) en intraveineuses de notre composé à base de fer. Les souris contrôles recevront trois injections intraveineuses, à 4 jours d’intervalle, de sérum physiologique. Cette expérience durera soit 14-17 jours à compter de l’injection des cellules cancéreuses (pour étudier les effets précoces du composé sur la réponse immunitaire antitumorale), soit 22-25 jours (pour étudier les effets plus tardifs du composé sur la réponse immunitaire antitumorale). Au cours de cette expérience, un suivi de la croissance tumoral sera réalisé à l’aide d’un pied à coulisse 4 fois par semaine. Donc, dans le cadre de cette expérience, les 42 souris utilisées seront utilisées pour une durée totale de 14-17 jours pour 21 souris et 22-25 jours pour 21 souris. Le temps de chaque intervention, injection des cellules cancéreuses, injection du composé et mesure de la taille des tumeurs se fera en moins de 5 minutes par souris (soit 4 interventions pour chaque souris concernant les injections, plus les mesures de la taille des tumeurs 4 fois par semaine).
Impact sur les animaux
Les injections (sous-cutanée et intraveineuses), ainsi que la contention des souris nécessaire pour réaliser ces injections, nécessaire pour l’ensemble de la procédure (développement tumoral et injections du composé) peuvent entrainer un état de stress chez ces dernières. C’est pourquoi nous avons choisi d’effectuer ces gestes sur souris anesthésiées. Un suivi quotidien des animaux (évaluation du comportement, alimentation, hydratation) et l’évaluation 4 fois par semaine de la courbe de poids ainsi que de la croissance tumorale (à l’aide d’un pied à coulisse sur animal vigile) ne provoquera pas de nuisance et permettra la surveillance d’apparition des points limites définis Le développement de la tumeur sur le flanc (qui sera limité à un volume maximal de 1000 mm3) pourrait provoquer une gêne légère de la souris – c’est pourquoi déplacements et activité seront particulièrement observés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les tumeurs et les ganglions lymphatique drainant ou non le site tumoral
Remplacement
Aucune méthode alternative de remplacement ne permet de satisfaire l’objectif de Remplacement à notre connaissance. Afin d’étudier les régulations du système immunitaire en condition tumorale, nous avons besoin d’un modèle prenant en considération l’environnement des cellules immunitaires (à savoir les interactions entre les différentes cellules du système immunitaire) ou encore le microenvironnement tumoral qui module de façon très spécifique la réponse immunitaire antitumorale. A ce jour, seules les expériences in vivo permettent de prendre en considération l’ensemble de ces paramètres.
Réduction
Grâce aux injections sous-cutanées de cellules tumorales dans un flanc de la souris, nous pouvons utiliser les ganglions lymphatiques qui ne drainent pas le site tumoral comme contrôle (cellules immunitaires non activées par les cellules cancéreuses), en comparaison avec les cellules immunitaires des organes lymphoïdes drainant le site tumoral (donc cellules activées). Cela permet de réduire le nombre de souris en évitant d’ajouter un groupe de souris « contrôle » (sans tumeur). L'effectif du nombre d'animaux requis par groupe expérimental a été calculé par une approche statistique, en nous basant sur des études similaires menées au sein de notre laboratoire. Ainsi, ce projetrequerra 7 souris / groupe expérimental (dont 3 groupes pour le temps précoce et 3 groupes pour le temps « tardif »), soit un total de 42 animaux.
Raffinement
Les souris femelles seront hébergées par 5 en cages filtrées, à une température de 22±2°C et une humidité relative de 50±20%. Les souris seront soumises à un cycle lumière-obscurité inversé de 12h. Elles auront accès ad libitum a eau et nourriture et disposeront d’un enrichissement adapté à leur besoin. Les expérimentations débuteront après une période d’acclimatation de 7 jours aux conditions de l’animalerie. Les injections seront effectuées sur animaux anesthésiés afin de limiter le stress engendré par la contention. Des critères d'arrêt anticipé de l'experimentation en cas de survenue d'une complication ont été identifies. Dès qu’un des points limites est atteint la souris en question sera écartée du protocole et des anti-inflammatoires ou analgésiques seront administrés à l’animal si nécessaire.
Choix des espèces
Au cours de ce projet, il est indispensable de travailler avec des souris possédant un système immunitaire fonctionnel pour étudier la régulation de ce système. Le modele de souris Balb/c, est le modele animal le plus approprie pour éviter un rejet de greffe des cellules cancéreuses 7 semaines : adulte, poids d’environ 18-20 g. La veille bibliographique réalisée sur les études in vivo établies à partir de modèle de cancer mammaire démontrent l’utilisation de souris femelles Balb/c âgées de 6-8 semaines