Procédures modérées

800 animaux non-humains, 400 souris et 400 rats, vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des immunisations par pistolet à gènes deux fois par semaine pendant jusqu'à 25 semaines, avec des prélèvements sanguins réguliers, les souris prélevées vigiles à la veine maxillaire et les rats sous anesthésie. Le porteur indique que le pistolet à gènes provoque une rétraction de la peau, une irritation et une douleur locale, et qu'aucun animal ne sera gardé en vie. Il affirme qu'un modèle in vitro ne reproduirait pas la complexité de la réponse immunitaire.

Objectifs

La préparation aux pandémies est un bien public mondial. Les menaces de maladies infectieuses ne connaissent pas de frontières. De même, des maladies telles que le cancer, les maladies auto-immunes et la résistance aux antibiotiques constituent un risque mondial. Des efforts sont donc en cours pour développer des vaccins plus efficaces et plus spécifiques. L'enjeu est de taille car les progrès scientifiques et la maîtrise des procédés de génie génétique ont permis de concevoir des molécules de plus en plus efficaces à des coûts avantageux. Les anticorps monoclonaux produits in vitro étaient coûteux et échouaient lors des essais cliniques. Ainsi, le développement des vaccins plus efficaces et plus spécifiques, tels que les vaccins à ADN sont donc mis en avant. Ces vaccins produisent, in vivo, une immunité spécifique à l'antigène et font l'objet d'intenses recherches. Alors que les vaccins traditionnels reposent sur la production d'anticorps par l'injection de virus atténués, de particules virales mortes ou de protéines recombinantes, les vaccins à ADN peuvent être construits pour fonctionner de manière fiable tout en conservant la spécificité du vaccin. Les vaccins à ADN sont non vivants, non réplicatifs et présentent un faible risque de réversion pour provoquer une forme de la maladie en question ou une infection secondaire. En outre, les vaccins à ADN sont très flexibles et peuvent coder de multiples gènes (virus, bactéries et protéines). L'objectif de cette étude est de comparer l'efficacité de différentes méthodologies d'immunisation chez le rat et la souris par la production d'anticorps neutralisants.

Bénéfices attendus

Le principal avantage de ce projet est le développement de vaccins plus efficaces et plus sûrs grâce à la validation de la méthode d'immunisation par le "gene gun".

Procédures

Les animaux seront soumis aux protocoles d’immunisation avec l’utilisation du pistoler à gènes sous pression qui envoie des molécules d'ADN à travers la barrière épidermique et/ou muqueuse. Ce type d’immunisation est réalisé sous anesthésie. Lors de ce protocole, les animaux contrôles recevront les injections des éléments d’essais par une des voies dites classique, à savoir : sous-cutanée, intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire ou orale. Afin que les résultats puissent être comparables, les animaux contrôles seront également anesthésiés. Les immunisations seront réalisées 2 fois/semaine. La durée maximale du protocole d’immunisation et des injections est 25 semaines. Des prélèvements sanguins sont prévus avant immunisation et toutes les 2 semaines pendant le protocole d’immunisation dont la durée maximale est de 25 semaines. Les rats seront prélevés en veine sublinguale sous l’anesthésie générale. Les souris seront prélevées en veine maxillaire en vigile. Les prélèvements de sang effectués en cours d'étude se feront en respectant les volumes circulants et à ne pas dépasser 15% du volume circulant. A la fin du protocole les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale sous anesthésie pour le prélèvement d’organes.

Impact sur les animaux

L'anesthésie induit une baisse de la température corporelle. Le traitement par pistolet à gènes induit une rétraction temporaire du pis, une irritation temporaire de la peau et une douleur locale (légère et temporaire). Les voies d'immunisation conventionnelles, telles que les voies sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire, orale et intraveineuse, peuvent induire une irritation et une douleur cutanées (locales et temporaires). La prise de sang chez la souris par la veine mandibulaire est effectuée avec l'animal éveillé. La contention peut générer un stress momentané, contrôlé par les opérateurs. La douleur locale est minime et temporaire, et les animaux ne montrent généralement pas de signes de souffrance (ils recommencent rapidement à explorer la cage, à manger et à boire). La prise de sang chez le rat est réalisée sous anesthésie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin d'étude, des organes tels que la rate, la moelle osseuse et les lymphonodes peuvent être prélevés après sacrifice par dislocation cervicale sous anesthésie. Aucun animal ne sera gardé en vie à la fin du projet.

Remplacement

La vaccination permet de développer une réponse immunitaire de mémoire qui est à ce fin protectrice. La réponse immunitaire est complexe, mettant en jeux plusieurs types cellulaires : les cellules présentatrices d’antigènes, les cellules T, les cellules B, entre autres avec des activités biologiques différentes. Un modèle in vitro ne permettrait pas de reproduire ces mécanismes complexes, et ne permettrait pas de montrer le potentiel et la puissance du vaccin ainsi que les effets indésirables.

Réduction

Le nombre total d'animaux (800) utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre ses objectifs, c'est à dire avoir une production de anticorps neutralisants et protecteurs après le protocole d'immunisation. Le nombre d'animaux par groupe, un échantillon minimum de 10 animaux/groupe, a été choisi pour cet essai préclinique de vaccin sur la base d'études antérieures, en raison de l'efficacité accrue des vaccins ADN avec le protocole d'immunisation par pistolet à gènes.

Raffinement

Nous réalisons le protocole sur des animaux anesthésiés. Afin d'éviter tout impact négatif de l'anesthésie sur l'animal, la durée de la procédure n'excède pas 10 minutes, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant pour éviter l'hypothermie. Les concentrations anesthésiques sont adaptées à chaque espèce. Le personnel est formé à l'utilisation du pistolet à gènes, afin d'assurer un contrôle adéquat de la technique et de la procédure. Pour les voies d'immunisation conventionnelles, les volumes d'administration et le type d'aiguille ou de canule sont adaptés à l'espèce et au site d'injection ou d'administration. Toutes les voies d'administration conventionnelles chez les rats et les souris seront effectuées sous anesthésie générale afin de réduire le stress des animaux et de garantir des conditions égales entre les groupes. Les mesures de raffinement pour les prélèvements répétés concernent le respect du volume circulant total et une période de récupération de 2 semaines. Les prélèvements dans les veines sublinguales des rats sont réalisés sous anesthésie, avec une pression sur le site de prélèvement en fin de procédure pour prévenir le risque de saignement. Chez la souris, la veine maxillaire est choisie et les prélèvements sont effectués tous les quinze jours, de manière à ne pas anesthésier les animaux et à prélever un volume suffisant, en alternant les deux côtés pour permettre un temps de récupération. La surveillance quotidienne des animaux, le contrôle de leur poids et l'observation clinique permettront d'identifier le plus tôt possible tout signe de douleur, de souffrance ou de stress. Les animaux seront hébergés en groupes et des enrichissements spécifiques à l'espèce seront systématiquement fournis et/ou ajoutés si nécessaire (par exemple, en cas de comportement agressif). La nourriture sera placée au fond de la cage pour faciliter l'alimentation.

Choix des espèces

Les rats et les souris peuvent bénéficier d'un protocole de vaccination destiné à stimuler largement le système immunitaire humoral. Une étude a montré que les anticorps naturels issus des sérums de rats immunisés ont produit une grande variété de production et une liaison totale supérieure à celle des anticorps naturels provenant des sérums de rats non immunisés. Cela indique que chez les rats de laboratoire, l'immunisation est associée à un plus grand répertoire d'anticorps naturels et à une liaison plus forte des anticorps. D'autres études plus récentes montrent chez la souris et le hamster et même chez l'humain le grand répertoire d'anticorps neutralisants produits par immunisation. Les animaux arrivent dans nos locaux à partir de 8 semaines d'âge. Après 1 ou 2 semaines d’acclimatation, en fonction de leur origine ils seront donc au stade adulte, et leur système immunitaire aura atteint sa pleine maturité.

11 lapins vont être utilisé·es, gardés en vie en vue d'une adoption, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie abdominale pour accéder au foie, puis une seconde intervention de prélèvement, l'ensemble pouvant durer jusqu'à une heure et demie, pour tester un pansement hémostatique à base d'alginate. Le porteur décrit l'accès au foie comme une "chirurgie lourde pour le lapin" et prévoit une euthanasie sous anesthésie en cas de complications, les autres animaux étant maintenus en vie. Il présente ce dispositif comme un futur pansement résorbable pour la chirurgie.

Objectifs

Le pansement idéal n’existe pas. Cependant, il doit présenter quelques caractéristiques, parmi lesquelles : 1/maintenir la plaie en milieu humide et chaud, 2/être modifié selon les stades de cicatrisation, 3/ être perméable aux échanges gazeux mais non aux bactéries, 4/absorber l’excès d’exsudat produit par la plaie, 5/ ne pas coller à la plaie mais adhérer à la peau saine sans se décoller ou s’abîmer rapidement, le tout en étant facilement applicable et confortable, 6/ ne pas être toxique et être hypoallergénique, 7/ protéger des chocs, 8/ être transparent afin de pouvoir visualiser la plaie sans retirer le pansement, 9/ être le moins coûteux possible et réduire le temps de traitement. Le pansement à base d’alginate de calcium répond à l’ensemble de ces critères mais son utilisation est réservée à la prise en charge de plaies cutanées mais très peu sur les organes internes lors de chirurgie. Pour maitriser les saignements, les chirurgiens ont recours à différentes techniques conventionnelles. Lorsque ces techniques sont insuffisantes, notamment lors d’hémorragies capillaires dites « en nappe », des hémostatiques chirurgicaux résorbables non naturels sont utilisés comme traitement adjuvant. L’objectif de cette étude est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale d’un produit à base d’alginate d’un pansement tissé, et de suivre sa résorption et son impact au niveau du tissu lésé et des zones proches à différents temps post-opératoire. Il y aura 3 groupes de 3 lapins qui seront opérés (chirurgie d’implantation). Et à J+2 semaines, J+1 mois et J+3mois post-opératoire, nous opérons les lapins pour faire un prélèvement histologique de la zone d’intérêt (chirurgie d’exérèse). Si les conditions le permettent, les animaux ne seront pas systématiquement mis à mort au moment de la chirurgie d’exérèse afin de pouvoir être mis à l’adoption. Nous prévoyons 2 lapins supplémentaires en cas d’un décès lors de la chirurgie ou à cause d’une mise à mort liée à un point limite. Ce projet portera sur 11 lapins au total. Pour ce faire, il sera réalisé une série de lésions calibrées sur le foie du lapin, suivie de l'application d'une quantité prédéfinie de produit. L'évaluation de l'arrêt du saignement est faite selon la grille de score d'ADAM. En cas de reprise de saignement, le chirurgien fera une cautérisation avec le bistouri électrique (pince bipolaire) ou posera des points de suture. La biocompatibilité du pansement tissé a été testé en in vitro.

Bénéfices attendus

Le projet est destiné à confirmer l’intérêt des propriétés hémostatiques du produit sur le saignement d’un organe intra-abdominal comme le foie mais aussi de suivre la résorption du produit dans le temps au niveau des zones d’implantation. L’objectif est de pouvoir avoir un pansement hémostatique naturel (non synthétique) pour le traitement des plaies chirurgicales et qui ne nécessite pas son retrait avant fermeture de l’incision chirurgicale comme les pansements actuels commercialisés.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie d’implantation pour permettre l’accès au foie tout en préservant les autres organes digestifs dans la cavité abdominale et une seconde chirurgie d’exérèse pour faire un prélèvement de tissu. La durée de la chirurgie ne devra pas excéder une durée de 1h30 par animal (5 minutes pour l’abord, 5 minutes pour l’accès au foie, 25 minutes pour les temps de saignement, 10 minutes pour le contrôle final de l’arrêt du saignement, 20 minutes pour la fermeture du plan musculaire et cutanée). L’animal aura une à deux interventions chirurgicales. La chirurgie d’exérèse ne sera faite que si la zone d’implantation ne présente pas trop d’adhérences qui compromettraient l’état de récupération de l’animal. L’animal sera injecté avec un analgésique pour anticiper la sensation de la douleur la veille de la chirurgie. Le jour de la chirurgie, l’animal sera anesthésié à l’aide d’un anesthésique couplé à un analgésique (anti-douleur) pour réduire toutes sensations à la douleur. L’animal est placé sous masque avec un anesthésie gazeux pour le maintien de l’anesthésie et sur une table chauffante afin de maintenir la température corporelle.

Impact sur les animaux

L’accès au foie est une chirurgie lourde pour le lapin. Afin de limiter l’impact et de ne pas risquer un incident de chirurgie, nous avons opté pour un abord chirurgical restreint dans la région sous costal plutôt qu’un abord abdominal plus vulnérant pour l’animal. L’abord abdominal nécessite une incision de grande longueur pour pouvoir placer les écarteurs et accéder au foie. De plus, lors de cette approche, le risque de faire une incision sur le coecum est important étant donné sa grande taille et la mise en évidence des viscères aurait accélérée la perte de chaleur et le desséchement de ces derniers, ce qui auraient entrainé plus de complications à gérer en post-opératoire. L’abord sous costal limite la taille de l’incision et nous ne touchons pas les viscères et ni le coecum. Cette approche permet de garder au chaud les organes et limite leur desséchement.

Devenir

La mise à mort des animaux sera décidée lors de la chirurgie d’exérèse pour faire un prélèvement histologique. Si nous observons trop de complications qui met l’animal dans une balance bénéfice/dommage en sa défaveur, alors l’animal sera euthanasié encore sous anesthésie générale. Dans le cas contraire, il sera maintenu en vie pour une adoption.

Remplacement

L’objectif de cette étude est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale d’un produit à base d’alginate (produit naturel), de constater sa persistance et de suivre sa résorption sur un tissu lésé. La preuve de concept de ce nouveau type de pansement hémostatique tissé permettra de mettre au point un nouveau dispositif médical pour la gestion des saignements intra-cavitaire en cours de chirurgie. Il nous est nécessaire de tester le pansement hémostatique dans un environnement avec les différents organes et les fluides corporels qui ne peuvent être reproduit en in vitro. Ce passage sur le modèle animal est la dernière étape de la preuve de concept.

Réduction

Nous utiliserons 11 animaux au total dont 9 animaux répartis en 3 groupes (3 lapins/groupe = 3*3 =9), et il est prévu 2 animaux supplémentaires pour compléter l’un des groupes si nécessaires. Le nombre/groupe a été déterminé pour avoir une représentation juste de la physiologie animale. En tant donné que c’est une preuve de concept, nous avons besoin de 3 animaux maximum par groupe pour obtenir la réponse à notre questionnement. Si le pansement ne permet pas de stopper le saignement et amène à faire une intervention chirurgicale pour l’arrêter nous stopperons le projet sans utiliser tous les animaux prévus. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons développé la voie d’abord chirurgicale ainsi que la finalisation de la prothèse dans notre structure sur des animaux décédés, issus de procédures antérieures. Il s’agit d’une preuve de concept, ce faible nombre d’animaux permettra d’obtenir des résultats suffisants pour cette étape du projet.

Raffinement

L’animal sera placé 3 semaines en acclimatation et reparti en lot homogène avec d’autres congénères. Le lapin est un animal qui stresse très facilement et qui a besoin de temps pour s’habituer à son nouvel environnement et aux personnes. La veille de la chirurgie, l’animal sera injecté avec un analgésique (anti-douleur) pour anticiper la sensation de la douleur. Le jour de la chirurgie, l’animal sera anesthésié à l’aide d’un anesthésique couplé à un analgésique. Un cathéter sera mis en place sur la veine de l’oreille pour permettre l’hydratation de l’animal tout au long de la chirurgie. L’animal est placé sous masque avec un anesthésie gazeux pour le maintien de l’anesthésie. L’animal est placé sur une table chauffante afin de maintenir la température corporelle. Une anesthésie locale sera mise en place. En fin de chirurgie, après nettoyage de la peau avec du sérum physiologique et une application d’un gel anesthésique sur les berges permettra d’apporter une anesthésie locale. L’animal sera habillé d’un pyjama pour protéger la cicatrice. Un renfort de protection (une compresse et coton cardé) réduira les frottements des fils des points sur le pyjama et donnera une protection supplémentaire à un grignotage du pyjama par l’animal. L’animal sera placé dans des couvertures polaires et sous-surveillance jusqu’à son réveil. L’animal avec les couvertures polaires seront remis dans la cage. L’animal recevra le soir de la chirurgie un analgésique pour la nuit et le maintien de l’analgésie au lendemain de la chirurgie pendant 3 à 5 jours se fera selon les besoins de chaque individu. Le soir de la chirurgie, il sera déposé dans la cage des légumes frais, plus appétent, pour stimuler l’appétit de l’animal et réduire la perte de poids en post-opératoire. Les légumes frais seront maintenus pendant 72 h post-opératoire. Le poids de l’animal est suivi quotidiennement jusqu’à la reprise de poids. La cicatrice sera surveillée toutes les 48 h jusqu’au retrait des points à 15 jours minimum post-chirurgie. La présence quotidienne du vétérinaire et l'application de points limites stricts et spécifiques au projet evite toute souffrance, douleur ou stress inutiles. Le transfert des animaux vers la structure d’hébergement sera fait dans les boites de transport propres à chaque animal dans un véhicule adapté.

Choix des espèces

Le lapin est un animal de taille intermédiaire, plus gros qu’un rat et moins gros qu’un cochon, mais assez gros pour avoir accès à un foie dont la taille peut supporter les biopsie punch de 5 mm de diamètre (3 à 4) prévues et l’implantation du produit hémostatique pour obtenir un effet pharmacologique (hémostatique). Les animaux seront réceptionnés à 2.5-3 kg environ pour atteindre 3.5-4 kg (âge adulte). L’utilisation d’animaux adulte permet de de bénéficier d’une taille permettant la chirurgie sur le foie.

800 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses sous la peau ou directement dans le foie sous échographie, un traitement par anticorps deux fois par semaine pendant quatre semaines et des échographies répétées sous anesthésie. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer une ulcération cutanée ou des douleurs, et que tous les animaux sont tués pour prélever tumeurs et foies. Il décrit des travaux in vitro et ex vivo déjà menés mais conclut à la nécessité d'une validation sur "animal entier".

Objectifs

Le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier dans le monde. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement de cellules issues de patients par notre anticorps permet d’activer les cellules immunitaires. Ceci suggère que notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité des thérapies existantes ciblant le système immunitaire pour le traitement du cancer du foie. L’objectif de notre projet est tout d’abord de valider nos résultats précédents en confirmant la capacité de notre anticorps à inhiber la progression tumorale dans des souris présentant un système immunitaire fonctionnel, mais également d’évaluer l’efficacité de notre anticorps en combinaison avec des anticorps ciblant le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Le cancer du foie est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles qui ciblent le système immunitaire et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologie du foie.

Procédures

Une partie des animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses du foie. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Une autre partie des animaux recevra une injection unique de cellules cancéreuses directement dans le foie grâce à un système échographique, réalisée sous anesthésie générale, sans subir de procédure chirurgicale. Cette procédure prend environ 15 minutes à être réaliser. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant 4 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute à être réalisée. Certains animaux subiront une échographie de 20-30 minutes, sous anesthésie générale, 2 fois par semaine, afin de suivre la croissance tumorale dans le foie des animaux. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont très limités. Pour les souris injectées sous la peau, la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée. Pour les souris injectées dans le foie, la tumeur peut entrainer une gêne et des douleurs au cas où la tumeur dépasse une certaine taille. De même, les injections répétées intrapéritonéales peuvent parfois engendrer une inflammation, une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement

1 320 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux reçoivent dès la naissance des injections intraveineuses sur animal vigile et des prélèvements d'urine quotidiens, puis des prélèvements de sang à la veine maxillaire, pour tester une thérapie par ARNm contre la leucinose. Le porteur indique qu'un quart des souris, porteuses de la maladie, ont un risque de mort de 50 % dans les trois premiers jours et de 100 % avant deux semaines, et que toutes sont tuées pour analyse des tissus. Il affirme que la démonstration ne peut se faire complètement que dans un "organisme entier".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer des stratégies thérapeutiques pour traiter une maladie métabolique rare d’origine génétique, causée par la dysfonction d’une enzyme. La forme classique de cette maladie se caractérise par un coma en période néonatale pouvant conduire au décès en l’absence de traitement en urgence. Il existe également des formes moins sévères, chroniques, sans épisode aigu néonatal sévère et des formes se révélant par des troubles neurologiques lors d’épisodes aigus de stress métabolique (fièvre...). A ce jour, le principal traitement repose sur un régime alimentaire extrêmement strict, limité en protéines. Ce régime est très efficace mais il doit être poursuivi à vie et ne permet pas de prévenir le risque de complications graves, parfois mortelles. Un tel régime altère de façon significative la qualité de vie. Certains patients peuvent bénéficier d’une transplantation hépatique qui certes guérit la maladie, mais demeure associée à un risque propre de rejet et de décès. L’efficacité de la transplantation hépatique dans cette maladie nous a conduit à proposer le projet ici présenté. Notre objectif est de développer une stratégie de traitement de cette maladie métabolique par une approche de thérapie innovante basée sur l’utilisation d’ARN messagers, non-pathogènes, qui ont montré qu’ils pouvaient corriger de manière stable des maladies où d’autres protéines sont manquantes après une seule administration. La spécificité de cette étude est d’étudier l’efficacité à court terme de cette thérapie après injection unique dans des modèles murins de cette maladie métabolique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de faire la preuve de concept de l’efficacité de court terme de cette thérapie innovante chez la souris, ouvrant la voie du développement d’une nouvelle stratégie thérapeutique chez l’homme.

Procédures

Tous les animaux de cette étude (N = 360 + 960 dans amendement) seront soumis à des injections par voie intraveineuse dans la veine temporale le jour de la naissance sur souris vigile et à des prélèvements d'urine quotidiens la première semaine de vie puis deux fois par semaine. Les animaux de l’étude de survie (N = 90 + 160 dans amendement) seront soumis à des prélèvements de sang au niveau de la veine maxillaire à partir d’une semaine de vie sur souris vigile. Les animaux de l’étude pharmacocinétique (N = 270 + 800 dans amendement) seront soumis à un prélèvement de sang unique au niveau de la veine maxillaire au moment de la mise à mort sur souris vigile. Ces différents actes seront le plus brefs possibles (1 min pour les injections néonatales, 1 min pour les prélèvements d’urine, 1 min pour les prélèvements de sang) et pratiqués par du personnel entrainé.

Impact sur les animaux

Les souris KO malades (25% des souris comptées dans le projet) présentent un phénotype grave : risque de 50% de décès au cours des 3 premiers jours et 100% au cours des 14 premiers jours. Les nuisances que subiront les souris seront : une douleur associée à une injection IV sur souris vigile (injection initiale unique sur souriceau), un stress lié à un prélèvement d’urine sur souris vigile réalisé quotidiennement la première semaine de vie puis deux fois par semaine et une douleur associée à un prélèvement sanguin sur souris vigile, à partir d’une semaine de vie, de façon hebdomadaire pour les souris de l’étude de survie ou au moment de la mise mort pour les souris de l’étude pharmacocinétique.

Devenir

Mise à mort pour analyse des tissus.

Remplacement

Afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux dans ce projet, nos collaborateurs ont déjà testé différentes formulations d’ARNm in vitro. sur des cellules de foie cultivées en laboratoire. Ceci leur a permis de sélectionner des traitements candidats. Cependant la capacité des nanoparticules à franchir les défenses immunitaires ne peut être démontrée complètement que dans un organisme physiologique "entier".

Réduction

Toutefois, la seule utilisation de la souche « malade » pose certains inconvénients : en sachant qu’un animal sur 4 est affecté par cette maladie à la naissance et compte-tenu du nombre de souris nécessaires pour notre projet, le nombre de souris en élevage serait trop important pour répondre à l’ensemble des questions posées. Aussi, dans l’optique de réduire au maximum l’utilisation de ces souris malades, les meilleures formulations sélectionnées in vitro ont été testées par nos collaborateurs dans un organisme physiologique entier, chez des souris saines, afin de sélectionner les plus efficaces et la plus apte à franchir les défenses immunitaires. Le nombre d'animaux nécessaire par lot a été déterminé grâce aux études publiées précédemment développant une approche similaire. Nous étudierons les réponses à nos traitements à la fois pour les mâles et les femelles ce qui permettra de réduire le nombre d’accouplements et aussi le nombre de souris atteintes non utilisées. Afin de déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires à la détection de l’effet de nos traitements, nous avons établi le paramètre le plus important (concentration plasmatique de leucine) et nous avons utilisé un test bilatéral standard de comparaison des moyennes (t-test) afin d’avoir 90% de chance de détecter une diminution des concentrations de leucine dans le plasma de souris traitées avec l’ARNm comparées aux contrôles, avec un risque d’erreur de 1%.

Raffinement

Nous allons utiliser des procédures de raffinement pour éviter la souffrance des souris lors de prélèvements sanguins et pendant l'injection du vecteur thérapeutique. Au moment de l’injection chez les nouveaux-nés ; la mère sera éloignée afin de minimiser son stress. Les souriceaux seront recouverts de sciure de la cage de la mère et replacés rapidement dans la cage. Au niveau expérimental, les quantités minimales de sang et d'urine seront prélevées par du personnel expérimenté en veillant à réaliser les prélèvements sur les zones les moins sensibles possibles. Une surveillance régulière sera mise en place et des points limites adaptés ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l'animal si nécessaire. Les souris seront gardées dans des portoirs ventilées dans lesquels nous ajouterons du coton, une maisonnette et des bâtonnets à ronger. L’enrichissement social des souris sera garanti en évitant tout isolement prolongé.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal pertinent qui permet de reproduire la maladie humaine avec son phénotype clinique et biochimique sévère. Le modèle souris, facile à produire par comparaison aux autres modèles disponibles (bovins), permet d’étudier les différents organes, types cellulaires et mécanismes de défense immunitaire, pertinents pour notre étude et inaccessibles in vitro. Amendement : Deux modèles murins pertinents et complémentaires de la maladie seront utilisés. Nouveau-nés de 0 à 2 jours de vie car la maladie présente un phénotype très sévère entrainant un décès de la souris dans les 15 premiers jours de vie ; souriceaux et souris adultes jusqu’à 2 mois pour l’étude de survie.

720 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent en sous-cutané une greffe de trois cancers gastriques humains, puis neuf injections intrapéritonéales ou vingt-huit gavages, avec suivi de la tumeur au pied à coulisse jusqu'à un volume limite. L'objectif est de tester quatre molécules et une technologie brevetée de ciblage tumoral, avant d'éventuels essais cliniques. Le porteur affirme qu'après des tests sur cellules, la validation exige de travailler sur "un organisme entier et complexe".

Objectifs

Ce projet vise à tester l’efficacité anti-cancéreuse de quatre molécules novatrices dans trois modèles de cancer de l’estomac. Le diagnostic des cancers gastriques est souvent tardif, où le cancer de l'estomac est foudroyant. Malgré l’arrivée de nouveaux traitements, le besoin médical non couvert demeure très important. Le but des candidats médicaments testés est d'apporter un nouveau traitement novateur qui pourrait également en combinaison améliorer les chimiothérapies actuelles en diminuant leurs effets secondaires indésirables et en boostant leur efficacité. Afin de soigner les patients atteints de cancers de l’estomac qui résistent aux traitements actuels, une technologie brevetée permettant de cibler spécifiquement la tumeur, sans toucher les autres organes, et, ce faisant, de réduire la toxicité des traitements anticancéreux et augmenter leur efficacité, a été mise au point et sera testée ici.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont la démonstration que de nouvelles molécules thérapeutiques sont actives dans le traitement du cancer de l’estomac. Cette approche thérapeutique permettra au mieux de guérir les patients atteints de cancers gastriques, sinon de ralentir la progression tumorale. Ces résultats sont nécessaires afin de procéder à l’évaluation ultérieure de ces molécules dans le cadre d’études cliniques précoces chez l’Homme.

Procédures

Suite à l’implantation sous cutanée des cellules cancéreuses (injection de quelques secondes maximum), les souris seront observées et palpées 3 fois/semaine. Dès que les tumeurs seront palpables, le suivi des animaux sera fait comme suit : mesure de la taille des tumeurs au pied à coulisse 3 fois/semaine et pesée des souris 3 fois/semaine (geste de quelque secondes maximum). L’observation des animaux sera réalisée 3 fois /semaine par le(s) expérimentateur(s) en même temps que la palpation et la pesée. Les souris vont subir 9 injections intrapéritonéales (3x/semaine pendant 3 semaines) ou 28 gavages au total (2x/jour pendant 2 semaines). Les injections et gavages durent 10 secondes maximum.

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir des injections sous cutanée qui vont générer du stress à la contention ainsi qu’une douleur de courte durée à l’injection. La pousse tumorale peut engendrer une perte de poids et des douleurs au niveau de la tumeur. Les injections intrapéritonéales et les gavages peuvent générer une douleur lors de l’injection. Les chimiothérapies peuvent entrainer des effets néfastes sur l’état général des souris, mais les drogues utilisées ici ont été testée précédemment et n'ont présenté aucun effet secondaire délétère. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress lors de la contention et éventuellement de la douleur au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure pour cause d'atteinte du volume tumoral maximal tel que défini dans les points limites et pour prélèvement des tumeurs pour analyse.

Remplacement

Des tests in vitro ont été effectués au préalable et ont permis d'affiner le design de l'étude, mais la sensibilité des cellules tumorales aux traitements anti-cancéreux est fortement dépendante du microenvironnement tumoral. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans la tumeur et au sein de l’organisme nécessite de travailler sur un organisme entier et complexe. Pour cette raison nous devons effectuer ces études d’efficacité chez la souris.

Réduction

Les études seront faites séquentiellement et une évaluation de l’efficacité des 4 composés sera effectuée après la réalisation des expériences sur le premier modèle, ce qui donnera lieu à une décision d’arrêter ou de continuer les expériences pour les modèles suivants. Cette décision sera prise par le comité scientifique. Le nombre d'animaux a été déterminé à l'aide d'un outil statistique et les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable. Les études sur les différents modèles tumoraux seront réalisées en séquentiel, les résultats seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés. En conséquence, les études statistiques nous ont permis de déterminer qu'il nous faudra 720 animaux au total pour cette étude.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures, les animaux seront habitués à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Pour chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort au plus tard 56 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a pas été atteint avant ce délai. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux). Pour les composés administrés en gavage, des sondes de gavage flexibles et à usage unique seront utilisées. Les animaux seront observés de manière qualitative par les zootechniciennes de l'animalerie qui remplissent tous les jours une grille de suivi, basée sur des scores de critères comportementaux. Les animaux ainsi repérés sont inspectés le jour même par un membre de l’équipe de recherche qui procédera à l’évaluation des points limites selon une grille de scoring. Cette procédure sous forme d'arbre décisionnel ainsi que la définition de points limites adaptés à l'étude permettent une évaluation objective des critères d'arrêt des souffrances.

Choix des espèces

L'objectif est de travailler sur des animaux présentant des tumeurs et éviter le phénomène de rejet. L'utilisation d'une souche murine fortement immunodéprimée est donc nécessaire pour éviter ce phénomène. La souris est l’espèce la plus adaptée pour cet objectif est un modèle qui permet une prise tumorale avec de nombreuses lignées humaines. En effet cette souris immunodéprimée est une souche reconnue pour l’implantation de tumeurs humaines. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

404 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour des défauts de réparation de l'ADN, elles reçoivent des injections d'un agent myéloablatif, le 5-fluoro-uracile, avant mise à mort pour prélèvement d'organes. Le projet étudie les conséquences de ces mutations sur l'instabilité du génome et le développement de cancers, avec des pistes annoncées pour les téloméropathies. Le porteur indique réaliser une partie des analyses sur fibroblastes prélevés, et affirme que le reste ne peut s'étudier qu'in vivo sur "le mammifère in toto".

Objectifs

L’information génétique nécessaire au bon fonctionnement des organismes vivants est contenue dans les molécules d’ADN qui forment les chromosomes. Les télomères représentent des structures particulières situées aux extrémités des chromosomes qui protègent ces derniers de la dégradation et de la fusion, source d'instabilité génomique. De nombreux facteurs participent à la protection des télomères. Par ailleurs l’ADN fait constamment l’objet de dommages introduits soit secondairement à des fonctions physiologiques telles que la réplication, soit à la suite d’exposition à des agents génotoxiques de l’environnement tels que les rayonnements. Ces dommages sont très efficacement réparés pour éviter l’altération de l’intégrité du génome. Les défauts de réparation de l’ADN et de protection des télomères, notamment dans certaines maladies génétiques, conduisent à diverses pathologies telles que les déficits immunitaires, les téloméropathies ou les cancers. Nous générons des modèles murins d’altération des processus de protection des télomères et de réparation de l’ADN afin d’apprécier les conséquences du défaut de ces processus dans certaines maladies génétiques et dans le développement des cancers afin d’entrevoir de nouvelles solutions thérapeutiques pour ces maladies.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'apporter de nombreuses informations originales et fondamentales sur les conséquences fonctionnelles de certaines de ces mutations dans la stabilité des télomères, l'intégrité du génome, et leurs implications dans les téloméropathies. Les résultats obtenus devraient permettre d'ouvrir des pistes à des approches thérapeutiques chez les patients atteints de téloméropathies causées par ces mutations.

Procédures

Des injections intrapéritonéales contenant du 5 fluoro-uracile (5FU), un produit myéolablatif, seront effectuées. A la dose utilisée de 5FU, il n'y a pas d'effet indésirable globale de cette drogue. Une létalité embryonnaire peut exister lors de la gestation des animaux homozygotes.

Impact sur les animaux

Les animaux, du fait d'un défaut potentiel de la stabilité du génome peuvent présenter un défaut immunohématologique. Cependant leur maintien dans une zone EOPS devrait les préserver d'infections opportunistes. Par ailleurs l'injection de l'agent myéloablatif génère une légère douleur lors de l'injection intrapéritonéale et provoque un stress et réduit le nombre de cellules souches hématopoiétiques.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes et analyses phénotypiques

Remplacement

Les questions scientifiques que nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo ou ex vivo, sur des organes prélevés sur des souris. Il s’agit ici d’études sur le développement du système hématopoïétique qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère in toto. En effet, le développement du système hématopoiétique des mammifères et son fonctionnement ultérieur sont de mieux en mieux caractérisés chez la souris et aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de ces processus dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part. Les organoïdes permettant d'étudier l'hématopoïèse et en particulier la lymphopoïèse ne sont pas actuellement disponibles. De même les approches in silico ne permettent pas d'étudier m'impact de mutations sur l'hématopoïèse et la lymphopoïèse. En revanche l'analyse de la réparation de l'ADN et de la stabilité des télomères sera en grande partie réalisée dans des fibroblastes embryonnaires des différentes lignées murines ce qui permettra d'utiliser un nombre limité d'animaux.

Réduction

En se basant sur des test statistiques, nous réduiront au maximum le nombre d'animaux utilisés pour obtenir les résultats escomptés. Les tests statistiques faits a priori utiliserons le calcul de puissance. Les tests statistiques faits a posterori seront réalisés à l'aide d'un test non-paramétrique . Par ailleurs, de nombreux tests seront réalisés sur des fibroblastes obtenus de souris, permettant une étude in vitro de nombreux paramètres et ainsi réduisant le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront observés de façon hebdomadaire par le personnel compétent de l'animalerie. Les cages disposent par ailleurs de matériel d'enrichissement (bouts de coton, tunnels colorés). Le maintien des animaux dans une zone EOPS devrait les préserver d'infections opportunistes. La mise à mort de l'animal sera réalisée en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites. Le scoring hebdomadaire est réalisé en plus de l'observatin quotitidenne règlementaire des animaux. Les injections intrapéritonélaes sont peu douloureuses et ne nécessitent pas d'analgésie.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement du système immunohématopoiëtique, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement de ce système entre les rongeurs et l’Homme. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation de ce projet tels que des anticorps pour les immuno-marquages. Le phénotype dommageable affectant la survie (embryonnaire et postnatale) sera réalisé au moment du sevrage (3 semaines), le phénotype du système immunitaires sera réalisé à 8-10 semaines (période classique d’analyse pour laquelle le système immunitaire est pleinement fonctionnel), l'apparition de tumeur sera évaluée à 3 mois (les tumeurs surviennent généralement vers 6 mois, puisque nous voulons savoir s'il y a une accélération de l'apparition des tumeurs dans les modèles de souris double mutantes par un effet de synergie nous analyserons ces souris à 3 mois).

56 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle du syndrome de Bardet-Biedl qui les rend progressivement aveugles et obèses, elles subissent un prélèvement de queue pour génotypage puis un électrorétinogramme sous anesthésie, avant mise à mort pour prélever les yeux. Le porteur signale que l'examen peut lui-même provoquer une cataracte. L'objectif est de dater le début de la dégénérescence rétinienne pour cibler une fenêtre thérapeutique dans d'autres projets.

Objectifs

Le principal objectif de ce projet est de déterminer si, dans un modèle murin du syndrome de Bardet-Biedl, une maladie génétique rare qui mène à la cécité, la dégénérescence rétinienne caractéristique de ce syndrome est déjà présente dès l'âge de 14 jours et comment elle évolue jusqu’à l’âge de 3 mois. Pour cela, nous effectuerons des enregistrements de l’activité électrique de la rétine, qui traduit la fonctionnalité des cellules rétiniennes suite à une exposition à de la lumière, à différents âges et nous étudierons l'état de l'avancement de la dégénérescence de la rétine au niveau moléculaire.

Bénéfices attendus

Nous espérons mieux cerner le moment du début de la dégénérescence rétinienne afin de pouvoir cibler la fenêtre thérapeutique idéale dans d’autres projets que nous menons et qui visent à préserver la fonction visuelle chez ce modèle murin et à terme chez les patients.

Procédures

Lorsque les animaux seront âgés de 7 jours, un petit bout de queue sera prélevé pour le génotypage. Les animaux seront soumis, une seule fois et sous anesthésie générale, à l'enregistrement d'un ERG (électrorétinogramme), une méthode non invasive et non douloureuse qui dure au maximum 20 minutes.

Impact sur les animaux

Les souris atteintes du syndrome de Bardet-Biedl que nous allons étudier deviennent progressivement aveugles. Elles naissent plus petites que les souris saines et deviennent plus tard obèses. De plus, l’ERG peut parfois entraîner l’apparition d’une cataracte.

Devenir

Tous les animaux utilisés pour ce projet seront mis à mort après l'enregistrement de l'ERG pour prélever les globes oculaires et étudier l'état d'avancement de la pathologie au niveau moléculaire.

Remplacement

L’animal permet des études fonctionnelles et offre un contexte physiologique qui ne sont à l’heure actuelle pas possibles avec les modèles cellulaires et in silico.

Réduction

Un total de 56 souris sera nécessaire pour ce projet, un effectif déterminé d’après la littérature pour obtenir des résultats fiables et robustes.

Raffinement

Les souris seront maintenues en portoir ventilé et en cycle d’éclairement de 12h de jour / 12h d'obscurité. Elles évolueront en groupes sociaux dans un milieu enrichi en matériaux de nidification (bâtons de coton), dôme et bâtons de bois. Elles auront accès à l’eau et la nourriture à volonté. Elles seront surveillées de manière quotidienne pas le personnel zootechnique. Un suivi hebdomadaire plus approfondi avec scoring permettra de détecter, soulager et éventuellement mettre à mort un animal présentant des signes de souffrance ou de détresse. Suite à l’enregistrement de l’ERG, des animaux dont un œil ne s’ouvrirait pas correctement ou qui présenteraient des écoulements suite à l’ERG seraient mis à mort. De l’ocrygel pourra être appliqué pour prévenir/résorber une éventuelle cataracte.

Choix des espèces

De nombreux modèles murins du syndrome de Bardet-Biedl ont été générés et caractérisés dans le cadre d’études précédentes, dont le modèle que nous allons utiliser dans ce projet, qui récapitule le phénotype des patients et qui permet donc d’obtenir des informations essentielles sur l’évolution de la pathologie, et en particulier sur les stades précoces auxquels il est difficile d’avoir accès chez les patients. Les outils qui permettent d’évaluer la fonction visuelle (ERG) et de caractériser la rétine au niveau moléculaire sont disponibles et bien standardisés chez la souris. Nous comparerons des souris saines et malades âgées de 14 jours (âge de l’ouverture des yeux à partir duquel la rétine est fonctionnelle), 1 mois, 2 mois et 3 mois.