Procédures modérées

3 260 souris vont être utilisé·es, dont 2 960 réutilisées dans d'autres procédures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent des cellules souches humaines après irradiation, puis des injections, gavages et prélèvements sanguins répétés jusqu'à huit fois, avec un suivi par imagerie. Il s'agit d'une plateforme produisant à la demande des souris "humanisées" pour le système immunitaire, fournies à des laboratoires pour tester vaccins et traitements. Le porteur présente ce modèle comme une alternative au primate non-humain et affirme qu'il est le "seul modèle d'hématopoïèse humaine expérimentale".

Objectifs

L’étude in vivo de la physiopathologie de nombreux pathogènes humains ainsi que l’analyse de l’activité et de l’innocuité des traitements et vaccins contre ces pathogènes ne peut être réalisé chez l’Homme pour des raisons éthiques. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces pathogènes dans un modèle expérimental, des modèles de souris humanisées pour le système immunitaire (souris HIS) ont été développés au cours des deux dernières décennies. Ces souris HIS sont des modèles in vivo précliniques qui permettent d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…). Dans ce projet, nous proposons de produire des souris HIS qui seront par la suite soit utilisées par des laboratoires de recherche dans le cadre de leurs projets de recherche sur les pathologies humaines et/ou de développement de nouveaux vaccins ou traitements. Dans ce projet, nous testerons l’activité de nouvelles immuno-modulateurs thérapeutiques ou de nouveaux vaccins afin de tester leur activité et/ou leur impact sur le système immunitaire humain.

Bénéfices attendus

Ces souris HIS générées dans ce projet permettront d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène de pathogènes humains mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…).

Procédures

irradiation (1 par animal, durée : quelques minutes) - prélèvement sanguin (1 à 8 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 2 à 4 semaines) - injection hydrodynamique (1 par animal, durée 7-8 secondes) - injection intra-péritonéale (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1jour à 1 mois) ) - injection intra-veineuse (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - injection intra-musculaire (1 à 3 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1semaine à 1 mois) - injection sous-cutanée (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) -administration dans eau de boisson (1 à 8 par animal, durée 24h à 1 mois, intervalle 1 jour à 1 mois) - administration par gavage (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - imagerie IVIS (2 à 10 par animal, durée 5min, intervalle entre 3 jours et 1 mois)

Impact sur les animaux

Immunodéficience : du fait de leur degré d’immunodéficience, ces animaux sont très sensibles aux infections. TSLP : Après irradiation les souris transgéniques pour TSLP peuvent développer avec l’âge des tumeurs d’origine murine. Après humanisation, ces souris peuvent développer des dermatites. L’apparition des signes cliniques est suivie régulièrement et des soins seront apportés en cas d’apparition de symptômes. Irradiation : de potentiels effets néfastes à long terme de l’irradiation, tels que le développement de tumeurs, pourraient apparaitre. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). Injection Hydrodynamique : un risque de dyspnée peut arriver dans les 5-10 minutes après injection. Si une dyspnée est observée la souris sera mise à mort.

Devenir

Les animaux portant un système immunitaire humain générés dans une procédure pourront être inclus d'autres procédures du même projet (par exemple pour booster certaines cellules humaines, augmenter le nombre de cellules myeloides humaines, valider l’activité d’immuno-modulateurs) ou d'autres projets à la demande des utilisateurs de la plateforme). Les autres souris utilisées pour valider l’activité d’immuno-modulateurs seront mises à mort pour analyse des différents organes post-mortem.

Remplacement

Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble, contre des tumeurs ou des pathogènes à tropisme exclusivement humain ni de prédire l’efficacité et l’innocuité de nouveaux vaccins ou traitements immunomodulateurs contre ces tumeurs ou pathogènes. Historiquement, le modèle de choix pour ces études est le primate non humain, le modèle de souris HIS est un modèle alternatif qui peut permettre de limiter le nombre d’études sur le primate non humain.

Réduction

Nous évaluons notre niveau de production de souris HIS à 380 souris la première année, 570 la deuxième année, 770 chaque année pour les 3 années suivantes, soit un total de 3260 souris sur 5 ans. Ces chiffres ont été calculés en tenant compte 1. du nombre d’opérateurs de la plateforme (facteur limitant la production la première année et qui passera de 2 à 4 FTE entre les années 1 et 3), 2. du nombre d’utilisateurs intéressés par les modèles développés par notre plateforme qui est estimé à 4 la première année, 6 la deuxième année et devrait se stabiliser à 8 par an à partir de la 3ème année. 3. du fait qu’environ 80% des animaux présenteront un niveau d’humanisation >10%, 4. du fait que la plateforme fournira en moyenne 75 souris humanisées par utilisateur et par an (15 pour étude pilote et 30 pour expérience principale, en comptant 1 étude pilote et 2 expériences principales /utilisateur/an).

Raffinement

La planification des expériences en amont et la concertation entre le personnel de la plateforme et les utilisateurs sont des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des études pilotes seront réalisées en amont des études principales. Enfin, l’état clinique (pelage, mouvement, activité, pâleur, signes de bagarres, apparition de tumeurs) des animaux sera suivi deux fois par semaine pour permettre la détection de signes de souffrance. En cas d’apparition de signes de souffrance, un analgésique pourra être administré aux souris. Si les signes de souffrance persistent, une mise à mort sera effectuée pour prévenir toute souffrance inutile.

Choix des espèces

La souris humanisée présentant un système immunitaire humain (HIS) est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale. Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris HIS sont générées par injection de cellules souches isolées dans des souriceaux nouveau-nés de moins de 9 jours car les nouveaux nés sont plus permissifs à la greffe dans les premiers jours de vie. Le contrôle qualité par vérification du niveau d’humanisation dans le sang sera réalisé à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines. Ce nombre de semaines correspond au temps minimum nécessaire au développement du système immunitaire humain dans une souris à partir de cellules souches hématopoïétiques. Les souris HIS seront ensuite utilisées entre 12 et 25 semaines de vie. Cet intervalle d’âge correspond à la période pendant laquelle le système immunitaire humain est le plus stable chez la souris.

280 rats vont être utilisé·es, tous tués à l'issue sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte de la monocrotaline pour déclencher une hypertension artérielle pulmonaire, puis un anticorps anti-NGF, avant des mesures échographiques et de pression cardiaque sous anesthésie. Le porteur veut confirmer que bloquer le facteur de croissance NGF freine la maladie, avec des retombées thérapeutiques annoncées à terme. Il soutient que la maladie induite reste peu douloureuse faute d'effort imposé aux rats, et affirme que ces interactions complexes ne peuvent être reproduites in vitro.

Objectifs

L’hypertension artérielle pulmonaire ou HTAP est une maladie grave qui touche les artères pulmonaires conduisant le sang du cœur vers les poumons pour y être réoxygéné. Dans cette maladie, la pression augmente de manière anormale dans ces artères, et le cœur doit alors travailler plus fort pour envoyer le sang dans ces artères. A force de travailler plus, il finit par fonctionner mal, entrainant le décès des patients. Aucun médicament actuellement sur le marché ne permet de guérir cette maladie, et il faut donc essayer de développer des nouveaux médicaments plus efficaces. Nous pensons que développer un médicament qui bloquerait le facteur de croissance des nerfs NGF pourrait avoir un grand intérêt dans cette maladie. En effet, nos expériences sur cultures de cellules humaines suggèrent que le NGF participe à l’inflammation présente dans l’HTAP. Le NGF pourrait notamment attirer des cellules inflammatoires à proximité des artères pulmonaires, et ces cellules inflammatoires libèreraient alors des substances qui contribuent aux altérations de ces artères pulmonaires qu’on observe dans la maladie. Nous souhaitons à présent valider cette hypothèse dans un modèle plus intégré d’HTAP, en utilisant le modèle monocrotaline (MCT). Ce modèle d’HTAP chez le rat est classiquement utilisé dans la littérature et déjà en place au laboratoire. L’utilisation de ce modèle est nécessaire car nous ne pouvons pas modéliser en culture les interactions complexes qui existent entre les cellules inflammatoires et les cellules des artères pulmonaires, afin de déterminer quel est le rôle du NGF dans ces interactions. Ainsi, ce projet va nous permettre de traiter les rats avec un anticorps qui bloque le NGF et voir si ce traitement empêche le développement de la maladie, en modifiant l’inflammation et ses conséquences sur les artères pulmonaires.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de déterminer les conséquences du blocage in vivo du NGF sur le développement de l’HTAP, et en particulier sur sa composante inflammatoire. Ainsi, l’effet d’un traitement à l’aide d’anticorps bloquants anti-NGF sera évalué sur l’élévation des pressions ventriculaires droites et de la pression artérielle pulmonaire, sur le débit cardiaque et sur l’hypertrophie ventriculaire droite pour apprécier les effets bénéfiques sur les paramètres qui définissent l’HTAP. Puis l’effet de ce traitement sera évalué ex vivo sur l’infiltration des monocytes et leur activation dans le poumon, sur la sécrétion de substances inflammatoires et leurs conséquences sur les artères pulmonaires. Les résultats obtenus dans ce modèle nous permettront ainsi de mieux comprendre le rôle physiopathologique du NGF dans l’inflammation associée à l’HTAP, et ainsi de contribuer à confirmer que le NGF est une nouvelle cible thérapeutique d’intérêt dans cette pathologie.

Procédures

Dans la 1ère partie de la procédure, les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales. Ils en recevront au maximum 6 sur la durée totale du protocole (28 jours), réparties de la manière suivante : Jour 0 (Anticorps), Jour 1 (solvant ou monocrotaline), Jour 8 (Anticorps), Jour 15 (Anticorps) et Jour 22 (Anticorps). Les volumes injectés sont faibles à chaque injection (200 ou 500µl) et la durée d’injection est très courte (quelques secondes par animal). 240 animaux seront concernés par ces injections (groupes 3 à 14). Dans la 2ème partie de la procédure, les animaux seront soumis à des mesures in vivo, sous anesthésie gazeuse et analgésie complémentaire, afin de réaliser des mesures échographiques (durée : une dizaine de minutes par animal), puis des mesures de débit cardiaque et de pressions ventriculaires droites et artérielles pulmonaires (durée : une vingtaine de minutes par animal). L’ensemble des animaux seront concernés par ces mesures, soit 280 animaux.

Impact sur les animaux

L’injection intrapéritonéale est peu douloureuse lorsqu’elle est bien réalisée. Les injections de monocrotaline, de son solvant seul, des anticorps non pertinents ou des anticorps bloquants anti-NGF n’est pas décrite comme provoquant des douleurs post-injection dans la littérature. Toutefois, les signes cliniques de souffrance seront surveillés quotidiennement pendant la suite du protocole. Concernant le développement de la maladie en elle-même, chez l’homme, l’HTAP n’induit pas de souffrances élevées mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. Etant donné que les animaux ne seront pas soumis à l’effort, la souffrance est considérée comme légère dans ce type de protocole d’induction d’une maladie.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux, toujours sous anesthésie gazeuse, seront euthanasiés (sans réveil) et les expérimentations suivantes auront lieu sur tissus prélevés après euthanasie.

Remplacement

Ce projet a pour but d’identifier des mécanismes in vivo pour valider la pertinence des résultats obtenus in vitro. En effet, nous recherchons à identifier un lien entre NGF, monocytes, IL-1b et altérations des artères pulmonaires. Nous avons réalisé des expériences in vitro qui nous ont permis notamment de montrer que le NGF stimule la libération d’une substance inflammatoire qui induit in vitro différents effets sur les cellules artérielles pulmonaires humaines en culture. Pour montrer que le blocage du NGF et de ce mécanisme conduit à des effets bénéfiques sur le développement de l’HTAP, ce projet nécessite à présent l’utilisation d’animaux pour modéliser cette pathologie in vivo (pathologie impossible à modéliser in vitro de manière complète pour le moment) et pour valider l’utilisation d’anticorps bloquants anti-NGF comme traitement possible de l’HTAP.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux à utiliser est basée sur les analyses des études déjà menées au laboratoire sur ce même modèle compte-tenu de la taille requise des échantillons pour une analyse statistique pertinente dans ce type de recherche. De plus, cette estimation tient également compte des données de la bibliographie et du fournisseur qui décrivent un effet variable de la monocrotaline en fonction des lots commandés. Pour optimiser le nombre d’animaux utilisés : (1) le plan d’expériences a été optimisé afin de pouvoir réaliser les expériences in vivo et ex vivo sur les mêmes animaux et afin d’utiliser les deux poumons de chaque animal (utilisation par exemple du poumon gauche pour les expériences de contraction et utilisation du poumon droit pour l’étude de l’expression de différentes protéines d’intérêt) (2) parallèlement à ce protocole, des études continueront à être réalisées sur des cellules d’artères pulmonaires humaines en culture afin d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans les effets observés. Ainsi, nous optimiserons l’utilisation des animaux et les remplacerons par des cellules humaines autant que possible. Au final, cette démarche nous a conduit à un protocole utilisant 14 groupes comptant chacun 20 animaux, soit un total de 280 animaux (140 mâles et 140 femelles, puisque nous souhaitons également explorer les différences éventuelles des effets observés en fonction du sexe). Ce nombre sera réduit si les résultats obtenus sont statistiquement significatifs (ou résolument non significatifs) avant la fin de la totalité des séries prévues. Les expérimentations sont planifiées pour obtenir un maximum de résultats expérimentaux sur un nombre d’animaux le plus faible possible (mesures échographiques, de débit cardiaque et de pression artérielle pulmonaire puis expériences ex vivo ultérieures après euthanasie réalisées sur les mêmes animaux, une seule procédure).

Raffinement

À leur arrivée, les animaux sont hébergés en cages collectives, pourvues d’enrichissement du milieu (litière : copeaux de peuplier ; enrichissement : papier tressé, morceaux de bois, tunnels et maisons en carton). 2 à 3 animaux seront hébergés dans chaque cage. La nourriture et l’eau seront données à volonté, et le change effectué une fois par semaine (cage, litière, biberon). Un suivi quotidien (week-ends, vacances et jours fériés inclus) des animaux sera effectué par le personnel de l’animalerie pour prévenir tout inconfort, souffrance ou comportement anormal des animaux. Au moment de cette procédure expérimentale, les animaux seront observés et cette surveillance portera sur le suivi du poids des animaux, sur leur apparence, et sur des paramètres comportementaux (mobilité, interaction avec ses congénères, peur, agression, vocalisation, automutilation, activité diminuée ou augmentée, prostration). Une feuille de suivi des animaux, sur laquelle sont précisées les conduites à tenir en cas de problème de santé de l’animal, sera complétée. L’expérience des personnels de l’animalerie nous garantit un bon suivi des animaux. Si le suivi du poids fait apparaitre une perte de poids des animaux supérieure à 5% par rapport à leur poids initial, une mise à disposition de nourriture humidifiée posée directement au fond de la cage sera effectuée, jusqu’à ce qu’une amélioration de l’état de l’animal soit observée. Les animaux seront sacrifiés en cas de perte de 20% de poids par rapport à leur poids initial, ou si l’animal perd 10% de son poids par rapport à la dernière pesée. En cas de détection de signe de douleur, dans un premier temps, une administration d’antalgique sera réalisée, et l’animal en souffrance sera alors surveillé toutes les demi-heures pendant deux heures. En cas de souffrance ou de détresse persistante au-delà de cette période malgré l’administration d’antalgique, une procédure d’euthanasie sera mise en œuvre.

Choix des espèces

Le rat est une espèce classiquement utilisée pour le développement de modèles d’hypertension pulmonaire. De plus, le laboratoire utilise cette espèce depuis plusieurs années, et dispose donc de nombreuses données sur lesquelles s’appuie le présent projet. Le modèle monocrotaline est le modèle que nous souhaitons utiliser dans cette DAP pour compléter des expériences déjà réalisées avec ce modèle. Le choix du rat est d’autant plus justifié par le fait que le modèle monocrotaline ne fonctionne pas chez la souris. En effet, pour être active et induire le développement d’une hypertension pulmonaire, la monocrotaline doit être métabolisée en un dérivé, appelé monocrotaline pyrrole, par des enzymes présentes dans le foie. Or ces enzymes nécessaires à cette réaction n’existent pas chez la souris. Ce modèle monocrotaline ne fonctionne donc pas chez la souris, et nécessite forcément l’utilisation du rat. Nous utiliserons des rats jeunes de 200g. Le protocole utilisé se déroule sur 4 semaines et les données de la littérature ainsi que les résultats précédents obtenus au laboratoire préconisent d’utiliser des rats de ce poids pour ce type de protocole. En effet, au-delà de 200g en début de protocole, l’injection de monocrotaline est décrite comme moins efficace pour entraîner le développement d’une hypertension artérielle pulmonaire.

156 primates, 78 macaques à longue queue et 78 macaques rhésus, vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une à deux chirurgies cérébrales, des IRM sous anesthésie tous les six mois, des prélèvements de liquide céphalorachidien mensuels et des prises de sang tous les quinze jours, avant une mise à mort par perfusion intracardiaque. Le projet crée des modèles de maladies neurodégénératives comme Alzheimer et Parkinson, dont les retombées thérapeutiques restent une perspective. Le porteur affirme qu'aucun modèle in silico n'est valide et justifie le recours au primate par sa "proximité avec l'homme".

Objectifs

De nos jours dans le monde environ 36 millions de personnes sont atteintes de démences, dont 25 millions pour la maladie d’Alzheimer et 6 millions pour la maladie de Parkinson. En raison du vieillissement progressif de la population et de l'absence de traitement, le nombre de personnes souffrant de maladies neurodégénératives augmente considérablement et devrait croître de manière régulière dans les années à venir. Qu'elles soient génétiques ou acquises, leurs mécanismes d’initiation liés à des causes multifactorielles sont mal connus. Ainsi, il est nécessaire de créer et maîtriser des modèles le plus proche possible de la réalité pathologique. L’étude proposée ici permettra aux travers de différents modèles de primates non-humains de maladies neurodégénératives, d’étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de l’initiation et de l’installation des différentes pathologies afin de définir des nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les maladies neurodégénératives sont une cause majeure d’invalidité, de dépendance, d’institutionnalisation et d’hospitalisation. Elles ont un impact très important sur la qualité de vie des personnes atteintes ainsi que sur celle de leurs proches et de leurs aidants, et touchent ainsi une part importante de la population. Les traitements actuellement disponibles sont à visée symptomatique et d’efficacité relative. Mieux comprendre les mécanismes à l’origine de ces pathologies c’est trouver les traitements de demain.

Procédures

Une chirurgie (2 heures environ), ou deux maximum, espacées de 1 mois. Imagerie : IRM sur animal anesthésié, avant la chirurgie, 48 heures après et tous les 6 mois. La durée de l'IRM est de 1h30 à 2h. Prélèvements sanguins de quelques minutes tous les 15 jours sur animaux vigiles en contention légère. Prélèvements de liquide céphalorachidien de l'ordre de 5 minutes une fois par mois sous anesthésie légère.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie ou aux prélèvements biologiques. Pour la chirurgie : stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible et infection au niveau des points de sutures. Pour l’imagerie : anesthésie. Pour les prélèvements liquide céphalorachidien (LCR) et sang : stress de l’anesthésie pour le LCR et de la contention (légère et rapide) pour le sang.

Devenir

Les animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque aux temps expérimentaux définis. Le cerveau et éventuellement d’autres tissus seront alors prélevés puis mis à disposition pour réaliser les analyses post-mortem.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du PNH car il n’existe pas de modèles mathématiques ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier les processus neurodégénératifs. Nous recherchons à travers l’utilisation des modèles animaux complexes et intégrés à mimer la pathologie humaine, impossible à trouver dans des modèles cellulaires. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme) pour étudier les mécanismes impliqués dans ces processus est une étape nécessaire à la découverte de nouvelles voies thérapeutiques

Réduction

Nos modèles sont générés sur un plateau de haute technicité (cadre stéréotaxique, Imagerie, stabulation) nous permettant la manipulation des animaux dans les meilleures conditions (chirurgie, déplacement…) et une grande reproductibilité dans les différents modèles ce qui limite le nombre d'animaux. Les prélèvements cérébraux réalisés à chaque fin d’étude sont destinés de prime abord aux études histologiques visant à identifier des marqueurs pour déterminer de nouveaux traitements, et servent également à renforcer notre banque de tissus (cérébrothèque) afin de proposer à la communauté scientifique des tissus de PNH et ainsi réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les chirurgies sont faites sous anesthésie générale et avec une couverture antalgique permettant de réduire le plus possible les douleurs ressenties, et des dispositifs de raffinement (monitoring cardiaque et respiratoire, maintien de la température corporelle, asepsie). Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’état des animaux est observé et quantifié selon des critères objectifs permettant d’établir des scores de bien-être et de déterminer des points limites à partir desquels les actions adaptées sont menées (des massages, le maintien de l’animal au chaud à l’aide d’une couverture, la modification de la nature et le change plus régulier de la litière, l’augmentation de la fréquence des pesées, le gavage avec des complément alimentaire, lait enrichi et jus sont quelques outils dont nous disposons en dehors de la sphère médicamenteuse pour améliorer l’état de santé de nos animaux).. . Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adapté au poids de l’animal, Les prélèvements de LCR sont faits sur animaux sédatés. Les prélèvements de sang sont réalisés sur animaux vigiles avec une légère contention. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée. L’échelle de bien être est là aussi utilisée pour estimer la gêne occasionnée par ce geste. Les animaux seront hébergés ensemble, dans une structure spécialement agrée pour l’hébergement et l’utilisation des PNH en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce (volière, nourriture variée, « jouet », fond sonore, etc.).

Choix des espèces

Ces modèles ont déjà été réalisés et validés chez les rongeurs (rats, souris), comme base d’étude des maladies neurodégénératives, mais la proximité d’espèce avec l’homme en fera toujours un modèle de choix, surtout dans la détermination de marqueurs prédictifs. Les maladies neurodégénératives sont des maladies chroniques progressives qui touchent le système nerveux central. Leur fréquence augmente avec l'âge chez l’homme. Afin d’être au plus près de cet état, dans ce projet, les animaux utilisés seront donc adultes.

1 408 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un groupe de 384 subit une chirurgie stéréotaxique du cerveau, les autres reçoivent jusqu'à cinq médicaments et enchaînent jusqu'à cinq batteries de tests comportementaux, avant une perfusion transcardiaque. L'objectif est de valider un nouveau modèle murin d'un trouble neurodéveloppemental rangé dans le spectre de l'autisme, les pistes thérapeutiques étant renvoyées à de futures études. Le porteur affirme qu'aucune méthode ne reproduit "la complexité du cerveau", ce qui rendrait le modèle animal "indispensable".

Objectifs

Récemment, plusieurs cas de mutations dans un gène codant pour une kinase ont été liés de manière causale a des troubles neurodéveloppementaux. Ces maladies sont caractérisées par un retard de développement, une déficience intellectuelle et d’autres anomalies comportementales qui font la font entrer dans les troubles du spectre autistique. Notre objectif est de valider un nouveau modèle expérimental d'un trouble neurodéveloppemental chez la souris. Nous rechercherons d’éventuelles anomalies comportementales s’apparentant aux symptômes de la pathologie. Des études biochimiques seront ensuite réalisées sur les tissus cérébraux de souris issus de ces souris pour tenter d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués. Ces études devraient permettre d’améliorer les connaissances sur cette pathologie dans le but de développer des thérapies pour aider les patients du spectre de l'autisme. Ce projet mettra en jeu des procédures d’administration de substances pharmacologiques avant évaluation des conséquences biochimique et comportementales (fonctions motrices, cognitives, émotionnelles et sociales), suivi par perfusion transcardiaque pour analyse du tissue. Cette étude qui nécessite une approche comportementale n’est possible qu’à l’échelle de l’organisme entier et ne peut être reproduite in vitro ni ex vivo. Ce projet s’effectuera dans le respect de la règle des 3R, en veillant au bien-être des animaux et en limitant leur douleur. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace des résultats grâce aux données collectées au cours d’expériences précédentes. Les animaux seront observés quotidiennement et évalués à l’aide de points limites bien définis. En conclusion, notre travail vise à identifier les déficits neurobiologiques et comportementaux qui sont présents dans un modèle murin d'un trouble neurodéveloppemental, permettant de futures études thérapeutiques de ce syndrome. Ce projet apportera des données anatomiques, biochimiques et fonctionnelles cruciales pour appréhender les mécanismes mis en jeu dans le spectre de l'autisme et pourrait ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.

Bénéfices attendus

En conclusion, notre travail vise à identifier les déficits comportementaux dans un nouveau modèle expérimental d'un trouble neurodéveloppemental permettant de futures études thérapeutiques. Ce projet apportera des données anatomiques, biochimiques et fonctionnelles cruciales pour appréhender les mécanismes mis en jeu dans le spectre de l'autisme et pourrait ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.

Procédures

Au total, 1408 animaux sur 3 ans seront utilisés et subiront une batterie de tests comportementaux. Parmi les 8 groupes expérimentaux différents, un groupe (384 animaux) subira une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie complète (durée de 20 minutes) et avec un traitement analgésique avant et jusqu'à 2 jours après la chirurgie. Aucun effet indésirable n'est attendu sur la base de notre expérience. Les autres animaux (1024) subiront des tests comportementaux jusqu'à 5 paradigmes différents, les tests étant espacés d'au moins une semaine entre chaque paradigme. Au total, 5 médicaments différents (dont 4 en aigue, par injection i.p, et un chroniquement pendant 3 semaines, administré dans l'eau à boire) seront administrés à des animaux éveillés. Aucun de ces médicaments n'ést préjudiciable au bien-être de l'animal. Une prise de sang sera effectuée au niveau de la veine caudal, à l'aide d'un tube capillaire, via une légère incision à l'extrémité de la queue, poirtant un faible risque d'hémorragie.

Impact sur les animaux

La chirurgie stéréotaxique de la souris est réalisée sous anesthésie générale et, normalement, tous les animaux survivent à cette procédure sans nécessiter de soins analgésiques prolongés. Neanmoins, des protocoles de soins pré et post opératoires sont mis en place pour éviter la sensation de douleur. Certains des tests comportementaux ont un impact modérément stressant sur les souris, mais nous surveillons régulièrement le bien-être des souris, leur poids, leur toilettage et leur comportement social, et nous n'avons pas constaté d'effets néfastes durables dans les expériences réalisées précédemment.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience. Nous utiliserons le tissu cérébral pour des analyses biochimiques et d'imagerie

Remplacement

A l’heure actuelle, il n'existe pas de méthode de remplacement permettant de reproduire la complexité du cerveau, ce qui rend l’utilisation d’un modèle animal indispensable à la réalisation de ce projet.

Réduction

La taille de chaque groupe sera de 16 animaux par condition expérimentale. Nous avons précédemment utilisé cette taille de cohorte pour des expériences comparables et avons atteint de différences significatives dans nos expériences (p

Raffinement

Pour éviter toute souffrance, les procédures de chirurgie se feront sous analgésie et anesthesie générale. Les souris seront observées régulièrement et une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. Tout signe de douleur, souffrance, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques. Les souris seront logés à raison de 5 compagnons (frères, soeurs) par cage dans un environnement enrichi.

Choix des espèces

L’espèce souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux. Les souris présentent un système nerveux suffisamment développé pour permettre une extrapolation des résultats à l’espèce humaine. De plus, les modèles transgéniques utilisés dans ce projet ont été créés chez la souris. Animaux seront utilisés au stades infantiles (2 semaines), juvéniles (4 semaines) et adultes (12 semaines). Tous les animaux seront testés dans das tests comportementaux entre 3 et 6 mois, pour définir les phénotypes chez la souris adulte.

28 poulets vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont gavés pendant dix jours de nitrofurazone, un antibactérien interdit et cancérogène, ou de son métabolite, subissent jusqu'à huit prélèvements sanguins, puis sont tués par groupes à quatre échéances pour prélever plasma, foie et muscle. L'objectif est réglementaire, mesurer la cinétique d'un traceur permettant de repérer l'usage illégal de cette molécule dans les élevages avicoles, en particulier à l'importation. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet cette étude cinétique et la juge "indispensable" sur "l'espèce cible".

Objectifs

La nitrofurazone est un principe actif antibactériens, interdit depuis 1995 sur tout le territoire Européen. Cette molécule présente une toxicité avérée (cancérogène, mutagène) et représente donc un risque pour le consommateur. Cependant, de la nitrofurazone peut être trouvée dans les denrées alimentaires d’origine animale et qui sont destinées à la consommation humaine. Sur le plan cinétique la nitrofurazone est rapidement métabolisées et ce dès les premières heures après son administration. De ce fait la surveillance des résidus de nitrofurazone dans les denrées d’origine animale est basée uniquement sur la surveillance d’un métabolite, le semicarbazide (SEM). Ce métabolite est plus persistant au niveau des muscles et du foie avec des demi-vies d’élimination respectivement de 4,5 jours et de 2,2 jours. Cependant, le SEM n’est pas spécifique de la nitrofurazone et il peut être détecté dans certains produits alimentaires d’origine animale, notamment lorsque ces denrées ont subi un procédé agroalimentaire (transformation industrielle par exemple) alors qu’il n’y a pas eu usage d’un traitement vétérinaire chez l’animal producteur de la denrée. Ce manque de spécificité implique que le contrôle basé uniquement sur le SEM peut engendrer des résultats d’analyse faussement positif. Un autre métabolite a été identifié et il pourrait être utiliser pour détecter l’utilisation de nitrofurazone en élevage. Ce métabolite est le 5-nitrofuraldéhyde. Cependant aucune information n'a été publiée sur sa cinétique et en particulier sur- ses caractéristiques cinétiques telle que sa vitesse d’élimination de l’organisme et sur sa persistance dans les tissus d’animaux. Ce projet permettra de générer des connaissances sur le devenir et la persistance de la nitrofurazone et de son métabolite le 5-nitrofuraldéhyde dans les matrices animales (muscle, foie), chez le poulet, et d’établir si ce métabolite peut devenir le traceur pour suivre l’utilisation de la nitrofurazone dans les élevages aviaires, en particulier lors d’importation.

Bénéfices attendus

L’usage de la nitrofurazone a été interdite sur tout le territoire de l’Union Européenne. Le dépistage dans les denrées alimentaires d’origine animale est basée sur la détection du métabolite marqueur persistant, le SEM qui se lient aux protéines des tissus animaux. L’analyse de ce métabolite traceur peut engendrer des résultats d’analyse faussement positifs car il peut provenir d’autres sources. On ne peut donc pas distinguer si l’occurrence du SEM dans les aliments d’origine animale provient d’un traitement thérapeutique illégal en élevage par nitrofurazone ou bien d’une contamination par exemple lors du processus de transformation agro-alimentaire. Notre projet s’intéresse donc sur l’analyse du 5-nitrofuraldéhyde qui est un autre métabolite potentiel à tous les nitrofuranes. L’étude pharmacocinétique réalisée in vivo documentera le devenir du 5-nitrofuraldéhyde et de la nitrofurazone afin de caractériser le métabolisme, la persistance, et la demi-vie dans différents organes du poulet.

Procédures

Des prélèvements sanguins sont prévues sur les poulets avant et lors de l’exposition avec la nitrofurazone et le 5- nitrofuraldehyde (sur la durée de l’étude, 8 prélèvements maximum de 0.5 ml de sang par animal traités). La durée des prélèvements sera environ de 30 secondes. Les poulets témoins seront mis à mort avant l’exposition au nitrofurazone et le 5-nitrofuraldehyde. Les animaux seront traités pendant 10 jours par voie orale (durée du gavage 1à 2 minutes). Il a été prévu quatre échéances (4 dates différentes) de mise à mort. A chaque échéance trois poulets exposés au nitrofurazone et trois poulets exposés 5-nitrofuraldéhyde seront mis à mort pour prélever différent tissus et organes. Ces opérations seront effectuées par des opérateurs habilités et expérimentés

Impact sur les animaux

Le gavage ainsi que les prélèvements sanguins seront effectuées sur des poulets vigiles par des opérateurs formés ce qui limitera le stress de l’animal.

Devenir

Les poulets seront mis à mort pour obtenir différents tissus et organes (plasma, foie et muscle) afin d’en évaluer la teneur en nitrofurazone et en nitrofuraldéhyde.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle in vitro permettant de réaliser une étude de cinétique. En conséquence l’étude pharmacocinétique simultanée de la nitrofurazone et de son métabolite le 5-nitrofuraldéhyde est indispensable après que des animaux reçoivent de la nitrofurazone. Cela permettra d’étudier la cinétique des molécules dans le plasma et dans le foie et le muscle. La comparaison avec l’administration du métabolite seul permettra d’évaluer si sa cinétique est influencée par la présence de nitrofurazone. Il est également important que cette étude soit réalisée chez l’espèce cible.

Réduction

Le nombre de poulet nécessaire à la modélisation de la cinétique des résidus est de 28 poulets (1 parquet de 4 Témoins, 2 parquets de 6 pour le traitement avec la nitrofurazone et 2 parquets de 6 pour le traitement avec le 5- nitrofuraldéhyde). Les prélèvements de sang seront réalisés sur 3 poulets par échéance de temps. La quantité de sang prélevé par animal n’excédera pas 10% du volume total sanguin de l’animal. Il est prévu quatre échéances de mise à mort ou le muscle et le foie seront prélevés afin d’établir la présence et la quantité de nitrofurazone et de son métabolite. La modélisation cinétique basée sur les répétitions des animaux aux échéances permettra de caractériser la variabilité interindividuelle des paramètres cinétiques et d’établir un modèle cinétique qui a terme permettra de réduire le nombre d’animaux. Il ne sera pas réalisée d’analyse statistique comparative, la modélisation permettant de réaliser une description quantitative et qualitative de l’évolution des concentrations chez le poulet.

Raffinement

Dans un premier temps, avant de commencer les procédures expérimentales, une phase d'acclimatation des poulets de 7 jours sera effectuée pour habituation au nouvel environnement : 5 parquets au sol seront à disposition et permettra la répartition de 6 animaux traités par parquet et 4 pour le lot témoin. Ces espaces permettront de favoriser la mobilité grâce à une répartition de zone d’enrichissement pour les animaux soit par l’espace paillé sollicitant le fouissage, zone perchoir qui constituera la zone de repos et une zone alimentation avec un accès illimité à l’eau et à la nourriture. La manipulation des animaux sera effectuée par des opérateurs formés afin de minimiser le stress des animaux. Une contention régulière sera effectuée pour habituation à l’immobilisation notamment lors des pesées. Une température d’ambiance sera appliquée allant de 23 degrés à leur arrivée et diminuant en fonction du développement de leur plumage. Le respect des rythmes de luminosité sera respecté par un passage de 8h d’obscurité durant les nuits. Une surveillance quotidienne du comportement et de l’état général des animaux sera effectuée au regard de leur consommation d’eau, de leur alimentation, et en effectuant des mesures du poids. Ces points clefs vont déterminer les points limites qui seront appliqués dès l'apparition de signes précoces de la douleur. Il ne sera pas possible d’utiliser une co-médication pour éviter d’éventuelles interactions. Néanmoins, une mise à mort compassionnelle pourra être effectuée si les points limites sont atteints.

Choix des espèces

Le poulet de chair est l’espèce la plus importante en élevage avicole et c’est également la viande la plus importés en ce qui concerne les volailles. C’est donc l’espèce cible qu’il faut étudier pour établir la cinétique de la nitrofurazone et de son métabolite. Au début de l’expérimentation, les poulets seront âgés de 3 semaines (soit une moyenne d’1kg à l'arrivée des animaux). Ce stade correspond à l'âge standard des animaux traitées sur élevage conventionnel.