Procédures modérées
Evaluation de la fermentation in vitro d’ingrédients ou d’émissions de gaz à partir de matière fécale et urinaire de porcelet sevré élevé dans différentes conditions d’élevage
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
240 porcelets vont être utilisé·es, dont 78 tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent jusqu'à trois prélèvements de fèces par stimulation rectale à l'écouvillon et des collectes d'urine par une poche collée sous l'abdomen, sous contention par une cordelette serrée autour du groin. Le protocole dégrade volontairement les conditions d'élevage, température de 16 à 33°C, hygiène réduite, densité supérieure au seuil réglementaire de l'expérimentation et rationnement alimentaire, pour se rapprocher d'un élevage commercial et tester des additifs destinés à la "production porcine". Les 162 porcelets gardés vivants repartent dans le circuit de production, et le porteur affirme que le porcelet, "espèce cible", ne peut être remplacé.
Objectifs
Ce projet vise à prélever des échantillons biologiques (fèces et urine) chez le porcelet sevré âgé de 21 à 70 jours et élevé dans différentes conditions d’élevage afin de pouvoir évaluer la fermentation d’ingrédients in vitro. Des bénéfices in vivo de ces ingrédients sont attendus sur la santé et les performances des animaux. En effet, les fermentations des fibres telles que les prébiotiques induisent la production d’acides gras à chaine courte et promeuvent la croissance des bactéries commensales d’où les bénéfices attendus en termes de santé digestive chez les animaux. Ces métabolites produits lors des fermentations peuvent également être utilisés comme source énergétique par l’hôte et ainsi contribuer à l’apport nutritionnel de la ration. De plus, la mise en contact in vitro de fèces et d’urine permet d’évaluer l’impact d’un aliment sur les émissions de gaz dans l’environnement (ammoniac, sulfure d’hydrogène…) et donc de concourir à l’amélioration de l’impact environnemental de la production porcine.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la mise en marché d’une ou plusieurs solutions nutritionnelles ou additifs permettant d’améliorer la santé des porcelets par la modulation de la composition et de l’activité du microbiote intestinal pendant la phase de post-sevrage et/ou de réduire les émissions de gaz et autres polluants dans l’environnement.
Procédures
Un maximum de 3 prélèvements de fèces pourra avoir lieu sur les porcelets par essai. Les sessions de prélèvement de fèces seront espacées d’au moins 5 jours. La récolte des fèces se fait par légère pression sur l’abdomen du porcelet ou par légère stimulation rectale pendant une minute à l’aide d’un écouvillon introduit dans le rectum. Les prélèvements de fèces seront réalisés à l’intérieur de la case afin de limiter le stress ressenti, soit sans contention particulière dans les bras de l’opérateur, soit à l'aide d'une cordelette placée autour du groin et fixée à l'extrémité d'un bâton avec lequel l'animalier serre le nez des animaux. De plus, jusqu’à 3 collectes d’urine pourront avoir lieu sur les porcelets par essai. Les sessions de prélèvement d’urine seront espacées d’au moins 5 jours. La récolte des urines se fera grâce à une poche de collecte d’urine (type poche de stomie comme utilisé chez l’homme) collée grâce à du sparadrap sous l’abdomen des porcelets mâles. Pour cela, l’animal est porté dans les bras par un opérateur puis un second vient coller cette poche sous l’abdomen. Le porcelet est ensuite remis dans sa case. Le décollage de la poche de collecte d’urine s’effectue de la même manière. Cette dernière sera gardée maximum 7 heures, afin d’obtenir un volume suffisant d’urine. Les prélèvements de fèces et d’urine pourront être réalisés indépendamment les uns des autres.
Impact sur les animaux
La modification des conditions d’élevage pourra concerner 60 porcelets. Ces modifications des conditions d’élevage impliquent la modulation des conditions d’hygiène (présence ou absence de nettoyage et/ou désinfection), la variation de la température de 16°C à 33°C et/ou de la ventilation. Ainsi, ces modifications peuvent créer des situations d’inconfort sanitaire pour les porcelets. En effet, des températures plus faibles en dessous de la zone de thermoneutralité (< 24°C) et de mauvaises conditions d’hygiène peuvent engendrer des troubles digestifs comme de la diarrhée. Des températures au-dessus de la zone de thermoneutralité placent l’animal en situation de stress thermique, ce qui peut induire une fréquence respiratoire plus élevée et un appétit plus faible. De plus, la densité à partir de 55 jours d’âge, c’est-à-dire lorsque les animaux atteignent environ 20 kg, sera plus élevée que ce qui est exigé dans la réglementation expérimentation puisqu’elle sera de 0,36 m²/porc. Cette densité n’est autorisée en expérimentation animale que pour des porcelets jusqu’à 20 kg et doit ensuite être de 0,50 m²/animal pour des porcelets entre 20 et 30 kg. Toutefois, la réglementation élevage exige une surface minimale de 0,30 m²/animal pour des porcelets jusqu’à 30 kg, ce qui correspond à nos conditions. En effet, le but est de se placer dans des conditions proches d’un élevage commercial. L’utilisation d’additifs alimentaires non enregistrés dans l’Union Européenne pourrait également engendrer une baisse de la consommation entrainant un ralentissement de la croissance d’environ 10-15%. Il faut toutefois préciser qu’il existe une forte variabilité de la croissance des porcelets en élevage commercial. Les additifs qui seront testés pourront être des additifs ayant déjà été testés sur animaux ailleurs que dans l’Union Européenne ou déjà utilisés en nutrition humaine. Au maximum, 18 porcelets pourront recevoir des additifs non enregistrés. Les animaux pourront être rationnés entre 75% et 95% du niveau ad libitum observé dans l’élevage. Cela pourra créer de la compétition à l’auge pouvant entrainer de l’agitation et de légères griffures. Enfin, les prélèvements d’échantillons biologiques peuvent induire un stress lors de la manipulation des animaux (prélèvements de fèces et d’urine). Les prélèvements de fèces seront réalisés par stimulation rectale à l’aide d’un écouvillon introduit dans le rectum pouvant créer de légères irritations.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés et exclus du circuit de consommation humaine s’ils ont reçu un additif non enregistré au sein de l’Union Européenne ou lorsque des prélèvements d’organes, de contenu intestinal ou d’autres tissus sera nécessaire. Ainsi, au maximum, 60 porcelets (10 essais x 6 porcelets) pourront être euthanasiés afin de prélever des échantillons biologiques (tissus, contenu caecal…) post-mortem et 18 porcelets (3 essais x 6 porcelets) ayant reçu un additif non enregistré pourront également être euthanasiés, soit un total de 78 porcelets mis à mort. Les autres animaux seront maintenus en vie et continueront leur cycle de production dans un élevage commercial.
Remplacement
Ce projet vise à développer des méthodes non animales (in vitro) en s’appuyant sur des échantillons d’urine et de fèces qui permettront de ne plus utiliser l’animal pour l’étude de certains aliments, matières premières ou additifs. Ainsi, il n’est pas possible de prélever d’autres animaux car le porcelet est l’espèce cible du projet. A ce jour, ces prélèvements ne peuvent pas être obtenus autrement que via un animal vivant. En effet, il existe des spécificités d’espèce, notamment avec un microbiote spécifique et des mécanismes de régulation physiologiques (endocrinologie, métabolisme digestif…) propres au porcelet.
Réduction
Le nombre de 5 porcelets (+ 1 porcelet remplaçant en cas de problème sanitaire ou mort de l’un des porcelets) a été défini comme étant le nombre minimal pour préparer un inoculum digestif (fécal…) de bonne qualité, c’est-à-dire présentant une diversité microbienne suffisante afin d’être représentative d’un microbiote moyen et une quantité de matière suffisante permettant la mise en culture in vitro de 30 flacons. Un flacon constituera donc une unité expérimentale. La littérature scientifique n’indique pas de nombre minimal d’échantillons à prélever pour mener à bien un essai in vitro et constituer un inoculum. Les données trouvées citent entre 5 et 15 porcelets prélevés. Le nombre de modalités expérimentales variera entre 2 et 6, c’est-à-dire que nous comparerons entre 2 et 6 groupes expérimentaux in vitro. Afin de disposer de suffisamment de réplicas (= flacons) pour chaque groupe expérimental considéré (15 minimum afin de détecter comme significatives des différences de l’ordre de 10%), ce suivi des fermentations pourra être répété 2 à 3 fois sur les mêmes animaux (donc âge des animaux évoluant entre les 3 prélèvements). Si l’on souhaite disposer d’inoculum obtenu sur des animaux de même âge, il conviendra alors de réaliser 2 ou 3 essais successifs impliquant ainsi 2 ou 3 lots de 6 porcelets différents. Dans ce cas, les animaux ne seront prélevés qu’une seule fois par essai. Notre modèle in vitro permet donc de limiter le recours à des animaux puisqu’à partir de 5 porcelets (+ 1 remplaçant), 30 flacons contenant l’inoculum pourront être préparés puis attribués à l’une des modalités expérimentales comparées. En ayant recours à des études in vivo, ces 30 flacons issus de 5 porcelets auraient été remplacés par un minimum de 30 animaux donneurs. L’exploitation des données par un test statistique ne se fait que sur les données produites (volume de gaz, microbiote…) par la mise en culture in vitro et non pas sur les données collectées sur les animaux.
Raffinement
L’état de santé des animaux sera vérifié quotidiennement par les techniciens animaliers de l’EU. Des points limites stricts et définis à l’avance sont appliqués tout au long du projet. De plus, le nombre de tentatives de collectes d'échantillons biologiques sera limité et la manipulation des animaux sera restreinte afin de réduire la souffrance ou le stress appliqué à ces animaux.
Choix des espèces
L'espèce choisie pour la réalisation du projet est le porc car les phénomènes physiologiques (digestifs, métaboliques, endocrinologiques) pouvant interférer avec le microbiote fécal sont hautement spécifiques de l'espèce porcine. De plus, la spécificité des conditions d'élevage de cette espèce de rente ne permet pas de la remplacer par une autre espèce modèle. Enfin, le porc est l’espèce cible des traitements testés. Les animaux utilisés seront des porcelets sevrés âgés de 21 à 70 jours.
Analyse comparée des protocoles d’administration de la FENM et de la Mémantine sur les paramètres comportementaux, biochimiques et physiologiques dans différents modèles murins de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
636 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans un ventricule cérébral sous anesthésie, des injections répétées et une pompe implantée sous la peau, puis passent des tests de mémoire dont un évitement passif où un stimulus électrique est appliqué sur les pattes. Le porteur présente les injections comme peu douloureuses et évoque un léger stress lors des tests. Il affirme que les modèles murins transgéniques développant progressivement la maladie d'Alzheimer sont les plus performants pour analyser les propriétés d'une molécule.
Objectifs
Ce projet de thèse a pour but de documenter de façon exhaustive la stratégie clinique qui sera sélectionnée pour le développement de la FENM dans la MA
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de préciser les effets pharmacologiques in vivo d'un candidat médicament et apporter des informations importantes avant le développement clinique de cette molécule de nouvelle génération potentiellement efficace pour modifier de façon durable le décours de la maladie, car neuroprotectrice.
Procédures
Une injection intracérébroventriculaire sera réalisée sous anesthésié gazeuse (durée 3 min). Injections intrapéritonéales pendant 7 jours (moins d'une minute). Les souris auront sous anesthésie une incision cutanée pour la pose de la pompe qui délivre le composé en continu (durée 5 min). Les capacités de mémorisation sont analysés avec des tests de comportement qui dure 8 min pour l'alternance spontanée, deux fois 10 min pour la reconnaissance d'objets, 90 et 60 secondes pour la mémoire spatiale et 2 fois 3 secondes pour le test d'évitement passif.
Impact sur les animaux
les procédures d’injections seront peu douloureuses avec une administration par voie intra péritonéale et par diffusion sous cutanée grâce au pompe Alzet. L'injection dans le ventricule se fait sous anesthésie gazeuse. Un léger stress est présent lors des tests de mémoire . un stimulus aversif sera administré au niveau des pattes de la souris. Les animaux ont la possibilité de remonter sur la plate-forme pour échapper au stimulus.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin du projet pour prélèvement et analyse des effets du traitement sur le cerveau
Remplacement
Les modèles précliniques d’étude des mécanismes complexes de neurodégénération dans la maladie d’Alzheimer les plus performants sont des modèles murins et plus particulièrement des modèles murins transgéniques développant la pathologie progressivement après plusieurs mois de vie. Les propriétés neuroprotectrices de la FENM seront analysées en administration chronique sur un modèle transgénique de la maladie d’Alzheimer, les souris APPSwe/PS1dE9 ainsi qu'un modèle pharmacologique d'injection de peptide amyloïde‐ß[25‐35] oligomérisé.
Réduction
Les molécules sont administrées dans une gamme de doses réduite (généralement 0.003 - 0.3 - 1 - 3 mg/Kg en fonction des résultats antérieurs). Les animaux sont testés sur des tests comportementaux adaptés au paramètre à mesurer. Les analyses statistiques sont optimisées aux données générées de façon à limiter le nombre d'animaux par groupe (12 souris/groupe). Ce nombre de 12 souris par groupe a été déterminé de façon empirique mais a été depuis confirmé en analysant nos données antérieures à l'aide de logiciel statistiques.
Raffinement
Les animaux seront reçus une semaine avant le début de l'expérimentation et gardés en groupe de 8-10 individus par grande cage. Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en cartons et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie gazeuse. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Après les tests comportementaux les animaux sont directement remis dans la cage d’origine à l’écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Les traitements pharmacologiques envisagés ont déjà été utilisés et ne sont pas à l’origine de douleur visible ou de détresse. Mais un examen quotidien sera fait. Les animaux seront retirés de l'étude si les points limite sont atteints.
Choix des espèces
Les souris C57BL/6 mâles seront utilisées pour différencier l'effet des deux modes d'administrations (bolus VS infusion). Ces souris témoins sont le fond génétique des souris transgéniques APPPS1 utilisées pour la suite de l'étude, il est donc important de travailler avec le même fond génétique pour ce projet. Les souris APPPS1 seront par la suite utilisées pour tester l'efficacité des composés aux doses efficaces en bolus VS infusion. Cette lignée développe la pathologie progressivement avec des altérations comportementales dès 9 mois et qui sont très marquées à 12 mois d'âge. Les dépôts amyloïdes, la neuroinflammation, la gliose et le stress oxydant apparaissent même plus tôt, dès 6 mois, c'est donc un très bon modèle expérimental pour refléter les symptômes de la maladie d'Alzheimer. Les souris C57/BL6 seront utilisées à l'âge de 3 mois qui correspond à l'âge adulte, puis à l'âge de 10 mois pour faire une comparaison avec nos souris transgénique traitées. les souris APPS1 à l'âge de 3 mois afin de visualiser si la FENM a un effet neuroprotecteur avant l'apparition des premiers signes de la pathologie, 6 mois afin de visualiser un effet neuroprotecteur sur le comportement de ces souris, puis 10 mois afin de vérifier un potentiel effet curratif de la FENM, lorsque les lésions histpathologiques de la MA sont iréversibles.
Exploration de la dysfonction endothéliale et de ses complications vasculaires chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
5 274 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie opérée sans réveil. Sur les unes, les expérimentateurs prélèvent des vaisseaux sous anesthésie profonde, sur d'autres ils pratiquent des chirurgies de la patte avec pose de cathéter pour perfuser des composés et mesurer la réponse des vaisseaux. Le porteur signale peur, stress, hypothermie et douleur liés aux manipulations et aux actes chirurgicaux. Il reconnaît qu'aucun modèle in vitro ne remplace complètement un organisme vivant et annonce des études sur cellules humaines pour limiter le nombre d'animaux.
Objectifs
Ce projet vise à déterminer l'impact de l'activité de certains récepteurs situés sur l'endothélium des vaisseaux qui pourraient être une cible thérapeutique pour la prise en charge des pathologies cardiovasculaires. Nous resoumettons le projet au regard des résultats obtenus. La mise à jour porte sur l'ajout des nouvelles lignées de souris ainsi que le besoin de réaliser de nouvelles procédures expérimentales. Ces ajouts tiennent compte de la règle des 3R. Le projet scientifique avait été antérieurement évalué positivement par l'ANR (Agence Nationale de la Recherche). Ce projet permettra de nouvelles avancées dans la compréhension des mécanismes de la dysfonction endothéliale qui contribuent au développement des anomalies de l'arbre vasculaire et en particulier de l'athérome. Il fournira de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de cette pathologie.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de la recherche fondamentale, ce projet permet de caractériser au niveau de l'endothélium des vaisseaux, le rôle de certains récepteurs ou cibles dans le bon fonctionnement du vaisseau (état contractile nécessaire au déplacement du sang). Il permet aussi d'évaluer la contribution de ces cibles dans les modifications observées de la paroi des vaisseaux (remodelage vasculaire) au cours des variations de débit sanguin et de pression de perfusion. Sur ce terrain, il sera aussi étudié leur contribution dans le développement des lésions d'athérome au cours d'un régime gras déséquilibré. Des travaux publiés sur des cellules endothéliales en culture, montrent que l'activation de ces récepteurs favorise la production de composés/médiateurs par la cellule jouant un rôle protecteur contre les mécanismes pro-inflammatoires et pro-athérogènes. Sur ces avancées, il est attendu d'observer une amélioration des paramètres vasculaires (amélioration de la réponse vasodilatatrice, diminution des lesions sur les parois) et métaboliques (diminution de l'inflammation, amélioration du diabète,et de la lipidémie) chez les animaux recevant des composés à l'étude capables d'activer ces récepteurs. Il est aussi attendu l'absence d'amélioration voire une aggravation de la maladie (développement de lésions d'athérome, diminution de la lumière du vaisseau par développement de la paroi) chez les animaux transgéniques invalidés pour les récepteurs ou cibles moléculaires d'intérêt. Ce projet permet aussi dans le cadre de la recherche translationnelle de pré-établir des données expérimentales de sécurité et aussi d'étude des effets potentiels dans l'organisme pour la mise au point de futurs médicaments.
Procédures
Nous avons estimé un besoin de 5274 animaux dans le projet de recherche. Afin d’étudier les propriétés vasodilatatrices de nouvelles molécules synthétisées ainsi que, leurs effets sur les cellules constitutives de la paroi du vaisseau, des vaisseaux seront prélevés sur les animaux au cours d’une anesthésie profonde induite par l’administration dans l’abdomen (une piqûre) d’un mélange anesthésique (durée : quelques secondes). La durée du prélèvement est estimée à 10 minutes (1664 animaux sont concernés). D’autres animaux subiront des actes de chirurgie (décrits ci-dessous) sous anesthésie profonde réalisés par l’administration dans l’abdomen (une piqûre) d’un mélange anesthésique (durée: quelques secondes). Ils recevront aussi un analgésique puissant par voie sous – cutané (une piqûre) afin de réduire la douleur en pré-ou post-opératoire. Parmi, les chirurgies, des animaux subiront une chirurgie sur la patte arrière de durée estimée à 45 minutes, afin d’étudier, par la suite, chez l’animal vigile, la réponse vasodilatatrice du vaisseau au cours de la perfusion de composés administrés par le biais du cathéter préimplanté dans la patte arrière (640 animaux). D’autres subiront un acte chirurgical au niveau du cou d’une durée estimée de 10 minutes, au cours duquel une lésion vasculaire (brûlure) sera opérée en surface du vaisseau (1408 animaux) afin d’étudier par la suite chez l’animal vigile, la cicatrisation/régénération du vaisseau. D’autres animaux subiront une chirurgie du cou afin de réaliser une ligature sur des vaisseaux du cou pour d’étudier sur ces modèles vigiles, les effets protecteurs des composés sur la paroi du vaisseau. Le temps mis pour effectuer une ligature sur des vaisseaux du cou est estimé à 15 minutes sous anesthésie profonde (1472 animaux). Enfin, un étude de pharmacocinétique sera effectuée sur les composés à l’étude afin de connaître l’évolution des concentrations circulantes dans le temps. Les composés seront administrés à l’animal vigile à la suite d’une injection dans l’abdomen (une piqûre, durée de l’administration, de quelques secondes) et le devenir ou la concentration circulante de ces composés, sera établie au cours du temps dans le sang de l’animal. Le sang sera prélevé 5 fois à la queue et la durée du prélèvement à chaque fois (ou temps) est estimée à 1minute (90 souris vigiles).
Impact sur les animaux
Les expérimentations prévues peuvent induire des nuisances ou effets indésirables sur les animaux. La peur et le stress sont des nuisances qui peuvent survenir lors de la manipulation des animaux, leur isolement dans certaines procédures, ou lors de l'administration d'un produit anesthésiant avant un acte chirurgical. Une nuisance de l'anesthésie est d'induire une hypothermie, une sensation de fatigue en période de réveil, une petite douleur au point d'injection. D'autres nuisances possibles, sont la sensation de fatigue, la douleur ou de la fièvre qui peuvent être observées au cours des actes chirurgicaux où l'expérimentateur pose à demeurre une cathéter intraveineux ou une sonde à ultrasons de mesure du débit sanguin. Les actes chirurgicaux portés sur les vaisseaux du cou (carotides) peuvent induire au réveil, une douleur locale gênant les mouvements de la tête en particulier pour la prise alimentaire. L'animal peut aussi ressentir au réveil, de la fatigue et développer une fièvre.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés. Ceci est nécessaire afin de prélever les tissus et organes à des fins d'histologie ou d'autres analyses. Ces examens donnent des informations complémentaires aux données mesurées sur l'animal vivant. Ils permettent de comprendre les mécanismes biologiques mis en jeu dans un tissu ou organe, le développement des lésions au cours du temps, et, les cellules impliquées. Ces prélèvements permettent aussi de réduire le nombre d'animaux dans les expérimentations.
Remplacement
Bien qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer complètement un organisme vivant, des études in vitro sur des lignées de cellules endothéliales humaines sont prévues pour comprendre les réactions biochmiques immédiates à l'échelle de la cellule et limiter dans la mesure du possible l'utilisation des animaux à cette fin (réduire). Les animaux sont prévus dans ce projet, pour explorer dans le temps, et dans un organisme vivant, les effets biologiques des molécules administrées sur les paramètres cardiovasculaires et métaboliques. C'est pourquoi, ils ne peuvent être substitués par d'autres modèles d'étude.
Réduction
1/Plusieurs données peuvent être obtenues avec un même animal : tests de tolérance au glucose, prélèvements de tissus, prélèvement de plasma pour étude des lipoprotéines (profils) prélèvement de foie ,... 2/ Une réflexion biostatique est réalisée en amont de la procédure/expérience, pour limiter le nombre d'animaux. Cette réflexion implique la recherche bibliographique et l'examen de travaux similaires avec le nombre d'animaux nécessaires pour démontrer une différence statistiquement significative. Elle implique aussi l'utilisation d'un logiciel de statistique pour estimer sur la base de précédents travaux effectués ou en cours de réalisation, le nombre d'animaux nécessaires pour chaque expérimentation à venir. 3/La formation et l'encadrement des expérimentateurs dans les procédures permet d'optimiser l'obtention de mesures/données fiables et interprétables sur un faible nombre d'animaux. 4/ Les animaux seront utilisés dans les expériences/procédures jugées indispensables en fonction de l'avancée du projet.
Raffinement
Pour optimiser l'expérimentation, la fiabilité des résultats, des mesures visant à réduire, voire supprimer la douleur, le stress et améliorer le bien-être des animaux seront mises en place : - les animaux seront élevés et hébergés dans une animalerie agréée - les moyens pour limiter le stress aux animaux sont appliqués: enrichissement des cages, animaux invités à coopérer dans les actes non invasifs et non douloureux (exemple: test de tolérance au glucose), expériences réalisées dans une pièce calme en présence d'un faible nombre d'expérimentateurs - les expérimentateurs seront encadrés dans les protocoles par un sénior et rompus aux procédures expérimentales ce qui permet de limiter le stress et la douleur - en cas de transport de l'animal, un transporteur agrée pour transport d'animaux sera réquisitionné - des points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure seront établis - dans la mesure du possible et en fonction de la statistique, les animaux prévus dans les mesures invasives seront réduits - des soins adéquats seront prévus avant, pendant et après l’opération (des anesthésiques et des analgésiques seront utilisés pour réduire /supprimer la douleur) - la réduction de la durée de certaines études (surtout toxicologiques) - la mise en place de procédures d’euthanasie appropriées.
Choix des espèces
Nous souhaitons d'utiliser la souris pour plusieurs raisons: Nous disposons d'une grande expertise de l'utilisation de cet animal (manipulation, procédures chirugicales, expérimentations spécifiques). Nous disposons aussi d'outils d'exploration des effets vasculaires des molécules étudiées appliqués aux vaisseaux de souris. Dans la littérature, les effets vasculaires de l'apoA-I sont pour beaucoup décrits avec les souris (sauvages et transgéniques) ce qui constitue une base pour notre recherche. Des souris transgéniques, porteuses de mutations sur des gènes qui nous interessent, sont disponibles, et, nous permettent de réaliser le projet.Les souris sont utilisées à partir de 8 semaine de vie. A cet âge, elles pourront débuter le régime gras, ce qui est classique dans les études explorant la mise en place de l'athérome au cours du développement de l'animal. Le régime gras sera maintenu sur 30 à 40 semaines maximum. Les différentes explorations sont prévues sur des animaux âgés de 8 semaines à 50 semaines maximum.
Développement d’un traitement innovant de la drépanocytose
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
486 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Porteuses d'une drépanocytose, elles reçoivent des injections sous anesthésie et, pour une partie, sont placées trois heures dans une atmosphère appauvrie en oxygène afin de déclencher des crises d'occlusion des vaisseaux, avant une mise à mort sans réveil. Le porteur reconnaît que ces crises provoquent douleur, perte de poids et baisse de mobilité, atténuées par un antidouleur puissant. Il affirme que la complexité des crises vaso-occlusives ne peut être reproduite in vitro et que seule cette souris génétiquement modifiée reproduit fidèlement la maladie.
Objectifs
L’un des projets de recherche de notre unité de recherche consiste à développer un nouveau traitement contre la drépanocytose, une maladie génétique du sang qui touche les globules rouges et qui est associée à des complications récurrentes, graves et parfois mortelles. De plus, l’espérance de vie des patients drépanocytaires est réduite. Actuellement, cette maladie ne peut pas être guérie et elle se traite très difficilement. Ceci souligne le besoin pour les patients de pouvoir bénéficier de nouveaux traitements plus efficaces, ou qui pourraient être utilisés en combinaison avec les médicaments déjà existants, pour augmenter leur efficacité. Dans ce projet, nous nous proposons de démontrer l’efficacité de plusieurs médicaments que nous avons avons développés au laboratoire. Nous souhaitons également déterminer comment, et à quelle dose, devront être pris ces potentiels médicaments, lors de futures études cliniques chez les patients drépanocytaires. La drépanocytose étant une maladie particulièrement complexe, nous devrons tester nos molécules chez des souris drépanocytaires, qui sont les seuls animaux disponibles qui reproduisent fidèlement la maladie chez l'Homme. Si les résultats obtenus chez la souris sont convaincants, nous poursuivrons ensuite les tests de ce médicament potentiel, chez l'Homme.
Bénéfices attendus
Si nos résultats sont positifs, ce projet pourrait clairement avoir un bénéfice pour la qualité de vie et l'espérance des patients drépanocytaires. Nous avons, d'ailleurs, obtenu un financement par une entreprise pharmaceutique qui est intéressée pour développer nos médicaments et les tester chez les patients.
Procédures
Une partie des souris utilisées (drépanocytaires ou non) seront injectées (pendant une durée d’1 minute chacune), sous anesthésie générale, puis au maximum 2 prélèvements de sang (durée de 30 s chacun) seront réalisés sous anesthésie générale. Les souris seront immédiatement mises à mort, sans retour à la conscience, après le dernier prélèvement de sang. Pour une des interventions cherchant à déclencher des occlusions des vaisseaux chez les souris drépanocytaires, celles-ci seront injectées 2 fois (pendant une durée d’1 minute chacune), sous anesthésie générale, puis seront placées, ou non, dans des conditions dans lesquelles l'oxygène de l'air sera diminué (de 21 à 8%), pendant 3 h, et enfin replacées à l'air ambiant pendant 1 h. Toutes les souris seront ensuite immédiatement anesthésiées (anesthésie générale), le sang sera prélevé (durée d’1 minute), et les souris euthanasiées. Finalement, les organes (foie, reins, cœur, poumons, rate) seront prélevés. Pour l’autre intervention cherchant à déclencher des occlusions des vaisseaux chez les souris drépanocytaires, celles-ci seront injectées 3 fois (pendant une durée d’1 minute chacune), sous anesthésie générale, et 3 h après la dernière injection, toutes les souris seront immédiatement anesthésiées (anesthésie générale), et le sang sera prélevé (durée d’1 minute). Les souris seront finalement euthanasiées et les organes (foie, reins, cœur, poumons, rate) seront prélevés.
Impact sur les animaux
Les souris drépanocytaires développent une maladie similaire à la drépanocytose humaine, avec en particulier une anémie chronique, mais sans effet majeur chez des souris jeunes (< 10 semaines), qui ont été choisies pour notre projet. Au cours de leur 10 semaines de vie, les souris drépanocytaires pourront développer des "crises vaso-occlusives" (comme les patients), engendrant pendant quelques jours une douleur, une perte de poids, une inactivité/mobilité réduite, et un comportement anormal. Ces crises sont transitoires, mais seront soulagées avec l'administration d'un anti-douleurs puissant. De même, quand nous induirons les crises vaso-occlusives chez les souris drépanocytaires, ceci engendrera une douleur d'une durée au maximum égale à la durée de l'intervention (3-4 h), ainsi qu'une inactivité/mobilité réduite, et un comportement anormal. Cette douleur sera prise en charge par administration préventive d'un anti-douleur puissant, avant le déclenchement de la crise. Dans ce projet, d'autres nuisances sont attendues pour les souris drépanocytaires ou non drépanocytaires, et sont liées à la préhension/contention des animaux, aux injections (introduction d'une aiguille sous anesthésie), ainsi qu’au prélèvement final de sang, à la perfusion intracardiaque, au prélèvement d’organes, et au sacrifice (tous sous anesthésie).
Devenir
Toutes les souris utilisées dans ce projet seront systématiquement euthanasiées en fin d'expériences. En effet, des analyses post-mortem sur des organes seront nécessaires pour certaines expériences. Pour le reste des expériences, les souris drépanocytaires (génétiquement modifiées), ou non drépanocytaires, ne pourront être ré-utilisées ou replacées car elles auront été injectées avec des molécules expérimentales dont les effets à long terme ne sont pas connus.
Remplacement
Les crises vaso-occlusives (CVOs) chez les patients drépanocytaires sont très complexes. Les cellules constituant les vaisseaux sanguins, mais également de nombreux types de cellules sanguines différentes, sont impliquées dans les mécanismes qui déclenchent ces crises. Ce système complexe ne peut à l'heure actuelle être remplacé par des systèmes in vitro, étant données les interactions multiples qui existent entre toutes ces cellules. L'évaluation de l'efficacité de nouveaux traitements dans la drépanocytose nécessite donc le recours à un modèle animal de cette maladie, et la souris est le seul modèle animal de drépanocytose actuellement disponible.
Réduction
Le but de notre projet est de déterminer si nos molécules pourraient être utilisées chez les patients drépanocytaires, avec des injections les moins fréquentes possibles, et si oui, à quelle dose. Dans un premier temps, nous partirons d'un dose classiquement utilisée en thérapeutique pour d'autres maladies, et nous évaluerons quelles molécules restent détectables dans le sang 96 h après l'injection, à cette dose. Seules les molécules respectant ce critère seront étudiées plus en détail dans ce projet, ce qui permettra de limiter le nombre de molécules testées, et donc le nombre de souris utilisées. Ces molécules seront ensuite testées pour savoir si elles sont efficaces pour limiter l’ampleur des crises vaso-occlusives chez des souris drépanocytaires. Pour répondre à cette question, le nombre de souris à utiliser pour obtenir des résultats robustes a été déterminé en nous basant sur des expériences similaires qui nous ont ensuite permis d’utiliser des logiciels de statistiques spécifiques pour estimer ce nombre. Au total, 360 souris devront ainsi être utilisées, mais uniquement si toutes les molécules répondent à nos critères initiaux. De plus, le maximum d’organes seront prélevés pour ne pas avoir à recommencer les expériences ultérieurement, sur de nouvelles souris. Il est aussi prévu, en fin de nos expériences, de prélever une quantité de sang suffisante pour pouvoir répéter les analyses sur le sang, sans avoir à recommencer les expériences ultérieurement, sur de nouvelles souris.
Raffinement
Pour le bien-être des animaux, un enrichissement est prévu dans les cages. Les souris seront hébergées dans des cages adaptées aux rongeurs, avec un nombre d’individus par cage compris entre 3 et 5 (pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de disputes ou de stress engendrés par une population trop importante). Toute injection ou tout prélèvement sera effectué sous anesthésie générale. Lors des modèles d'induction des crises vaso-occlusives (CVOs) chez les souris drépanocytaires, qui sont douloureuses, les animaux resteront sous la surveillance continuelle de l'expérimentateur, et tout changement de comportement et d’apparence physique, ainsi que des signes de douleur, seront recherchés. Si ces changements et ces signes sont trop importants, l’animal sera euthanasié et l’expérience sera interrompue pour cet animal. Surtout, un médicament anti-douleur très puissant sera administré aux souris, en prévention, avant de déclencher la CVO. Il est également possible que les souris drépanocytaires élevées dans notre animalerie développent spontanément une CVO douloureuse, en raison de leur maladie. C’est pourquoi ces souris drépanocytaires seront quotidiennement surveillées, y compris pendant leur hérbergement, et elles seront traitées par un anti-douleur très puissant quand des signes évoquant des COVs seront constatés.
Choix des espèces
Seule cette espèce possède un modèle génétiquement modifié mimant la drépanocytose, et qui reproduit de façon fidèle les manifestations cliniques de la maladie. Des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines maximum seront utilisées, car les souris drépanocytaires développent ensuite des atteintes d’organes sévères au cours du vieillissement.
Etude de la formation de la cardiomyopathie atrial associée à la réponse immuno-inflammatoire dans le modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 70
Nourries quatre mois d'un régime enrichi en graisse, des souris sont prélevées d'une goutte de sang à la queue huit fois en deux heures, éveillées et chacune isolée dans une cage, puis examinées sous anesthésie par échocardiographie. D'autres souris et des rats subissent une chirurgie cardiaque destinée à installer une insuffisance cardiaque, et d'autres souris encore sont irradiées puis reçoivent le lendemain des cellules de moelle osseuse de souris donneuses. Au total, 1 370 souris et 70 rats, soit 1 440 rongeurs, vont être utilisés, la déclaration en comptant 1 100 en souffrance modérée et 340 en souffrance sévère. Le porteur cite comme effets possibles des difficultés à se déplacer et à s'alimenter, des douleurs après l'opération, des arrêts cardiaques et un affaiblissement après l'irradiation. Tous seront tués à la fin des actes, pour les prélèvements et les analyses.
Objectifs
La fibrillation atriale est l’arythmie la plus fréquente en pratique clinique. Sa prévalence augmente avec le vieillissement de la population faisant craindre une épidémie dans les 50 prochaines années. La cardiomyopathie atriale définie une déformation du myocarde atrial, un remodelage du tissu et une désorganisation de la hiérarchie du tissu. A l’échelle fonctionnelle, les conductions électriques sont anormales et favorisent les troubles du rythme (arythmie). Récemment, il a été décrit une accumulation de tissu gras à l'épicarde de l'oreillette. Les maladies métaboliques comme l’obésité sont des facteurs de risques de la fibrillation atriale, dans lesquels ce tissu gras épicardique semble dégénérer et libérer des facteurs qui diffusent librement dans le myocarde. Une infiltration de cellules immunes est observée, perturbant l’environnement homéostasique. Quiescent dans le cœur sain, l’épicarde atrial est réactivé en réponse à un stress, et devient une source de progéniteurs capables de se différencier en myofibroblastes et en adipocytes. Un stress de l'environnement réactive les progéniteurs et induit une transformation de ces cellules en adipocytes qui composent le tissu gras. Aujourd'hui, rien n’est connu sur les échanges et l'impact des cellules inflammatoires avec les progéniteurs. Les objectifs sont d'identifier les cellules immunitaires infiltrées et de comprendre leur rôle.
Bénéfices attendus
Les projets portant sur la compréhension du changement de structure et de fonction de l'oreillette dans le contexte de l'obésité et de l'insuffisance cardiaque permettront de cibler le rôle de l'inflammation et ses conséquences dans le développement précoce des troubles du rythme atrial.
Procédures
Procédure souris obèses : les souris seront mises sous régime enrichie en graisse pendant 4 mois. Elles seront soumises à une prise d'une goutte de sang répétée 8 fois en 2 heures pour tester l'évolution de syndromes métaboliques. Pour cela, les animaux sont vigiles, isolés les uns des autres dans 1 cage. Lors du prélèvement à la queue, chaque souris est posée tranquillement sur la grille, sans contention et le prélèvement d’une goutte de sang est effectuée en quelques secondes. Des mesures cardiaques seront effectuées par un monitoring adapté (échocardiographie) qui dure 5 minutes par animal et des tests de troubles de rythme qui dure 5 minutes par animal seront aussi réalisés. Durant toute la procédure, les animaux seront anesthésiés. Procédure, insuffisance cardiaque : les souris et les rats subiront une chirurgie cardiaque, sous anesthésie avec un anesthésiant et une injection de combiné de deux analgésiques pour respecter le bien-être animal. La durée de l'intervention est de 10-15 minutes. Puis, des mesures échocardiographies sous anesthésie seront réalisées, la durée est de 5minutes par animal. Procédure irradiation : les souris receveuses, seront irradiées, la durée est de 5 minutes par animal. Le lendemain elles sont transplantées avec des cellules issues de la moelle osseuse de souris donneuses.
Impact sur les animaux
L'obésité peut conduire à des difficultés de déplacement, un changement cutané et du pelage mais également à une obésité, un diabète. L'insuffisance cardiaque engendre des difficultés de déplacement et d'alimentation les 1ers jours et des arrêts cardiaques. La chirurgie peut conduire à des risques anesthésiques (détresse respiratoire, hypothermie, arrêt cardio-respiratoire) mais aussi à des douleurs post-opératoires ou encore à un risque infectieux. L’irradiation peut également induire un affaiblissement général en plus du risque infectieux accru.
Devenir
La totalité des animaux seront euthanasiés à la fin des actes pour réalisation des prélèvements et analyses.
Remplacement
Les projets ont pour but de comprendre l’influence du métabolisme et de l'immunité sur l’activité cardiaque et le remodelage atrial. Comme nous travaillons sur les modifications à l’échelle de l’organisme, il est nécessaire d’utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Toutefois, des biopsies de tissu provenant d'études antérieures seront utilisées pour ne pas reproduire les expériences. Des lignées de cellules seront aussi utilisées.
Réduction
La taille des effectifs est établie avec un calcul de puissance en amont et par la suite des analyses seront effectuées en plus du nombre d'animaux. Les lots d'animaux d'expérimentation sont 1370 souris + 70 rats = 1440 animaux
Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux sont en cage par 5 avec du matériel d'enrichissement. Les souris rendues obèses seront surveillée quotidiennement, des tests de glycémie seront réalisés pour surveiller l'obésité et le diabète. La prise de poids est effectuée de manière hebdomadaire. Les points limites sont évalués par un personnel compétent, notamment sur l'aspect du pelage, le comportement et la mobilité. Dans le projet de l’insuffisance cardiaque, les animaux sont en cage par 5. Le jour de la chirurgie, ils sont anesthésiés puis rasés sur le thorax et désinfectés avec un antiseptique dermique. Une dose d'analgésique sera injectée en sous cutané chez l’animal 30 minutes avant la procédure chirurgicale et 30 minutes avant la fin de la procédure. La 1ère semaine, les animaux seront nourris avec de la bouillie et l'apport d'eau sera facilité. Les souris seront surveillées quotidiennement et la prise de poids sera évaluée de manière hebdomadaire. Les points limites seront évalués quotidiennement par un personnel compétent et formé. Le comportement, la mobilité, la prise de poids, l'aspect du visage, l'aspect de la cicatrice seront des critères évalués quotidiennement par un scoring. Dans le projet de l’irradiation, les souris seront surveillées quotidiennement, une attention particulière sera effectuée sur la consommation de l’eau dans lequel un antibiotique sera ajouté pour contrôler la fragilité à l’infection. Une alimentation directement dans la cage pour faciliter l’hydratation en post-irradiation avec de la nourriture molle sera employée.
Choix des espèces
La souris est l’animal le plus approprié pour nos études concernant la réponse systémique dans le développement des arythmies cardiaques. Il s'agit du seul modèle dans lequel ont été générées des lignées déficientes pour l’expression de gènes d'intérêt. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications cardiaques dans un espace de temps raisonnable. La souris est l'espèce pour laquelle la technologie de transgénèse est la plus fiable et la mieux établie. Le rat est l'animal le plus approprié pour nos études concernant l'isolement de cellules progénitrices de l"épicarde. Le modèle d'insuffisance cardiaque permet d'augmentere le nombre de cellules progénitrices in situ, de les isoler et de travailler par la suite in vitro. Souris et rats adultes de 8 semaines à 12 semaines d’âge. Ce stade de développement corrobore avec le début de l’âge adulte, un stade qui correspond au début du développement des maladies cardiovasculaires chez l’homme.
Exposition chronique aux additifs et contaminants alimentaires inorganiques de la vie in utero à l’âge adulte: impact d’un challenge LPS sur la réponse du système immunitaire intestinal et systémique et l’homéostasie de la barrière intestinale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 344 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Exposées dès la vie intra-utérine à des additifs alimentaires ou à des pesticides contenant des nanoparticules, elles reçoivent ensuite une injection de toxine bactérienne qui peut perturber leur état général. Le porteur signale un stress lié aux manipulations, à la contention et à l'injection. Il affirme que le recours à l'animal est "nécessaire" pour obtenir cette exposition chronique dès l'utérus et qu'aucun modèle alternatif ne reproduit les interactions entre microbiote, intestin et réponse immunitaire.
Objectifs
Ce projet fait suite à un projet précédant qui a permis de montrer une perturbation du fonctionnement du système immunitaire intestinal et extra-intestinal lors d'une exposition à des nanoparticules (TiO2 et SiO2) avec notamment une altération des réponses fonctionnelles des cellules immunitaires. Pour déterminer si cela pourrait conduire à une perturbation de la réponse immunitaire à un challenge infectieux in vivo, nous étudierons la réponse de souris soumises à une infection à une toxine bactérienne lipopolysaccharidique (appelée LPS) après qu'elles aient été exposées de façon chronique à des additifs alimentaires ou à des contaminants de type pesticide contenant des nanoparticules.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mettre en évidence l’impact d'additifs et de contaminants de type pesticide sur les défenses immunitaires dirigées contre une infection de type bactérien. Il apportera des données utilisables pour l'évaluation des risques pour la santé humaine et animale dans l'utilisation de ces additifs et contaminants. Cet impact pourra être pris en compte par les instances règlementaires afin de réguler l'exposition humaine aux nanoparticules inorganiques.
Procédures
Les animaux seront exposés aux additifs alimentaires ou aux contaminants de type pesticide contenant des nanoparticules à des doses encandrant l'exposition humaine. Puis, ils seront exposés au maximum 6 h à une toxine bactérienne délivrée par injection unique nécessitant une contention de quelques secondes des animaux.
Impact sur les animaux
La mise en oeuvre de nos procédures pourra générer du stress. Il sera atténué par l'habituation des animaux aux manipulations hebdomadaires (suivi de poids, observations). Ensuite, la contention et l'injection de toxine peut engendrer un court stress. La toxine peut perturber l'état général des animaux qui seront sous surveillance constante jusqu'à la fin de l'expérimentation.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux seront euthanasiés afin d'effectuer des prélèvements permettant d'étudier la réponse immunitaire contre la toxine bactérienne.
Remplacement
Le projet étudie les effets des nanomatériaux alimentaires contenus dans des contaminants de type pesticide sur la réponse à une infection après une période d’exposition périnatale et jusqu'à l'âge adulte,. L’utilisation du modèle animal est nécessaire afin d’avoir cette exposition chronique dès la vie in utero. De plus, l’étude portera sur les interactions microbiote-intestin et intestin-réponse immunitaire et aucun modèle alternatif ne permet de recréer toutes ces interactions. Du fait de ces 2 raisons majeures, le recours à l'animal est donc nécessaire.
Réduction
Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en collectifs (5 ou 3 par cages selon l'expérimentation) dans des cages contenant des abris et les femelles gestantes seront isolées (1 par cage) avec un enrichissement des cages (dispositifs de nidification en papier absorbant) afin d'améliorer leur bien-être. Les individus présentant une détérioration de l'état général (poil piqué, dos vouté, difficulté de mobilité, agressivité extrême) et/ou une perte de poids significative seront écartés de l'étude et des soins adaptés leur seront donnés. L'exposition à la toxine bactérienne peut perturber l'état général des animaux qui seront observés en continu jusqu'à leur euthanasie
Choix des espèces
La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote et l’intestin. Nous travaillerons avec la lignée C57bl/6J car nous avons déjà des résultats préliminaires concernant l’exposition des adultes aux additifs alimentaires. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l’âge adulte pour mimer une exposition périnatale et chronique à long terme.
Rôle des points de contrôle immunologique associés à la sénescence dans la régulation de l’infiltration et l’activation des cellules de l’immunité innée
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dépourvues de poils, elles reçoivent des injections sous la peau et dans l'abdomen sous anesthésie gazeuse pour étudier comment le système immunitaire réagit aux cellules vieillissantes dites sénescentes. Le porteur qualifie les nuisances de légères, entre gêne liée à l'absence de poils, douleur d'injection et inconfort de la sédation. Il annonce que bloquer un sucre présent à la surface des cellules sénescentes pourrait relancer leur élimination par l'immunité, piste renvoyée à un stade ultérieur.
Objectifs
Ce projet fait partie d'une étude plus globale visant à comprendre comment le système immunitaire, c’est à dire l’ensemble de nos globules blancs, réagit face à des cellules âgées. Au cours du vieillissement, certaines de nos cellules rentrent dans un état dit de sénescence ou les cellules sont toujours vivantes mais incapables de se dupliquer et présentent un fort pouvoir inflammatoire. Il est proposé que ces cellules sénescentes s’accumulent avec l’âge et soient responsables de nombreuses maladies liées à l’âge et du cancer. Ce projet est basé sur une première étude démontrant un lien entre la surexpression d’un sucre particulier à la surface des cellules sénescentes et leur échappement au système immunitaire. L’objectif du projet est de déterminer si le blocage de ce sucre pourrait favoriser la réactivation des cellules immunitaires et donc l’élimination des cellules âgées. L’interaction et le dialogue entre les cellules sénescentes et les cellules immunitaires seront étudiés. La finalité de ce projet pourrait permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre le vieillissement pathologique en ciblant spécifiquement des molécules de surface associées aux cellules sénescentes. Cette approche pourrait être utile pour les patients dans de nombreuses maladies liées à l’âge incluant le cancer.
Bénéfices attendus
Par cette étude on s’attend à mieux comprendre comment le système immunitaire et les cellules sénescentes interagissent au cours du vieillissement. Plus largement, nous espérons mieux comprendre comment les cellules sénescentes s’accumulent dans nos tissus avec l’âge et comment elles modulent leur immunosurveillance. Notre projet pourra contribuer à terme au développement de solutions thérapeutiques contre les maladies liées à l’âge (maladie d’Alzheimer, fibrose pulmonaire, artériosclérose etc…) et le cancer et à l’augmentation de l’espérance de vie en bonne santé.
Procédures
-Anesthésie gazeuse (2 minute 30 après induction) - 2 injections sous cutanées (en une fois, bilatérale pour tous les animaux, environ 1 min 30 par souris) sous anesthésie gazeuse et simultanément 1 injection intra péritonéale (1 fois pour tous les animaux ; environ 30 sec par souris) -2 administrations par injections intra péritonéales (2 fois par animal, 1 fois à J2 et 1 dois à J4) sur animal vigile (pour tous les animaux) (environ 2 min par souris)
Impact sur les animaux
Nos souris présentent une perte de poils totale provoquant potentiellement une gêne légère et subiront des injections sous-cutanées de produit non-irritant (2 injections/animal pour l’ensemble des animaux prévus) générant une douleur légère. La sédation par anesthésique gazeux (pendant environ 1 min 30 après induction à 2%) pendant quelques minutes est également source d’un léger inconfort.
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin des procédures car nous devons faire des analyses sur leurs tissus et leurs cellules.
Remplacement
Nous avons déjà observé dans des études précédentes que les cellules âgées dites sénescentes qui s’accumulent avec le vieillissement présentent des capacités inflammatoires très puissantes. Ces cellules sénescentes seraient à l’origine de nombreuses maladies liées à l’âge, y compris le cancer. Ceci serait possible par une capacité à modifier l’activité des cellules immunitaires innées, c’est-à-dire nos globules blancs qui jouent un rôle essentiel dans la surveillance de nos tissus. En exprimant à leur surface un sucre ayant un potentiel immunosuppresseur, les cellules âgées sont capables de bloquer complètement la fonction de nos globules blancs appelé NK ou cellules tueuses naturelles. Cette inhibition favorise l’apparition de fibrose pulmonaire ou de cancer avec l’âge. Nous souhaitons maintenant étudier l’interaction de ces cellules avec le système immunitaire global et plus précisément comment les cellules sénescentes arrivent à recruter localement les globules blancs et les bloquer dans leur fonction. Il n’existe malheureusement pas de bon modèle in vitro pour cela, la sénescence et le système immunitaire étant un processus intégré impliquant une communication intra- et inter- cellulaire et tissulaire, ce projet nécessite une étude à l’échelle de l’organisme entier. Dés que les mécanismes seront identifiés, nous remplacerons les expériences chez l’animal par des expériences de co-cultures in vitro.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, une étude exhaustive de la littérature a été menée avant d'initier ce projet pour s'assurer de la non-reproduction de résultats déjà publiés. Une étude statistique prévisionnelle nous permet également de prédire le nombre minimal d’animaux à inclure dans chaque groupe. Nous avons calculé précisément la grandeur de l’effectif (nombre d’animaux par groupe) nécessaire pour notre étude en fonction de l’estimation des effets biologiques attendus. Ainsi, nous avons pu réduire les groupes d’animaux au minimum possible tout en maintenant une puissance statistique nécessaire à la validation des résultats. Enfin, la maîtrise du protocole expérimental permet d’éviter les problèmes techniques et la perte d’animaux non désirée et donc de réduire au maximum la gêne et le nombre d’animaux nécessaires
Raffinement
Ces expériences ont été raffinées en tenant compte du bien-être animal et ainsi réduire à un niveau minimum le stress, la douleur, la souffrance, l’angoisse ou l’inconfort potentiel. Pour cela, nous utiliserons une série de mesures : -un double enrichissement (des maisons en coton et des bâtons à ronger) -séparation des cages d'expérimentation et d’élevage -suivi quotidien des animaux en expérimentation -injections sous anesthésie - analyses cellulaires sophistiquées après l’euthanasie des souris pour obtenir un maximum de résultats avec le minimum d’échantillons et d’animaux - une grille de score avec un score maximum et une liste de points limites adapté au modèle entrainant l'euthanasie immédiate. L’ensemble de ces mesures de raffinement vise à assurer le bien-être des animaux, éviter toute souffrance inutile et assurer des résultats scientifiques de qualité pour éviter tout reproduction expérimentale inutile liée à un défaut de design expérimental.
Choix des espèces
Nous utilisons un type spécial de souris comme modèle pour notre recherche car elle partage des similitudes avec les humains et a une durée de vie relativement courte. Chez la souris, nous pouvons étudier en détail comment les tissus se réparent et comment leur physiologie change. Cela nous aide à comprendre les différentes étapes des événements biologiques. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 12 semaines. Ceci correspond à des animaux matures, pleinement formés et avec un système immunitaire innée fonctionnel. Ce modèle de souris est le meilleur choix car il nous permet d'étudier tous les processus impliqués dans les maladies liées à l'âge simultanément. Nous pouvons simultanément examiner les cellules immunitaires, les cellules sénescentes, la progression des maladies et l'expression d'une molécule spécifique appelée ganglioside. En utilisant ce modèle de souris, nous pouvons obtenir des informations précieuses sur les mécanismes des maladies liées à l'âge, ce qui pourrait nous aider à développer de meilleurs traitements et à améliorer la santé humaine
Evaluation des effets de composés pharmacologiques sur la dysfonction érectile chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
1 260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les expérimentateurs sectionnent les deux nerfs caverneux sous anesthésie pour provoquer une dysfonction érectile, administrent des composés pendant une à douze semaines, puis mesurent l'érection par stimulation du nerf sous anesthésie. Le porteur reconnaît des risques de douleur, d'infection et d'inconfort liés aux chirurgies de l'abdomen, à la lésion nerveuse et aux prélèvements en cage à métabolisme. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'évaluer l'érection, résultat de l'interaction entre système nerveux et vaisseaux, ce qui imposerait le recours au rat.
Objectifs
La dysfonction érectile (DE) est définie comme l’incapacité à obtenir et ou à maintenir une érection suffisante pour l’accomplissement d’un rapport sexuel, de manière constante ou récurrente. La DE peut être psychogénique (médié par l’adrénaline), d’origine organique ou mixte. Les causes d’une DE organique sont nombreuses : neurogéniques (lésion de la moelle épinière, sclérose en plaques, maladie de Parkinson etc..), vasculaires (athérosclérose, hypertension artérielle, diabète etc…), iatrogéniques (suite à la prise de certains médicaments comme les béta-bloquants, certains antidépresseurs etc..) ou hormonales. Toutes les études ont montré une augmentation de l'apparition de la DE avec l’âge. En effet, la DE touche entre 1 et 9% des hommes de moins de 40 ans, et plus de la moitié des hommes de plus de 70 ans. La DE a des conséquences personnelles négatives telles que la frustration, soucis, souffrance psychologique et ou l’évitement de l’intimité sexuelle, ce qui occasionne une altération de la qualité de vie et des difficultés relationnelles dans le couple. Actuellement, différents traitements sont disponibles pour la DE, comme les comprimés de sildénafil (viagra) ou de vardenafil (Levitra), les injections dans l'urètre ou directement dans le corps caverneux du pénis d’alprostadil, les pompes à vide, la pose d’implant, ou plus récemment les thérapies par onde de choc. Cependant, ces traitements peuvent être inconfortables (nécessité de planifier l’acte sexuel, des injections invasives) ou contre-indiquées avec certains autres traitements (contre-indication entre la prise de sildénafil ou vardénafil avec les dérivés nitrés, ces derniers étant utilisés pour traiter l’angor). De plus, certains types de patients (diabétique, personne ayant eu une prostatectomie) répondent difficilement ou sont insensibles aux traitements actuels. Au final, il y a encore une forte proportion de patients avec une DE qui nécessite une alternative thérapeutique dans leur prise en charge. Ce projet s’inscrit donc dans le cadre du développement des traitements pharmacologiques pour la DE, ou dans la recherche d’un effet indésirable sur la fonction érectile d’un traitement médicamenteux.
Bénéfices attendus
La DE est une pathologie fortement liée à l’âge, ainsi l’allongement de l’espérance de vie augmente le nombre de personnes ayant une DE dans la population. Cependant, chez les patients souffrant de pathologies cardiovasculaires et ou métaboliques, la DE s’accompagne d’une résistance aux traitements thérapeutiques disponibles actuellement. De plus, il n’existe pas encore de traitement médicamenteux curatifs à la DE, en effet, les traitements médicamenteux actuels restent symptomatiques. La recherche de médicaments pour compléter l’arsenal thérapeutique actuel contre la DE est donc indispensable et reste active. Ce projet permettra de sélectionner les candidats médicaments efficaces dans le traitement de la DE et ou de discriminer ceux qui pourraient avoir un effet néfaste sur la fonction sexuelle. De même, ce projet donnera une preuve d’efficacité à un candidat médicament, dans un modèle animal standardisé, complétant les études précliniques règlementaires avant les essais chez l’homme.
Procédures
Les interventions que vont avoir les animaux sont : - L’induction du modèle de DE par lésion bilatérale du nerf caverneux chez le rat anesthésié. Cette procédure est réalisée une seule fois afin de mettre en place la DE, et l’opération dure environ une heure. Elle permet de mimer la lésion du nerf caverneux au cours d'une chirurgie de prostatectomie, sans réaliser la chirurgie. - Une administration (voie selon la molécule à étudier) du composé à analyser, d’un contrôle négatif (souvent le véhicule du composé à tester) et de la molécule de référence. La fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (une ou plusieurs fois par jour pendant 1 à 12 semaines). Tout type d’administration, réalisé par des personnels tutorés, dure moins d’une minute sur un animal vigile, et moins de 30 min sur un animal anesthésié. - Mesure de la fonction érectile suite à une chirurgie sur animal anesthésié: stimulation artificielle du nerf caverneux et mesure de l’augmentation de la pression intracaverneuse (signe de l’érection). Cette procédure est sans réveil, donc réalisée une fois par animal, et la mesure dure environ 2 heures incluant le temps de chirurgie. - Si le protocole le requiert, des prélèvements de sang et d’urines pourront être envisagés. Les prélèvements sanguins respecteront les normes en vigueur, limitant le volume inférieur à 10% du volume total sanguin de l’animal, et jamais plus de 15% sur une période de 28 jours. Chaque prélèvement sanguin, réalisé par des personnels tutorés, durera moins de 3 minutes. Si le protocle le recquiert, des récoltes d'urine par isolement de l'animal dans un hébergement individuel peuvent être réalisés, à raison d'une fois par semaine au maximum, et l'isolement est inférieur à 24 heures. A noter que tous les animaux n’auront pas forcément toutes ces interventions. En effet, les interventions seront limitées selon leur pertinence et selon les recommandations dans le cadre d’un partenariat avec une entreprise pharmaceutique.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont : - Les chirurgies de l'abdomen (pour réaliser les lésions nerveuses, les administrations intraprostatiques ou intracaverneuses, ou encore pour mesurer la fonction érectile) présentent des risques de douleur, d’infection et d’inconfort. - La lésion des nerfs caverneux pour créer la dysfonction érectile peut présenter des risques de douleur - L’administration du composé à tester qui nécessitera une contention, et l’implantation des pompes osmotiques peuvent entraîner des risques de stress et de douleur - Prélèvements de sang et d’urine en cage à métabolisme peuvent stresser l’animal. Les risques de douleur et d'infection sont pris en compte pendant le projet par l’utilisation des antalgiques et/ou antibiotiques. De plus, les personnels qualifiés et tutorés vont limiter le stress au maximum. A noter que tous les animaux ne vont pas forcément subir toutes les procédures dans la liste.
Devenir
Tous les animaux vont avoir au minimum un traitement par le composé à tester et des composés témoins. Ensuite, selon les paramètres à analyser, suite à des prélèvements d’organes, et ou de sang, et ou la mesure de la fonction érectile, les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés par un surdosage en anesthésique.
Remplacement
L’érection survient suite à une interrelation entre le système nerveux (centrale et périphérique) et différents types cellulaires, conduisant à cet afflux de sang au niveau du corps caverneux du pénis. Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro pertinent permettant d’évaluer cette fonction et la sélection de candidat médicament efficace dans le traitement de la DE. De plus, la survenue d'une DE est la résultante de la dérégulation de plusieurs mécanismes physiologiques chez les diabétiques et les personnes atteintes d’une hypertension artérielle. Ainsi, la possibilité d’utiliser des souches de rats diabétiques et hypertendus est essentielle afin de sélectionner un candidat médicament efficace contre la DE associé à ces pathologies.
Réduction
Une analyse de puissance statistique a été réalisée afin de réduire au minimum le nombre de rats par groupe. La formule est n=1+2C (s/d)^2 pour calculer la taille du groupe pour des variables continues. D’après notre expérience suite aux expérimentations réalisées précédemment dans le laboratoire, le critère principal a une déviation standard (s) de 0,5. Afin de mettre en évidence un effet significatif, le produit d’intérêt devrait modifier ce critère de 0,75 par rapport au groupe contrôle (d). Avec une puissance (1-β) de 90% et un niveau de significativité (α) de 5%, la constante C correspond à 10.51. Ainsi, en reprenant la formule, le nombre de rats par groupe nécessaire pour l’étude est : n= 1+ 2*10.51*(0.5/0.75)^2 = 10,3. Notre expérience passée nous a permis de fixer la taille du groupe expérimental à n=12 rats afin d’obtenir des données interprétables pour 10 animaux/groupe avec les tests statistiques utilisés car 20% des données sont non interprétables, inhérentes aux difficultés techniques du modèle expérimental.
Raffinement
Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible : - Les rats sont hébergés par 2 animaux par cage, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. - Un suivi quotidien de tous les rats sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). - L’induction de la DE par une lésion du nerf caverneux se fait sous analgésie et anesthésie générale. Un traitement antibiotique est aussi mis en place pour éviter toute complication infectieuse. - L’évaluation de la fonction érectile se fait sous analgésie et anesthésie générale et est sans réveil. A noter que toutes les procédures expérimentales ne seront pas forcément appliquées aux animaux. Les procédures expérimentales appliquées à chaque groupe de rats seront attribuées en fonction de leur pertinence (voir dans la description de chaque procédure) et selon les recommandations dans le cadre d’un partenariat avec une entreprise pharmaceutique.
Choix des espèces
Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Les rongeurs sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et notamment dans le domaine de la médecine sexuelle. L’organisation anatomique des organes participant à l’activité sexuelle ainsi que leur innervation sont comparables chez le rat et l’homme. De plus, les modèles pathophysiologies de diabète et d’hypertension artérielle présentant une dysfonction érectile ont été décrits chez le rat. Les animaux seront utilisés adulte, à partir de 7 semaines d’âge, en effet l’évaluation de la fonction érectile se fait forcément après la maturité sexuelle. Ce choix est justifié par la littérature scientifique.
Etude des effets anti-tumoraux de perturbateurs du métabolisme cellulaire dans le cancer de la prostate
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent des greffes de cellules cancéreuses sous la peau ou dans la prostate par chirurgie, puis des injections répétées de composés jusqu'à vingt-cinq semaines, développant tumeurs et métastases qui reproduisent la maladie humaine. Le porteur reconnaît des pertes de poids et des atteintes au point d'injection pouvant aller jusqu'à la nécrose. Il affirme avoir mené des essais in vitro sur cellules humaines et conclut à la "nécessité" de la souris pour tenir compte de toutes les interactions de l'organisme.
Objectifs
Selon le dernier rapport de l'Institut National du Cancer, le cancer de la prostate (PCa) est le cancer le plus fréquent chez l'homme et la troisième cause de décès par cancer en France. Le cancer de la prostate représente plus de 50000 nouveaux cas et 8000 morts par an en France. L'ablation de la prostate (prostatectomie) ou la radiothérapie sont les traitements des tumeurs localisées. Lorsque le cancer devient métastatique, des traitements anti-hormonaux (anti-androgènes) et/ou une chimiothérapie (Docetaxel) sont prescrits. Cependant, à très court terme (1 à 2 ans) les patients développent une résistance. Ainsi, la nécessité de trouver de nouveaux traitements est cruciale. Au laboratoire, nous travaillons sur le métabolisme des cellules cancéreuses, en effet, celle-ci ont un métabolisme différent des cellules normales. Notre stratégie est donc de cibler cette particularité est ainsi identifier des approches thérapeutiques nouvelles qui vont contrecarrer les résistances aux thérapies existantes. Grâce à l'expérimentation animale nous pouvons ainsi valider dans un modèle intégré les résultats obtenus dans des cellules en culture.
Bénéfices attendus
100% des options thérapeutiques actuelles pour le cancer de la prostate métastatique conduisent à une résistance aux traitements. Il est donc important de trouver de nouvelles approches thérapeutiques. Notre travail permettra de déterminer si le ciblage du métabolisme des cellules cancéreuses de prostate est une piste thérapeutique intéressante. Nous caractériserons l'action anti-tumorale et anti-métastatique de molécules qui ont un effet anti-prolifératif et diminuent l'agressivité des cellules cancéreuses in vitro. Cela apportera la preuve de concept que dans un système physiologique intégré (étude préclinique) ces molécules ont un effet anti-cancéreux.
Procédures
Nous réalisons différentes expériences qui nous permettent de tester les effets anti-tumoraux de nouveaux composés. Au total, nous réalisons 4 types d'interventions dont une procédure chirurgicale : 1) injections en sous-cutanée de cellules cancéreuses, cette intervention est réalisée une seule fois par souris et pour une procédure, elle dure 10 secondes. Cette nuisance concerne 540 souris. 2) injection intra-veineuse réalisée une seule fois par souris et pour une procédure, elle dure 10 secondes. Cette nuisance concerne 180 souris. 3) injection intra-péritonéale des agents, elle est réalisée 3 fois par semaine pour une durée allant de 6 à 25 semaines en fonction des procédures. Cette nuisance concerne 915 souris. 4) Une procédure chirurgicale ou les souris recevront une injection dans la prostate (greffe orthotopique) après une intervention chirurgicale qui dure 20 minutes. Cette nuisance concerne 185 souris. Aucun prélèvement ne sera réalisé sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Les souris subiront des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables peuvent être la perte de poids. Les injections intrapéritonéales et dans une moindre mesure sous-cutanée pourront entraîner des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose...). Il y aura également le développement de tumeurs intra-prostatique et de métastases qui reproduisent la pathologie humaine.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des procédures et des traitements, nous étudions les tumeurs générées par xenogreffe sous-cutanée, in situ (dans la prostate) ou bien aux métastases dans différents organes, il est donc nécessaire de mettre à mort l'animal, afin de prélever ces tissus pour les analyser.
Remplacement
Pour satisfaire au remplacement, nous avons réalisé des études in vitro sur des cellules cancéreuses humaines (prolifération, capacités migratoires et invasives des cellules) et nous avons montré que nos composés d'intérêt inhibent la prolifération des cellules cancéreuses ou induisent la mort. Il est maintenant nécessaire de l’étudier sur l’animal car il n’existe pas de méthodes alternatives permettant de tenir compte de toute la complexité et de toutes les interactions existantes entre cellules et organes dans un organisme. La formation de métastases est un processus complexe dont l'intégralité des étapes ne peut être étudiée que sur animal vivant.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, une étude exhaustive de la littérature a été menée avant d'initier ce projet pour s'assurer de la non-reproduction de résultats déjà publiés. De plus, pour satisfaire à la réduction, chaque procédure utilise un nombre d’animaux minimum mais nécessaire à des études statistiques pertinentes. Concernant les souris transgéniques, nous ne maintiendrons en élevage que les souris ayant un phénotype non dommageable et nous réaliserons des croisements uniquement pour générer le nombre d'animaux requis pour l'expérience, nous ne conserverons que les mâles qui génèrent un cancer de la prostate.
Raffinement
Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des conditions stériles permettant de maintenir l’environnement adapté à des animaux immunodéprimés. Nous assurerons un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et mises à mort des souris. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance et ainsi rendre en charge immédiatement tout mal être.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Sa physiologie est adaptée aux expériences que nous désirons réaliser. Dans notre projet, nous utilisons des modèles animaux déjà établis et disponibles auprès de fournisseurs agréés, il n'est donc pas utile de générer de nouveaux modèles. Enfin, nous étudions des composés qui ont déjà été utilisés chez la souris, ils ne sont pas toxiques, mais on ne connait pas leurs effets dans le cancer de la prostate. La souris est un modèle qui nous permet d'obtenir assez de matériel biologique pour faire des analyses protéiques, génomique et histologique. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Nous travaillons sur la prostate, nous utilisons donc que des souris mâles. Les procédures expérimentales proposées sont réduites dans leur durée au temps suffisant pour établir les effets anticancéreux potentiels des nouveaux composés testés. Nous n'utilisons que des souris mâles adultes à maturité sexuelle qui sécrètent les hormones mâles. La maturité sexuelle est obtenue entre 6-7 semaines chez la souris. Les animaux seront donc utilisés à partir de cet âge.
Étude du rôle des cellules gliales sur le comportement de rongeurs
- Enseignement supérieur
Rats : 60
195 souris et 60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, ils subissent une chirurgie crânienne d'une heure, des injections dans l'abdomen et des tests comportementaux, certains étant imagés éveillés sous un microscope auquel ils doivent s'habituer. Le porteur signale une douleur post-opératoire, un risque d'infection de la cicatrice et, après administration de LPS, anorexie, baisse de locomotion, perte de poids et anxiété. Il affirme que l'usage d'animaux est "inévitable" pour comprendre l'activité des circuits neuronaux, la souris permettant en outre d'obtenir aisément des animaux génétiquement modifiés.
Objectifs
Le bon fonctionnement du cerveau repose sur l'interaction des différentes cellules du cerveau. L'objectif de ce projet est de étudier les différents types de cellules gliales et d’évaluer son rôle dans le comportement animal. Les cellules gliales qui comprennent les oligodendrocytes, les astrocytes et la microglie, sont des cellule spécialisée dont la fonction est d'entourer, de soutenir et d'isoler les cellules nerveuses (neurones) du système nerveux central (SNC), y compris le cerveau et la moelle épinière. La principale fonction des oligodendrocytes est la formation de la gaine de myéline, une membrane grasse qui permet d'isoler et de protéger les fibres nerveuses du cerveau et de la moelle épinière. Les astrocytes assurent une diversité de fonctions importantes, centrée sur le support et la protection des neurones. La microglie forme la principale défense immunitaire dans le système nerveux central. Nous étudierons les cellules gliales par des expériences d'imagerie, de biologie moléculaire et de comportement chez les rats et les souris. Nous étudierons aussi l’activité électrique des neurones et des cellules gliales.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche.
Procédures
- Le groupe A suivra: une chirurgie (1 heure). Deux semaines plus tard, les animaux recevront une injection intrapéritonéale et deux heures plus tard ils suivront un test comportemental (5 minutes). Le lendemain, elles recevront une deuxième injection et 2h plus tard elles seront exposées au deuxième test comportemental (5 minutes). - Le groupe B suivra: une injection intrapéritonéale (1 minute) et deux heures plus tard ils suivront un test comportemental (5 minutes). Le lendemain, ils recevront une deuxième injection (1 minute) et 2h plus tard ils seront exposés au deuxième test comportemental (5 minutes). - Le groupe C suivra: une chirurgie (1 heure). Deux semaines plus tard, les animaux suivront un test comportemental (10 minutes). Finalement les animaux seront euthanasiés (1 minute) et leur cerveau sera prélevé́. - Le groupe D suivra: une chirurgie (1 heure). Deux semaines plus tard, les animaux seront habitués à rester sur le microscope et ensuite l’activité́ neuronale sera imagée chez les animaux éveillés. Les séances d’imagerie dureront 30 minutes et elles auront lieu une fois par jour pendant 3 jours. A la fin de la dernière séance, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé́. - Le groupe E suivra: une chirurgie (1 heure) pour implanter une fibre optique sur leur tête. Deux semaines plus tard, les animaux suivront une deuxième chirurgie (1 heure). Deux semaines plus tard, les rats seront connectés au niveau de la fibre optique vers un système d’enregistrement de l’activité́ électrique et leur comportement spontané́. Chaque séance durera 20 minutes et chaque rat suivra 3 séances. A la fin de la dernière séance, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé́.
Impact sur les animaux
- Nuisances liées aux procédures chirurgicales : douleur post opératoires, risque mineur d’infection de la cicatrice, risque mineur de détérioration des implants crâniens - Nuisances liées à la connexion des animaux à la fibre optique : stress de la contrainte du maintien sous l’objectif du microscope auquel l’animal doit s’habituer - Douleur légère liée aux différents injections intrapéritonéales. L'administration de LPS aux animaux peut induire de l'anorexie, la diminution de la locomotion, la perte de poids et de l’anxiété.
Devenir
A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses immuno-histologiques.
Remplacement
Pour comprendre l'activité des circuits neuronaux dans le cerveau, il est nécessaire de générer des données biologiques pertinentes. L'utilisation d'animaux est donc inévitable. Les souris et les sont les modèles animaux de prédilection pour les recherches dans ce domaine en raison de la structure anatomique et de la fonction bien définies de différents cortex corticaux. La souris est aussi l’espèce de rongeurs qui permet d’obtenir aisément des animaux modifiés génétiquement.
Réduction
L’expertise de nos instructeurs sur ces modèles garantit que le nombre d'animaux utilisés est minimisé par une pratique toujours de haute qualité dès le départ. De même il est extrêmement important pour nos objectifs éducatifs de pouvoir démontrer et mettre en pratique les actes de préparation chirurgicaux, le nombre d'animaux sera donc adapté en conséquence. Ce projet a aussi pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche. Par an, 20 étudiants et 10 instructeurs suivront les projets décrits dans cette DAP. Dans ce context, lors de la formation, les instructeurs réalisent une démonstration de la procédure puis les étudiants auront l’occasion de pratiquer la procédure sous-couvert des instructeurs.
Raffinement
Nos mesures mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales impliquent une induction et suivi de l'anesthésie, une mise en place d'analgésie, une installation tout au long des procédures chirurgicales de contrôle de la température par tapis chauffant. Les souris seront placées en cages de 4-5 souris et les rats de 2. Ils seront tous placés sur un rack ventilé, placé dans une salle d'hébergement. Un enrichissement de leur milieu (carrés de cellulose, maisons en papier mâché que les animaux peuvent utiliser pour se cacher et/ou ronger) permettra de favoriser les comportements d'exploration et d'empêcher le stress. Les animaux opérés seront observés quotidiennement par l’expérimentateur pendant la période qui suit le réveil (2h) ainsi que pendant les 4 jours suivant. L'évaluation des points limites se fera selon une grille d'évaluation (Annexe 1) incluant le poids de l'animal, l'état de la plaie, l'état du pelage, la mobilité de l'animal et les signes de douleur. Si l'animal présente un score entre 6 - 16, une seconde injection de carprofène s.c. sera effectuée et reconduite toutes les 24h si les signes persistent lors des observations suivantes. Si l’animal n’a pas repris de poids au bout de 4 jours, ou si des signes de souffrance sont observés, le traitement sera étendu de 2 jours supplémentaires. Si la récupération ne s’effectue pas bien et si le score des critères de la grille d’évaluation est supérieur à 11 durant 2 jours consécutifs l’animal sera euthanasié par l'expérimentateur par dislocation cervicale. Dans des cas très rares, les implants (fibre optique et le système de fixation) peuvent se détacher du crâne. Dans cette situation, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris et les rats sont les espèces de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système central de ces espèce est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle cellulaire et aussi au niveau des circuits neuronaux. Nous utilisons le modelé souris qui est l'espèce de rongeur permettant d'obtenir aisément des animaux modifies génétiquement. Le projet sera réalisé sur des animaux agés de plus de 6 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte pour ces espèces. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une bonne reproductibilité des procédures chirurgicaux.
Rôle de l’activation immune maternelle dans le développement et la fonction des neurones dopaminergiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 696 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles gestantes reçoivent par voie intraveineuse un composé qui simule une infection virale pour déclencher une activation immunitaire, puis la descendance est mise à mort après sevrage pour prélèvements. Le porteur qualifie les modèles animaux de "puissants et indispensables" et signale une perte d'appétit et de poids transitoire ainsi qu'un comportement altéré dans les 24 heures suivant l'injection. Il affirme que les interactions entre système immunitaire, cellules gliales et neurones au cours du développement ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Objectifs
L’activation du système immunitaire au cours de la grossesse (activation immunitaire maternelle), par exemple par des virus communs comme le virus de la grippe, est un facteur de risque pour plusieurs troubles psychiatriques et neurologiques, en particulier l’autisme et la schizophrénie. Les animaux utilisés à des fins scientifiques sont des modèles puissants et indispensables pour étudier les liens entre activation immunitaire maternelle et altérations du développement cérébral chez la descendance. Les rongeurs dont la mère a reçu pendant la gestation un composé qui induit une activation immunitaire maternelle en simulant une infection virale, présentent des altérations des neurones qui sécrètent la dopamine. La dopamine est un neurotransmetteur notamment impliqué dans la physiopathologie de la schizophrénie. Cependant les mécanismes responsables des dysfonctions de ces neurones sont inconnus. Dans ce projet, nous tenterons d’identifier les mécanismes responsables des dysfonctions des neurones qui sécrètent la dopamine dans un modèle d’activation immunitaire maternelle chez la souris.
Bénéfices attendus
Parmi les pathologies dont le risque est augmenté par l’activation immunitaire maternelle, la schizophrénie est une pathologie très courante (500 000 à 600 000 patients en France) directement associée à des altérations des neurones qui sécrètent la dopamine. Ainsi, preque tous les traitements pharmacologiques de la schizophrénie disponibles actuellement sont basés sur l’inhibition d’une molécule sur laquelle se fixe la dopamine. Ces thérapies traitent principalement les symptômes positifs (par exemple, les hallucinations et les délires) et la réponse aux médicaments antipsychotiques existants est très variable, avec environ 30 pour 100 des patients classés comme résistants au traitement. Le ciblage des voies de la dopamine dans la schizophrénie est issu de découvertes fortuites et n’est pas fondé sur une compréhension fine des dysfonctions sous-jacentes. Notre projet permettra de comprendre le lien entre un facteur de risque identifié de la schizophrénie (l’activation immunitaire chez la mère), des altérations des cellules immunitaires du cerveau (les cellules gliales), et les dysfonctions du système de la dopamine.
Procédures
Femelles gestantes vigiles : Une Injection de solution par voie intraveineuse (5 minutes). Femelles lactantes vigiles : Traitement antibiotique dans l’eau de boisson pendant 15 jours Puis après sevrage de la descendance : euthanasie selon une méthode réglementaire ou une chirurgie sans réveil permettant les prélèvements et analyses ultérieurs.
Impact sur les animaux
L’injection du composé mimant un virus induit une activation immunitaire, corrélée à une perte de poids d’environ 1 à 2 pour cent du poids total par rapport au poids des animaux témoins deux jours après l’injection, qui reflète une perte d’appétit liée à l’inflammation transitoire. Un stress transitoire est aussi attendu lors de la contention au moment de l’injection. Pendant la période transitoire d’activation immunitaire (c’est-à-dire dans les 24h après injection), il est attendu que les souris présentent un comportement modérément altéré, avec prise de nourriture amoindrie. Cependant, cette perte de poids ne persiste pas : dès le troisième jour après l’injection, les poids des souris ayant reçu le composé et celui des souris ayant reçu l’injection contrôle redeviennent similaires.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés selon des méthodes réglementaires pour des expériences de physiologie et de biochimie, ou après sevrage de la progéniture. Ces souris ne peuvent entrer dans de nouveaux protocoles d’expériences puisqu’elles ont reçu des injections dans le cadre du projet.
Remplacement
L’étude d’un système intégré, requis pour la modélisation des altérations du cerveau associées à des pathologies psychiatriques, nécessite d’avoir recours à des animaux. En particulier, les interactions complexes au cours du développement postnatal entre système immunitaire d’une part, cellules gliales et neurones dans le cerveau d’autre part, ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Réduction
La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre de souris incluses dans le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats significatifs et reproductibles. Le nombre total d’animaux impliqués est de 3696.
Raffinement
Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux de 5 individus maximums et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront exclus du protocole. Dans tous les protocoles, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux utilisés par la mise en place de période d’accoutumance et l’emploi d’anesthésiants et antalgiques adaptés. L’évaluation de la souffrance sera basée sur un suivi quotidien (attitude corporelle, aspect du pelage, poids corporel) de sorte à administrer un traitement anti-inflammatoire/antalgique supplémentaire, ou sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites établis. L’animalerie est maintenue à une température constante entre 20 et 24 degrés avec un éclairage circadien (8 h / 20 h). Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et disposent d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce Mus musculus (souris) repose en premier lieu sur l’anatomie du cerveau de souris qui est très bien caractérisée, ainsi que sur le fait que les grandes étapes de développement du cerveau, les systèmes de neurotransmission et la répartition et la fonction des aires cérébrales sont bien conservés entre souris et être humain. Ces paramètres sont importants dans le contexte de l’étude de mécanismes impliqués dans des pathologies humaines. Les souris gestantes recevant une injection sont de jeunes adultes (8-15 semaines). Les souris soumises aux expériences pour l’étude du développement neuronal postnatal sont des souris juvéniles ou jeunes adultes (jour postnatal 15 à 100). Trois stades de développement seront étudiés : pic du turnover des synapses dans le cerveau en développement chez la souris juvénile ; stade adolescent auquel des changements résultant d’un changement du turnover des synapses se manifeste ; stade adulte pour étudier les conséquences à long terme.
Mécanismes d’agressivité et de résistance des glioblastomes aux traitements (1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
186 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les expérimentateurs greffent des cellules tumorales dans le cerveau, laissent croître une tumeur cérébrale suivie par une grille de points limites, puis pratiquent des séances d'IRM sous anesthésie jusqu'à deux heures et demie avant une mise à mort par perfusion intracardiaque. Le porteur décrit une douleur modérée liée à la croissance de la tumeur et une douleur légère liée à l'IRM. Il affirme s'être assuré de "l'inexistence d'approches alternatives in vitro" capables de reproduire le dialogue entre cellules tumorales et vaisseaux cérébraux.
Objectifs
L’agressivité du glioblastome, une tumeur cérébrale de haut grade chez l’homme, est liée à la présence de cellules cancéreuses souches et à leur résistance aux traitements. Ces cellules souches cancéreuses sont situées dans une niche où elles établissent des interactions privilégiées avec les cellules environnantes, notamment les cellules vasculaires. Des données précédentes de notre laboratoire ont permis de montrer que bloquer la communication entre cellules cancéreuses souches et les cellules vasculaires réduit la progression tumorale in vitro et in vivo chez la souris. Des études récentes sur cellules in vitro suggèrent que la communication entre cellules cancéreuses souches et cellules vasculaires dépend pour partie de l’expression de facteurs d’adhésion et par partie de la signalisation calcique. Il est nécessaire de valider ces résultats dans un modèle expérimental in vivo qui reproduit au mieux les conditions pathologiques. L'objectif de ce projet est de caractériser in vivo, par imagerie, les conséquences de ces mécanismes moléculaires identifiés in vitro. Dans un second temps, nous souhaitons évaluer d'une stratégie thérapeutique anti-tumorale prenant appui sur ces mécanismes moléculaires.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre la communication entre cellules cancéreuses souches et cellules vasculaires et il permettra d'explorer comment la modulation pharmacologique de ces voies de communication favorise la régression tumorale. Cette étude devrait permettre de déterminer si le blocage de la communication entre les cellules tumorales et leur environnement réduit la progression des glioblastomes multiformes, des tumeurs cérébrales incurables chez l'homme (survie médiane actuelle de 15 mois).
Procédures
- greffe intracrânienne de cellules tumorales (sous anesthésie) (animalerie 1) - croissance d'une tumeur intracérébrale (suivi par grille de points limites spécifiques, animaleries 1 et 2) - IRM (sous anesthésie, durée 2h30 maximum, animalerie 2) - administration de médicaments au maximum une fois par jour pendant moins de 14 jours (animaleries 1 et 2) - euthanasie par perfusion intracardiaque sous anesthésie très profonde (animaleries 1 et 2)
Impact sur les animaux
- La greffe intracrânienne de cellules tumorales, conduite sous anesthésie, engendre une douleur modérée - La procédure expérimentale d'IRM, qui sera utilisée pour caractériser la tumeur, engendre une douleur légère et est conduite sous anesthésie. La phase terminale est réalisée sous anesthésie profonde (procédures sans réveil) - la croissance tumorale engendre une douleur modérée et fait l'objet d'un suivi et d'une grille de points limites particulière.
Devenir
Le tissu cérébral des animaux utilisés dans ce projet est analysé par histologie pour mettre en correspondance les analyses à l'échelle cellulaire et les observations réalisées dans les images in vivo. Pour réaliser ces analyses, tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Nous nous sommes assurés de l'inexistence d'approches alternatives in vitro qui pourraient être utilisées pour reproduire l'interaction entre cellules tumorales et cellules vasculaires cérébrales. Cette recherche n'a pas identifié de solution in vitro alternative pour notre étude. En effet les méthodes in vitro basées sur la culture cellulaire ne présentent pas les systèmes de communication multicellulaires nécessaires pour ce projet.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats : au final 20 animaux par groupe et 9 groupes sont prévus, pour un total de 180 souris sur 5 ans. Pour obtenir ces 20 animaux par groupe, nous avons pris en compte i) les problèmes d'implantation/croissance tumorale (15 pourcent), ii) les problèmes lors de l'imagerie (20 pourcent, principalement du au mouvement, risque à compter deux fois puisque l'imagerie est faite avant et après traitement sur chaque animal). Des groupes de 12 animaux complets (i.e. avec toutes les données IRM avant et après) seront suffisant pour obtenir une démonstration statistique. Ce chiffre a été obtenu suite aux calculs effectués dans G-Power (www.gpower.hhu.de) pour un size-effect de 1.25. Pour obtenir ces 12 animaux, et en considérant le risque maximal (12x1.15x1.2x1.2), 20 animaux seront donc commandés par groupe. De plus 6 souris servirtont à la mise au point la procédure d'implantation tumorale.
Raffinement
L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur (critères pris en compte : prostration, renfoncement des yeux, arrêt du nettoyage du pelage). Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance (notamment, suppression de la douleur grâce à l’administration d’antalgiques). L'environnement sera enrichi selon le programme mis en place par l’animalerie. Suite au transport, qui sera réalisé part un transporteur agréé, les animaux auront une semaine d'acclimatation avant le début des expériences.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. En effet, le cerveau de souris permet une analyse neuroanatomique de haute résolution concernant les réseaux cellulaires et vasculaires. Sa taille est compatible avec la microdissection d’aires cérébrales d’intérêt permettant des analyses biochimiques ou moléculaires. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les animaux seront adultes, pour travailler sur un cerveau mature et stable.