Procédures modérées

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le rôle de l'inflammation dans les réponses immunitaires contre les tumeurs. Chaque animal est irradié, reçoit une greffe de moelle osseuse puis des cellules tumorales, et une partie ingère un irritant intestinal par cycles de cinq jours. Le porteur indique que l'irradiation peut faire souffrir en cas de mauvaise reconstitution, que l'irritant colique provoque une perte de poids et une souffrance, et que tous les animaux sont tués pour prélever organes et tumeur. Il affirme que la complexité du micro-environnement tumoral "oblige" à recourir à l'expérimentation animale, les bénéfices restant formulés au conditionnel.

Objectifs

Chez l’homme, les réponses immunitaires anti-tumorales sont souvent inefficaces. Cela est notamment dû au développement d’un épuisement des réponses immunitaires (aussi appelé exhaustion). Il a été montré que certaines protéines sécrétées en contexte inflammatoire contribuaient au développement d’une exhaustion des globules blancs au cours du vieillissement. Au regard de ces résultats, nous souhaiterions déterminer le rôle de ces protéines sur l'exhaustion des réponses immunitaires dans le cadre du cancer.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de préciser le rôle de ces protéines inflammatoires sur les acteurs de la réponses anti-tumorale, notamment sur leur fonction. In fine, ce projet pourrait aboutir à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d'améliorer les réponses anti-tumorales et le traitement de certains cancers.

Procédures

Irradiation (4 minutes par souris), une injection intraveineuse rétro-orbitaire de cellules de moelle osseuse sous anesthésie générale (15 sec/souris). Pour certaines souris, une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale (15 sec/souris) ou alternativement une injection intrapéritonéale d'une substance favorisant le développement de tumeurs (15 sec/souris) suivi de l'ingestion d'un irritant de l'intestin via l'eau de boisson pendant 3 cycles de 5 jours toutes les 2 semaines. Mesure de la croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse trois fois par semaine (30 sec/souris) jusqu'à fin de l'expérimentation ou mesure de la croissance tumorale par échographie sous anesthésie générale toutes les deux semaines pendant 2 mois (5 minutes par souris).

Impact sur les animaux

L'irradiation peut occasionner une souffrance en cas de mauvaise reconstitution des cellules de la moelle osseuse. L'injection intraveineuse, l'injection intrapéritonéale et l'injection sous-cutanée de tumeurs peut entraîner un stress ou une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. L'irritant colique peut entraîner une perte de poids et une souffrance des animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse ou les échographies peuvent également induire un stress chez les animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever les organes et la tumeur pour analyser les cellules immunitaires et l'expression de plusieurs protéines d'intérêt.

Remplacement

La complexité inhérente au microenvironnement tumoral ne permet pas de récapituler les évènements immunologiques impliqués dans des systèmes in vitro, obligeant à utiliser l’expérimentation animale. Les hypothèses testées chez l'animal ont préalablement été testées dans des systèmes in vitro et en se basant sur des données publiées de la littérature.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés. L'utilisation de l'imagerie permet une surveillance non invasive de la croissance tumorale au niveau du tube digestif en évitant la mise à mort séquentielle d'animaux. Chaque animal chimère permet d'analyser les cellules de deux génotypes différents au sein d'un même animal.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Tous les gestes invasifs réalisés sur les animaux seront faits sous anesthésie générale. Des points-limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera suivi de manière quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie et très régulièrement par le responsable du projet (pesée et surveillance deux fois par semaine après l'irradiation, mesure de la croissance tumorale trois fois par semaine après l'injection de cellules tumorales, suivi régulier par échographie pour certains animaux).

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la disponibilité de modèles de souris transgéniques nous permet d'étudier le rôle de certaines voies de signalisation dans le développement tumoral. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Souris adultes de 8 à 14 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral.

6 950 souris immunodéprimées vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer des immunothérapies cellulaires associées à d'autres traitements contre le cancer. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales humaines, la thérapie à tester et des injections répétées, avec un suivi de la tumeur au pied à coulisse et par bioluminescence. Le porteur indique que la tumeur peut rendre les souris cachectiques et douloureuses, applique un point limite au volume tumoral, et tue les animaux en fin d'étude, une partie des surnuméraires étant réutilisée pour entraîner les expérimentateurs à leurs gestes. Il affirme que l'étude dans un "organisme vivant complet" reste "indispensable" après les tests in vitro.

Objectifs

L’immunothérapie est une avancée scientifique majeure dans la lutte contre le cancer. Elle utilise les caractéristiques du système immunitaire et de ses lymphocytes T, qui détectent et éliminent les attaques extérieures (microbes, virus, bactérie) ainsi que les cellules tumorales de l’organisme. Or, ces dernières envoient des signaux qui modulent l’activité de ces lymphocytes T les rendant moins efficaces. Les traitements d'immunothérapie visent à favoriser l’infiltration de cellules immunitaires dans les tumeurs afin de lutter contre, et de les aider à contourner les mécanismes de protection pour les détruire. Plusieurs stratégies existent : L’immunothérapie active basée sur le principe de la vaccination stimule les défenses immunitaires du patient pour prévenir les récidives ou traiter les cancers métastatiques. De petites molécules sont utilisées pour cibler directement les voies de signalisation impliquées dans l’activation et la prolifération des cellules immunitaires. L’immunothérapie adoptive consiste à injecter au patient des cellules "éduquées" qui agissent contre les cellules cancéreuses. Des cellules immunitaires sur lesquelles a été ajouté un attribut (type anticorps) ou dont le récepteur a été modifié, vont reconnaitre spécifiquement la cellule tumorale et enclencher sa destruction. L’administration de molécules agissant sur des points de contrôle immunologique : des protéines présentes à la surface des cellules saines de l’organisme qui régulent la réponse immunitaire en freinant ou boostant la stimulation des lymphocytes T. Les tumeurs peuvent exprimer certaines de ces protéines, leur permettant de passer inaperçues vis-à-vis du système immunitaire. Ces approches représentent des succès en clinique, mais certains cancers présentent malgré tout des résistances aux traitement et imposent de poursuivre la recherche et le développement de nouvelles thérapies. L’objectif de ce projet est de sélectionner les modifications des cellules immunitaires permettant de les rendre plus efficaces face à une croissance tumorale puis leur associer un traitement type petite molécule et/ou biologique afin de permettre une régression tumorale. Ces modèles sont développés sur souris immunodéprimées porteuses de tumeurs humaines. Ce projet vise également à identifier des biomarqueurs montrant l’engagement de la cible et de grande importance dans le diagnostic en clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet comporte plusieurs phases, destinées à déterminer les conditions expérimentales optimales puis à effectuer l’évaluation de l’efficacité de nouvelles thérapies combinant des entités chimiques et biologiques ciblant des cellules tumorales injectées soit en sous-cutanée soit en intraveineuse à la souris. Dans un premier temps, il est nécessaire de déterminer la concentration suboptimale de cellules immunitaires modifiées à injecter induisant une régression tumorale. Si besoin, le suivi des biomarqueurs d’activité soit au niveau de la tumeur, soit dans la circulation sanguine soit dans des organes d’intérêts peut être fait. Dans un second temps, nous évaluerons l’activité des cellules immunitaires modifiées sur la régression tumorale en combinaison avec des traitements d’entités biologiques et/ou chimiques. Ces traitements permettent de lever l’inhibition que portent les cellules tumorales sur les cellules immunitaires modifiées et de stimuler ces dernières. Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche en immunothérapie ciblée et personnalisée. En effet, connaissant les caractéristiques des tumeurs, la modification des cellules immunitaires du patient ou d’un sujet sain permet une reconnaissance ciblée de la tumeur et donc de s’affranchir des effets indésirables dus à la non-spécificité des traitements. L’association de ces cellules avec des entités chimiques ou biologiques permet de lever l’inhibition de la tumeur et de booster les cellules immunitaires.

Procédures

Injection en sous cutané ou en intraveineuse des cellules tumorales sur animal vigile (moins de 30 secondes) Injection en intraveineuse des cellules immunitaires modifiées sur animal vigile (moins de 30 secondes) Traitement intra-péritonéal ou per-os d’entité biologique ou chimique (moins de 30 secondes par administration) mesures du volume tumoral par pied à coulisse sur souris vigile (2 à 3 fois par semaine) (moins d’une minute à chaque mesure). Injection en intra-péritonéal de la luciférine, 2 à 3 fois par semaine (moins de 30 secondes par geste) Un maximum de 6 prélèvements de sang sur 24 h peut être envisagé sur animal vigile (moins de 30 secondes par prélèvement).

Impact sur les animaux

La potentielle souffrance peut être liée à la tumeur inoculée (qui peut rendre cachectique) ou à la croissance tumorale, voire à la convergence des deux. Mais compte tenu de la localisation de la greffe en sous-cutanée et des points limites prédéfinis, cette souffrance semble plutôt de nature modérée. Une potentielle source de stress peut également provenir : De la greffe de cellules immunitaire en intraveineuse. La contention d’une durée maximale de 30s peut générer du stress ainsi que l’injection (moins de 10s). De l’injection en intra-péritonéale de la luciférine pour les mesures d’imagerie par bioluminescence : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress ainsi que l’injection (moins de 10s). De l’administration d’entité biologique ou chimique en intra-péritonéal ou Per-os : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress Pour les prélèvements de sang, il est nécessaire de raser les pattes arrière de l’animal. La contention ainsi que le rasage de la patte d’une durée maximale de 30s peut générer du stress. Du prélèvement de sang au niveau de la veine marginale de la patte. La contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress De l’induction de l’anesthésie pour la mesure d’imagerie : l’induction qui est rapide peut générer du stress

Devenir

Les souris greffées en sous cutanée et non incluses surnuméraires ou dont la tumeur n’a pas suffisamment poussé peuvent être réutilisées pour l’entrainement des expérimentateurs à différentes techniques en lien avec ce projet ou d’autres projets (administration sous-cutanée, intra-veineuse, intra-péritonéale, per os, prélèvements de sang, apprentissage des mesures, puçage, etc…). Elles peuvent également être réutilisées dans d’autres études de pharmacologie (pharmacodynamie, pharmacocinétique) ou servir à l’évaluation de la tolérance d’un produit provenant d’une série chimique connue. En revanche, en cas de non-réutilisation possible, elles seront automatiquement euthanasiées. Pour cela le volume tumoral doit respecter les consignes de l'autorisation de projet dédiée à l'entrainement. Les souris incluses dans les études sont euthanasiées si des points limites sont atteints ou en fin d’étude Pour les souris ayant reçu des greffes de cellules tumorales en intraveineuse : les souris non incluses surnuméraires sont euthanasiées. Les souris incluses dans les études sont euthanasiées si des points limites sont atteints ou en fin d’étude.

Remplacement

Aujourd’hui, de plus en plus de tests in silico et in vitro sont mis en place pour caractériser autant que possible les candidats médicaments, de façon à n’investiguer in vivo que les meilleurs candidats issus de ces sélections. Ce projet est mis en œuvre après la validation in vitro des différentes nouvelles entités biologiques et chimiques. L’absence d’efficacité in vitro ne permet pas de justifier l’utilisation d’un modèle animal par conséquent ce projet s’inscrit en dernier lieu dans le processus de recherche d’un candidat médicament. C’est seulement sur la base de ces données que les études d’efficacité antitumorale sont ensuite réalisées : uniquement les candidats les plus prometteurs vont être testés, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Cependant, cette étape chez l’animal reste aujourd’hui encore indispensable : en effet, même avec les limitations inévitablement liées à n’importe quel modèle, c’est dans un organisme vivant complet que l’on peut vraiment étudier les effets pharmacologiques d’une molécule anti-cancéreuse. Son comportement dans un système complexe est plus relevant d’un point de vue physiologique.

Réduction

Les conditions et taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester ont été déterminés au préalable dans un projet dédié et permettent de sélectionner les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires avant le début de l’expérimentation. Les cellules immunitaires issues de donneurs sains sont modifiées puis évaluées sur des tests in vitro dit de « killing ». Les cellules immunitaires modifiées sont mises en présence de cellules tumorales selon des ratios définis. Le choix du donneur pour une étude in vivo sera donc fait en fonction des résultats de ce test. Le design expérimental a été revu avec le biostatisticien/pharmacocinéticien afin d’identifier notamment le nombre de groupes et de souris dans chaque groupe et par étude au cas par cas, de façon à tirer des conclusions significatives tout en utilisant le nombre minimal d’animaux nécessaires. En cas d’animaux greffés en sous-cutané surnuméraires après randomisation, une ré-utilisation dans un autre projet peut être envisagé après l’aval de la SBEA (structure chargée du bien-être animal). Les tumeurs sont mesurées au moyen d’un pied à coulisse ou par imagerie optique : 2 techniques non invasives pour l’animal qui permettent un suivi de la tumeur dans le temps et une réduction du nombre d’animaux. Dans la mesure du possible, nous réaliserons au cours d’une même étude : •Un suivi de la croissance tumorale (étude d’efficacité) •L’évaluation de biomarqueur (étude de pharmacodynamie) •L’évaluation de la biodisponibilité des produits testés (pharmacocinétique) Ainsi nous contribuons à diminuer le nombre d’animaux car 3 études peuvent être réalisées en une seule étude.

Raffinement

La progression des tumeurs est mesurée via le pied à coulisse (sous cutanée) ou par bioluminescence (intraveineuse) : 2 techniques non invasives pour l’animal. Dans le cas d’un protocole avec traitement chronique, les tumeurs sont mesurées au moins 2 fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais également pour limiter la souffrance et appliquer les points limites si nécessaire. Au-delà de 1500 mm3 (pour les tumeurs greffées en sous-cutanée), une surveillance accrue et une réduction de l’intervalle de temps entre les mesures sont mises en place afin d’anticiper efficacement l’atteinte du point limite attaché au volume tumoral. Pour les études de suivi par imagerie de bioluminescence, la surveillance se fait sur la perte de poids des animaux. Une surveillance accrue sera réalisée si les souris présentent un fort signal de bioluminescence. les doses de produits à administrer à l’animal sont sélectionnées préalablement in vivo grâce à des études de Dose Maximale Administrable (DMA) et Dose Maximale Tolérée (DMT) (faisant l’objet d’un autre projet) afin de limiter les risques d’une potentielle toxicité des composés testés. Les souris immunodéprimées seront hébergées et manipulées dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement et de manipulations strictes appliquées par tout le personnel et intervenants, et ce afin de prévenir tout risque d’infection et/ou contamination. des prélèvements de sang à la veine saphène latérale peuvent être mis en œuvre afin d’obtenir des informations sur des possibles biomarqueurs ou sur le profil d’exposition du composé (évitant ainsi des études de pharmacocinétique dédiées) et pour exploiter au mieux les données d’activité antitumorale. Si des prélèvements répétés sont prévus, le volume maximal prélevé n’excède pas 15% de volume de sang total sur 28 jours. Cette technique de prélèvement, peu invasive et rapide, permet de prélever plusieurs fois sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux, tout en respectant les limites de volémie physiologiques. Les souris sont hébergées en groupes sociaux. Un enrichissement de milieu adapté va également permettre de surveiller leur état général par l’observation de leur comportement vis-à-vis de celui-ci.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique: ces modèles sont davantage déployés chez la souris que chez le rat. Le modèle murin est à l’heure actuelle le modèle le plus couramment utilisé pour ce type de recherche en immuno-oncologie Les souris sont utilisées à partir de 6 semaines soit un poids corporel d’environ 18-20g en début d’expérimentation. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments. Afin de ne pas avoir d’interférence avec les signes de vieillissement nous essayerons dans la mesure du possible de ne pas excéder 6 mois d’âge à la fin des études.

1 664 ombles chevaliers vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier les effets d'un toxique issu des particules d'usure de pneu et d'une hausse de température. Les poissons sont exposés dès les premiers stades de vie à la molécule 6PPD-quinone par balnéation, puis filmés par groupes de cinq pour mesurer leur activité et leur vitesse de nage. Le porteur indique attendre une mortalité d'environ 10 % liée à la température et une hausse supplémentaire liée au toxique, et tue tous les individus, ces stades précoces étant jugés les plus sensibles. Il affirme que le modèle poisson n'est "pas remplaçable ni substituable" pour cette question.

Objectifs

Les lacs péri-alpins tiennent une place particulière en raison de leur réserve en eau douce, et des nombreux services écosystémiques rendus. Néanmoins, ces derniers constituent également une zone importante de stockage des micro-plastiques, dont la majorité serait des résidus de pneus dus à un intense trafic routier. Une étude a mis en évidence une forte contamination du lac Léman aux micro-plastiques dont 60% sont des particules de pneus (TWP pour tire wear particles). La connaissance des impacts de ces micro-plastiques sur la faune aquatique reste encore parcellaire, en particulier sur les poissons. Quelques études ont porté sur les produits issus de la dégradation de la gomme des pneus et de ses additifs, dont beaucoup sont toxiques pour les poissons. En effet, les 2/3 des TWP et autres débris déposés sur la route peuvent ruisseler avec la pluie. La molécule 6PPD-quinone (6PPD-Q), dont la source principale dans les milieux aquatiques provient du lessivage des particules de pneus à partir des routes, est connue pour sa forte toxicité pour les organismes piscicoles et sa présence en quantité non négligeable (jusqu’au mg/L) dans l’eau de ruissellement de chaussée. Elle a récemment été identifiée comme responsable du « syndrome de mortalité par ruissellement urbain » chez le saumon coho adulte et semble particulièrement toxique pour les salmonidés. Le mode d'action précis de la 6PPD-Q est toutefois encore inconnu sur les stade embryo-larvaire, même s’il semble être lié à une perturbation de la barrière hémato-encéphalique. Les effets de la 6 PPD-Q sur les premiers stades de vie de ces salmonidés sont encore indéterminés à notre connaissance. Les effets sont connus chez les larves de zebra fish, ou cette molécule n’entraine pas d’augmentation de la mortalité mais à des effets neurotoxiques et entraine de nombreuses malformations cardiaques. A ce titre, nous nous proposons d’explorer les effets de cette molécule sur les premiers stades de vie de l’omble chevalier qui est un salmonidé vivant dans les lacs péri-alpins. De plus, l’omble chevalier est un bon candidat pour ce projet car il possède un temps de vie embryolarvaire long (4-5 mois), connu et maitrisé par le laboratoire. De plus, l’étude de l'impact d'une molécule toxique est classiquement analysée au stade juvénile, stade qui permet plus facilement de mettre en évidence des effets sur la mortalité, le développement, effets tératogènes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise donc à produire des connaissances et un seuil de toxicité des effets de la contamination à la 6PPD-Q durant premiers stades de vie de l’Omble Chevalier, salmonidé vivant dans les lacs peri-alpins dans un contexte de réchauffement climatique.

Procédures

Les animaux feront l’objet de prise vidéos pour l’observation de leur comportement lors des stades d’alimentation exogéne (750 DPF) et juvénile (840 DPF). Ainsi, les animaux seront testés par groupe de 5, ils seront acclimatés durant 2h dans le système expérimental et seront filmés à l’aide d’une webcam connectée à un ordinateur placé hors de la salle de test (afin de ne pas déranger les poissons durant le test) durant 10 minutes. Ces tests permettent d’évaluer différents comportements, tels que l’activité, la vitesse de nage, grâce à un logiciel de suivi vidéo. Ainsi, la prise de vidéo ne devrait impliquer qu’un léger stress du au changement de bac.

Impact sur les animaux

Compte tenu du peu de connaissance de l’impact de la 6PPD-Q sur les poissons non modèle aux stades embryolarvaires, nous pouvons supposer que les effets devraient être modérés car les doses de 6PPD-Q testées sont des doses environnementales. La seule étude à notre connaissance portant sur les premiers stades de vie a été réalisée sur les larves de zebra fish, où peu de mortalité (2.26% de mortalité à 1ng/L et 7.5% de mortalité à 10ng/L) pour les concentrations testées dans ce projet. De plus, pour les animaux incubés à 8,5°C nous pouvons nous attendre, au vue de la littérature, à une hausse de la mortalité de 10%.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation car d’après la littérature, les premiers stades de vie sont les plus sensibles aux molécules toxiques ainsi il sera inutile de poursuivre les expérimentations au-delà des stades de développements cruciaux choisis.

Remplacement

Le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à la problématique posée (règle des 3 R : Remplacement) étant donné le peu de connaissance sur les premiers stades de vie de poisson et en particulier sur les salmonidés qui semble particulièrement sensible à la 6PPDQ. Ainsi, le modèle poisson est pertinent pour cette étude car il n’est pas remplaçable ni substituable.

Réduction

mixtes (GLM). L’effectif de 60 individus par temps de prélèvement est un minimum pour avoir la quantité de matière nécessaire à nos analyses, mais également pour prendre en compte la variabilité interindividuelle, tout en limitant au maximum le nombre d’individus mis à mort (Règle des 3 R : Réduction). 1 440 individus seront utilisés et mis à mort (60 individus prélevés par temps de prélèvement * 2 conditions thermiques) * 6 conditionnements (témoin eau 0ng/l, témoin éthanol 1.5ng/l stade 200 DPF puis eau claire, 1.5ng/l avec balnéation de la 6PPD-Q durant le développement embryo-larvaire, 3ng/l stade 200 DPF puis eau claire ; 3ng/l avec balnéation de la 6PPD-Q durant le stade embryo-larvaire) * 2 stades de développement (740 DPF et 820 DPF) = 1 440 individus. Au total pour l’expérimentation, nous aurons besoins de 1 440 individus pour les mesures morphologiques et comportementales. Nous pouvons prévoir une mortalité maximum au cours de l’expérimentation d’environ 10% dû à la hausse de température durant le développement embryo-larvaire . Ainsi, 1584 (1440+1440*0,1) individus seront utilisés pour l’effet température. Si nous nous basons sur la seule étude de toxicité de la 6 PPD-Q réalisée au stade larvaire sur les larves de zébra fish à nos concentrations nous pouvons nous attendre à avoir de faible hausse de mortalité (2.26% de mortalité à 1ng/L et 7.5% de mortalité à 10ng/L) , les expérimentations sur l’omble chevalier adultes à nos doses ne montrent pas de mortalité , nous pouvons nous attendre à une hausse de 5% en raison de son affinité présumé pour les salmonidés. Ainsi, 1664 (1584+1584*0,05) individus seront utilisés au cours de l’étude

Raffinement

L’eau sera renouvelée au 2/5 (soit 16 L) tous les 2 jours à partir du commencement du nourrissage soit à 700 DPF pour éviter une accumulation de déchets métaboliques, favorable aux pics azotés et à la survenue de pathogènes. Les animaux seront visités au minimum 1 fois par jour durant la semaine et une fois durant les weekends, une surveillance rapprochée sera mise en place en cas de perturbation (hausse de la mortalité, sous-alimentation). De plus, dans chaque bassin, des galets seront installées pour permettre aux alevins de se cacher (règle des 3 R : Raffinement). Un couvercle sera également mis sur les bacs afin d’éviter tout stress dû à la lumière, les stades embryo-larvaire vivant dans des gravières à 50m de fond. Les animaux seront nourris ad libitum pendant toute la durée de l’expérience à partir de 700 DPF.

Choix des espèces

L'omble chevalier est une espèce sentinelle du changement climatique des lacs alpins qui sont concernés par une forte pollution aux particules de pneu (responsable de 60% de molécules plastiques présente dans le lac léman). Ainsi, cette espéce est à la fois exposé aux particules plastiques et à la hausse des températures dans nos lacs alpins et péri-alpins. De plus, les stades embryonaires choisis pour cette étude sont connus pour être plus sensibles aux polluants.

154 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer une bithérapie contre des cancers dits méthionine-indépendants. Chaque animal reçoit une greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses, un régime privé d'un acide aminé et des traitements injectés, avec un suivi de la tumeur au pied à coulisse trois fois par semaine. Le porteur indique une douleur modérée et une perte de poids liées à la tumeur, prévoit du paracétamol puis de la morphine, et tue les animaux atteignant un point limite de douleur sévère. Il affirme qu'une étude sur "organisme entier" est "nécessaire", la tolérance à long terme des molécules n'étant pas connue et le bénéfice restant un transfert possible "chez l'Homme".

Objectifs

Objectif principal : Evaluation de l’efficacité et de la synergie d’une nouvelle bithérapie ciblant les cancers méthionine-indépendants. Objectifs secondaires : Quantification de la synergie entre les 2 composés de la bithérapie, évaluation de la tolérance et toxicité à long terme des composés en monothérapie et en bithérapie, évaluation de la synergie de tolérance (réduction des effets secondaires liée aux diminutions posologiques permises par la synergie d’efficacité), évaluation des mécanismes d’efficacité anti-tumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité et la tolérance d’une association thérapeutique qui pourra être transférée chez l’Homme pour le traitement du cancer.

Procédures

Greffe de cellules cancéreuses : La greffe sera réalisée par une injection sous-cutanée de cellules cancéreuses (procédure durant 10 min), dans le flanc droit des souris, à une distance suffisante des articulations pour éviter toute limitation des amplitudes articulaires. L’injection sera réalisée après une période d’acclimatation de 7 jours pour diminuer le stress des animaux liée à la minupulation, avec désinfection à la bétadine de la zone d’injection. Cette procédure permettra ensuite de suivre le volume tumoral de manière non invasive. L’étude visant à évaluer l’efficacité antui-tumorale d’une nouvelle association médicamenteuse, tous les animaux de l’étude seront concernés par cette procédure. Administrations des médicaments : L’étude vise à évaluer l’association entre un traitement administré par voie orale, et un traitement administré par voie injectable. Le premier traitement consistera en un régime particulier (croquettes en tout point identiques aux croquettes standards mais dépourvues d’un acide aminé particulier), mis à disposition des animaux. Le second traitement sera administré par voie sous-cutanée, intra-péritonéale (procédure durant 2 min), ou par mini-pompe osmotique SC placée sous anesthésie (procédure durant 10 min), selon ses propriétés de diffusion qui auront fait l’objet d’une étude préalable. Le délai entre deux injections aura été déterminé lors de l’étude préalable, et la fréquence des injections sera réduite au minimum (elle ne dépassera pas 2 injections par jour). Mesure du volume tumoral : Le volume tumoral sera mesuré 3 fois par semaine à l’aide d’un pied à coulisse. Il constituera le critère de jugement principal pour évaluer l’efficacité des traitements. Tous les animaux de l’étude seront concernés. Prélèvements sanguins : Trois prélèvements sanguins sont prévus par animaux (procédure durant 8 min). Ils seront prévelés au niveau mandibulaire, aux temps suivants : J0 (avant la première administrationd de traitement), J7 et J21. Le délai mminimum entre 2 prélèvements correspond au délai nécessaire pour la reconstitution sanguine du volume prélevé qui est réduit au minimum (100 µl).

Impact sur les animaux

Le modèle de greffe tumorale a pour effet attendu une douleur modérée, une perte de poids liée à l’activité métabolique de la tumeur, et un stress modéré lié aux manipulations.

Devenir

Les animaux concernés par les 2 procédures seront mis à mort à la fin de ces procédures. Ceci permettra l’autopsie des souris pour évaluer l’éventuelle toxicité du traitement sur certains organes nobles (coeur, cerveau, foie, reins), et de mieux comprendre les mécanismes d’efficacités du traitement (par l’analyse de la tumeur). La mise à mort préalable avant ces prélèvements, dans le cadre d’une autopsie, permet d’éviter une manipulation chirurgicale sous anesthésie qui comprend des risques d’antalgie ou d’anesthésie insuffisante.

Remplacement

Une étude chez l’annimal est nécessaire pour évaluer l’efficacité d’associations thérapeutiques dont une des deux molécules est un nouveau traitement, jamais testé chez l’animal ou chez l’Homme, et pour vérifier la bonne diffusion de ces nouveaux composés jusqu’à la tumeur lorsqu’ils sont administrés ensemble par voie systémique Les données in vitro sont prometteuses et démontrent l’existence d’une efficacité anti-tumorale des bithérapies à l’étude, le comportement des nouvelles molécules, et a fortiori des associations médicamenteuses impliquant ces nouvelles molécules, n’a jamais été décrit sur un organisme entier. Il est donc nécessaire de vérifier i) que l’administration conjointe des 2 traitements ne modifie pas leur capacité à atteindre la tumeur par des mécanismes de régulations complexes propres aux organismes vivants, et ii) que l’administration systémique des associations thérapeutiques aboutira bien à une efficacité localisée au niveau des cellules tumorales. Aussi, une étude est nécessaire pour évaluer la bonne tolérance des nouvelles molécules et des bithérapies impliquant ces nouvelles molécules, notamment lors d’une administration prolongée et répétée. En effet, une étude in silico (modélisation informatique) et une étude in vivo préliminaire ont permis de sélectionner les composés qui sont bien tolérés à court terme, mais la tolérance à long terme n’est pas connue. La connaissance de la tolérance à long terme de ces nouvelles molécules et nouvelles associations thérapeutiques est nécessaire avant d’envisager leur administration chez l’Homme. Les éventuelles toxicités attendues, de manière hypothétique, étant principalement médullaire et neurologique, une évaluation chez l’animal est d’autant plus pertinente qu’il n’existe pas de modèle cellulaire satisfaisant pour évaluer les effets spécifiques à long terme avec une administration médicamenteuse répétée sur ces systèmes. Nous avons testé la tolérance de notre traitement sur des fibroblastes et des cellules endothéliales, avec des résultats permettant d’envisager une très bonne tolérance in vivo, mais ces modèles ne représentent pas les systèmes les plus susceptibles d’être altérés, et ne permettent pas non plus d’évaluer l’éventuelle toxicité d’une administration répétée. Enfin, la synergie entre les 2 traitements devrait permettre de diminuer les doses nécessaires des nouvelles molécules pour assurer l’absence d’effet indésirable tout en maintenant un effet anti-tumoral.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux dans l’étude, nous avons limité le nombre de groupes de traitements, le nombre d’animaux par groupes, tout en nous assurant que nous aurons un nombre d’animaux suffisant qui correspond aux exigences scientifiques et statistiques pour répondre à la question posée. Concernant le nombre de groupes, nous devions tenir compte de plusieurs exigences scientifiques : Inclure l’analyse de 2 nouvelles molécules agissant via deux mécanismes différents et comprenant chacune des avantages et inconvénients, et inclure des dosages différents. Si nous avions limité l’analyse à l’étude de l’un ou l’autre de ces traitements, nous n’aurions pas pu généraliser les résultats au second traitement en raison de leurs caractéristiques différentes, et l’étude aurait dû être renouvelée pour le second traitement. Réaliser d’emblée cette étude avec ces deux traitements permet de réduire le nombre d’animaux utilisés, notamment en permettant de n’avoir qu’un seul groupe contrôle et témoin. Pour limiter le nombre de groupes, nous avons fait le choix de n’inclure dans l’étude qu’un seul traitement de chacune des deux classes thérapeutiques, en considérant que les résultats de chacun de ces traitements seront généralisables aux autres molécules de leur classe thérapeutique. Inclure différentes posologies (dosages) permettra de statuer sur la synergie (potentialisation d’effet) entre les deux traitements. Pour limiter le nombre de groupes, nous n'avons retenu que deux dosages par traitement. Concernant le nombre d’animaux par groupe, le nombre de souris a été réduit au minimum pour obtenir des résultats exploitables sur le plan statistique. Pour déterminer le nombre d’animaux par groupe, nous avons tenu compte des différences attendues entre les groupes et de la variabilité de résultats au sein de chaque groupe Nous avons calculé qu’il est nécessaire d’inclure dans l’analyse statistique au minimum 11 souris par groupe en fin d’analyse. En raison du risque de non prise des greffes tumorales estimé à 10%, et du risque de décès prématuré de cause non tumorale estimé à 10%, nous avons calculé qu’il était nécessaire d’inclure 14 souris par groupe.

Raffinement

Nous prendrons toutes les dispositions nécessaires pour limiter au maximum les nuisances, attendues ou non, liées aux manipulations des animaux et procédures de l’étude. Le bien-être des animaux fera l’objet d’une évaluation biquotidienne, week-end compris. Pour limiter les nuisances et effets indésirables liées à la greffe tumorale, nous reproduirons un protocole d’étude déjà réalisé et décrit dans plusieurs études concernant les cellules cancéreuses d’intérêt chez des souris. Pour réduire le stress des animaux lié aux manipulations, une période d’acclimatation de 7 jours est prévue avant la première procédure, avec des éléments de distractions prévus dans les cages et des moments de préhensions douces pour habituer les animaux aux manipulations et au contact humain. Toute manipulation sera réalisée dans un environnement calme, et par un manipulateur qualifié pour limiter la durée de chaque manipulation. La douleur ou l’inconfort de l’animal sera évalué 2 fois par jour, week-end compris. Pour prévenir un inconfort modéré, du paracétamol sera administré en continu systématiquement dans l’eau de boisson. Par ailleurs, si des signes comportementaux indiquent une douleur modérée, un traitement morphinique sera administré à visée antalgique à une dose plus ou moins importante selon les signes cliniques observés. En cas de signe clinique indiquant une douleur sévère définissant un point limite, la souris sera mise à mort pour éviter toute prolongation de sa souffrance.

Choix des espèces

La greffe de cellules cancéreuses pancréatiques à des souris a déjà été décrite dans plusieurs articles scientifiques. Reproduire ce modèle permettra de s’affranchir de manipulations de mise au point et de risquer le sacrifice inutile de souris en raison d’une mauvaise prise de greffe ou du délai de croissance tumoral. Nous avons privilégié un modèle de souris immunodéprimées à un modèle murin immunocompétent, car notre étude porte exclusivement sur les cancers méthionine-indépendants, or seules une quarantaine de lignées cancéreuses humaines ont été testées vis-à-vis de leur capacité à proliférer avec/sans méthionine, et aucune lignée murine n’a été testée dans ce but. De ce fait, greffer des cellules cancéreuses murines dont on ignore le statut de méthionine-dépendance/indépendance reviendrait à prendre le risque que l’étude menée ne soit finalement pas interprétable, au cas où la lignée choisie aurait été méthionine-dépendante. Les souris seront accueillies au laboratoire à 6 semaines de vie, pour une greffe tumorale et introduction des traitements entre 7 et 8 semaines de vie, comme décrit lors d’études précédentes évaluant des traitements anti-tumoraux sur le même modèle animal que celui décrit ici (même lignée cancéreuse, même lignée murine).

268 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester une immunothérapie cellulaire contre le myélome multiple. Elles reçoivent par voie intraveineuse des cellules tumorales humaines, parfois après une irradiation aux rayons X et une greffe de cellules souches humaines, puis la thérapie à évaluer, avec un suivi par imagerie. Le porteur indique que la maladie induite peut provoquer une perte de mobilité puis une paralysie des pattes et une perte de poids, et qu'un échec de greffe peut tuer environ une souris sur dix. Il affirme que le recours à un "organisme vivant entier" est "indispensable", les bénéfices annoncés d'une thérapie "universelle" restant un "objectif ultime".

Objectifs

Le myélome multiple (MM) est un cancer du sang caractérisé par la prolifération incontrôlée d'un type particulier de cellules sanguines de la famille des globules blancs appelées plasmocytes. Ces plasmocytes sont des cellules productrices d’anticorps et s’accumulent dans la moelle osseuse. Les traitements actuels du MM reposent sur la chimiothérapie et la greffe de moelle osseuse. Bien que ces traitements aient amélioré la survie des malades, certains patients répondent mal aux traitements conventionnels. L’immunothérapie est une nouvelle stratégie thérapeutique utilisée dans le traitement d'autres cancers du sang, qui vise à réorienter les défenses immunitaires de façon spécifique contre les cellules cancéreuses. Ainsi il est possible de modifier génétiquement une population de cellules du système immunitaire (les lymphocytes), afin qu'ils reconnaissent spécifiquement les cellules tumorales et les éliminent. Le but ultime étant d'améliorer la prise en charge des patients résistants aux traitements classiques. La plupart de ces immunothérapies cellulaires sont faites avec des cellules appelées lymphocytes T car elles sont très faciles à réorienter contre la tumeur; mais elles ont le désavantage d’être spécifiques à chaque individu et ne peuvent pas être données à un autre individu. C’est à dire, qu’un patient ne peut bénéficier de cette immunothérapie à base de lymphocytes T que s’il est en suffisamment bon état de santé (malgré son cancer) pour être prélevé de ses lymphocytes T. Une autre alternative est de faire ces immunothérapies cellulaires avec des cellules appelées lymphocytes NK, qui elles ne sont pas spécifiques à un individu et peuvent être obtenus d’un donneur sain. Cependant, ce type de thérapie dite « universelle » (les cellules thérapeutiques issues d’un donneur peuvent être utilisées pour traiter différents patients) reste peu exploité. Dans notre projet, nous testerons une nouvelle thérapie cellulaire « universelle » à base de lymphocytes NK pour le traitement du Myélome Multiple que nous avons développé. Notre objectif ultime est d’améliorer la prise en charge des malades et de proposer des nouvelles thérapies accessibles pour tous.

Bénéfices attendus

Notre projet consiste à développer une nouvelle immunothérapie cellulaire « universelle » contre le Myélome multiple. Les immunothérapies cellulaires ont déjà fait leurs preuves dans d’autres types de cancer du sang et donnent une nouvelle chance aux patients qui ont rechuté après un traitement classique. Ainsi, nous cherchons à contribuer à l’amélioration de la prise en charge des malades atteints de Myélome multiple en développant des alternatives thérapeutiques. De plus, nous avons choisi de développer cette thérapie cellulaire avec un type de cellules immunitaire pouvant être accessibles pour tous.

Procédures

Notre projet consiste à développer une nouvelle immunothérapie cellulaire « universelle » contre le Myélome Multiple (MM). Pour évaluer son efficacité sur cette maladie, nous utiliserons trois types de modèles murins de MM humain. Ces modèles consistent en l’injection par voie intraveineuse (veine de la queue) de cellules tumorales de MM humain à des souris éveillées (1 minute). Après 7 jours, notre thérapie cellulaire sera injectée (par voie intraveineuse dans la veine de la queue sur souris éveillées ; durée 1 minute) deux ou trois fois par semaine pendant deux semaines). La progression de la tumeur et donc l’efficacité de notre immunothérapie cellulaire seront suivis par imagerie in vivo sous anesthésie générale (durée de la session : 10 min) et ce une fois par semaine pendant toute la durée de l'étude, soit 3 mois maximum. Une deuxième partie de l’étude consiste à vérifier qu’il n’existe pas de toxicité de la part de notre immunothérapie cellulaire envers des cellules saines. Pour ce faire, nous allons utiliser des souris ayant reçu une greffe de cellules souches humaines: les souris reçoivent un prétraitement au rayon X afin de les préparées à la greffe (2 minutes) et elles sont ensuite injectées par voie intraveineuse (veine de la queue) avec des cellules souches humaines (souris éveillées ; durée 1 minute). Cinq semaines plus tard, une prise de sang (1 à 2 gouttes prélevée de la veine mandibulaire, (veine de la joue), durée 1 minute, souris éveillée) sera effectuée pour vérifier la prise de la greffe. Notre thérapie cellulaire sera alors injectée (par voie intraveineuse dans la veine de la queue sur souris éveillées ; durée 1 minute). Pour vérifier s’il existe une toxicité de notre thérapie sur les cellules du sang, des prises de sang (1 à 2 gouttes prélevées de la veine mandibulaire, durée 1 minute) seront effectuées sur les souris éveillés 4 et 7 jours après l’injection de cellules thérapeutiques.

Impact sur les animaux

Dans le modèle de MM humain, les cellules tumorales se multiplient dans la moelle. Ceci entraine fréquemment, quand le traitement n’est pas efficace, l’apparition d’une perte de mobilité qui dans la plupart des cas est suivi par une paralysie des pattes inférieurs, s’accompagnant d’une perte de poids. Des tumeurs au niveau du crâne sont également des évènements susceptibles d’être attendus sur ce modèle, néanmoins ces tumeurs apparaissent à long terme à environ 2 mois post injection des cellules tumorales. Il est également possible que les cellules tumorales s’accumulent au niveau de la rate, pouvant générer une gêne abdominale. Dans le modèle souris humanisé (souris greffées avec des cellules souches humaines), il existe un risque d’échec de greffe (environ 1 souris sur 10) qui peut entrainer la mort de l’animal environ 15 jours après la greffe. L’irradiation rend aussi la souris fragile aux infections et peut favoriser la présence d’une diarrhée et perte de poids. Dans le cas où notre thérapie soit toxique envers les cellules du sang, une perte de poids et un changement de comportement sera attendu.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Nous analyserons à partir de la moelle osseuse et de la rate prélevées en post-mortem, les différentes populations de cellules du système immunitaire.

Remplacement

Nous avons réalisé le maximum d'expériences in vitro afin de valider l'efficacité de nos cellules thérapeutiques. Cependant ces tests ne nous permettent pas d'évaluer à long terme ces cellules thérapeutiques. L’utilisation d’un organisme vivant entier est donc indispensable afin de reproduire les conditions observables chez l’Homme dans le cadre de leur utilisation en thérapie. De plus, il est nécessaire de vérifier ces résultats dans un modèle in vivo, car celui-ci intègre la plupart des caractéristiques de ces pathologies humaines telles que l’hétérogénéité des cellules tumorales, l’existence de tissus sains, la présence de barrières limitant l'efficacité des traitements.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisés au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Plusieurs groupes de souris seront analysés simultanément permettant de n’avoir qu’un seul groupe d’animaux « contrôle ». L’utilisation de l’imagerie in vivo permet également de réduire le nombre d’animaux utilisé grâce à l’analyse d’une même souris sur toute la durée de l’expérience.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes procédures. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, un enrichissement sera mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux, en utilisant une grille d'évaluation hebdomadaire prenant en compte l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. De plus la mesure hebdomadaire par imagerie in vivo, nous permettra d'évaluer la propagation tumorale et euthanasier les animaux si celle-ci devient trop invasive et avant que les signes cliniques n’apparaissent (paralysie par exemple).

Choix des espèces

L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont le comportement est bien connu et proche de l’humain. Ainsi, l’évaluation du bien-être et de la douleur liée à l’expérimentation peut être effectuée aisément (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, isolement) permettant une prise en charge rapide et adapté. De plus, les modèles de MM humains et murins sont bien décrits dans la littérature scientifique. Les souris utilisées dans ce projet sont des animaux adultes de 2 à 3 mois au début de la procédure (injection des cellules tumorales) qui est l’âge de référence utilisé dans de nombreux modèle expérimentaux sur souris adultes.

3 024 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, comme modèles du syndrome de Wolfram. Chaque animal subit un jeûne de 16 h, des injections intrapéritonéales et des incisions caudales répétées sur neuf mois, pour caractériser un diabète et tester cinq composés. Le porteur indique que le modèle Wolfram-like développe progressivement cécité, surdité et troubles vestibulaires, et que les animaux sont tués pour prélever leurs organes. Il affirme que ces modèles murins sont "indispensables", seul "recours mammifère autre que l'humain" à reproduire ces symptômes, alors que les retombées thérapeutiques restent une "preuve de concept" à venir.

Objectifs

Le syndrome de Wolfram est une maladie multi-organe caractérisée par un diabète sucré de type 1, un diabète insipide, une surdité neurosensorielle, une atrophie optique bilatérale et des signes neurologiques. De même, le syndrome de Wolfram-like est caractérisé par un diabète sucré de type 1, une surdité neurosensorielle et une atrophie optique bilatérale. A ce jour, aucun traitement pour lutter contre la progression de ces maladies n’existe. L'objectif principal de ce projet de recherche est de caractériser l'apparition du diabète dans deux modèles murins de ces maladies et déterminer le potentiel thérapeutique de cinq composés chimiques sur ce diabète.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques dans les syndromes de Wolfram et Wolfram-like sont actuellement basées sur la prévention et le traitement des complications pour améliorer le bien-être des patients. Aucun traitement n'est disponible pour arrêter la progression de cette maladie. Ce projet va permettre, dans un premier temps, de caractériser le diabète des modèles murins de référence pour le syndrome de Wolfram et Wolfram-like. Il permettra ensuite d'apporter une preuve de concept d'efficacité de composés développés/cédés par des chimistes sur ces deux modèles.

Procédures

Les gestes techniques à réaliser lors de ce projet sont les suivants : contrôle alimentaire (durée 16h) -identification par marquage à l'oreille - injection en intrapéritonéal sur animal vigile - incision caudale sur animal vigile (anesthésie locale via créme anesthésiante). Chaque animal sera identifié une fois. Les animaux subiront 1 contrôle alimentaire (durée 16h), 2 injections en intrapéritonéal (1 min) à au moins 3 jours d’intervalle, 2 incisions caudales (première fois coupure puis retrait de la croute) à 1 mois. Ces interventions seront répétées à 3 mois, 5 mois, 6 mois et 9 mois pour permettre de suivre l'évolution dans le temps des altérations de la fonction pancréatique des modèles murins, pour un total de 5 contrôles alimentaires, 10 injections en intrapéritonéal et 10 incisions caudales sur une période de 9 mois.

Impact sur les animaux

Les effets attendus seront "légers" à "modérés". La procédure d'identification peut engendrer du stress. Le contrôle alimentaire sur un durée de 16h peut également engendrer un stress. L'incision pour les prélèvements de goutte de sang est superficielle mais peut engendrer un léger stress . Pour limiter le stress, les animaux sont habitués à la manipulation au préalable. Le modèle murin du syndrome de Wolfram-like développe progressivement des troubles neurosensoriels (cécité, surdité et syndrome vestibulaire) à partir de 21 jours après la naissance.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et les organes collectés pour procéder aux analyses de biologie moléculaire et d'immunohistochimie permettant la compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu.

Remplacement

L'utilisation de modèles murins des syndromes de Wolfram et Wolfram-like pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours mammifère autre que l'humain à présenter les symptomes de ces pathologies dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement. L’utilisation de modèles animaux demeure essentielle pour décrypter le vivant. Aucune alternative à ce jour ne peut s'y substituer totalement. Même si les méthodes in vitro ou in silico jouent un rôle important dans de nombreux projets de recherche, elles ne permettent pas, seules, de comprendre et de reproduire les interactions multiples au sein d’un organisme vivant.

Réduction

Nous avons basé la taille de notre lot sur les données bibliographiques de souris développant un diabète, non induit par un régime spécifique. Nous avons estimé que 12 animaux par groupe expérimental sont nécessaires et suffisants pour générer des données statistiquement robustes tout en prenant en compte une éventuelle variation inter-individuelle. De plus, des analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe et ce nombre sera révisé au besoin. De même, les animaux utilisés pour la réalisation des tests métaboliques seront ensuite euthanasiés et leurs organes collectés afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet. Ces tissus seront utilisés pour lors de nombreuses analyses, morphologiques, histologiques, afin de disposer du plus large éventail de données possibles à l’issue d’une procédure expérimentale et ainsi réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Nous procéderons à l'enrichissement du milieu avec accès à des maisons en carton et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L'état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière. Des points limites ont été établis afin de surveiller au plus près les altérations dues aux procédures prévues dans le projet . Les animaux manifestant au moins un des points limites identifiés seront systématiquement euthanasiés. En plus des procédures habituelles d’hébergement, une attention particulière sera portée à la litière des animaux. Si une augmentation de la production d'urine à la suite du développement d'un diabète est constatée, le fond de cage sera renouvelé plus fréquemment. Pour limiter l’agitation des souris présentant un syndrome vestibulaire, l’enrichissement sera renforcé dans les cages. Enfin, pour éviter que les souris présentant un syndrome vestibulaire ne puissent se blesser, les abris utilisés pour enrichir les cages seront en carton et non en matériau dur.

Choix des espèces

La pathologie du syndrome de Wolfram est une pathologie multiorgane où les altérations neurosensorielles s'accompagnent de signes neurologiques, cognitifs et endocrinologiques. Un modèle rongeur permet de caractériser les signes d'altérations métaboliques dans un schéma physiologique global d'évolution de la pathologie et d'ainsi tester le potentiel thérapeutique d'une ou plusieurs molécules thérapeutiques. Les tests métaboliques seront réalisés sur les animaux à 1 mois, 3 mois, 5 mois, 6 mois et 9 mois pour permettre de suivre l'évolution dans le temps des altérations de la fonction pancréatique des modèles murins.

18 chats vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester la tolérance et la pharmacocinétique d'un médicament antidiabétique vétérinaire. Chaque animal reçoit un à deux comprimés par jour pendant sept jours, avec des prélèvements sanguins répétés à la veine jugulaire et un hébergement individuel pour surveiller vomissements et alimentation. Le porteur indique que les prélèvements peuvent laisser des douleurs ou des hématomes, et que l'isolement, les vomissements et d'éventuels troubles urinaires peuvent gêner l'animal, les chats étant ensuite gardés en vie. Il affirme qu'il est "indispensable de recourir à l'animal entier" et reconnaît qu'aucune analyse statistique n'a fondé le nombre de 18 animaux.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de démontrer la tolérance et les paramètres pharmacocinétiques d'un élément test après une administration répétée pendant sept jours à trois doses différentes.

Bénéfices attendus

La cible thérapeutique est le chat. Le bénéfice de ce projet est de développer un nouveau médicament contre le diabète chez le chat.

Procédures

Les animaux seront soumis a des administrations orales: adminsitration de 1 à 2 comprimés maximum pendant 7 jours. Durée d'une administration inférieure à la minute. Des prélèvements sanguins seront réalisés à la première et dernière administration aux temps suivants: Jour 1: 0h (réalisé à jour-1), puis 0.5h, 1.5 h, 4 h, 6 h, 8 h, 24 h après traitement. Jour 7: Predose (juste avant administration ), puis 0.5h, 1.5 h, 4 h, 6 h, 8 h, 24 h aprés traitement. Un volume de 1 mL de sang sera collecté à chaque temps de prélèvement. Durée d'un prélèvement inférieur à la minute. Les animaux seront hébergés de manière individuelle aprés chaque administration pendant 4h et pendant 24h au septième jour aprés la dernière administration. Cela est nécessaire pour le suivi de l'alimentation, pour observer les éventuels vomissements et pour recueillir les urines par miction spontanée. Recueil d'urine aprés la dernière administration pendant 24h uniquement.

Impact sur les animaux

Du stress lié à la contention. Des douleurs ou hématomes au niveau des veines jugulaires pourront être présentes suite au différents prélèvements sanguins. De l'inconfort, de la gêne pourront être ressenti par l'animal lors de l'hébergement en condition individuelle. Des vomissements seront peut être observés cela pourra également entrainer un mal être pour l'animal. Des troubles de l'alimentation ou bien des troubles urinaires pourront peut être, être observés.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux, ni de mimer la tolérance des produits administrés, il est indispensable de recourir à l’animal entier. L'utilisation des animaux reste une exigence dans le cadre de la réglementation liée à l'autorisation de mise sur le marché (AMM) d'un nouveau médicament.

Réduction

18 animaux seront inclus dont 6 animaux par groupe et 3 animaux par sexe. C'est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats interprétables. Aucune approche statistique a été réalisé pour ce projet.

Raffinement

Les chats seront hébergés par groupe de 3 par sexe pendant la période d'acclimatation. Les animaux seront hébergés de manière individuelle aprés chaque administration pendant 4h et pendant 24h avant la première administration et au septième jour aprés la dernière administration. Durant cette période les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. De l'enrichissement (exemple: griffoir, coussin) sera présent dans chaque box autant que possible. Tout geste réalisé sur l'animal sera fait par un personnel formé. Si un animal présente un signe de souffrance, un problème de comportement, un signe clinique sévère ( exemple vomissement trés intense à répétition, trouble de la miction ou troubles de l'alimentation), cet animal pourra être pris en charge par le vétérianaire désigné et pourra avoir un traitement adapté pour soulager ses maux ( exemple administration d'un antivomitif, distribution d'aliment humide si nécessaire)

Choix des espèces

Espèce cible pour ce produit vétérinaire. Adulte, age supérieur à 1 an. Animaux de poids supérieur à 2.5 Kg. Nécessaire pour avoir des groupes homogènes en poids autant que possible. Ce stade de développement permettra de démontrer les paramètres PK et le côté sécuritaire du principe actif au stade cible que vise le nouveau médicament.

160 anguilles européennes vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avant d'être relâchées dans le milieu naturel. Chaque individu est capturé, anesthésié, puis équipé par chirurgie d'un émetteur acoustique et d'une marque RFID implantés sous la peau avec un à trois points de suture, pour suivre en télémétrie la migration de dévalaison en lagune. Le porteur indique que le stress de la capture et du marquage peut retarder la migration, et écarte les individus déjà blessés ou en mauvais état sanitaire. Il affirme qu'il est "indispensable" d'étudier des anguilles sauvages capturées dans le milieu, l'espèce étant présentée comme menacée d'extinction.

Objectifs

Ce projet a pour objectif (i) de mieux connaître la dynamique de dévalaison à l'intérieur d'un système lagunaire, (ii) d'étudier la diversité des comportements migratoires et (iii) d'évaluer le succès de deux projets de restauration de la continuité hydrobiologique.

Bénéfices attendus

L'analyse des détections enregistrées par les stations d'écoute fixes et mobiles permettront de : i) S'assurer du bon déroulé de l'opération de marquage et de la survie des individus, -ii) Etudier le comportement des individus relâchés après l'opération de marquage : sont-ils immédiatement mobiles ou non ? - iii) Etudier comportements migratoires des individus : est-ce qu'ils dévalent tous ou certains remontent-ils au contraire le cours d'eau ? -iv) Connaître à quel moment les individus prennent la direction de la mer -v) Evaluer combien d'individus parmi ceux qui ont été détectés partis des bassins amont parviennent jusqu'aux portes de la mer - vi) Estimer la durée nécessaire pour les individus de parcourir la distance entre l'embouchure des bassins et les portes de la mer -vii) Evaluer si les voies de connexion restaurées sont utilisées par les anguilles pour rejoindre la mer -ix) Mieux connaître la diversité des comportements de dévalaison. Les résultats obtenus pourront éventuellement permettre de formuler des préconisations pour la gestion des ouvrages de connexion, afin d'optimiser le retour en mer des anguilles.

Procédures

Capture dans un vereux (nasse) : relève toutes les 24h approximativement. Facultatif : Si trop de captures, mise en couve jusqu'à 3 jours maximum. Stabulation dans un bac obscur et aéré : de 5 min à 4h Bain anesthésiant: 5 à 15 min Injection analgésique : 2 s Marquage avec une fermeture de la plaie à l'aide de 1 à 3 points de suture : 2 à 5 min Phase de réveil sous surveillance : de 10 à 30 min Stabulation avant relâcher : de 5 min à 2h

Impact sur les animaux

Le stress de la capture et du marquage est susceptible de retarder la migration des individus.

Devenir

L’ensemble des animaux sera remis en liberté à la suite de leur marquage, ce qui est primordial pour répondre à l’objectif de l’étude.

Remplacement

L’étude portant sur le comportement de poissons en milieu naturel, l’expérimentation doit être réalisée avec des individus capturés dans le milieu, et ne peut donc s’affranchir de l’emploi de poissons sauvages.

Réduction

Le milieu étudié présentant des densités d'anguilles élevées, il est nécessaire de suivre un maximum d'individus afin de pouvoir obtenir des résultats robustes et représentatifs de l'ensemble des deux sous-populations ciblées. De plus, au niveau des embouchures des bassins ciblés, des individus peuvent se faire éventuellement prédater par des silures. Et entre l'embouchure des bassins ciblés et les portes de la mer, les anguilles peuvent être prélevées par les pêcheurs professionnels ou la prédation aviaire. Par conséquent, un nombre suffisamment élevé d'individus doivent être marqués pour optimiser les probabilités d'avoir suffisamment d'individus qui parviennent jusqu'aux sorties de l'hydrosystème du Vaccarès. Dans le cadre de cette étude pilote, un total de 40 individus par bassin et par saison de dévalaison (octobre à mai), soit un total de 80 pour une année de suivi, et 160 si deux années de suivi sont réalisées, seront marqués. Le choix de ce nombre est un compromis entre avoir suffisamment d'individus pour obtenir des résultats robustes (n>>30 par bassin et par saison de suivi) et avoir suffisamment de moyens financiers pour y parvenir (coût des marques acoustiques relativement élevées >400€). Si les retours d'expérience sont favorables, un déploiement à plus grande échelle sera éventuellement envisagé.

Raffinement

Un individu qui présente des marques externes de blessures prononcées (souvent d'origine de prédateurs aviaires) ou d'autres signes d'état sanitaire dégradé (kystes, parasites, opacité des yeux, etc.) ne sera pas utilisé dans le cadre de cette procédure. Le marquage des individus s'effectue sous anesthésie et analgésie pour limiter au maximum la douleur. Un individu qui présente un comportement anormal lors de son anesthésie: des signaux d'hyperventilation ou de tremblements sera immédiatement placé dans le bac de réveil et ne sera donc pas traité. Les bacs de stabulation seront noirs, de manière à favoriser l'obscurité et diminuer le stress des individus pendant les phases de stabulation (avant leur traitement et pendant la phase de réveil). La densité des individus par bac sera limitée à 40kg/L. Et les bacs seront brassés par des aérateurs pour favoriser le brassage et l'oxygénation de l'eau. Les bacs seront placés à l'ombre pour éviter que l'eau se réchauffe excessivement. Une fois un individu marqué, il pourra être détecté en continu à plusieurs points de passage, aux points de sorties des bassins ciblées ainsi qu'aux portes de la mer, de manière continue. Ces suivis télémétriques (RFID et acoustique) constituent un moyen de raffiner le suivi en capture-marquage-recapture, puisqu'il permet de suivre à distance le déplacement d'individus marqués (de recapturer leur signalement) sans avoir à les manipuler à nouveau.

Choix des espèces

L’anguille européenne est une espèce migratrice amphihaline catadrome qui présente un cycle de vie unique, et qui est actuellement menacée d'extinction. Afin de mieux comprendre ses déplacements et en particulier de mettre en place des dispositions pour optimiser son retour en mer, il est indispensable d’étudier des individus de cette espèce. Dans le cadre de cette étude, uniquement des anguilles femelles argentées de plus de 50 cm, ayant un poids suffisamment important (>400g) pour supporter l’implantation de transpondeurs sans affecter leurs constantes vitales, seront utilisées. L'implantation de transpondeurs correspond à un lestage total de 5.1g dans l'air, avec une marque RFID de 23 mm de long qui pèse 0.6 g et un émetteur acoustique de 9mm de diamètre qui pèse 4.5g dans l'air (et 2.7g dans l'eau). L’impact des implants est négligeable lorsque leur masse est inférieure à 2.5% de celle du poisson, ce qui se vérifie ici.