Procédures modérées

66 souris vont être utilisées, chacune passant 48 heures isolée dans une cage de calorimétrie et subissant trois séances de rotarod, de grip test et de marche en équilibre sur une planche à trous, ainsi qu'un open field de 30 minutes, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les prises de sang se font sous anesthésie, et une partie des souris reçoit pendant six mois un régime enrichi en sucres et en lipides, que le porteur dit capable de conduire "à la longue à une obésité". L'équipe a créé une lignée privée d'un gène dont les souris résistent à la prise de poids, et veut comprendre cette résistance en les comparant à des souris témoins. Toutes sont tuées à l'issue pour l'analyse de leurs tissus. Le porteur retient des groupes de 12 souris pour deux génotypes et deux régimes, soit 48 souris, et écrit pourtant que "l'étude de 66 animaux sur 3 ans est nécessaire".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier la locomotion et le métabolisme chez des souris qui semblent résistantes à la prise de poids. En effet, nous avons développé un modèle de souris avec une perte d’expression d’un gène spécifique, et à notre surprise ces animaux sont résistants à la prise de poids. Des analyses complémentaires montrent une masse musculaire normale mais une non-accumulation de la masse graisseuse dans ces animaux à l’âge d’un an. Nous souhaitons donc explorer plus en avant ce phénotype, notamment via des analyses longitudinales de la composition corporelle, du métabolisme, de l’activité locomotrice et de la calorimétrie de ces animaux, complété par des analyses sanguines, et ceci à la fois en diète normale ou enrichie en lipides. Nous espérons que cette approche nous permettra de mieux comprendre la résistance à la prise de poids dans ce modèle.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour but d’étudier l’activité locomotrice et le métabolisme dans un modèle de souris. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier la locomotion et la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour l’étude de l’activité locomotrice et du métabolisme.

Procédures

1 – Les prélèvements sanguins requièrent moins d'une minute. 2 – L’analyse de la masse corporelle se fera par qNMR, qui est une analyse non-invasive d’une durée de 1 minute. 3 - L’analyse du métabolisme se fera par des tests de Calorimétrie indirecte, qui se déroulent dans des cages d’hébergement individuelles pendant 48 heures. 4 – L’analyse de la locomotion des animaux se fera par une batterie de tests non invasifs réalisés sur une durée de 3 à 4 semaines selon un protocole classique : pour le rotarod, 3 tests de 5 min sont réalisés par souris ; le grip test et la marche en équilibre sur planche à trou sont aussi réalisés trois fois (environ 5 min) par souris et l’open field est un test de 30 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Nous souhaitons étudier le métabolisme et l’activité locomotrice chez des souris résistantes à la prise de poids, et ceci via des tests classiques et non invasifs. Nous souhaitons aussi analyser les paramètres biochimiques de ces souris et ceci via un prélèvement d’une faible quantité de sang. Ces analyses peuvent induire des contraintes décrites ci-dessous : -Une partie de l’étude du métabolisme se fait chez des animaux avec une diète enrichie en sucres et en lipides, ce type de régime peut conduire à la longue à une obésité avec ces problèmes associés (difficulté à se déplacer, etc.). Nous allons donc restreindre ce régime enrichi en sucres et en lipides à une période de 6 mois. - Toujours à propose de l’étude du métabolisme, celle-ci nécessite des tests se déroulant dans des cages d’hébergement individuelles, conduisant donc à un isolement des animaux pendant 48 heures. Toutefois ce test est de courte durée et une fois terminé, les animaux sont remis dans leurs cages d’origine avec les mêmes dispositions d’avant le test (les mêmes souris dans la même cage, et les cages sont gardées dans le même état qu’avant le début du test, et ceci afin que les animaux retrouvent leur environnement). - Concernant les prélèvements sanguins, ceux-ci peuvent entrainer un stress et/ou éventuellement à une légère douleur. Les animaux seront donc anesthésiés quelques minutes avant le prélèvement sanguin.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure afin d’étudier leurs tissus pour des analyses histopathologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude a pour but d’étudier l’activité locomotrice et le métabolisme dans un modèle de souris d’une maladie humaine génétique. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier la locomotion et la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour l’étude de la locomotion et du métabolisme. Enfin, nous espérons que l’analyse de ce modèle murin permettra de mieux comprendre la faiblesse musculaire et la perte de poids de noter maladie d’intérêt.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Des travaux précédents et l’étude de la littérature nous ont permis d’établir que l’étude de groupes de 12 animaux permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs, et compte tenu de notre projet d’analyser deux conditions (souris contrôle ou souris sans notre gène d’intérêt) sous deux types de nourriture (normale ou enrichie en lipide), nous estimons que l’étude de 66 animaux sur 3 ans est nécessaire.

Raffinement

Afin de limiter la prise de poids des animaux, le régime enrichi sera limité à 6 mois. De plus, les prélèvements sanguins à la veine temporale superficielle se feront sous anesthésie. Les point limites seront alors déterminés en fonction des observations faites d'une part pendant l'anesthésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l'animal) et d'autre part pendant et après le prélèvement sanguin (changement du comportement : akinésie, prostration, paralysie, non réponses à des stimuli externes). L'anesthésie et la procédure de prélèvement seront arrêtés si ces points limites sont atteints. Enfin, les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. Néanmoins, si des signes de douleur apparaissaient (réduction de l’appétit, diminution de la mobilité et du comportement exploratoire, tendance à l’isolement, poil terne et hérissé, dos voûté), nous ferons alors un traitement analgésique et anti-inflammatoire. De plus, de la nourriture gélifiée sera de plus mise à disposition de l'animal dans la cage dès les premiers signes de problème moteur pour palier tout risque de réduction de prise de nourriture. Toutefois, en cas de douleur forte (isolement, immobilité, automutilation, cachexie, etc.) et/ou d’échec des traitements précèdent ; les animaux seront euthanasiés rapidement pour éviter toute souffrance et l’expérience sera stoppée.

Choix des espèces

Cette étude a pour but d’étudier l’activité locomotrice et le métabolisme dans un modèle de souris. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour l’étude du métabolisme. Nous allons étudier le métabolisme et l’activité locomotrice par des tests non invasifs sur 66 souris adultes, et ceci sur une période de 6 mois pour l'étude du métabolisme, à 15 mois pour l'étude de la locomotion, Ce protocole a été choisi d’après nos expériences précédentes et par l’étude de la littérature et ceci afin de reproduire l’aspect progressif de la perte de force et de la prise de poids des animaux.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une myopathie centronucléaire, elles reçoivent une injection d'un vecteur viral, subissent des mesures de force musculaire sous anesthésie et la pose d'électrodes pouvant enflammer le muscle, avant le prélèvement de leurs organes. L'objectif est de tester une thérapie génique apportant le gène manquant responsable de la maladie musculaire. Le porteur affirme que ces analyses "ne peuvent pas être effectuées" sur cellules en culture, seul l'animal reproduisant l'évolution des symptômes.

Objectifs

Les myopathies centronucléaires sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints et aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Le principal objectif de ce projet est de mettre au point un traitement curatif en apportant le gène manquant responsable de cette maladie à l'aide d'un vecteur viral. En parallèle nous souhaitons également étudier plus en détail les fonctions des différents domaines de la protéine manquante responsable de la maladie musculaire.

Bénéfices attendus

Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires. Ce projet permettra également de faire avancer les connaissances scientifiques relatives aux fonctions des différentes régions de la protéine étudiée.

Procédures

Les 140 souris de la cohorte « Injection intraveineuse » seront soumises aux procédures suivantes : - Injections systémiques rétro-orbitales sous anesthésie générale, non-invasive, unique à 8 semaines d’âge, 5min par animal. -Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, non-invasive, hebdomadaire de 6 à 12 semaines d’âge, 10min par animal - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 13 semaines d’âge

Impact sur les animaux

Les animaux présentent une légère atrophie et faiblesse musculaire mais qui n’affecte pas leur qualité de vie de manière significative aux âges analysés. Les animaux interagissent, se déplacent et s’alimentent normalement. En revanche lors de la soumission à l’effort ou par stimulation électrique, le phénotype des souris devient observable et quantifiable le temps de l’analyse. A notre connaissance il n’y a pas de douleurs associées au phénotype myopathique. La pose sous-cutanée des électrodes et l’injection intra-musculaire peuvent causer une inflammation dans le muscle tibial antérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures car notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire.

Remplacement

Ces analyses ne peuvent pas être effectuées sur des cellules en culture car celles-ci ne reproduisent pas la fonction d’un organe et encore moins d’un organisme entier. En effet seul le modèle animal permet d’étudier d’une part la maladie dans sa globalité et d’autre part l’évolution des symptômes, ce qui est essentiel dans le cadre d’une mise au point de thérapie.

Réduction

Le nombre d’animaux a été basé sur les résultats de précédentes études sur ces mêmes animaux. Il nous permet d’assurer la robustesse statistique des différences entre animaux sains et malades et ainsi d’évaluer correctement l’effet de notre traitement. Toutes les souris passeront des tests phénotypiques et leurs tissus seront collectés pour compléter l’analyse histologique et moléculaire, nous permettant ainsi de nous affranchir de la création d’une deuxième cohorte pour la collection de tissus, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaire à la procédure expérimentale.

Raffinement

Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Lors de l’injection par voie rétro-orbitale, du gel ophtalmique sera appliqué au niveau de l’œil de l’animal afin de s’affranchir de la sécheresse oculaire au réveil. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir toute douleur lors de l’opération chirurgicale. Durant la procédure les souris seront placées sur une plaque chauffante pour maintenir leur homéostasie thermique et elles seront monitorées en permanence.

Choix des espèces

Pour tester l'éventuelle amélioration thérapeutique, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo sur modèle animal. Nous disposons déjà de plusieurs modèles murins de myopathies avec lesquelles nous avons publié plusieurs études sur les myopathies centronucléaires. Conserver la même espèce animale pour ce projet s’inscrit dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Nous prévoyons ainsi de réaliser cette étude sur des lignées de souris déjà disponibles dans nos laboratoires, ces modèles présentent des phénotypes comparables aux symptômes observés chez les patients humains. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. L’effet du traitement avant l’apparition des symptômes a déjà prouvé son efficacité lors d’une étude précédente au laboratoire, nous traiterons donc ces animaux au stade adulte (8 semaines) pour étudier l’effet du traitement après l’apparition des symptômes.

210 rats et 24 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur provoque une douleur inflammatoire de la patte par des stimulations thermiques ou mécaniques répétées, ou une douleur post-opératoire par incision et sutures, avec un risque d'automutilation de la plaie. L'objectif est de tester des nanomédicaments à base d'enképhalines contre la douleur, une partie des animaux étant tuée pour doser les substances dans le sang. Le porteur affirme que la complexité de la douleur rend le recours à l'animal "incontournable" et présente le rat comme l'espèce "de référence".

Objectifs

La morphine et les opioïdes synthétiques apparentés sont les analgésiques les plus largement utilisés mais leur utilisation est associée à des effets secondaires graves, tels que la dépression respiratoire, l'accoutumance et la dépendance. Dans ce contexte, les enképhalines, qui sont des opioïdes existant naturellement dans le corps humain, sont une option intéressante car elles jouent le rôle d’une morphine endogène, inhibitrice de la douleur mais sans effets secondaires. Cependant, l'utilisation des enképhalines a toujours été limitée car elles sont rapidement dégradées après leur injection dans la circulation sanguine. Ainsi, la conception de systèmes d'administration les protégeant de la dégradation et leur permettant d'atteindre leur cible pour délivrer leur action est un objectif ambitieux. Notre équipe a développé une nouvelle approche de nanomédecine permettant la protection des enképhalines. La preuve de concept a été faite sur un modèle classique de douleur inflammatoire chez le rat et l’étude a montré que les nanomédicaments contenant les enképhalines ont protégé la substance active qui s’est accumulé au site de la douleur et a montré une action analgésique périphérique. Cette étude préliminaire est très encourageante et une des voies d’amélioration de l’activité analgésique des enképhalines repose sur l’augmentation de leur stabilité par l’utilisation de médicaments qui empêche leur dégradation (appelés inhibiteurs d’enképhalinases) et ainsi prolonger encore leur durée de vie et donc leur action anti-douleur. Notre objectif est de tester cette piste d’amélioration en développant de nouveaux médicaments à base d’inhibiteurs des enképhalinases pour booster la concentration en enképhalines et traiter efficacement et durablement la douleur.

Bénéfices attendus

La douleur représente un important défi sanitaire mondial en raison de l'absence relative de traitement efficace, en particulier pour soulager la douleur neuropathique. Actuellement, les médicaments les plus puissants et les plus fréquemment utilisés pour soulager la douleur sont la morphine et les opioïdes de synthèse. Toutefois, leur utilisation chronique est associée à de graves inconvénients, tels que la dépression respiratoire, la tolérance et la dépendance. Chaque jour, plus de 130 personnes aux États-Unis meurent après une surdose d'opioïdes. Il existe donc un besoin important de médicaments antidouleur efficaces dépourvus d’effets secondaires. L’objectif de ce projet est le développement de nouveaux traitements innovants de la douleur. Les enképhalines qui sont des opioïdes naturellement existants dans le corps humain représentent un moyen prometteur d'atténuer la sensation de douleur, sans les effets secondaires de la morphine. Cependant, leur dégradation rapide une fois administrés limite leur utilisation clinique. Ainsi, la conception de nanosystèmes d'administration de médicaments protégeant les enképhalines de la dégradation et leur permettant d'atteindre les récepteurs opioïdes situés dans le système nerveux périphérique (effet local et non central) est un objectif majeur. Cette nouvelle approche permettrait de lutter contre la crise des opioïdes qui a englouti l'Amérique, et d’autres pays dans une moindre mesure, dans une vague d'addiction et de décès par overdose.

Procédures

Pour le modèle de douleur inflammatoire au niveau de la patte, le rat subira 2 injections, d’une durée de quelques secondes, sous anesthésie générale. La voute plantaire des pattes arrière du rat sera soumise une douzaine de fois (toutes les 30 minutes environ) à un stimulus thermique ou mécanique, qui va déclencher le retrait spontané de la patte, l’animal n’étant pas contraint. La procédure durera au maximum 24h. Pour le modèle de douleur post-opératoire, le rat ou la souris subira une incision qui sera refermée avec 2 points de suture sous anesthésie générale (durée de l’intervention : 5 minutes). Pour la pharmacocinétique, chaque rat sera soumis à une injection et à 4 ou 5 prélèvements de sang sur 24 ou 48 h. Ces gestes seront réalisés sous anesthésie à l’isoflurane et dureront moins d’une minute. Pour la biodistribution, chaque souris sera soumise à une injection unique de traitement et sera suivi en imagerie à différents temps sur une période de 24h. Les injections et l’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale et dureront moins d’une minute.

Impact sur les animaux

Le modèle d’inflammation de la patte induira une douleur locale modérée pendant 3 à 8 h avec une réduction de la motricité mais sans autres manifestations comportementales notables. La voute plantaire des pattes arrière du rat sera soumise à un stimulus thermique, qui va déclencher le retrait de la patte. La douleur reste modérée car les animaux ont la possibilité d'échapper à la stimulation en retirant leur patte, l’animal n’étant pas contraint. Le modèle de douleur post-opératoire, équivalent à la suture d’une plaie superficielle aux urgences de l’hôpital sous anesthésie locale, induira une douleur locale pendant 2 à 3 jours avec un pic de douleur à 24h. Une éventuelle infection au site d’incision ou une désunion de la cicatrice seront à surveiller ainsi que des comportements d’automutilation au niveau de la plaie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures, soit parce que l’étude est terminée et qu’ils ne pourront pas être ré-utulisés dans une autre procédure, soit pour réaliser des prélèvements sanguins pour doser les substances actives dans le plasma.

Remplacement

La douleur est un phénomène très complexe. C’est une expérience sensorielle et émotionnelle désagréable, associée à une lésion tissulaire. Le stimulus générant la douleur va activer les terminaisons nerveuses de neurones spécialisés dans la perception de la douleur. Ce signal se propage ensuite le long des fibres nerveuses jusqu’à la moelle épinière et le cerveau. Il existe dans le cerveau et la moelle un puissant système de contrôle de la douleur qui fait notamment intervenir des endorphines et régule le transfert des informations douloureuses en provenance de la périphérie. Cette complexité est actuellement impossible à modéliser in vitro ou in silico et le recours à l’animal est incontournable pour évaluer nos nanomédicaments sur la douleur. Le rat constitue un bon modèle d’étude de la douleur car il possède une organisation nerveuse comparable à celle de l’homme. Les modèles de douleur inflammatoire sont validés par la communauté internationale (International Association for the Study of Pain, IASP)

Réduction

Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été réalisé à l’aide d’un logiciel de statistique qui permet de déterminer le nombre juste et minimal d’animaux qui garantira la validité statistique de l’étude. Un plan d’expérience a été construit afin de réduire au maximum le nombre d’animaux. Les animaux seront répartis dans les groupes expérimentaux de manière aléatoire. L’attribution des traitements se fera en simple aveugle pour éviter les biais expérimentaux. Si les traitements innovants testés ne présentent pas l’effet analgésique escompté l’étude s’arrêtera là. Pour l’étude de pharmacocinétique, afin de réduire le nombre d’animaux, plusieurs prélèvements sanguins seront réalisés sur le même animal dans la limite du volume maximal prélevable en 24h. L’étude de biodistribution se fera en imagerie par fluorescence ce qui permettra un suivi longitudinal des animaux et de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

La semaine précédent la mise en place du modèle, les rats seront manipulés tous les jours et habitués aux gestes de la procédure afin de minimiser le stress le jour de la procédure expérimentale. Les injections, lesprélèvements et la chirurgie se feront sous anesthésie générale associée quand cela est possible à une anesthésie locale (quand pas d’interférence entre le traitement et l’anesthésique). Notre modèle de douleur inflammatoire et post-opératoire induit une douleur modérée dans la patte qui est raisonablement bien supportée par l’animal. Dans les tests utilisés pour évaluer la sensibilité nociceptive, l’animal n’est pas contraint pendant les mesures et l’intensité de la stimulation est progressivement augmentée jusqu’à une valeur minimale seuil pour déclencher la réaction nociceptive et donc le retrait de la patte. La stimulation n’est jamais poursuivie au-delà. Pour des raisons scientifiques évidentes, les anti-douleurs et les anti-inflammatoires ne peuvent pas être utilisés. Toutefois, une grille de score permettra de suivre l’état général des animaux et de définir des points limites qui seront strictement appliqués. Les animaux seront stabulés en groupes sociaux, dans un environnement enrichi afin de favoriser un comportement naturel.

Choix des espèces

Cette étude sera effectuée sur des rats car c’est l’espèce de référence dans la littérature pour les études sur la douleur. Les rats sont calmes, faciles à manipuler et s’acclimatent progressivement à l’expérimentateur. L’étude de biodistribution sera menée sur des souris afin de pouvoir réaliser une étude longitudinale en imagerie de fluorescence, les rats étant trop grands pour être imagés en entier dans l’appareil d’imagerie. Nous utiliserons des rats et des souris adultes car la population cible est adulte.

Pour les groupes les plus exposés, trois semaines d'immobilisation du train arrière, six semaines d'entraînement à la course en montée et des récupérations de 30 minutes à 40 °C : 108 souris adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement des biceps fémoraux. Toutes reçoivent aussi une injection intrapéritonéale de puromycine pour suivre la synthèse des protéines, et l'immobilisation entraîne une perte de masse musculaire des pattes postérieures. L'équipe veut savoir si la chaleur amplifie les effets de l'exercice sur le muscle, et le porteur envisage des retombées pour les athlètes, les personnes en rééducation, les sédentaires et les malades. Il écrit que l'immobilisation partielle rend le projet difficile à mener chez l'humain, et présente l'utilisation des souris comme une étape "obligatoire mais également extrêmement enrichissante du point de vue scientifique".

Objectifs

L’activité physique, en sollicitant la force musculaire, provoque l’augmentation de la masse musculaire (hypertrophie). Cette modalité d'exercice est recommandée lors de situations de perte de masse musculaire (atrophie), par exemple après une période d'immobilisation (alitement, pose d’un plâtre). Par ailleurs, l'exposition à certaines conditions environnementales spécifiques, tel que la chaleur, peut amplifier la prise de masse musculaire ou limiter sa perte. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les effets de la récupération musculaire en atmosphère chaude après une série d’exercices de course en montée chez des souris saines ou présentant une perte de muscle suite à une immobilisation

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'évaluer si la chaleur est bénéfique pour amplifier les adaptations musculaires à l’exercice, ce qui permettra d'envisager des perspectives non seulement pour les athlètes, mais aussi chez les personnes en réhabilitation post-blessure ou post-opération chirurgicale. Les populations sédentaires ou souffrant de pathologies métaboliques (e.g. diabète, insuffisance rénale chronique) ou de pertes de masse musculaire (cancers, vieillissement) bénéficieront également de perspectives d'intérêt. D’autre part, l’exercice couplé à la chaleur permettrait d’accélérer davantage la prise de masse musculaire chez les populations atrophiées.

Procédures

Pour la procédure aigüe, les animaux subiront deux à trois interventions : - groupe E : l’exercice physique (une séance de 1 heure) + injection sur animal vigile (5 secondes) - groupe E+C : l’exercice physique (une séance de 1 heure) + la récupération en milieu chaud (30 minutes à 40°) + injection sur animal vigile (5 secondes). Pour la procédure chronique, les animaux subiront une à quatre interventions : -groupe NS (pas d’immobilisation) : une injection (5 secondes) -groupe S (immobilisation) : immobilisation de trois semaines + injection (5 secondes) -groupe NS-E (pas d’immobilisation + exercice) : 6 semaines d’entraînement + injection (5 secondes) -groupe S-E (immobilisation + exercice) : immobilisation de trois semaines + 6 semaines d’entraînement + injection (5 secondes) -groupe NS-E+C (pas d’immobilisation + exercice + chaleur) : 6 semaines d’entraînement + récupération en ambiance chaude (30 minutes à 40°) + injection (5 s) -groupe S-E+C (immobilisation + exercice + chaleur) : immobilisation de trois semaines + 6 semaines d’entraînement + récupération en ambiance chaude (30 minutes à 40°) + injection (5 s)

Impact sur les animaux

Les stress auxquels seront soumis les animaux sont l’exercice physique, l'immobilisation, la chaleur et l’injection intrapéritonéale de puromycine. Les 3 séances de familiarisation permettront d’éduquer les souris au tapis de course. L'immobilisation du train arrière provoquera un déconditionnement des souris, avec une perte de masse musculaire, mais cela ne concerne que les pattes postérieures. Au niveau de la chaleur, le stress sera relativement court (30 minutes à 40°C) et l’hydratation sera ad libitum. Enfin, l’injection intrapéritonéale de puromycine durera 5 secondes. Il s’agit d’une injection dans le bas ventre de puromycine, permettant de suivre le taux de synthèse des protéines. Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement également.

Devenir

La totalité des animaux sera euthanasiée à l'issue de chaque procédure dans le but de prélever les biceps fémoraux pour l'étude des gènes et protéines jouant un rôle dans la régénération musculaire.

Remplacement

Ce projet nécessite une réalisation dans un environnement très contrôlé pour éviter des biais qui pourraient provenir de facteurs externes. De plus, nous souhaitons évaluer les effets de la chaleur, ce qui ne peut être contrôlé précisément que dans des conditions de laboratoire avec des animaux. L’immobilisation partielle est aussi une contrainte qui rend difficile la réalisation du projet chez l’homme. Dans le cadre de ces expérimentations très spécifiques, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux étant donné l’absence de modèle cellulaire permettant de mimer les effets corps entier de l’immobilisation sur l’ensemble des tissus d’intérêt ainsi que les effets des méthodes de prévention. De plus, ces expérimentations ne peuvent pas être directement réalisées chez l’homme. L’utilisation d’animaux est donc ici une étape obligatoire mais également extrêmement enrichissante du point de vue scientifique de par les résultats très précieux qu’elle génère.

Réduction

Le calcul a été effectué avec l’aide l’un logiciel de statistiques afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux tout en gardant la puissance statistique nécessaire à l’interprétation des résultats.

Raffinement

Pour l’activité physique et les tests réalisés sur tapis roulant, les animaux y sont préalablement habitués progressivement pour réduire le stress induit au changement d’environnement. Afin de réduire au maximum les nuisances sur le bien-être des souris, les animaux seront constamment surveillés au cours de la séance pour prévenir tout accident. Les procédures de suspensions du train arrière sont, elles, validées et optimisées, et des soins quotidiens sont réalisés pour prévenir toute complication. Les animaux seront hébergés par deux pour éviter l’isolement. Chaque procédure possède également des points limites et critères d’arrêts stricts en cas d’évènement potentiellement néfaste pour les animaux en ce qui concerne la douleur, le mal-être, etc. Les suivis quotidiens des animaux permettent d’identifier des signes de souffrance.

Choix des espèces

Le choix des souris a été fait car nous voulons utiliser le même protocole d’entraînement que les études qui montrent des adaptations similaires post-entraînement chez l’homme et chez la souris. De plus, comme chez l’homme, il a été montré que l’immobilisation induit une perte de masse musculaire chez la souris également. La souris Mus musculus a été privilégiée pour plusieurs raisons. Les espèces murines rat et souris sont des espèces se rapprochant de l'humain en ce qui concerne le système musculosquelettique. Les systèmes de dégradation et de synthèse protéique sont similaires chez l'homme et chez la souris bien qu'il existe des différences subtiles de typologie entre les deux espèces. Ainsi, les conclusions tirées de ces études chez la souris pourront être étendues chez l'homme. Les souris utilisées seront toutes des adultes de 8 semaines.

1 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une injection virale dans l'hippocampe par stéréotaxie sous anesthésie, pouvant provoquer une perte de poids transitoire et une douleur de 24 à 48 heures, puis une perfusion intracardiaque terminale. L'objectif est de caractériser les modifications des astrocytes autour des vaisseaux et des neurones dans la maladie d'Alzheimer, le cerveau étant prélevé exsangue pour l'analyse. Le porteur affirme que l'expérimentation sur la souris est "essentielle" faute de pouvoir recréer in vitro les interactions cellulaires du cerveau.

Objectifs

Le système nerveux central, dont fait partie le cerveau, est composé de plusieurs types cellulaires : les neurones, mais également les cellules gliales dont les astrocytes. Ces derniers sont reconnus comme des acteurs essentiel à la physiologie et impactés dans de nombreuses pathologies. Ils interagissent avec les vaisseaux sanguins et participent à la régulation des fonctions vasculaires, comme l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique, ainsi qu’avec les neurones et régulent le message nerveux. Ces deux interfaces et leurs fonctions sont perturbées dans la maladie d’Alzheimer. Ce projet a pour but de caractériser la nature moléculaire des changements des fonctions astrocytaires périvasculaires et périneuronales dans la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur le rôle des astrocytes dans les alérations vasculaires et neuronales liées à la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Les interventions sous anesthésie générale (30 minutes d'intervention) sont utilisées dans ce projet sur un même lot d’animaux. 1) Injection virale par stéréotaxie : animaux sous anesthésie générale sont opérées. Un virus de type AAV ( adenovirus associé) permettant de colorer les astrocytes est injecté dans l’hippocampe par stéréotaxie. Cette chirurgie n’est réalisée qu’une seule fois. Ces interventions entrainent des effets modérés (possible irritation de la plaie). Une observation particulière des animaux est réalisée dans les jours suivants et l’application des points limite permet de limiter la nuisance et la souffrance des animaux. 2) Perfusion intracardiaque (3 semaines après la première intervention): Réalisée sous anesthésie générale, cette intervention est sans réveil. Elle dure environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les souris subiront une injection intracérébrale de virus de type AAV (adénovirus associé) qui peut entrainer des effets modérés par exemple une perte transitoire de poids et une douleur pendant 24/48h. Une observation particulière des animaux dans les jours suivants et l’application des points limites permettent de limiter la nuisance et la souffrance des animaux.

Devenir

L'euthanasie des animaux sous anesthésie générale est nécessaire pour les analyses histologiques. Ces analyses nécessitent que les vaisseaux sanguins ne contiennent plus de sang car sa présence interfère avec l'expérience d'immunofluorescence.

Remplacement

L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe tel que le cerveau. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Pour l’ensemble des questions traitées, il faut obtenir les observations sur au minimum 5 réplicas biologiques pour chaque génotype et à chaque stade. Ce nombre est un minimum pour intégrer dans notre étude la variabilité entre les animaux. C’est un pre-requis dans l’ensemble des publications de travaux scientifiques. Elle est particulièrement cruciale pour l’étude de modèle murin de la maladie d'Alzheimer qui peut légèrement varier d’un individu à un autre. Ce chiffre est un minimum qui tient compte de la variabilité connue intrinsèque au modèle APPPS1. En effet, la formation des plaques amyloides peut varier d’une souris à l’autre pour un même stade. On realisera une analyse statistique en vérifiant la normalité des données et l’absence de différence entre les animaux de même génotype. En cas de non normalité, les tests non paramétriques seront utilisés. Pour réduire la sur-utilisation des animaux possiblement liée à la chirurgie, les expérimentateurs sont formés et supervisés de façon adéquate. Une attention particulière est portée à la stérilité de tous les instruments et de l'environnement.

Raffinement

Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Certaines procédures pouvant induire une légère douleur, celle-ci est anticipée par l’administration d’anesthésiques et d’analgésiques. Les animaux subissant des interventions feront l'objet d'une surveillance accrue pendant l'intervention et les jours suivants et d’éventuels soins supplémentaires (application d’analgésique supplémentaire) sont apportés en fonction de ces observations. Pour toutes les procédures, des points limites spécifiques ont été définis basés sur l'apparence physique (manque de toilettage, poil ebouriffé), la mobilité des animaux (prostration), l'absence de lésion ou saignement, la présence d'un nid dans la cage. Dans nos expériences ou une anesthésie profonde est réalisée, la qualité de l'anesthésie sera systématiquement contrôlée par l'absence de reflexe réponse au pincement de la patte.

Choix des espèces

La souris est un mammifère où les règles et les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'homme. Nous avons identifié 50 marqueurs à tester au cours de la progression de la maladie d’Alzheimer à 1 mois, 3 mois (stade sans dépôts amiloides) 6 mois (stade intermédiaire), 9 mois et 1 an (stade présentant des dépots amyloides).

126 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ou deux chirurgies d'environ une heure, sources de stress, de douleur et de perte de poids, puis des tâches locomotrices avec enregistrement de l'activité de neurones par électrodes, un jour sur deux pendant six semaines. L'objectif est de caractériser le rôle des neurones corticospinaux dans la motricité des pattes postérieures, le cerveau étant prélevé à l'issue. Le porteur affirme que ces neurones sont "impossibles à reconstituer" en culture cellulaire et à modéliser numériquement.

Objectifs

Le projet vise à caractériser le rôle des neurones corticospinaux dans la motricité des pattes postérieures de la souris. Ces neurones transmettent des informations depuis le cortex moteur vers la moelle épinière ; nos expériences chez l’animal anesthesié démontrent que ces informations sont à la fois motrices (pour la contraction du muscle) et sensorielles (pour filtrer les informations sensorielles pertinentes pour le mouvement, comme la proprioception qui renseigne sur la position du corps). Nous cherchons maintenant à caractériser le rôle de ces neurones dans une situation physiologique, chez l’animal éveillé libre de ses mouvements. Plus pécisément, nous avons pour objectif de : 1) analyser les conséquences de perturbations de cette voie (activation ou inhibition) sur les comportements moteurs des souris, 2) identifier les neurones corticospinaux en enregistrant leur activité électrique grâce à des électrodes, , et corréler leur activité avec le comportement observé, 3) caractériser les autres cibles de ces neurones, en plus de la moelle épinière, qui peuvent médier certains des comportements observés.

Bénéfices attendus

La voie corticospinale est atteinte dans plusieurs pathologies (sclérose latérale amyotrohique, lésion traumatique de la moelle épinière, etc.) sans que l’on sache précisément son rôle en situation physiologique. Notre projet permettra de caractériser l’activité de ces neurones dans le cadre d’un comportement moteur, et ainsi de poser des hypothèse sur les conséquences de leur atteinte en situation pathologique.

Procédures

Les animaux subiront soit une chirurgie unique durant environ 1,5 heure, soit deux chirurgies à 2 semaine d'écart, chacune durant au plus 1 heure. Au minimum une semaine après la dernière chirurgie, les animaux effectueront des tâches comportementales de locomotion fine. Ces tâches durent une dizaine de secondes et sont répétées pendant un maximum de 30min, un jour sur deux, pendant 6 semaines. Au maximum chaque animal sera donc testé pendant 9 heures.

Impact sur les animaux

Les chirurgies entrainent inévitablement un stress et des douleurs chez la souris. Une perte de poids est souvent constatée les jours suivant la chirurgie mais l’animal récupère son poids initial en 3-4 jours. Les sutures peuvent aussi entrainer une gêne ou des démangeaisons qui poussent l’animal à se gratter et, très rarement, à endommager sa cicatrice. Cette gêne disparait également en quelques jours. Les tests comportementaux envisagés peuvent également être source de stress pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement.

Remplacement

Le projet porte sur les neurones corticospinaux, qui sont parmi les plus longs de l’organisme, allant du cortex à la partie lombaire de la moelle épinière. Ils sont impossibles à reconstituer avec des techniques de remplacement de type culture cellulaire et doivent être intacts pour pouvoir être étudiés. Ils sont impossibles à modéliser numériquement car leurs cibles sont encore méconnues. Nous devons donc recourir à l’animal pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Les mesures pour réduire le nombre d’animaux ont été étudiées en adéquation avec le projet. Le nombre d’animaux utilisé a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement valides. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire et produire des résultats spécifiques de genre.

Raffinement

Les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations quotidiennes et l'enrichissement des cages est systématique (bâton à ronger, matériaux de nidification). Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire et la température de l’animal est maintenue grâce çà un tapis chauffant thermostaté relié à une sonde rectale. Les yeux sont hydratés avec un gel oculaire. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement après la procédure chirurgicale et estimé selon une grille de score pondérée qui évalue l'apparence générale de l'animal, l'apparence de la plaie, le comportement spontané, le comportement provoqué et le poids. Des points limites ont été établis pour chaque item permettant de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

L’étude de la communication entre le cortex et les circuits locomoteurs spinaux requiert l’utilisation de mammifère. La souris est un modèle largement utilisé dans l’étude du cortex moteur, et des comportements locomoteurs. De plus, de nombreuses connaissances sont établies sur l’organisation des projections corticospinales chez la souris. Animaux utilisés à partir de 30 jours après la naissance, car c’est l’âge à partir duquel la voie de communication entre le cortex et la moelle a fini son développement