Procédures modérées

84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections sous-cutanées de deux antibiotiques, puis sont tuées par prélèvement intracardiaque sous anesthésie pour doser ces composés dans le sang. L'objet est de décrire la pharmacocinétique du céfépime et de l'enmétazobactam avant d'en tester l'efficacité, dans un projet ultérieur, sur un modèle de pneumonie à Klebsiella pneumoniae résistante. Le porteur indique que les doses ne sont pas toxiques et affirme que le recours à l'animal reste une étape "obligatoire et règlementaire".

Objectifs

L’objectif du projet est de caractériser la pharmacocinétique sanguine du céfépime (antibiotique) et de l’enmétazobactam sur une période de 8h post-injection, après deux administrations sous-cutanées. Cette caractérisation permettra d’évaluer le devenir de ces deux composés, depuis leur entrée jusqu'à leur élimination en fonction du temps et ainsi d’avoir les bonnes concentrations et fréquence d’administration pour en évaluer leur efficacité dans des modèles d’infection ultérieurement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de reconstruire les courbes pharmacocinétiques des deux composés (céfépime et enmétazobactam) sur 24h chez la souris et ainsi d’adapter les fréquences d’administration dans un modèle de pneumonie à Klebsiella pneumoniae résistant aux carbapénèmes afin d’y évaluer leur efficacité sur la diminution de la charge bactérienne pulmonaire.

Procédures

L’injection des composés se fera par voie sous cutanée. Les doses administrées sont non toxiques pour les animaux. Les souris seront ensuite soumises à un prélèvement intracardiaque (d’une minute) sous anesthésie fixe. La profondeur de l’anesthésie est vérifiée par pression des voutes plantaires.

Impact sur les animaux

L’effet indésirable principal ici est lié à la douleur légère et de courte durée générée par deux injections (l’une pour l’administration des composés puis la seconde pour l’administration de l’anesthésie fixe)..

Devenir

Tous les animaux seront mis afin de doser les différents composés étudiés.

Remplacement

Le céfépime est un antibiotique de la famille des bêta-lactamines. Cependant, le céfépime peut être hydrolysé par des β-lactamases à spectre étendu (BLSE) telle que l’OXA-48. La principale stratégie pour restaurer l'efficacité des β-lactamines est l'utilisation d'inhibiteurs de β-lactamase. Le but est de trouver la meilleure combinaison capable d’avoir une activité antibactérienne efficace contre ces BLSE. Dernièrement, des études in vitro et in vivo ont démontré une activité intéressante chez des Entérobactéries multi résistantes. La mesure de l’efficacité de cette combinaison (céfépime + enmétazobactam) ne peut se faire sans avoir recours au modèle animal ce d’autant que certains échecs de traitement ne peuvent être anticipés autrement et que les aspects liés à la pharmacocinétique de ces nouvelles molécules ne peuvent être évalués autrement. Pour l’heure, le recours à des animaux est une étape obligatoire et règlementaire dans le développement de molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux hypothèses a été réduit à 3 par groupe grâce à l’expérience acquise lors d’études précédentes. Compte tenu de la variabilité attendue sur les dosages chez la souris, trois souris par point sont nécessaires pour mener à bien cette étude – Aucun test statistique sera appliquée sur les résultats de dosage.

Raffinement

Un gros travail bibliographique a été réalisé en amont de cette étude afin de s’assurer que la dose utilisée ne soit pas toxique pour les animaux. Il s’agira d’une étude sans infection où aucune toxicité n’est attendue. De plus un enrichissement du milieu (jouets en plastique, igloos en carton) sera utilisé et une surveillance accrue sera également réalisée pour cette étude. Des critères d’arrêts de l’étude ont été définis afin d’assurer le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Les souris représentent classiquement un des modèles de choix pour l’évaluation de la pharmacocinétique. D’autre part, il s’agit de l’espèce utilisée pour la mise au point du modèle d’infection pulmonaire à Klebsiella pneumoniae dans d’autres projets. Souris de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel d’environ 20-22g (même poids que pour les précédentes études).

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de sclérose latérale amyotrophique, elles reçoivent des injections intraveineuses et intracrâniennes de molécules, puis passent chaque mois pendant dix-huit mois une batterie de tests locomoteurs (rotarod, grip test, marche sur planche à trous, open field) et une mesure de force musculaire sous anesthésie. L'objectif est de tester la correction de la faiblesse musculaire, aucun traitement n'existant pour cette maladie. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de disposer d'un modèle animal car aucun système cellulaire ne reproduit les troubles de la locomotion à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier la correction des altérations locomotrices et de la force musculaire chez des souris modèles d’une maladie humaine musculaire, la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA, ou maladie de Charcot), pour laquelle il n’existe pas de traitement. Cette pathologie est due à une anomalie de l’ADN qui entraine une perte des neurone moteurs, aboutissant in fine à un affaiblissement des muscles squelettiques. Ayant précédemment identifié le mécanisme de cette mort neuronale, nous souhaitons désormais développer une approche thérapeutique pour cette maladie. Plus précisément, nous souhaitons injecter en intraveineux différentes molécules thérapeutiques, que nous avons précédemment validées en modèle cellulaire, dans des souris adultes modèle de cette maladie, et ceci afin d’étudier la correction du phénotype neuromusculaire de ces animaux. Pour cela nous effectueront une batterie de test non invasif de la locomotion et une mesure de la force musculaire de ces animaux chaque mois sur une période d’environ un an. Nous espérons que cette approche nous permettra d’ouvrir une piste thérapeutique pour cette maladie.

Bénéfices attendus

Nous avons besoin de modèles animaux pour développer une approche thérapeutique pour la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), car il n’existe pas de modèle in vitro ou de système cellulaire pour étudier la correction de la neurodégénérescence, de la faiblesse musculaire et les altérations de la locomotion caractéristiques de ces pathologies. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour étudier cette maladie. Enfin, l’analyse de la correction de la faiblesse musculaire dans ce modèle murin a un véritable intérêt pré-clinique pour développer et tester des pistes thérapeutiques pour cette maladie neurodégénérative.

Procédures

1 – Les injections en intrapéritonéale, notamment d’agents anesthésiques, requièrent moins d'une minute. 2 - Les injections en sous cutané, notamment d’agents analgésiques, requièrent moins d'une minute. 3 – Une injection intraveineuse de virus adéno associé (AAV) requiert entre 30 secondes et 1 minute par animal. 4 - Une injection stéréotaxique intra-crâniales d’une molécule thérapeutique requiert entre 5 et 7 minutes par animal. 5 – L’analyse de la locomotion se fait par une batterie de tests non invasifs réalisés chaque mois et ceci sur une période de 18 mois. Ces tests s’étalent sur une durée de 10 à 15 jours selon un protocole classique : pour le rotarod, 3 tests de 5 min sont réalisés par souris ; le grip test et la marche en équilibre sur planche à trou sont aussi réalisés trois fois (environ 5 min) par souris et l’open field est un test de 30 minutes par animal. 6 – La mesure de la force musculaire est réalisée en 4 à 8 minutes sous anesthésie gazeuse. Cette mesure est répétée chaque mois (mais en décalage de 10 à 15 jours avec les tests locomoteurs) et ceci sur une période de 18 mois. En conclusion, chaque animal recevra à l’âge de deux mois une injection intraveineuse rétro-orbitale sous anesthésie gazeuse (entre 30 secondes et une minute), puis trois semaines plus tard une injection sous cutanée d’un analgésique et une injection intrapéritonéale d’anesthésiques suivie d’une injection stéréotaxique intra-crâniales d’une molécule thérapeutique (d’une durée de 5 à 7 minutes). Un mois après cette injection intra-crâniale, le phénotype de cet animal sera suivi par une batterie de tests locomoteurs non invasifs (rotarod, grip test, bar test puis rotarod) répartis sur 10 à 15 jours, puis deux semaines après le dernier test, nous effectuerons une mesure de leur force musculaire sous anesthésie gazeuse en 4 à 8 minutes. Ces tests locomoteurs et mesure de force seront répétées environ chaque mois sur une période de 18 mois.

Impact sur les animaux

Nous souhaitons étudier une maladie neurodégénérative et neuromusculaire touchant les adultes, et ceci en utilisant un modèle animal ; nous nous attendons donc à l’éventuelle apparition d’altérations locomotrices et/ou d’une faiblesse musculaire chez ces souris. Il est à noter que les tests locomoteurs que nous utiliserons pour évaluer l’apparition de ces altérations sont classiques, non invasifs et sans douleur. De même, il est à noter que la mesure de la force musculaire se fait sous anesthésie. Concernant le nombre d’animaux étudié, des travaux précédents et l’étude de la littérature nous ont permis d’établir que l’étude de groupes de 12 animaux permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le facteur de comparaison sera la dose et la nature de molécule thérapeutique. Ainsi, compte tenu de notre projet d’analyser 3 doses de traitements de 5 molécules (4 thérapeutiques et une molécule contrôle), sous deux conditions (contrôle ou pathologique), nous estimons que l’étude de 360 animaux sur 3 à 5 ans est nécessaire.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure afin d’étudier leurs tissus (muscle, cerveaux, etc.) pour des analyses histopathologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude a pour but de tester des approches thérapeutiques dans un modèle d’une maladie neurodégénérative et neuromusculaire causée par une mutation génétique, la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA). Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces traitements à l’échelle de l’organisme entier ; en effet des modèles cellulaires ou un in vitro ne peuvent pas reproduire des troubles de la locomotion ou de la force musculaire et apporter un même niveau d’information. De plus, nous avons établi précédemment que le modèle souris est un bon modèle animal d'étude de cette maladie.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Des travaux précédents et l’étude de la littérature nous ont permis d’établir les doses de molécules thérapeutiques à injecter, les temps d'analyses et que l’étude de groupes de 12 animaux permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le facteur de comparaison sera la dose et la nature de molécule thérapeutique et compte tenu de notre projet d’analyser 3 doses de traitements de 5 molécules (4 thérapeutiques et un contrôle), sous deux conditions (contrôle ou pathologique), nous estimons que l’étude de 360 animaux sur 3 à 5 ans est nécessaire.

Raffinement

Afin de diminuer le stress et la douleur liées à la mesure de la force musculaire par stimulation électrique et aux injections intraveineuses et intracérébrales ; ces procédures expérimentales se font toutes sous anesthésie. Les point limites seront alors déterminés en fonction des observations faites d'une part pendant l'anesthésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l'animal) et d'autre part pendant et après l'injection de l'animal (changement du comportement (akinésie, prostration, paralysie), réponses à des stimuli externes). L'anesthésie et la procédure d'injection seront arrêtés si ces points limites sont atteints.

Choix des espèces

Cette étude a pour but de tester des approches thérapeutiques dans un modèle d’une maladie neurodégénérative et neuromusculaire causée par une mutation génétique, la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA). Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces traitements à l’échelle de l’organisme entier ; en effet des modèles cellulaires ou un in vitro ne peuvent pas reproduire des troubles de la locomotion ou de la force musculaire et apporter un même niveau d’information. Enfin, nous allons étudier des approches thérapeutiques sur le comportement locomoteur et la force musculaire chez des souris adultes, en effet la maladie que nous étudions touche les adultes. Enfin, nous suivrons le comportement locomoteur et la force musculaire de ces animaux sur une période de 18 mois. Ce protocole a été choisi d’après nos expériences précédentes et par l’étude de la littérature et ceci afin de reproduire l’aspect progressif de la maladie étudiée.

614 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines par voie rétro-orbitale sous anesthésie, puis une chimiothérapie ou un placebo, avant d'être tuées pour prélever moelle osseuse, rate et thymus. L'objectif déclaré est de comprendre les mécanismes de rechute et de chimiorésistance des leucémies aiguës lymphoblastiques T, dont les bénéfices pour les patients restent renvoyés au long terme. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" d'évaluer ces mécanismes dans des modèles vivants et que les cellules leucémiques ne survivent pas assez longtemps in vitro.

Objectifs

Les leucémies aiguës lymphoblastiques T (LAL-T) sont des hémopathies malignes agressives au pronostic réservé, notamment en cas de rechute. Elles représentent 15 à 30% des leucémies aiguës de l'enfant et de l'adulte. Les polychimiothérapies récentes ont permis d'améliorer le pronostic des leucémies aiguës, cependant 20 à 30% des patients atteints de LAL-T présentent une rechute le plus souvent réfractaire aux thérapeutiques conventionnelles et conduisent au décès des patients dans 60% des cas. Le statut mutationnel de certains gènes semble être un facteur important de ces rechutes résistantes aux thérapies. Les cellules souches leucémiques jouent également un rôle essentiel dans la progression et la rechute des leucémies. Par leur propriété d'auto-renouvellement et de quiescence, les LSC sont capables d'échapper à la chimiothérapie de 1è ligne et de régénérer le contingent leucémique, faisant le lit de la rechute. L'étude de ce compartiment cellulaire s'inscrit donc dans la continuité de ce projet, et fait l'objet ici de cet amendement. Identifier les mécanismes à l'origine de la rechute et l'acquisition d'une chimiorésistance est essentiel pour améliorer le pronostic de ces patients. Pour mener à bien ces objectifs il est dès lors indispensable d'évaluer leur impact dans des modèles vivants, seuls garants d'une reproductibilité dans ce contexte de pathologie maligne ou le micro environnement joue un rôle décisif. Dans cette perpsective, la souris immunodéprimée constitue le modèle animal le plus adapté. Par ailleurs, les cellules leucémiques de patients sont fragiles et ne peuvent être maintenues suffisamment longtemps in vitro pour y mener des tests thérapeutiques. Il est en revanche largement décrit dans la littérature scientifique que la souris est un bon modèle d'expansion des cellules leucémiques humaines.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'étendre nos connaissances sur les mécanismes à l'origine de la rechute de LAL-T et comprendre les altérations moléculaires responsables de l'acquisition d'une chimiorésistance. A terme, ce projet contribuera à la mise en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques afin d'améliorer les chances de guérison des patients atteints de LAL-T.

Procédures

1/ Injection de cellules leucémiques ou pré-leucémiques par voie rétro-orbitale après anesthésie générale (temps estimé < 10min par souris). Surveillance clinique et/ou biologique au moins bi-hebdomadaire et adaptée à l'état clinique des souris. 2/ Traitement des souris immunodéprimées après prise de greffe par de la chimiothérapie conventionnelle classiquement utilisée dans le cadre du traitement des leucémies aiguës humaines et comparaison avec un groupe recevant un placebo (La durée et fréquence du traitement dépendra de la molécule utilisée : quotidien à hebdomadaire pendant une durée inférieure à 6 semaines).

Impact sur les animaux

Le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet est évalué à 450 souris sur 5 ans. Pour réduire ce nombre, nous avons estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique des résultats grâce aux données collectées au cours d'expériences précédentes. Un nombre de 64 souris supplémentaires seront nécessaires pour l'amendement de ce projet, sans extension de sa durée (soit 2 années restantes). Nous serons particulièrement attentifs au bien être des animaux. Afin de réduire au maximum le risque de souffrance, les souris seont traitées dès que le taux d'infiltration sanguin leucémique sera compris entre 2 et 20% (évaluation en cytométrie en flux de façon hebdomataire via un prélèvement mandibulaire). Un tel taux d'infiltration est habituellement atteint entre 4 et 12 semaines post-greffe. Durant les protocoles expérimentaux, un suivi quotidien la première semaine, puis bi-hebdomadaire des animaux sera mis en place afin de surveiller les signes évocateurs d'une douleur. Afin de préserver le bien-être animal, nous détecterons les points limites qui conduiront à leur mise à mort (CF Points limites adaptés détaillés dans les procédures expérimentales). Concernant l'amendement, le temps de prise de greffe attendu dans les souris syngéniques est similaire au modèle de xénogreffe faisant l'objet du projet initial. En revanche, les souris utilisées pour cet amendement sont moins immunodéprimées que les souris initiales et la greffe étant syngénique, le risque potentiel pour l'animal est moins élevé pour les procédures relatives à cet amendement. Par ailleurs, aucune prédisposition à une toxicité particulière de ce modèle pré leucémique pour l'animal n'est attendue dans des conditions d'hébergement. Nous serons particulièrement attentifs au bien-être des animaux et appliqueront les mêmes règles de surveillance et d'éthique que précédemment, avec une surveillance interne quotidienne du personnel de l'animalerie.

Devenir

Mise à mort de l'animal à l'issue de chaque procédure pour récupération des tissus biologiques (moelle osseuse, rate, thymus)

Remplacement

Les expérimentations ayant pour objectifs de déterminer les mécanismes de résistance à la chimiothérapie ne peuvent pas être réalisées in vitro du fait de la forte mortalité des cellules leucémiques et doivent nécessairement être conduits in vivo dans des leucémies xénogreffées et amplifiées chez l'animal. Par ailleurs le modèle des lignées cellulaires n'est pas un reflet exact de la biologie des leucémies aiguës et ne peut donc pas être considéré comme un équivalent moléculaire fiable dans ce contexte. Pour la même raison, dans cet amendement, l'étude de la transformation leucémique de cellules immatures transduites avec un oncogène humain (ici TLX3) ne peut être réalisé in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de ce projet est évalué à 450 souris sur 5 ans. Pour réduire ce nombre, nous avons estimé (par test paramétrique) la taille des échantillons permettant une analyse statistique des résultats grâce aux données collectées au cours d'expériences précédentes. Concernant l'amendement, un nombre de 64 souris RAG2-/-gc-/- supplémentaires seront nécessaires à ce projet, sans extension de sa durée (2 années restantes). Ce nombre a été calculé en prenant en compte une probabilité proche de 100% de prise de greffe (modèle syngénique), afin d'élaborer un nombre suffisant de tumeurs et 1è et 3è génération (8 souris d'une première génération puis 4 souris de seconde génération (par première génération) puis 2 souris de 3è génération (par seconde génération)).

Raffinement

Nous serons particulièrement attentifs au bienêtre des animaux. Les souris immunodéprimées seront élevées dans un environnement répondant à un statut sanitaire de type EOPS ou SOPF et ne présenteront donc pas de phénotype dommageable dans ces conditions. Les cages sont ventilées et enrichies à l'aide de cotons, bout de bois et tunnels, afin de répondre aux besoins des souris (nidification, entretien des dents, jeux). Celles-ci seront également maintenues en communauté (2 à 5 souris par cage), en accord avec leurs besoins sociaux. Nous avons défini des points limites précoces, évaluables à l’aide d’une grille de score que nous avons établie, dans le but de ne pas causer de souffrance animale. Un suivi visuel quotidien des animaux sera mis en place par un personnel qualifié de l'animalerie. La manifestation de tout signe évoquant une douleur définie par les points limites préalablement évoqués sera particulièrement surveillée. Le volume des injections et des prélèvements sera réduit au minimum possible. Afin de limiter la douleur, l'injection des cellules leucémiques se fera sous anesthésie gazeuse par isoflurane (induction 4,5%, entretien 2,5-3%, durée totale d'environ 2 minutes). Le suivi de la leucémie sera réalisé à partir de la 3ème semaine suivant l'injection des cellules leucémiques humaines par des prélèvements sanguins (

Choix des espèces

Les modèles de xénogreffe de leucémies chez la souris sont connus et bien décrits dans la littérature scientifique, ce qui permet de nous assurer une efficacité maximale dans la réalisation de ce projet. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes, âgées entre 7 et 15 semaines. C'est la fenêtre d'injection qui premet d'avoir un taux idéal de greffe d'après les données de la littérature, en permettant de réaliser la procédure d'injection dans de bonnes conditions. Ce modèle de xénogreffe est particulièrement applicable à notre étude, car il permet de récapituler l'éventail des signes cliniques de la maladie et de modéliser sa progression.

1500 souris et 450 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des administrations répétées de composés chimiques ou biologiques par diverses voies, avec des prélèvements sanguins pouvant atteindre 20 % du volume circulant et jusqu'à une vingtaine d'interventions par semaine, pour évaluer la toxicité de candidats médicaments sur des rongeurs génétiquement modifiés au niveau du système immunitaire. Le porteur indique que les effets attendus vont de la perte de poids aux atteintes rénales, hépatiques ou immunitaires liées à la souche et au produit testé. Il affirme que ces études réglementaires "nécessitent encore" l'animal et ne peuvent pas être réalisées in vitro.

Objectifs

Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier, en recherchant/vérifiant les homologies avec l'homme (par exemple vérification de la liaison du candidat médicament à sa cible pharmacologique dans cette espèce). Ces études permettent d’obtenir des données sur la réponse immunitaire, la toxicité éventuelle du composé, de bien choisir les doses dans les premières études règlementaires, et peuvent également être des études règlementaires. Elles peuvent permettre de comprendre grâce à des investigations perfectionnées les mécanismes de toxicité (toxicité rénale, hépatique, testiculaire...) ou les profils d’immunotoxicité, afin d'établir la pertinence de ces effets observés chez le rongeur en comparaison avec l'humain, avec pour objectif d'assurer la santé des patients humains. Elles permettent également de sélectionner un composé possédant un rapport efficacité/toxicité optimal dans une espèce rongeur. L'efficacité d'un composé peut également être testée sur un modèle pathologique ou un animal transgénique, ici des animaux génétiquement altérés au niveau du système immunitaire. Il est attendu d'utiliser en moyenne 30 rats ou 50 souris par étude et de réaliser jusqu'à 15 études rat et 30 études souris sur la durée du projet (soit environ 3 études rat/an et 6 études souris/an).

Bénéfices attendus

Le développement de composés pharmaceutiques ou chimiques requiert des explorations in vivo chez le rongeur ainsi que des études réglementaires à proprement parler. Ces études peuvent être demandées par les autorités réglementaires, pour affiner ou mettre en place des conditions expérimentales, ou pour répondre à des questions de sécurité, ou pour explorer les mécanismes d’action. Ces études peuvent donc servir à affiner les expériences en amont des études réglementaires qui devront être réalisées par la suite, en permettant de limiter le nombre global d'animaux utilisés dans le développement d'un produit. Elles peuvent aussi directement contribuer à assurer la sécurité non-clinique des médicaments en comprenant mieux leurs mécanismes.

Procédures

Les animaux sont traités, par différentes voies (principalement orale et injection intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse) de façon journalière ou hebdomadaire (ex : composés biologiques), avec le produit d’intérêt. La durée des administrations est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 30 minutes maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses chez le rat. La durée des études peut être courte (un jour) ou longue [en général de 1, 3 ou 6 mois pour les études règlementaires].. Des prélèvements sanguins et urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur : -Prélèvements multiples: -jusqu’ à 7,5% du sang total circulant peut être prélevé en 24h sans récupération - jusqu’ à 10% du sang total circulant peut être prélevé en 24h avec 7 jours de récupération - jusqu’ à 15% du sang total circulant peut être prélevé en 24h avec 2 semaines de récupération - jusqu’ à 20% du sang total circulant peut être prélevé en 24h avec 3 semaines de récupération -Prélèvement unique: maximum 15% du volume sanguin circulant Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min).. Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse, n’excédant pas 18h est aussi possible.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent : - au phénotype dommageable de la souche utilisée (ex : sensibilité aux infections opportunistes...) ; - aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), à l’inconfort lié aux procédures (prélèvements, administration répétée) ; - aux effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) qui peuvent être observés.

Devenir

Les études de toxicologie incluent souvent une analyse histopathologique pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus. De plus, les animaux ayant un phénotype dommageable pendant les études ou bien se développant avec l’âge, aucun animal ne sera gardé à l’issue de ces études.

Remplacement

L’évaluation de la toxicité de candidats médicaments selon les règlementations en vigueur nécessite encore l’utilisation d’animaux, et ces études ne peuvent pas être réalisées in vitro. Il n’existe pas encore de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité des organismes vivants, et en particulier des réponses immunitaires. De plus, certaines études ne peuvent pas être réalisées dans des souches sauvages ou transgéniques à phénotype non- dommageable qui ne sont pas adaptées à la recherche de mécanismes d’action ou d’un effet toxique spécifique (ex : immunotoxicité…). Un animal transgénique ou exprimant certaines caractéristiques ou déficiences dans le système immunitaire représente parfois un meilleur modèle pour l’évaluation d’un produit.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude: un ou deux sexes, animaux satellites ou non pour analyses de toxico-/pharmacocinétique ou pharmacodynamie, nombre de temps intermédiaires pour des sacrifices ou analyses spécifiques, type de marqueurs mesurés (sensibilité des méthodes d’analyse), comparaison avec des composés de référence, nombre de doses testées, criblage de plusieurs produits, etc. Pour les études à objectif règlementaire, le nombre d’animaux est précisé dans les lignes directrices correspondantes. En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés sera le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement (en fonction des signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel et consommation de nourriture et d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et si besoin, au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés...) et que la douleur ne peut pas être suffisamment limitée à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Prélèvements sanguins : Des techniques de prélèvement (ex : veine caudale, sublinguale, jugulaire, sous-mentonnière, mandibulaire...) sont utilisées quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements peuvent être réalisés sous anesthésie pour éviter stress, douleur ou inconfort, comme par exemple les administrations intramusculaire, intra-articulaire ou intra-vésicale Les animaux sont hébergés conformément à la Directive 2010/63 avec enrichissements. En général l’hébergement est groupé mais peut être individuel si un protocole expérimental particulier le requiert ou si des problèmes de comportements antisociaux sont anticipés chez certains animaux (notamment les souris mâles âgées de plus de 6 semaines); dans ce cas, ce choix devra être dûment argumenté. Des portoirs ventilés pourront être utilisés selon le phénotype dommageable, le cas échéant après avis du vétérinaire sanitaire.

Choix des espèces

Le choix du rongeur est justifié par : - les objectifs de l’étude : disponibilité d’un modèle de maladie, rongeurs utilisés pour d’autres études précliniques, présence du récepteur pour le composé, données de pharmacocinétique, pharmacodynamie, modèle de déficience dans un gène ou d’un mécanisme d’intérêt, - la comparaison possible avec d’autres études dans ces espèces, - la quantité de données disponibles sur la souche, - des aspects pratiques de manipulation, - sa place dans la phylogénie (l'utilisation de rongeurs sera privilégiée, en première intention, plutôt que celle du chien, du porc ou du primate). Les animaux ont en général 6 à 8 semaines d’âge en début de traitement, correspondant à un âge de croissance, selon les recommandations générales de la règlementation. L’âge peut varier en fonction des objectifs de l’étude (par exemple animaux juvéniles de moins de 6 semaines, matures de plus de 8 semaines, âgés...).

150 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisés dans d'autres projets puis proposés à l'adoption. Ils reçoivent un candidat médicament par des voies variées, parfois par endoscopie sous anesthésie d'une heure, avec jusqu'à neuf prélèvements sanguins et des séjours de 24 à 48 heures en cage à métabolisme pour recueillir leurs urines. Le porteur indique un stress lié au jeûne et à l'isolement et une douleur équivalente à une piqûre. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'évaluer la pharmacocinétique et décrit le chien comme l'espèce la plus adaptée.

Objectifs

Le projet consiste à évaluer le profil pharmacocinétique d'un candidat médicament chez le chien grâce à des prélèvements, répétés dans le temps, d'échantillons sanguins et/ou d'urine après administration du produit à tester. Le but est de mesurer la concentration plasmatique et/ou urinaire du produit et/ou de ses métabolites, et d'éventuels marqueurs biologiques après administration.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Du fait de la cible thérapeutique, ces composés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques sur l’espèce utilisée (Chien) grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les animaux seront administrés avec les composés à tester par différentes voies (orale, intrapéritonéale, sous-cutanée, transdermique, intramusculaire ou intraveineuse) avec -2 min par administration. Les produits pourront également être administrés par endoscopie, dans ce cas les animaux seront soumis à une anesthésie d'environ 1h. Des prélèvements de sang seront réalisés sur l’animal vigile au niveau de la veine céphalique, veine saphène ou veine jugulaire (2 minutes par prélèvement). Ces prélèvements seront en général de 1 à 2 mL, avec un maximum de 9 prélèvements et/ou dans la limite de 20% du volume sanguin total sur 24h. Les animaux pourront éventuellement être mis à jeun la veille de l’administration pour une durée qui est fonction du produit testé. Pour les recueils urinaires, les animaux seront placés en cage à métabolisme sur une durée de 24h en général qui peut être augmenté jusqu’au 48h au maximum.

Impact sur les animaux

Les chiens de ce projet pourront subir un stress lié à la privation de nourriture avant administration du produit, une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration et de l'anesthésie, un stress lié à l'isolement en cage à métabolisme (24h à 48h) pour la collecte d’urine et une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins. Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Ils font donc l’objet d’échange avec les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observation des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques.

Devenir

Réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire. Lorsque les animaux ne peuvent pas être reutilisés (4 à 5 ans après leur arrivée), ils pourront être mis à l'adoption ( généralement via le GRAAL) si leur état de santé le permet.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le chien car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer la pharmacocinétique d’une nouvelle molécule. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le chien est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’etudier le devenir des médicaments dans l'organisme (analyses pharmacocinétiques). Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse pharmacocinétique : 3 à 6 animaux par groupe. Pour des études exploratoires, un nombre inférieur d’animaux pourra être utilisé. Cependant, une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Le chien est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour la réalisation d’études de pharmacocinétique permettant d’étudier le devenir (absorption, distribution, métabolisation, élimination), d’un produit testé, dans le sang et/ou les urines (lorsque le chien est utilisé au cours du développement préclinique de ce produit). Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

700 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modifiés génétiquement dès l'embryon pour exprimer des mutations cancéreuses, ils sont suivis jusqu'à douze mois et anesthésiés chaque mois pour détecter des tumeurs internes par fluorescence, afin d'étudier l'origine cellulaire de cancers du muscle de l'enfant. Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer des troubles de la nage, une léthargie, des œdèmes et une incapacité à se nourrir, déclenchant la mise à mort. Il affirme que les cellules en culture ne modélisent pas l'apparition des tumeurs et que le poisson zèbre partage 80 % de ces programmes génétiques avec l'humain.

Objectifs

Les cancers touchent chaque année plus de 2500 enfants en France. On estime qu’un enfant sur 440 sera atteint par un cancer avant 15 ans. Malgré des essais cliniques, leur taux de survie ne s’améliore plus depuis 20 ans. Il est donc indispensable de développer des traitements plus efficaces et moins toxiques. Ce projet vise à déterminer si les cancers du muscle fréquemment observés chez les enfants et les adolescents peuvent dériver non pas seulement de la transformation de cellules du muscle mais aussi d’une autre population de cellules. Cette question est importante, car on sait que la réponse aux chimiothérapies peut varier en fonction de la cellule à l’origine des tumeurs. In vitro, il a été montré que lorsqu’on exprime des gènes mutés, fréquemment retrouvés chez les patients atteints par ces cancers, dans les cellules neuronales, celles-ci prolifèrent et expriment des marqueurs de ces cancers. Il est maintenant nécessaire de vérifier à l’aide du modèle de poisson que lorsque ces mutations sont introduites dans ces cellules neuronales, elles conduisent bien à la formation de tumeurs. L’objectif de ce projet est de pouvoir déterminer si des cellules neuronales constituent l’une des cellules d’origine des cancers du muscle chez l’enfant lorsqu’elles expriment des mutations fréquemment retrouvées dans ces pathologies. Or, on sait que la réponse aux traitements peut varier en fonction de la cellule d’origine du cancer. Le poisson est un modèle de vertébré particulièrement utile pour l’étude de la génétique du cancer. Les gènes et programmes génétiques impliqués dans le développement des cancers sont conservés à 80% entre l'Homme et le poisson et de très bons outils sont disponibles pour reproduire les altérations génétiques trouvées des patients dans les cellules de poissons. Pour tester l’hypothèse d’une origine neuronale de certains cancers du muscle chez l’enfant, ces mutations seront introduites dans des embryons de poissons. Ensuite, un suivi attentif de la formation de tumeurs sera réalisé sur une durée 12 mois maximum. Le nombre de poisson a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique des résultats.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l’origine des cancers des muscles chez les enfants. Cette étape est indispensable pour adapter la prise en charge thérapeutique des jeunes patients, car la cellule d’origine des cancers impacte la réponse aux traitements.

Procédures

Pour les poissons zèbres de 5 jours à 3 mois : Les poissons seront transférés provisoirement de leur aquarium à un autre plus petit (1 litre), par groupe de 3, 2 fois par semaine, pour réaliser l’observation attentive de l’apparition des tumeurs et d'éventuels signes de mal-être. Durée maximale de l'intervention : 10 minutes. Nombre maximal : 24. Les poissons sont également suceptibles d'etre anesthésiés et observé sous une loupe 1 fois par mois pour évaluer la présence de tumeur interne (fluorescence). Durée de l'intervention : 10 minutes. Nombre maximal : 3. Pour les poissons zèbres de plus de 3 mois : Les poissons seront transférés provisoirement de leur aquarium à un autre plus petit (1 litre), par groupe de 5 poissons, 1 fois par semaine, pour réaliser l’observation attentive de l’apparition des tumeurs et d'éventuels signes de mal-être. Durée maximale de l'intervention : 15 minutes. Nombre maximal : 36. Les poissons sont également suceptibles d'etre anesthésiés et observé sous une loupe 1 fois par mois pour évaluer la présence de tumeur interne (fluorescence). Durée de l'intervention : 10 minutes. Nombre maximal : 9.

Impact sur les animaux

La fréquence d'observation a été définie de manière à anticiper la détection des tumeurs tout en réduisant le malêtre animal associé à leur manipulation répétée. L'observation attentive des poissons nécessite leur transfert transitoire dans un autre bac (par groupe de 3 ou 5 poissons suivant leur âge). Les poissons seront également légèrement anesthésiés (Tricaïne methasulfonate tamponnée à pH7, 100mg/L) une fois par mois pour permettre d'observer par fluorescence, d'eventuelles tumeurs interne aux poissons. Chez les patients, aucun symptôme majeur n'est observé dans les premiers stades de la maladie en dehors de l'apparition d'une masse préférentiellement proche des muscles. De fait, certains animaux peuvent présenter des signes de malêtre dus au développement de ces tumeurs. Les signes les plus précoces comprennent des modifications de la nage, une incapacité à maintenir sa position dans la colonne d'eau, une respiration accélérée passagère ou une apathie. Les animaux qui présentent un ou plusieurs de ces signes cliniques seront identifiés et observés pendant une durée maximale de 48h. En absence d’amélioration des signes mal-être listés ci-dessus, les poissons seront mis à mort. La présence de tumeur, le hérissement des écailles, la présence d’oedèmes, une léthargie (immobilité au fond de l’aquarium) prolongée ou une incapacité à se nourrir constituent des points limites nécessitant une mise à mort immédiate.

Devenir

En cas de mal-être, les poissons zèbres seront mis à mort. Dans le cas d'apparition de tumeurs, afin de récupérer les tumeurs, et permettre leur analyse, les poissons seront mis à mort. A la fin de la procédure (soit à 1 an maximum), les poissons seront mis à mort pour prévenir la survenu d'éventuelle altération tardive du à la procédure.

Remplacement

Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer expérimentalement les conséquences des modifications génétiques impliqués dans les maladies humaines telles que le cancer. Les cellules cancéreuses humaines en culture sont très utiles pour comprendre les mécanismes moléculaires en place lorsque le cancer est déjà établi. En revanche, elles ne représentent pas la complexité des comportements cellulaires là où la tumeur est établie, l’interaction avec les tissus sains et le reste de l’organisme. Les cellules cancéreuses en culture ne peuvent pas modéliser les étapes permettant l’apparition et l’évolution temporelle des tumeurs.

Réduction

Dans un but de réduction et en accord avec la littérature scientifique, la taille de chaque groupe a été calculée pour obtenir des résultats significtifs tout en incluant le minimum d'individus dans cette étude. Des tests statistiques seront utilisés pour s'assurer de la significativité des résultas. De plus, l’analyse des caractéristiques biologiques des tumeurs sera réalisée sur le même groupe que la mesure du taux d’incidence des tumeurs. Dans la mesure du possible, nous essaierons de grouper au maximum les manipulations génétiques de manière à mettre en commun les groupes témoins et réduire ainsi le nombre total d’animaux utilisés. Nous réaliserons en priorité le modèle transitoire (350 poissons) puis nous développerons le système constitutif (350 poissons) si besoin, et en cas d’échec du premier modèle (soit un maximum de 700 poissons).

Raffinement

Tout signe de mal-être des animaux potentiellement dus au développement de tumeurs pourront être prévenus par une surveillance attentive des poissons à la recherche de signes ou de changements de comportement généralement associés à une maladie par l’application de critères d’arrêt définis.

Choix des espèces

Le poisson zèbre représente un bon organisme modèle pour l'étude de la génétique du cancer. Les gènes et programmes génétiques impliqués dans le développement des cancers sont conservés à 80% entre l'Homme et le poisson et nous disposons de très bons outils pour reproduire les altérations génétiques trouvées dans les tumeurs humaines spécifiquement dans certains types de cellules dans les poissons adultes. D'autres espèces d'animaux pourraient être envisagées comme alternative au poisson zèbre, tels que Caenorhabditis elegans et Drosophila melanogaster, mais ce sont des invertébrés dont de nombreux organes diffèrent considérablement de l’Homme, ce qui limite leur utilité pour l’étude du cancer. Le poisson représente une bonne alternative à la souris à la fois parce qu'il est un vertébré moins évolué et parce qu'il offre d'excellentes possibilités de manipulation génétique pour tester l'influence de gènes particuliers sur le développement tumoral. Les micro-injections de vecteurs ADN seront réalisées dans des embryons au stade d’une cellule. L’étude de la survenue des tumeurs primaires sera faite dans des poissons juvéniles ou adultes (âge compris entre 4 et 52 semaines) en fonction de la vitesse d’apparition des tumeurs.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent cinq injections intraveineuses et sont soumises à quatre tests comportementaux non précisés, pour étudier le rôle des lymphocytes B. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable et ne décrit qu'un stress bref lié aux injections et aux contentions. Il justifie le recours à la souris par la disponibilité de lignées transgéniques reproduisant la maladie.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est d'étudier le rôle des lymphocytes B dans le développement et la progression de la maladie d'alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ou préventives pour ralentir et/ou limiter le développement de la MA.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections par voie intraveineuse (5 injections espacées de deux semaines) et des tests comportementaux (au nombre de 4). Chaque injection intra-veineuse durera au maximum une minute (préhension + immobilisation + injection).

Impact sur les animaux

Nous n'attendons aucun effets indésirables sur les animaux car les animaux développeront une maladie modérée. Dans ce modèle bien caractérisé, les souris développent une maladie grave à l'age de 12 mois et donc bien après la période de leur utilisation dans notre étude. Tous les animaux seront mis à mort à l'age de six mois maximum. En revanche, les animaux pourront développer des effets indésirables au cours des injections et des contraintes liées aux test comportementaux. Ces effets indisérables seront de l'ordre de l'angoisse et du stress de courte durée lorsque les animaux seront immobilisés pour être injectés par voix intra-veineuse ou lorsque les animaux seront placés dans des environnements différents et multiples pour les tests comportementaux. Nous avons alors établi des points limites afin de limiter au maximum ces éffets indésirables.

Devenir

AMENDEMENT: Les animaux que nous utilisons développent spontanément une maladie grave à l'age de 12 mois. Tous les animaux seront donc utilisés et mis à mort au plus tard à l'age de 6 mois.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de mettre en évidence le rôle des cellules B dans un modèle expérimental de la maladie d'Alzheimer. Le projet met en jeu des explorations comportementales sur animal vigile qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.

Réduction

Pour respecter le principe de réduction, le nombre de souris utilisées sera réduit à son minimum (analyses de paramètre multiples pour chaque souris et utilisation de tests statistiques adaptés). L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques, de biologie cellulaire et moléculaire afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique.

Raffinement

Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupées dans un milieu enrichi. Les souris seront sous surveillance journalière et des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.

Choix des espèces

Les tests de comportement étant la méthode de choix pour tester l'efficacité d'une voie thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer, nous avons besoin d'utiliser un organisme vertébré pour nos expériences in vivo. Le modèle souris est un bon modèle pour les raisons suivantes : - Plusieurs lignées transgéniques murines modélisant la maladie d'Alzheimer existent et sont disponibles commercialement. - Nous disposons de nombreux outils spécifiques de la souris (sondes pour hybridation in situ, immunohistologie). - La durée de vie des souris et leur capacité reproductive sont particulièrement adaptées à ce projet. Les souris adultes agées de 6 semaines seront utilisées.

321 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation cérébrale sous anesthésie puis des administrations intranasales et des tests de mémoire et de locomotion sur six mois, pour évaluer des vésicules issues de cellules souches contre les troubles cognitifs de la radiothérapie. Le porteur indique que l'irradiation peut provoquer des difficultés à se déplacer et un amaigrissement, et l'administration nasale un écoulement et une tête penchée. Il présente ce modèle comme le plus utilisé en préclinique et renvoie les bénéfices pour les patients à une thérapie future.

Objectifs

La radiothérapie dans le traitement des tumeurs cérébrales peut conduire à la mort de cellules non tumorales comme les cellules des vaisseaux sanguins et les neurones. En effet, 50% à 90% des patients traités par radiothérapie pour des tumeurs du cerveau présentent dans les 6 mois après traitement des troubles neurologiques avec des troubles de l’attention, de la mémoire ou de la résolution de problèmes. De nouveaux traitements permettraient d’améliorer leur qualité de vie. Dans ce projet, nous allons évaluer l’efficacité thérapeutique des vésicules extracellulaires issues de cellules souches mésenchymateuses pour limiter les impacts de la radiothérapie. Les cellules souches mésenchymateuses sont un type de cellules souches très utilisé en médecine dite régénérative. Elles ont la capacité de se renouveler pour créer des cellules spécialisées capable de réparer la fonction d’un organe. Elles sont prélevées chez une personne à partir de la moelle osseuse ou de la graisse corporelle. Elles sont mises en culture puis administrées à l’Homme. Cependant, cette stratégie thérapeutique cellulaire a ses limites telles que la transplantation autologue (prélèvement et administration chez la même personne) des cellules souches mésenchymateuses. Cette technique limite le nombre de patients pris en charge en raison du temps nécessaire à la mise en culture des cellules souches mésenchymateuses. On note surtout une efficacité diminuée en fonction de l’âge et de facteurs de risques associés (hypertension, cholestérol). Les cellules peuvent être aussi inutilisables si elles ont été irradiées lors du traitement par radiothérapie. Des études ont démontré que l’effet thérapeutique des cellules souches mésenchymateuses serait majoritairement lié à des vésicules extracellulaires qu’elles sécrètent. Elles sont produites en grand nombre par les cellules souches mésenchymateuses suite à leur activation par des facteurs stimulants. Une production de vésicules extracellulaires in vitro permet de s’affranchir des limites liées à l’utilisation des cellules souches mésenchymateuses via le patient. Les vésicules extracellulaires sont stockées et conservées sous forme lyophilisée simplifiant leur administration. Les vésicules extracellulaires seront injectés par voie non-invasive intra-nasale et permettront de limiter la destruction des vaisseaux sanguins (qui est observée après exposition aux rayonnements ionisants) et pourraient donc limiter le développement des troubles cognitifs.

Bénéfices attendus

Les bénéfices que ce projet pourrait apporter sont multiples tels que : - une nouvelle thérapie non-invasive (administration intranasale) - une réduction des troubles cognitifs (troubles de l’attention, de la mémoire ou de la résolution de problèmes) - une amélioration de la qualité de vie des patients vis-à-vis des troubles cognitifs

Procédures

- Irradiation cérébrale sous anesthésie générale : 10 min - Administration intranasale sous anesthésie générale : environ 5 min par administration - Tests comportementaux sur animal vigile (un test par jour pour une durée de 10 et 5 min pr évaluer la mémoire, 3 min pour évaluer la locomotion) réalisés 4 fois sur une période de 6 mois - Analyse échodoppler sous anesthésie générale : 10 min. - Prélèvement sanguin 1 fois sous anesthésie générale avant la mise à mort : 15 secondes. - Perfusion intracardiaque sous anesthésie générale : 15 minutes

Impact sur les animaux

Pour les irradiations, les animaux étant anesthésiés pour limiter les mouvements, il peut y avoir un effet des anesthésies répétées et les effets potentiels de l’anesthésie sur les variables physiologiques telles que l’hypothermie, l’hypotension, l’hypoxie. Pour les administrations, même si les animaux sont légèrement anesthésiés, il est possible de noter un inconfort transitoire après l’administration. Pour les transports, il peut être noté un stress chez les animaux suite aux changements des conditions environnantes. Après irradiation, un animal peut développer des difficultés à se déplacer et/ou une apparence extérieure piloérection, dos rond ou amaigri Après injection intranasale, les effets indésirables peuvent être un écoulement nasal important et/ou une tête penchée, difficultés à se déplacer, amaigrissement Le transport des animaux peut également conduire à du stress et de l’angoisse conduisant à un amaigrissement

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de réaliser les prélèvements des structures cérébrales.

Remplacement

Le nouveau développement de stratégie thérapeutique doit être validé sur des modèles précliniques (modèles animaux). De plus, les modèles in vitro (culture isolée de cellules en boîte de pétri) ne permettent pas d’évaluer le réseau vasculaire ni les troubles cognitifs. Par conséquent l’utilisation d’un modèle murin est indispensable pour valider notre approche thérapeutique.

Réduction

Les modèles d’expérimentation animale présentent une certaine variabilité de réponse. De plus le retour d’expérience des médecins, chercheurs et biostatisticiens déterminent qu’un nombre de 12 ou 15 animaux dans chaque groupe expérimental est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement robustes afin de valider notre nouvelle thérapie.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés minium 7 jours avant le début des manips. Les animaux seront hébergés par groupe de 4 animaux par cage, des maisons, du coton et du carton seront présents dans chaque cage. Les cages de transports seront autoclavées et des lingettes de produit désinfectant seront utilisées pour éviter la contamination des animaux. Le modèle murin d’irradiation cérébrale (15Gy, dose unique, collimateur variable, sarrp) étant un nouveau modèle développé et utilisé, nous n’avons pas de retour précis concernant les nuisances attendues. Cependant, les animaux seront observés quotidiennement sur leur comportement, leur aspect extérieur et pesés de façon hebdomadaire pendant toute la durée des expérimentations. Après irradiation, si un animal présente des difficultés à se déplacer et/ou une apparence extérieure piloérection, dos rond ou amaigri (pesée hebdomadaire) : des croquettes humidifiées ou du gel de transport seront déposés dans la cage. Transport: des frisottis et du gel de transport sont ajoutés dans les cages de transport des animaux si un animal montre des signes de souffrances (locomotion, isolement, apparence) lié au stress du transport, il sera euthanasié par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Le modèle murin (15Gy, dose unique, collimateur variable, sarrp) sélectionné pour ce travail est le plus pertinent puisqu’il est le plus utilisé dans les études précliniques. De plus, il a déjà été démontré après irradiation localisée du membre inférieur gauche que l’injection d’EV-CSM au niveau musculaire améliorait le processus de néovascularisation et la cicatrisation cutanée. Enfin, nous maîtrisons, chez la souris, les techniques et les équipements afin d’évaluer les paramètres vasculaires, inflammatoires (anticorps) et cognitifs indispensable pour démontrer l’efficacité de notre traitement. Le modèle murin permet de diminuer la quantité de CSM ou VE-CSM injectés en intranasal et réduire les couts expérimentaux. Les animaux seront utilisés entre 8/12 semaines, correspondant au stade adulte. Ce stade a été choisi afin d’éviter une hétérogénéité liée à l’âge qui pourrait modifier les paramètres étudiés.

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans la patte puis des injections de chimiothérapie, pour distinguer le rôle de deux types de cellules immunitaires dans la réponse au cisplatine. Le porteur indique que la tumeur peut réduire la mobilité et l'alimentation, provoquer une perte de poids et des nécroses cutanées. Il affirme que la complexité du cancer ne peut pas être appréhendée in vitro et renvoie les retombées pour les patients au long terme.

Objectifs

Si l’impact des chimiothérapies sur les cellules tumorales est connu, les conséquences d’un tel traitement sur les cellules du système immunitaire restent cependant à découvrir. Nos données préliminaires montrent qu’une chimiothérapie peut attirer le système immunitaire dans la tumeur permettant ainsi une meilleure efficacité du traitement contre le cancer. Ce projet consiste à étudier le rôle de 2 types de cellules immunitaires dans la réponse à une chimiothérapie afin de discriminer leur importance individuelle. Pour cela, deux types de souris génétiquement modifiées, ne possédant pas l’une ou l’autre des cellules d’intérêt seront comparées à des souris ayant les deux types de cellules et l’on observera l’efficacité de la chimiothérapie sur la croissance tumorale dans ces différentes souris ainsi que l’évolution du système immunitaire au sein de la tumeur. Cela nous permettra de comprendre l’importance de nos deux cellules immunitaires d’intérêt dans l’efficacité de la chimiothérapie.

Bénéfices attendus

Une augmentation de la réponse immunitaire au sein même de la tumeur via l'augmentation de la présence du système immunitaire pourrait avoir d'importants impacts dans le ralentissement de la croissance tumorale. Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients en améliorant notre compréhension d'un phénomène immunitaire bénéfique à l'encontre du cancer. A mi-chemin entre la recherche fondamentale et appliquée, ce projet vise à long terme à améliorer les mécanismes immunitaires naturellement mis en place chez les patients cancéreux afin d'augmenter leur chance de survie.

Procédures

Sous anesthésie générale par isoflurane, les animaux subiront 1 injection sous cutanée de 1 minute, 10 jours plus tard, au maximum 3 injections Intrapéritonéale (IP) de 1 minute, réparties sur une semaine et certaines souris auront également 2 Intra veineuse (IV), de 1 minute chacune environ, espacée de 3 jours, la première injection IV ayant lieu le même jour que la première injection IP.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis au maximum à 2 injections IV de 1 minute, 1 injection sous-cutanée de 1 minute et 3 injections IP de 1 minute, sous anesthésie, répartie sur plusieurs jours. Les administrations IV et SC ne sont pas connues pour être particulièrement douloureuses. L’injection des tumeurs en sous-cutané dans la patte des souris pourrait diminuer la mobilité des souris ainsi que leur capacité à se nourrir. De ce fait, il est possible qu’un effet indésirable de cette expérimentation soit une perte de poids. En réalisant des injections en sous-cutané, il est possible d’observer la formation de nécroses cutanées. Dans de précédentes expériences, nous avons montré que les traitements n’ont pas d’effets indésirables sur les souris mais nous continuerons de le vérifier.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les tumeurs, rates et ganglions.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales. Par la suite, le décryptage des mécanismes moléculaires sera réalisé in vitro.

Réduction

Les groupes expérimentaux seront constitués de n=10 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes. Le test statistique utilisé sera celui de Wilcoxon en raison de la taille des groupes.

Raffinement

Chaque animal sera examiné et pesé 3 fois par semaine. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. Les injections SC (cellules tumorales) et IP (traitements) seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Afin de limiter la perte de poids des souris potentiellement due à des problèmes de mobilités induits par les tumeurs, nous allons ajouter des croquettes dans les cages afin que la nourriture leur soit plus accessible. De plus, des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance.

Choix des espèces

Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 7 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature. Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation de par l’utilisation de souris génétiquement modifiés. Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une section définitive du nerf sciatique d'une patte sous anesthésie, qui provoque une atrophie et une perte de force du membre, pour étudier la régulation des connexions entre le cerveau et le muscle. Le porteur décrit une chirurgie modérément invasive et affirme que la souris peut continuer à se déplacer sur ses quatre pattes. Il conclut que l'étude ne peut être conduite que sur un "organisme entier", aucun modèle in vitro ne reproduisant la communication entre motoneurones et muscle.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment est régulée la maintenance des connections cerveau-muscle. Le muscle squelettique est le plus grand organe du corps humain, il représente 40 à 50% du poids corporel. Il est essentiel pour la mise en mouvement du squelette, le maintien de la posture, la respiration, la thermogenèse et la régulation du métabolisme des lipides et des glucides. Cette capacité à bouger et à respirer nécessite une communication entre le cerveau et le muscle. Elle a lieu via des synapses hautement spécialisées qui contrôlent la contraction musculaire. Un dysfonctionnement de ces connections est la cause de faiblesse musculaire, d’atrophie musculaire voir de paralysie et est impliqué dans plusieurs pathologies telles que les myasthénies ou la sclérose latérale amyotrophique. Comprendre comment est régulé la formation et la maintenance de ces synapses est donc d’un grand intérêt.

Bénéfices attendus

Des dysfonctionnements de connections verceau-muscle sont observées dans différentes maladies neuromusculaires. L’apport de connaissances fondamentales est un prérequis pour comprendre la physiopathologie des maladies neuromusculaires et permettre le développement de thérapie à plus long terme.

Procédures

Les animaux subiront deux injections : une sur animal vigile pour l’anesthésie générale (durée une minute) et une sur animal anesthésié pour l’analgésie per et post-opératoire (durée une minute). Les animaux subiront une intervention chirurgicale d’une durée de 15 minutes pour réaliser une section définitive du nerf sciatique d’une seule patte. En de douleur post-opératoire, les animaux pourront recevoir une autre injection pour l’analgésie (durée 1 minute).

Impact sur les animaux

Une chirurgie de dénervation de la patte postérieure gauche sera réalisée. Cette dénervation conduit à une atrophie des muscles de la patte observable à partir de 14 jours, donc à une perte de force musculaire sur le membre. Comme la souris est quadrupède, cette intervention ne l’empêche pas de se déplacer, de grimper dans la cage et de s’alimenter. La technique de dénervation définitive est une chirurgie modérément invasive et parfaitement maitrisée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérimentation afin de collecter tous les muscles squelettiques des pattes postérieures. Ces tissus prélevés serviront pour les analyses de biologie moléculaire et d’histologie pour décrypter les acteurs moléculaires responsables de l'homéostasie musculaire.

Remplacement

Cette étude ne peut être conduite que sur un organisme entier car il est actuellement impossible de reproduire in vitro le système complexe de communication entre les motoneurones et le muscle. La souris est le modèle idéal pour cette analyse car les processus étudiés sont très conservés au cours de l’évolution en particulier chez les mammifères.

Réduction

Un effectif de n=20 animaux par point de collecte sera suffisant pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Après obtention des résultats expérimentaux, les données seront analysées à l’aide d’un test statistique non paramétrique. L’ensemble des muscles des deux pattes postérieures seront collectés. La patte droite non dénervée servira de contrôle contralatéral.

Raffinement

Pendant toute la chirurgie, les animaux seront sous anesthésie générale et locale, coussin chauffant pour éviter l’hypothermie. Un gel oculaire sera appliqué sur les yeux afin d’éviter tout dessèchement de l’œil. Après la chirurgie les animaux recevront pendant 3 jours un traitement analgésique et antalgique. Pour une meilleure récupération après l’anesthésie générale, les animaux seront stabulés une nuit en armoire chauffante. Afin de faciliter l’accès à la nourriture et l’eau derrière l’intervention chirurgicale, des croquettes et de l’eau gélifiée seront déposés sur le sol de la cage. Pendant les 5 jours suivant l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés individuellement quotidiennement afin de vérifier la bonne cicatrisation de la suture, et de traiter la douleur avec des antalgiques adaptés en cas de besoin ou d’euthanasier l’animal en cas de souffrance non jugulée, appréciée par des critères de signes cliniques, d’aspect et de comportement. Toutes les souris de la même cage seront opérées le même jour afin de maintenir le groupe social.

Choix des espèces

Le modèle murin permet le développement d’animaux génétiquement modifiés conduisant à l’obtention de modèle dans lequel un ou plusieurs gènes peuvent être rendus non fonctionnels. De plus, le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin permet donc des explorations moléculaires, cellulaires, tissulaires et fonctionnelles. Les souris seront utilisées à l’âge adulte mature entre 12 et 13 mois car le laboratoire étudie les mécanismes régulant l'homéostasie musculaire. L’âge de 12 mois représente à peu près le milieu de la vie pour une souris.