Procédures modérées

50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quarante sont dystrophiques et dix sont des témoins, et toutes subissent des injections intraveineuses en contention vigile, des mesures de fonction cardiaque, des électromyogrammes et des mesures de force musculaire sous anesthésie, pour tester une molécule associée à une restauration de la dystrophine dans la myopathie de Duchenne. Le porteur affirme que le modèle murin est "indispensable", les modèles in vitro ne rendant pas compte selon lui de la dégénérescence progressive. Les bénéfices pour les patients sont renvoyés au long terme, en complément d'outils de thérapie génique en développement.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique à transmission récessive liée au chromosome X due à l’absence de la protéine dystrophine. Cette maladie entraîne une dégénérescence de l’ensemble des muscles (squelettique, cardiaque ou lisse), une inflammation, de la fibrose et une perte de masse et de force musculaire. Il n’existe pas à ce jour de traitement pour la DMD mais des stratégies de thérapie génique prometteuses sont en cours d’évaluation dans des essais cliniques. Parmi les approches de thérapie génique, la restauration de la protéine dystrophine est la plus prometteuse. Néanmoins, nous savons aujourd’hui que la restauration de dystrophine devra s’accompagner d’une stratégie permettant un meilleur maintien de l’intégrité musculaire. En effet, chez les patients DMD, les fibres dépourvues de dystrophine se cassent et dégénèrent. La force musculaire diminue et le tissu musculaire laisse la place aux tissus conjonctif et graisseux. Les stratégies thérapeutiques sont confrontées à des limites comme la dégénerescence des fibres musculaires dystrophiques et la perte du bénéfice thérapeutique. Dans cette optique, notre molécule représente un bon candidat car il a déjà été prouvé que ce traitement renforce l'intégrité musculaire. Nous proposons donc une thérapie combinée associant la restauration de dystrophine et notre molécule afin de maintenir un environnement musculaire plus propice à la réexpression de la dystrophine.

Bénéfices attendus

Nous attendons comme bénéfices à court terme, chez les souris dystrophiques, une amélioration du phénotype dystrophique lorsque les souris sont traitées avec la combinaison molécule d’intérêt et restauration de dystrophine comparé au traitement restauration de dystrophine seul. A long terme, nous projetons d’utiliser cette molécule comme traitement utilisable chez le patient atteint dystrophie musculaire de Duchenne en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs types d'interventions: - Injection intra veineuse (1 minute) (sans anesthésie) dans le laboratoire collaborateur. Prélèvements de sang (20 secondes) (1 fois en fin de procédure pour chaque animal) (avec anesthésie). Les animaux seront soumis à des mesures fonctionnelles : -Mesures de composition corporelle (2 minutes) (1 fois) (sans anesthésie). Evaluation de la fonction cardiaque (échocardiographie) (10 minutes) (1 fois) (avec anesthésie). Electromyogrammes (20 minutes) (1 fois) (avec anesthésie et analgésie). Mesures de contractilité musculaire (20 minutes) (1 fois) (avec anesthésie)

Impact sur les animaux

Lors de l’injection en intraveineuse par voie caudale, l’animal vigile placé dans un appareil à contention prévu à cet effet, ressentira un stress et une douleur/inconfort équivalent ou supérieur à l'introduction d'une aiguille. Lors du transport entre les deux laboratoires et à l’arrivée dans leur nouvel environnement, les animaux pourront subir un stress dû aux mouvements des cages de transport, lorsqu'ils seront transférés dans leur nouvelle cage, pendant les premiers jours après leur arrivée et si l’alimentation n’est pas identique. Lors des mesures de composition corporelle, l’animal subit un stress pendant l’immobilisation de 2 minutes dans le cylindre de contention. Au cours des procédures d’évaluation de la fonction cardiaque et des procédures de mesure de force, les animaux subissent un stress au moment de la contention et lors de l’administration de l’anesthésie (gazeuse ou piqure en intrapéritonéal).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Le but de notre projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour le maintien de l’intégrité musculaire dans le muscle dystrophique. L’utilisation d’un modèle murin de la dystrophie musculaire de Duchenne est indispensable car les modèles in vitro ne peuvent rendent compte de la dégénerescence progressive observée au cours de cette maladie. Ce modèle dystrophique est celui qui est signalé dans les directives pour l'étude de la dystrophie musculaire de Duchenne car il s’agit du modèle le plus approprié car bien caractérisé. La finalité de cette étude est de développer des stratégies thérapeutiques, ce qui ne peut se faire que sur un modèle animal. Néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l'utilisation de souris.

Réduction

Les processus expérimentaux seront conçus de façon à utiliser un nombre de souris limité. Pour tous les groupes expérimentaux et toutes les méthodes d'analyse, 5 à 10 animaux est le nombre d'échantillons nécessaire pour obtenir une analyse statistique fiable. Néanmoins, considérant une forte hétérogénéité chez les souris dystrophiques, des groupes de 10 souris par condition seront nécessaires pour permettre une analyse statistique fiable, pour éviter que la variabilité des paramètres de mesures in vivo puisse empêcher la bonne exploitation des résultats. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable et pour éviter de les répéter. De plus tous les muscles et une majorité des organes de la souris seront prélevés. Au total, nous prévoyons d'utiliser 40 souris dystrophiques et 10 souris contrôle. La taille des effectifs sera été établie grâce à un calcul de puissance et nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats

Raffinement

Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Elles consistent en un contrôle quotidien des cages, un changement régulier, un nombre réduit d’animaux par cage et pas d’animaux isolés. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de laine de bois afin que les souris puissent faire un nid ainsi que de lanières de papier Kraft et des tunnels en carton. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage. Pour limiter la souffrance et l'angoisse, les procédures qui le nécessiteront seront réalisées sous anesthésie et sous analgésiques. Au cours des différentes procédures, la température des souris est maintenue constante à l’aide d’une plate-forme chauffante ou sous lampe radiante. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de relever le moindre signe de souffrance. Nous mettrons en place des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum. Nous procèderons à l'euthanasie compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour la caractérisation de l’homéostasie musculaire. Cette espèce permet de combiner les études moléculaires et fonctionnelles du muscle squelettique. Le modèle de souris dystrophique utilisé dans ce projet combinent l’avantage du modèle murin dystrophique et l’avantage d’avoir les mitochondries marquées, ce qui sera très utilie pour mener à bien notre projet. Nous utiliserons des animaux âgés de 4 semaines en début de procédure et de 16 semaines en fin de procédure. L’intérêt est de traiter les animaux à un stade précoce de la maladie dès la fin du sevrage. Le démarrage du traitement dès que possible à 4 semaines permettra d’évaluer la capacité de notre molécule à ralentir la progression de la maladie.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Saines, elles reçoivent trois injections destinées à produire des anticorps contre des peptides liés à la spermatogenèse, avec prélèvements sanguins sous anesthésie. Le porteur indique que les injections peuvent provoquer des lésions ou des ulcérations cutanées et les prélèvements des saignements et des hématomes. Il décrit la souris comme le "meilleur modèle" pour induire l'immunisation et rattache le projet à une étude internationale sur les effets du COVID sur la fertilité.

Objectifs

L’auto-immunité est la conséquence d’un système immunitaire qui s’emballe et dépasse son rôle de défense contre les agents extérieurs pour s’attaquer aux propres cellules de l'organisme. Les agents extérieurs peuvent être des bactéries, champignons, virus. Ainsi l'épidémie de COVID-19 a incité les scientifiques, et en particulier les immunologistes, à étudier l'impact de l'infection par le SARS-CoV-2 sur la population humaine mondiale. La principale préoccupation est de savoir si l'infection peut déclencher une maladie auto-immune. Les anticorps formés contre le SARS-CoV-2 se lieraient aux protéines des tissus humains, entraînant une réactivité auto-immune. La présente étude porte sur l'appareil reproducteur. Les tissus du système reproducteur sont très vulnérables aux infections virales, de plus les ovaires et les testicules expriment des récepteurs qui servent également a la voie par laquelle le virus pénètre dans les cellules. Par ailleurs, plusieurs études ont indiqué que les patients atteints de COVID-19 produisent des auto-anticorps et qu'une partie d'entre eux développent des troubles auto-immuns; à cet égard, une altération de la spermatogenèse a été signalée dans des études menées sur des patients atteints de COVID-19. Notre première analyse a permis d'identifier 4 sequences (peptides) communes liées à la spermatogenèse et la protéine Spike du SARS-CoV-2. Nous avons également découvert que des patients masculins et féminins affectés par le COVID-19 développaient des anticorps contre 2 des 4 peptides sélectionnés liés à la spermatogenèse, soulignant l'apparition de nouveaux troubles de la fertilité dans la population. Le but de ce projet est la production d'anticorps anti-peptides sur des souris saines afin de vérifier l'impact sur la fertilité

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet auront un impact à la fois sur la communauté scientifique et sur la population en général. Cette étude nous permettra de produire des anticorps qui seront utilisés dans un projet plus vaste afin de comprendre leur rôle.

Procédures

Trois injections et les prélèvement sanguins sont réalisées sur animal anesthésié. Temps : injections : 1 minute/souris Prélèvement sanguin : 2 minutes/souris

Impact sur les animaux

Les souris peuvent développer des lésions cutanées ou des ulcérations au niveau de la peau ou du muscle. Le prélèvement de sang peut provoquer des saignements excessifs et des hémorragies sous-cutanées.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la prodédure pour prélèvement.

Remplacement

Le projet actuel constitue la phase finale d'une large étude internationale à grande échelle qui a commencé par une analyse visant l'identification de peptides partageant des séquences similaires avec la protéine Spike du SARS-CoV-2 et les protéines liées à la spermatogenèse. Ensuite, nous avons démontré la réactivité des anticorps des sérums des patients COVID-19 envers lesdites protéines/peptides liées à la spermatogenèse par des tests in vitro (sérums collectés de divers centres cliniques internationaux). L'objectif du projet actuel est à présent de produire des anticorps contre les peptides caractérisés et de pouvoir étudier leur effet sur un organisme complexe. Cela nécessite d’induire une réponse immunitaire contre ces peptides, ce qui ne peut être généré que chez ou à partir d'animaux vivants et de prélèvements de tissus à la fin del la procédure.

Réduction

Le nombre d'animaux employés est basé sur les travaux rapportés dans la littérature. Il a été établi pour nous permettre d’obtenir des anticorps en quantité suffisante pour poursuivre vos travaux.

Raffinement

Tous les animaux seront maintenus dans un groupe social et dans des cages enrichies (matériaux de nidation, tubes). L'expérience est arrêtée lorsque l'analyse de sang confirme la présence d'anticorps. Nous avons établi des points-limites nous permettent de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Les souris ont un génome très proche de celui de l'homme, et leurs systèmes physiologiques schématisent les observations faites chez l'homme. Aujourd'hui, la souris représente le meilleur modèle pour induire l'immunisation. Des souris âgées de 6 à 8 semaines seront recrutées. À cet âge, les souris sont considérées comme des adultes et leur système immunitaire est pleinement développé.

Ce projet doit fournir aux organismes de sélection ovine des indicateurs de l'efficacité alimentaire et des émissions de méthane des agneaux, pour orienter la sélection de l'élevage ovin allaitant. 1 000 jeunes moutons de race Romane vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis rendus à ce que le porteur appelle leur "carrière de production". Sans anesthésie ni sédation, chacun subit une prise de sang à la jugulaire, un prélèvement de fèces à la main dans le rectum et l'aspiration d'environ 40 mL de liquide du rumen par une sonde de 12 mm de diamètre et d'un mètre de long descendue par la bouche, deux fois pour les mâles et une fois pour les femelles. Le régime 100 % concentré peut en outre les exposer à une acidose du rumen. Le porteur conclut que l'usage des agneaux "ne peut donc être évité", et vise une sélection qui limite l'impact environnemental de l'élevage tout en maintenant "la rentabilité économique pour les éleveurs".

Objectifs

Notre projet a pour objectif d’identifier des prédicteurs de l’impact environnemental de l’élevage d’ovins allaitants. Les impacts seront étudiés sous l’angle de l’ingestion (aliments et eau) et des émissions de gaz à effet de serre. Nous utilisons des agneaux mâles et femelles de race Romane, descendants de béliers sélectionnés pour valoriser efficacement (ou peu efficacement) ce qu’ils ingèrent, une valorisation efficace signifiant que les individus ingèrent moins que les autres tout en ayant le même niveau de production. Le projet portera sur l’étude des 5ème et 6ème génération de sélection. Après 4 générations de sélection, la divergence est bien marquée : les agneaux issus de béliers efficaces ingèrent 10% de moins de concentré que les agneaux issus de béliers peu efficaces, tout en ayant des performances de croissance identiques. Ces différences sont très réduites bien que significatives, avec un régime plus riche en fourrages. La connaissance des émissions de gaz à effet de serre dans chacune des lignées et sous deux régimes différents nous renseignera sur les liens génétiques entre l’efficacité alimentaire et l’impact environnemental. Chaque année, une centaine d’agneaux de chacun des deux sexes (50% issus de béliers efficaces et 50% issus de béliers peu efficaces) seront mesurés pour leurs émissions de gaz et leurs ingestions d’aliments et d’eau. Les différents outils de mesures reposent sur l’identification électronique des animaux qui sont ainsi mesurés tout en étant maintenus dans leurs lots d’élevage. L’impact environnemental sera évalué sous deux régimes alimentaires différents : un régime 100% concentré basse énergie quand les agneaux auront entre 3 et 5 mois d’âge, puis un régime plus riche en fourrages quand les agneaux auront entre 6 et 9 mois d’âge. Enfin, l’enregistrement en routine des émissions de gaz et des quantités ingérées est peu envisageable à grande échelle, à des fins de sélection. Nous rechercherons donc des prédicteurs de ces caractères dans différents tissus/fluides : le plasma sanguin, le fluide ruminal et les fèces. Les prélèvements de chacun de ces fluides seront réalisés au maximum 2 fois dans la vie de chaque animal, à l’issue de chacune des phases d’alimentation, avec un délai de 3 à 4 mois entre les deux prélèvements. Les émissions de gaz à effet de serre sont principalement dues aux fermentations ruminales, donc l’étude du microbiote ruminal sera central dans ce projet en lien avec le microbiote fécal.

Bénéfices attendus

Notre projet propose d’étudier des animaux sélectionnés sur leur efficacité alimentaire et de répondre à la question suivante : des animaux plus efficaces émettent-ils plus de gaz à effet de serre que des animaux moins efficaces ? La sélection sur chacun des caractères pourra alors être différente en fonction des résultats obtenus, de façon à ce que l’impact environnemental de l’élevage ovin soit limité, tout en maintenant la rentabilité économique pour les éleveurs. De plus, l’ensemble des prélèvements sera utilisé pour rechercher des prédicteurs des émissions de méthane, car ces dernières restent encore peu accessibles en élevage conventionnel. Ces prédicteurs pourront être utilisés par les organismes de sélection, pour inclure l’efficacité alimentaire et/ou les émissions de gaz à effet de serre dans leurs programmes de sélection

Procédures

Pour ce protocole, les agneaux mâles auront chacun deux séries de prélèvements, espacées de 3 mois minimum. Les femelles ne seront prélevées qu’un seule fois, après la phase d’alimentation fourragère. Pour ces prélèvements, les animaux ne seront ni anesthésiés ni sédatés. Chaque année, les 200 animaux étudiés seront prélevés. Sur la totalité du projet, ce seront ainsi 1000 animaux qui seront échantillonnés. Ces prélèvements correspondent à une prise de sang à la jugulaire, un prélèvement de fèces au niveau rectal, et un prélèvement de fluide ruminal par sondage gastro-oesophagien. L’ensemble de ces 3 prélèvements est réalisé en moins de 10 minutes, sans isoler l’animal de ses congénères. Chaque mâle aura donc 2 prises de sang, 2 prélèvements de fèces et 2 prélèvements de fluide ruminal. Les prélèvements sont faits à 5 mois et 8 mois d’âge, pour les mâles. Les femelles n’auront qu’une prise de sang, un prélèvement de fèces et un prélèvement de fluide ruminal, lorsqu’elles auront environ 8 mois d’âge. Pour le prélèvement à la jugulaire et le prélèvement rectal, l’animal sera en attente dans un couloir. Un animalier lui soutiendra la tête pendant qu’un autre animalier fera le prélèvement de sang à la jugulaire. Suite à la prise de sang, un baume antiseptique et cicatrisant pourra être appliqué en massage sur les veines. Ensuite, environ 5g de fèces seront prélevés directement dans le rectum par un animalier dont le gant sera enduit de lubrifiant, un second animalier soutenant toujours la tête de l’animal. Enfin, l’animal passera du couloir au restrainer, matériel de contention adapté aux ovins. Celui-ci portera l’animal jusqu’au poste de prélèvement du fluide ruminal. La tête de l’animal sera maintenue par un animalier, pendant qu’un second animalier fera descendre la sonde gastro oesophagienne souple (12 mm de diamètre et 100 cm de longueur) par la bouche jusqu’au rumen. Une fois la sonde placée, la pompe à vide (reliée à l’autre extrémité de la sonde) sera activée et environ 40 mL de fluide ruminal sera prélevé. La pompe sera ensuite éteinte et la sonde retirée avec précaution. L’ensemble de ce prélèvement (de l’introduction de la sonde à son retrait) n’excède pas deux minutes. Un renforcement positif par distribution manuelle de concentré sera réalisé à la fin du prélèvement de fluide ruminal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pendant la première phase de contrôle pourraient être liés à l’alimentation 100% concentrés (à base de céréales) à volonté lors du premier contrôle, avec des risques d’acidification importante du milieu ruminal. L’aliment concentré a été formulé pour respecter des recommandations élevées en fibres et il a été enrichi en bicarbonate, pour prévenir cette acidose ruminale. Les soigneurs sont habitués à l’élevage de ruminants et connaissent ce trouble digestif et ses symptômes. En cas d’acidose aigüe, ils ont à leur disposition des traitements à administrer par voie orale. Ils sont formés à ce geste. Lors des phases d’adaptation prévues dans le projet, les animaux qui auraient du mal à se familiariser avec les automates d’ingestion sont entraînés par les animaliers, avec un renforcement positif par distribution manuelle de concentré. Tout animal qui ne parvient pas à s’adapter aux automates n’est pas conservé pour le protocole. Durant toute la phase d’élevage et d’expérimentation, en cas de signes de maladie (fièvre >40°C, problèmes respiratoires, décubitus prolongé, anorexie, perte de poids…), ou d’impact sur l’état général des animaux, une intervention vétérinaire aura lieu et un traitement adapté (antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mis en place (l’animal sortira du protocole si nécessaire). En cas de non réponse aux traitements et sur décision vétérinaire, l’animal sera euthanasié.

Devenir

Les agneaux poursuivront leur carrière de production suite à la procédure expérimentale.

Remplacement

Notre projet porte sur l’impact environnemental de la sélection sur l’efficacité alimentaire. Les principales émissions de gaz à effet de serre proviennent de la digestion des fibres dans le rumen, par les ruminants. Ces émissions de gaz poduits dans le rumen ont des origines génétiques et alimentaires complexes. Cette variabilité individuelle ne peut être étudiée en dehors des animaux eux-mêmes. De plus, nous cherchons des prédicteurs biologiques de ces émissions de gaz, donc il est indispensable de prélever des échantillons sur les animaux mesurés afin d’avoir le lien direct entre les mesures et les prédicteurs testés. Le recours à l’animal ne peut donc être évité.

Réduction

Notre projet repose sur le phénotypage de 200 agneaux par an, soit 1000 agneaux sur 5 ans. Ces effectifs ont été calculés pour nous permettre d’observer des différences faibles entre nos deux lignées d’animaux, sur des caractères autres que la consommation résiduelle. Nous avons choisi de travailler sur les deux sexes, afin d’appliquer le modèle de transmissibilité aux caractères que nous étudions. Ce modèles nécessite des trios (parents-descendants) phénotypés à un âge identique entre les générations. L’estimation des paramètres génétiques repose sur l’analyse de nombreux animaux (au moins 700). Les enregistrements issus de ce projet viendront compléter des bases de données issues de projets antérieurs de façon à avoir les effectifs suffisants nous permettant les analyses génétiques des nouveaux caractères.

Raffinement

Durant notre projet, les animaux sont élevés en lots pour exprimer leurs comportements sociaux. Les mesures réalisées reposent sur l’utilisation d’automates que les animaux fréquentent selon leurs besoins. Toutes les données sont gérées en temps réel et intégrées par un logiciel dédié. Le suivi des animaux est quotidien, par cet outil informatique, par des caméras, mais aussi par les nombreux passages des animaliers pour un suivi visuel. Les temps d’occupation des automates sont régulièrement contrôlés pour s’assurer que chaque animal se nourrisse à volonté. Tout animal qui ne parvient pas à s’adapter aux automates n’est pas conservé pour le protocole. Les animaux sont logés sur des aires de copeaux de bois, pour nous assurer qu’ils ne mangent pas leur litière, ce qui fausserait l’étude. Des disques à mordiller seront suspendus dans les parcs. Les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge au contact humain, et en particulier à être manipulés. Afin de limiter le stress de contention, les prélèvements sont réalisés par du personnel qualifié à l’aide de matériel de contention adapté aux ovins et auquel les animaux sont habitués. Les prélèvements de fèces, sang et de contenu ruminal se font successivement lors de la même contention, afin de réduire au maximum le temps de contention. Les prélèvements de sang et de fèces sont similaires à ceux qui peuvent être réalisés en élevage classique pour du génotypage, de la prophylaxie ou du diagnostic de parasitisme gastro-intestinal. Pour les prises de sang, les agneaux pouront être tondus au niveau du coup pour faciliter la visualisation de la veine jugulaire. Un baume antiseptique et cicatrisant pourra être appliqué en massage sur les veines. Une attention particulière sera portée aux veines jugulaires pour repérer tout signe éventuel de phlébite. Les prélèvements de contenu ruminal ne sont pas des prélèvements habituels en élevage ovin. Néanmoins, le personnel de l’établissement utilisateur a été formé et pratique ce type de prélèvement depuis plusieurs années. A la fin des prélèvements, une poignée de granulés est donnée à l’animal pour un renforcement positif. Ils font l’objet d’une surveillance visuelle toute particulière au moment des prélèvements et après ceux-ci. Les ingestions et les poids sont encore enregistrés sur les deux jours suivants les prélèvements, pour avoir une indication de leur état de santé.

Choix des espèces

L’étude des émissions de gaz à effets de serre est primordiale pour l’espèce bovine qui en est la principale responsable. Néanmoins, l’espèce ovine présente 2 avantages au sein des ruminants pour l’étude de l’impact environnemental des ruminants : des troupeaux avec de grands effectifs (mêmes conditions d’élevage), une sélection génétique opérationnelle. Le rumen est l’élément central de notre projet, donc l’espèce ovine est toute indiquée pour être support de ce travail. Notre projet porte ainsi sur l’utilisation d’ovins allaitants de race Romane sélectionnés sur leur efficacité alimentaire. Cette efficacité alimentaire est évaluée lors de la phase de croissance dans un premier temps. Les agneaux entrent en halle de phénotypage entre 10 et 12 semaines d’âge, afin de débuter la phase de contrôle autour de 90 jours d’âge, et ont 8 à 9 mois d’âge en fin de projet.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines sont génétiquement modifiées pour supprimer une réaction inflammatoire cérébrale, et toutes sont isolées en cage jusqu'à huit jours, soumises à un régime gras puis à un jeûne de seize heures, avec contentions dans un scanner corporel, avant mise à mort et prélèvement du cerveau. Le porteur revendique la souris comme un "modèle de référence" pour les études métaboliques et affirme qu'aucun modèle de substitution n'existe pour cette approche intégrée. Les retombées annoncées, une meilleure compréhension de la boulimie, de l'hyperphagie ou de l'anorexie, restent formulées comme une possibilité.

Objectifs

L’existence de la réaction inflammatoire postprandiale (PIR) systémique est maintenant bien documentée. En revanche, ses effets sur l’organisme sont encore mal connus. La PIR apparaît chez l’individu sain dans un contexte de physiologie normale. Elle se caractérise par l’augmentation transitoire de facteurs inflammatoires circulants après un repas. La PIR est exacerbée lorsque le repas est riche en graisses. Récemment, notre équipe a montré que la PIR se développait aussi dans le cerveau, elle se caractérise par une activation des cellules inflammatoires spécifiques (les cellules microgliales) chez l’individu sain en réponse à un repas gras. Cette réponse est visible 3 heures après le début du repas. Elle se produit dans l’hypothalamus, une structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire, du poids corporel et du métabolisme énergétique. Nous avons déjà identifié des effets bénéfiques de la PIR en montrant qu’elle contrôlait la prise alimentaire en favorisant la satiété et en limitant les apports caloriques après consommation d’un repas gras. Toutefois, chez les mammifères, il existe un équilibre dynamique entre les apports et les dépenses énergétiques de l’organisme qui reste constant en condition de vie normale. Cet équilibre est appelé homéostasie énergétique. Il vise à faire coïncider la prise alimentaire (calories assimilées) par rapport aux besoins de l’organisme (calories brûlées), liés à son fonctionnement et à l’activité physique. La question est de savoir si la PIR n’agit que sur la prise alimentaire ou contrôle également les dépenses énergétiques de l’organisme. Pour tester cette hypothèse, nous allons mesurer différents aspects des dépenses énergétiques (dont activité locomotrice et métabolisme basal) chez des souris dont la PIR cérébrale a été abolie ou non. Cette approche de perte de fonction sera possible grâce à l’étude d’animaux mutants ne pouvant pas déclencher la PIR au niveau cérébral. Des animaux non mutants seront les témoins de l’expérience. Les animaux seront étudiés dans différents états nutritionnels (sous régime standard ou gras pendant 72 heures). Ils seront également soumis à un test d’effort calorique conventionnel (mise à jeun pendant 16 heures). L’ensemble de ces analyses fonctionnelles sera réalisé en cages calorimétriques dédiées. A la fin des études, les animaux seront mis à mort et les cerveaux seront collectés post-mortem pour analyses histologiques. Au total, 128 souris seront utilisées dans ce projet.

Bénéfices attendus

Les résultats permettront de mieux comprendre les fonctions de la PIR cérébrale chez l’individu sain, et donnera des informations nouvelles sur les mécanismes cérébraux impliqués dans le contrôle de la satiété et du métabolisme énergétique. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur le contrôle de l’appétit, et pourrait permettre de mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire tels que la boulimie, l’hyperphagie, ou l’anorexie.

Procédures

La procédure implique une mise en cage individuelle pendant 8 jours au maximum, afin de mesurer les dépenses énergétiques de chaque individu, ce qui peut engendrer stress et inconfort. Des contentions seront réalisées afin d’évaluer la composition corporelle (procédure non invasive mais nécessite un transfert des animaux dans un scanner corporel). Une injection intrapéritonéale d’anesthésique durant 5 secondes sera réalisée avant mise à mort sous sédation.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances sont liées aux conditions d’hébergement isolées pendant 6 à 8 jours. Le stress métabolique induit par la mise sous régime gras pendant 3 jours et par la mise en jeun pendant 16 heures représente une nuisance supplémentaire. Enfin, la contention des animaux (notamment pour mesurer la composition corporelle dans le scanner EchoMRI), et les injections intrapéritonéales d’agent d’anesthésique avant la mise à mort représentent aussi des nuisances. Ces injections seront réalisées une seule fois par animal. Pendant les expériences de calorimétrie, la surveillance quotidienne du bien-être animal sera assurée de manière visuelle, à travers les cages transparentes, et par suivi des enregistrements de prise alimentaire, prise hydrique, et locomotion. De plus, lors des changements de conditions nutritionnelles (introduction du régime gras HFD (High fat diet ) après SD, ou du régime équilibré SD (standard diet) après mise à jeun), une observation directe des animaux sera faite.

Devenir

Les 128 souris seront toutes mises à mort afin de prélever le cerveau en vue d’analyses histologiques.

Remplacement

Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses métaboliques et comportementales fines.

Réduction

La procédure décrite a été optimisée, standardisée et validée précédemment, ce qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, d’éviter des études pilotes supplémentaires, et donc de réduire les effectifs nécessaires au projet. Le fait de travailler avec des animaux standardisés (sexe, âge, et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier de manière optimale les différences significatives entre les groupes expérimentaux, ce qui permet de mener des études conformes sur des effectifs réduits.

Raffinement

Depuis la naissance des animaux dans l’animalerie, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux (manipulation par les personnes compétentes, calme dans les pièces). Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidation et carré de coton qui permettent l’expression de comportements innés et favorisent la protection des animaux. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux. Les différentes manipulations des animaux et injections seront effectuées par du personnel compétent, conformément à la législation. Les principaux dispositifs instrumentaux utilisés dans ce projet (cages métaboliques et scanner EchoMRI) permettent des mesures non-invasives. Une liste de points limites a été préalablement établie et si un animal présente des signes de souffrance ou atteint pour une durée de plus de trois jours, un des points limites décrits dans les procédures l'animal sera ecarté de l'étude.

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes mâles, âgées de 9 semaines. Cet âge correspond à un cerveau mature stabilisé.

100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié reçoit une injection de streptozotocine pour induire un stress oxydant, tous sont gavés d'eau ou d'extraits de tomate ou de baie de goji, puis anesthésiés pour des mesures de fonction vasculaire avant prélèvements. L'objectif déclaré est d'évaluer l'effet antioxydant de poudres alimentaires, la tomate étant décrite comme un ingrédient stratégique pour l'industrie agroalimentaire. Le porteur affirme qu'aucun modèle de substitution in vitro n'existe pour évaluer l'impact d'un aliment sur la fonction vasculaire.

Objectifs

L'objectif est d’évaluer l’effet antioxydant de poudres issues de différents lots de tomates contrastées ainsi que d'un lot de baie de goji. En effet, la tomate et la baie de goji sont des aliments dont la consommation est associée à des effets bénéfiques pour la santé, mais leur profil nutritionnel dépend du génotype et des conditions de production. La poudre de tomate est un ingrédient stratégique pour l’industrie agroalimentaire et utilisée dans diverses préparations (soupes, snacks, préparation pour bébés). Les effets santé de la tomate sont partiellement attribués aux caroténoïdes qui sont reconnus, entre autres, pour leur rôle d’antioxydants ou de précurseurs biodisponibles de la vitamine A. La tomate est la première source d’apports alimentaires en lycopène, un caroténoïde principalement accumulé dans le tissu adipeux et ayant des propriétés antioxydantes importantes. Lors de la digestion, les caroténoides sont métabolisés et distribués dans l'organisme. Peu d'études mettent en évidence un effet protecteur de ces métabolites sur la fonction cardiovasculaire in vivo. De plus, l'effet propre au génotype de tomate associé à son cocktail de micronutriments ainsi que celui de la baie de goji, au delà des caroténoides, reste à évaluer.

Bénéfices attendus

Le projet doit apporter une meilleure connaissance des mecanismes de protection apportés par les caroténoides et antioxydants présent dans notre alimentation.

Procédures

La moitié de animaux recevra une injection intrapéritonéale d'une molécule induisant une hausse de la glycémie 72 heures avant l'évaluation de la fonction vasculaire. Les animaux seront soumis à une supplémentation orale aigue (1 traitement oral) en eau ou extraits de tomate ou baies de goji (15ml/kg). Une anesthésie sera réalisée et associée à une injection d'analgésique afin de réaliser des doses-réponse de molécules vasomotrices au niveau des tissus vasculaires.

Impact sur les animaux

La supplémentation par voie orale ainsi que l’induction de l’anesthésie gazeuse pouvant être source de stress ou de douleurs modérées pour l’animal, les animaux seront habitués au gavage par un manipulateur expérimenté. L'injection de Streptozotocyne peut entrainer des douleurs faibles au site d'injection. De plus, l'induction de l'anesthésie et la mise en place du stress oxydant par injection de Streptozotocine se tiendront strictement en dehors du lieu d'hébergement.

Devenir

La réalisation de prélèvements sanguins et tissulaires post-mortem nécessite la mise à mort des 100 rats Wistar en fin de procédure.

Remplacement

L'impact d'un stress oyxdant et les potentiels effets compensatoires apportés par la consommation d'une préparation à base de tomate ou de baies de goji sur le flux de perfusion ne peut s'étudier qu'à l'aide d'un modèle in vivo sur l'animal. En effet il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro pour évaluer l'impact d'un aliment sur la fonction vasculaire.

Réduction

Compte tenu de la variabilité et de la stabilité de la mesure, Un n de 10 animaux par groupe apparait comme le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des variations relatives de 10% de flux de perfusion entre les groupes.

Raffinement

Les animaux sont stabulés une semaine après leur arrivée, avant toute procédure, pour s’acclimater à leurs conditions d’hébergement. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les rats sont hébergés en cages de 3 individus avec un enrichissement du milieu ((tubes, coton, bâtons à ronger). La température et l’hygrométrie sont contrôlées dans des conditions constantes de température avec des cycles jour/nuit de 12 heures et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les animaux sont visités quotidiennement par un personnel formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents point limites. Afin d’éviter toute douleur, les procédures seront réalisés sous anesthésie associée à une analgésie. Une phase d'habituation au gavage sera réalisée pendant 3 jours avant le début de l'étude. Cette période d'habituation vise à diminuer le stress lié à la préhension et au gavage.

Choix des espèces

Le rat est un modèle de choix car la physiologie digestive et cardiovasculaire des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme. Afin d'éviter des modifications liées au développement des animaux, les animaux seront utilisés à un stade mature (rats de 12 semaines) pour être représentatif d’une population adulte.

90 souris et 30 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie réutilisée d'une étude à l'autre, le reste tué. Ils reçoivent jusqu'à cinq administrations de composés chimiques ou biologiques par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée, pour déterminer les doses toxiques avant de futurs tests d'efficacité. Le porteur indique que les effets peuvent aller de la perte de poids aux stéréotypies, à la prostration et à la détresse respiratoire, l'atteinte d'un point limite déclenchant la mise à mort. Il affirme que l'étude est "indispensable" et ne peut pas se faire autrement que sur des animaux vivants, les tests in vitro étant jugés insuffisants.

Objectifs

L’objectif du projet est de collecter des données de tolérance et de toxicité pour des nouveaux composés chimiques et biologiques dont la bibliographie est insuffisante ou inexistante. La réalisation de cette étude pour chaque nouveau composé, est indispensable pour connaître les doses à utiliser pour les futures études d’efficacité in vivo sans risquer de tester des doses toxiques.

Bénéfices attendus

La réalisation de cette étude pour chaque nouveau composé, est indispensable pour connaître les doses à utiliser pour les futures études d’efficacité in vivo sans risquer de tester des doses toxiques. Elle permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisés dans la phase de test d’efficacité biologique.

Procédures

Administration de composés par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse, ou sous cutanée ;10 secondes par administration ; maximum 5 administrations / animal.

Impact sur les animaux

Nous cherchons à déterminer si les produits testés induisent de réactions toxiques pour l’animal à certaines doses. Si c’est le cas, ces nuisances s’exprimeront par : - une perte de poids - des modifications du comportement: . des comportements stéréotypés marqués (animal tournant en rond, se cabrant, agressif) . diminution de la mobilité, prostration . diminution de l’alimentation et du toilettage, voire de l’aspect général de l’animal (pelage sale autour face/ région urogénitale, hirsute) - des effets sur l’activité respiratoire

Devenir

Si une autre étude sur un nouveau composé chimique est prévue dans les 3 semaines suivantes, les animaux pourront être réutilisés, et considérés comme en utilisation continue étant donné qu’ils seront utilisés dans les mêmes procédures. Si une autre étude sur un nouveau biologique est prévue dans les 5 semaines suivantes, les animaux pourront être réutilisés. Si aucune étude n’est planifiée, les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude.

Remplacement

Le but de cette étude est de déterminer une activité toxique in vivo et ne peut donc pas être réalisée par d’autres moyens que d’utiliser des animaux vivants. En effet les études de toxicité in vitro sont insuffisantes et un composé peut se révéler toxique chez l’animal à des doses non toxiques in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est basé sur les recommandations OCDE, considéré comme suffisant pour conclure (3 animaux par groupe); moins de 3 animaux par étude serait insuffisant. Un animal pourra être utilisé pour une deuxième étude dans les cas suivants : Si une autre étude sur un nouveau composé chimique est prévue dans les 3 semaines suivantes, les animaux pourront être réutilisés. Si une autre étude sur un nouveau composé biologique est prévue dans les 5 semaines suivantes, les animaux pourront être réutilisés.

Raffinement

Voici la liste des points limités : Perte de poids > 15% Changements majeurs : - Diminution marquée de la motilité - Absence d’alimentation et de toilettage - Prostration - Comportements stéréotypés marqués (tourne en rond, se cabre, agressivité) - Recroquevillé - Effets marqués sur la respiration avec détresse respiratoire - Décoloration et fourrure sale autour de la bouche et de la région urogénitale Pour l’administration par voie Intra péritonéale, surveillance au point d’injection. Si un des points limites est observé, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

L’OCDE recommande d’utiliser des rongeurs pour ce type d’étude. Nous avons choisi les souriscar cela est suffisant dans le cadre de notre projet, les tests d’activité biologique des composés étant réalisés chez la souris. La souris est par ailleurs l'espèce la plus utilisée sur le campus. Nous avons complété cette demande pour le hamster car c'est à priori une autre espèce pour laquelle nous pourrions être sollicité (études SRAS-CoV-2 ou virus de la même famille). Si nous sommes sollicités pour tester des molécules qui vont être étudiées chez d'autres espèces, nous discuterons avec le scientifique de la nécessité de définir la DMT chez cette espèce. Des animaux adultes seront utilisés si les études d’activité biologique seront réalisées chez les adultes ; des jeunes animaux ou des animaux âgés seront utilisés si les études d’activité biologique seront réalisées chez les jeunes ou les animaux âgés respectivement.

Des séances d'enregistrement quotidiennes pendant plusieurs mois, tête immobilisée, sous une restriction d'eau que le porteur dit appliquée pour le "maintien d'un état de motivation des animaux" : 7 macaques, 4 macaques à longue queue et 3 macaques rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous mis à mort à l'issue. Chacun reçoit d'abord un implant crânien, puis, après ces mois d'enregistrement par des électrodes descendues dans le cerveau pendant une tâche instrumentale, des injections de vecteurs viraux sous anesthésie générale. Le porteur écrit vouloir établir si l'inactivation de certains neurones du striatum "induit des signes compulsifs assimilables à ceux observés chez l'homme", puis analyser leur cerveau après la mort. Il juge "indispensable" d'étudier ces fonctions chez le singe pour "extrapoler aux aptitudes humaines", et choisit des macaques de 5 à 7 ans dont le crâne est "compatible" avec la fixation de la tête.

Objectifs

Nous nous intéressons aux mécanismes neuronaux qui contrôlent l’adaptation du comportement de l'organisme aux contraintes changeantes de l’environnement (flexibilité comportementale). Plus précisément, nous étudions la contribution d'une région du cerveau appelée striatum, située sous le cortex cérébral, qui est censée intervenir dans la flexibilité comportementale. L’innervation cholinergique de cette région est altérée dans des pathologies neuropsychiatriques où prédominent des signes compulsifs (tics, stéréotypies, persévérations). La libération d’acétylcholine dans le striatum est assurée par un groupe spécifique d'interneurones cholinergiques (INChs) dont le dysfonctionnement est associé à un manque de flexibilité comportementale et à la manifestation de compulsions. Ainsi, une diminution de densité en INChs est décrite dans le striatum de patients atteints du syndrome de Gilles de la Tourette et des études chez le rongeur indiquent que l'inactivation des INChs perturbe l'adaptation des animaux à des changements de contexte. Les informations traitées par le striatum sont transmises aux circuits de commande du comportement par les neurones de projection, appelés "spiny projection neurons" (SPNs) qui sont de 2 types: ceux qui influencent directement les commandes comportementales et ceux qui influencent ces mêmes commandes de façon indirecte, par le biais de structures de relais. L'adaptation comportementale résulterait de la mise en jeu coordonnée de ces 2 types de SPNs, sous contrôle des INCh. Les connaissances acquises chez le rongeur ne permettent pas de déterminer comment les INChs contrôlent les SPNs et, par suite, les messages de commande qui façonnent le comportement. Notre projet vise à (1) déterminer la connectivité entre INChs et SPNs du striatum; (2) examiner les interactions fonctionnelles entre INCHs et SPNs; (3) établir si l'inactivation sélective des INChs induit des signes compulsifs assimilables à ceux observés chez l'homme. Pour cela, nous utilisons des approches expérimentales innovantes de marquage de populations neuronales distinctes dans le striatum, d’enregistrements simultanés de ces populations neuronales et d’inactivation des INChs par un procédé de ciblage sélectif de ces interneurones par utilisation d'outils génétiques.

Bénéfices attendus

Les troubles compulsifs sont une cause majeure de handicap dans bon nombre de maladies neuropsychiatriques. A n’en pas douter, les progrès à venir dans la compréhension et le traitement de ces anomalies passeront par une meilleure connaissance des mécanismes neuronaux sous-jacents. Dans cette perspective, la piste d'une anomalie de la neuromodulation cholinergique au niveau du striatum, une région profonde du cerveau, est actuellement privilégiée. On suppose qu'un défaut du signal cholinergique perturbe les informations transmises par le striatum aux circuits de commande comportementale qui aboutirait à l'expression de conduites inadaptées. Notre projet vise à préciser les bases anatomiques et physiologiques de cette régulation. Un aspect innovant de notre projet est le développement d'une méthode d'inactivation sélective des interneurones du striatum à la source du signal cholinergique à l'aide d'outils génétiques. Cet aspect du projet offre la possibilité de créer un modèle de troubles compulsifs chez le primate non humain permettant d'appréhender précisément la signification fonctionnelle de ce signal. Cette recherche fondamentale ouvre des perspectives prometteuses pour de nouvelles thérapies chez l'homme destinées à compenser un contrôle cholinergique défaillant dans les troubles compulsifs.

Procédures

(1) chirurgie pour la pose d'un implant crânien 1 implant / animal (2) enregistrements de l'activité neuronale dans les ggb chez le singe effectuant une tâche instrumentale séances quotidiennes pendant plusieurs mois (3) injections de vecteurs viraux sous anesthésie générale 1 plan d'injection / animal

Impact sur les animaux

(1) la restriction hydrique appliquée pour le maintien d'un état de motivation des animaux (2) la contention de la tête pendant les enregistrements neuronaux (3) les risques liés à l'anesthésie générale (4) les risques liés à la chirurgie crânienne (5) les risques liés à la descente d'électrodes ou de canules d'injection dans le cerveau (6) les risques liés au maintien à long terme d'un implant crânien

Devenir

Notre projet implique une analyse post-mortem de la connectivité entre INChs et SPNs et une évaluation de l'expression d'un transgène (DREADD) dans les INChs. Chaque animal sera mis à mort à l'issue de la procédure expérimentale.

Remplacement

Nos recherches portent sur la contribution de l’innervation cholinergique du striatum dans la flexibilité comportementale. L’approche expérimentale consiste à décrire le schéma des connexions anatomiques au sein du striatum, à corréler des indices de la flexibilité comportementale à l’activité électrophysiologique et à examiner les conséquences d’une inactivation cholinergique sur le comportement. Une telle approche exclut toute alternative basée sur des modèles in vitro (tranches de tissu, cultures de cellules ou cellules dissociées) ou sur l’animal anesthésié. Les neurosciences computationnelles permettent d’élaborer des modèles utiles pour la compréhension des processus sensorimoteurs ou cognitifs. Ces modèles tirent parti des données neurophysiologiques, acquises chez l'animal comme chez l'homme, et fournissent des hypothèses de travail ou des cadres d'interprétation utiles pour guider la recherche, mais en aucun cas ils ne peuvent remplacer l'expérimentation. De plus, un modèle computationnel, aussi sophistiqué soit-il, est une approximation de la complexité neurobiologique susceptible d'être améliorée sur la base des nouvelles données acquises.

Réduction

Nous avons restreint autant que possible le nombre d'animaux impliqués dans le projet tout en restant compatible avec l'exigence d'analyses statistiques fiables. Pour cela, l'analyse électrophysiologique des interactions INChs-SPNs sera faite chez les mêmes singes qui seront ensuite utilisés pour les injections de vecteurs viraux. Pour l’électrophysiologie, l'analyse porte sur des échantillons de neurones enregistrés lors de séances quotidiennes, pendant plusieurs mois. L'analyse est d'abord faite pour chaque animal et les données sont ensuite groupées. Ce "pooling" permet d'augmenter la puissance statistique, en particulier si les échantillons de neurones disponibles pour chaque animal sont trop faibles. Nous complétons cette analyse globale par une analyse cas par cas si les performances et les données neuronales divergent trop entre les sujets. Afin de réduire le nombre d’animaux pour l’étude de la connectivité INChs-SPNs, nous réaliserons les injections de vecteurs viraux dans les 2 hémisphères cérébraux de chaque singe. Comme les projections des SPNs vers le globus pallidus sont strictement ipsilatérales, on ne risque pas d'induire de chevauchement des marquages en intervenant sur chacun des hémisphères.

Raffinement

Tout est fait pour favoriser la coopérativité de l'animal dans les expériences de conditionnement, d'enregistrement et d'inactivation pharmacogénétique. Pour diminuer le stress des animaux au début de certaines phases de la procédure expérimentale (capture, contention de la tête), on les habitue progressivement aux contraintes imposées. A l'animalerie, les animaux sont hébergés en duo ou trio, selon les affinités, dans un environnement enrichi qui inclut l'accès à une volière munie d'objets à manipuler, de perchoirs et de cordages.

Choix des espèces

L'analyse des anomalies comportementales après inactivation expérimentale chez le rongeur n'est jamais aussi détaillée que celle faite chez le singe. Les spécificités du répertoire comportemental des primates font du macaque rhésus un bon modèle pour l'expression de compulsions semblables à celles qui se manifestent chez l'homme. Une abondante littérature atteste de la similitude d’organisation des circuits qui relient le cortex préfrontal au striatum chez le macaque rhésus et l'homme. Il est donc indispensable d’étudier les supports neuronaux des fonctions de planification et de sélection de l'action chez le singe pour extrapoler aux aptitudes humaines et à leur dérèglement en pathologie. De plus, les tests comportementaux sont proches de ceux employés chez l'homme (mouvements d'atteinte de cibles avec la main) et les données électrophysiologiques recueillies à l’échelle neuronale chez le singe sont un complément précieux aux mesures plus globales de métabolisme cérébral (IRMf) chez l’homme. Nous préférons des animaux dans une tranche d'âge de 5 à 7 ans (poids 8-10 kg) dont la morphologie crânienne est compatible avec la mise en place chirurgicale de la chambre d'enregistrement et du dispositif de fixation de la tête.

Toutes mises à mort vers l'âge de 5 mois pour le prélèvement de plusieurs tissus, dont les reins, le cœur, le pancréas, le cerveau et le foie, 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles naissent d'œufs fécondés dans lesquels l'équipe microinjecte des ARN de spermatozoïdes d'hommes obèses ou non obèses, et peuvent devenir obèses et diabétiques. À 4 mois puis à 4 mois et demi, elles reçoivent une injection intrapéritonéale de glucose, puis d'insuline, suivie à chaque fois de deux heures de mesures de la glycémie sur du sang prélevé à la queue, toutes les 15 minutes la première heure. Le porteur dit ce matériel biologique "indispensable" et affirme que "seul ce modèle expérimental est disponible" pour savoir si ce mode d'hérédité vaut chez l'homme. Une souris qui perd 10 % de son poids deux semaines de suite, ou dont la glycémie reste trop basse deux heures après une injection de glucose lors du test à l'insuline, est mise à mort.

Objectifs

L'obésité pose aujourd'hui un grave problème de santé publique. Bien que cette pathologie soit étroitement associée à une mauvaise hygiène de vie, de plus en plus de données épidémiologiques et expérimentales convergent vers la même idée : nos gènes se « souviennent » de l’hygiène de vie de nos parents ou en d’autres termes un phénotype nouvellement acquis ici l’obésité peut être transmis à la descendance via la lignée germinale paternelle et/ou maternelle. Ce type d’hérédité non darwinienne est un processus nouveau mettant en jeu des mécanismes dits « épigénétiques » qui font appel à des modifications qui ne sont pas codées par la séquence nucléotidique du gène. Contrairement aux modifications génétiques, les modifications épigénétiques induites par l’environnement sont instables et ne persistent que pendant 2 ou 3 générations. Les mécanismes moléculaires impliqués dans ce type d’hérédité sont encore très mal connus. On sait néanmoins que les petits ARNs présents dans le spermatozoïde de souris rendues obèses par une alimentation riche en graisse et en sucre sont les vecteurs de cette hérédité. L'objectif principal de notre projet est de valider le rôle des ARN des spermatozoïdes dans l’hérédité épigénétique de l’obésité chez l'homme. Pour cela, des ARN de spermatozoïdes d’hommes obèses et d’hommes non-obèses seront microinjectés dans des œufs fécondés de souris. Les caractères obèse et diabétique seront analysés sur les animaux obtenus. La présente demande correspond à l’analyse phénotypique des animaux obtenus après microinjection.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider le rôle des ARN de spermatozoïdes comme vecteurs de l'information épigénétique de l'obésité et du diabète chez l'homme. Sur le plan fondamental, ce projet conduira à mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans l’hérédité de l’obésité et du diabète chez l’homme. Sur le plan clinique, cette compréhension est une étape importante pour sinon stopper au moins ralentir l’épidémie mondiale de l’obésité. Cela conduira à identifier les parents, ici les pères, susceptibles de transmettre cette maladie à leurs descendants. Dans un premier temps, ce projet apportera des arguments aux cliniciens pour intégrer les parents et les descendants de parents obèses dans des programmes de prévention. Dans un deuxième temps, ce projet permettra de valider une méthode pour enlever ces marques épigénétiques délétères (marques non stables) soit via des voies interventionnelles (amaigrissement) soit par des voies moléculaires (éliminant des molécules inductrices).

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à 3 séries de prélèvements. A l'âge de 4 mois, les souris subissent un test de tolérance au glucose (Test GTT) et à l'âge de 4mois 1/2 un test pour mesurer leur sensibiltié à l'insuline (test ITT). Pour ces 2 tests, du sang sera prélevé au niveau de la queue . La glycémie est vérifiée toutes 15min la 1ère heure et toutes les 30 min la 2ème heure. A l'âge de 5 mois, les souris seront mises à mort et un prélèvement de sang sera effectué.

Impact sur les animaux

A notre connaissance, les animaux obtenues après microinjection d'ARN de spermatozoïdes ne développent pas de pathologies graves. Même si elles peuvent devenir obèses et diabétiques, la sévérité de ces pathologies reste modérée. L' Injection Intrapéritonéale de Glucose ou d'Insuline et le prélèvement à la queue, associés aux tests GTT et ITT, induisent une douleur légère de courte durée. Le prélèvement de sang en fin de procédure induit également une douleur légère de courte durée.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de la procédure expérimentale. Cela nous permettra de prélever plusieurs tissus (reins, tissus adipeux, coeur, pancreas, prostate, cerveau, foie). Certains seront directement congelés pour des analyses moléculaires et d'autres seront fixés pour analyses histologiques. Ce matériel biologique nous est indispensable pour réaliser les analyses moléculaires nécessaires à la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans l'hérédité épigénétique de l'obésité et du diabète.

Remplacement

Notre travail porte sur la transmission paternelle de caractères nouvellement acquis chez les mammifères et plus spécifiquement l'hérédité. L’hérédité épigénétique a été étudiée sur plusieurs modèles animaux vertébrés ou non-vertébrés. En utilisant des vers, il a été ainsi montré que les ARN étaient un vecteur de l’hérédité épigénétique pour des caractères sensorielles. Le rôle des ARN des spermatozoïdes comme vecteurs connus de cette hérédité a été montré chez la souris car il n’est pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou des modèles animaux non vertébrés pour étudier le rôle des ARN dans l’hérédité épigénétique de l’obésité. C'est pourquoi nous devons utiliser ce modèle expérimental animal pour valider l'hypothèse selon laquelle les ARN des spermatozoïdes sont des vecteurs de l'hérédité chez l'homme. Seul le modèle murin peut permettre de récapituler toutes les étapes de développement embryonnaire d’un organisme multicellulaire de mammifère. A l’heure actuelle, ce type de différenciation ne peut pas être réalisé in vitro. C’est pour cela que ce modèle a été utilisé jusqu’à présent et a permis démontrer que les ARN de spermatozoïdes de souris étaient un vecteur de l’hérédité épigénétique de l’obésité. Pour savoir si cela reste vrai chez l’homme, seul ce modèle expérimental est disponible. C’est pourquoi nous avons choisi de l’utiliser. Nous avons utilisé comme approches alternatives le vers pour étudier les mécanismes moléculaires de l’hérédité épigénétique. Néanmoins même si grâce à cette approche, nous avons pu identifier des mécanismes moléculaires associés, nous ne pouvons définir si ces mécanismes sont identiques dans des modèles animaux expérimentaux comme la souris et si ces mécanismes épigénétiques s’appliquent pour des maladies métaboliques comme l’obésité et le diabète de type II. Néanmoins les différences spécifiques entre les espèces et les tissus peuvent limiter la généralisation des résultats obtenus à partir de ce modèle non vertébré. Par conséquent, il est nécessaire d'utiliser ce modèle animal vertébré, la souris, pour obtenir une vision plus complète de la complexité de l'hérédité épigénétique de l'obésité et valider l'hypothèse selon laquelle les ARN des spermatozoïdes sont des vecteurs de l'hérédité chez l'homme.

Réduction

Avant ces expériences, nous avons utilisé, parallèlement à notre modèle murin et en collaboration, un modèle non-vertébré, Caenorhabditis elegans, un petit ver transparent et non parasitaire. Ce modèle nous a permis d’étudier certains aspects des mécanismes moléculaires de cette hérédité sans avoir recours au modèle animal vertébré. D’autre part afin de calculer la taille de l’échantillon nécessaire, nous avons réalisé un calcul de puissance basé sur nos précédentes expériences, test qui permet de minimiser le nombre d’échantillons et donc d'animaux nécessaires pour valider ou non notre hypothèse de départ. Enfin, grâce à nos analyses du transcriptome d'hommes obèses, nous avons sélectionné les hommes où les variations transcriptomiques étaient les plus fortes. Ce sont ces préparations qui seront utilisées dans ces expériences pour maximiser les potentiels effets des ARN sur la descendance.

Raffinement

Dans un souci de Raffinement, voici les dispositions que nous mettrons en place pour minimiser les souffrances éventuelles et le stress qui pourraient être générées par nos expériences : • Nous nous attendons à ce que nos souris deviennent obèses. Pour éviter de les séparer lorsqu’elles vieillissent (et ainsi de respecter le maximum de souris autorisées par cage) et de les stresser inutilement (en évitant de perturber la dominance déjà établie), les souris seront regroupées par 4 dans une cage dès leur arrivée à l’animalerie. Ces animaux seront observés hebdomadairement pour pouvoir détecter d’éventuels problèmes. Si un de nos animaux est gravement blessé (bagarre ou autres), et/ou perd 10% de son poids pendant 2 semaines consécutives, cet animal sera mis à mort et répertorié. • Un intervalle d’au moins une semaine sera respecté entre chaque test GTT et ITT et limite ainsi les manipulations des animaux. • Toutes les souris seront manipulées au moins une fois par semaine • Les souris seront identifiées par punch à leur arrivée. Cette identification est définitive et ne peut pas induire d’infection. D’autre part, elle permet une identification rapide des souris lors des tests GTT et ITT et limite ainsi les manipulations des animaux. • Afin de limiter le stress lors des tests GTT et ITT, chaque souris sera identifiée par 0, 1, 2 ou 3 traits au feutre au niveau de la queue pour accélérer leur identification (feutre inodore spécial et non toxique). Le premier test (GTT) sera réalisé lorsque la souris sera âgée de 4 mois, le second test (ITT) sera réalisé une à deux semaines après. Lors des tests de GTT et ITT, la glycémie sera vérifiée toutes les 15 min (1ère heure) toutes les 30 min (2ème heure) pendant une période de 2 heures. Si lors des tests ITT, la glycémie est faible (

Choix des espèces

Notre projet porte sur la transmission paternelle de caractères nouvellement acquis sur un mammifère. Nous avons choisi d’utiliser la souris car la technique de micro-injection d’ARN dans les œufs fécondés est solidement établie dans cette espèce ce qui n’est pas le cas chez le rat seul autre modèle expérimental de mammifère largement utilisé pour étudier l’obésité et le diabète. D’autre part, au cas où nous voudrions poursuivre ce projet en étudiant l’impact de gènes spécifiques dans ce mode d’hérédité, nous pourrions utiliser ou générer des souris génétiquement modifiées invalidées pour le gène d’intérêt. Les pesées seront réalisées une fois par semaine de l’âge de 1 à 5 mois 1/2. Cela nous permettra de suivre le possible développement de l’obésité. Les tests GTT et ITT seront effectués à l'âge de 4 mois et 4mois 1⁄2 respectivement. En effet, nos résultats ainsi que ceux publiés par d'autres groupes montrent que la micro-injection d'ARNs spermatiques dérivant de souris obèses induit le diabète seulement chez les animaux adultes. Les prélèvements de sang terminal et d’organes et tissus (reins, tissus adipeux, coeur, pancreas, prostate, cerveau, foie) seront réalisés à l’âge de 5 mois 1/2. La mise à mort aura lieu 2 semaines après le dernier test pour que les souris récupèrent d’un éventuel stress et que les analyses moléculaires ne soient pas altérées.