Procédures modérées

Pour savoir si des cellules stromales issues du tissu adipeux peuvent traiter la sclérodermie systémique, 154 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement du sang, des poumons, de la rate et de la peau. Elles reçoivent des injections dans le derme cinq jours par semaine pendant quatre ou six semaines, soit jusqu'à trente, et une seule injection de ces cellules dans la veine de la queue. La bléomycine ou l'acide hypochloreux injectés peuvent provoquer des démangeaisons, parfois des plaies ou des irritations de la peau, et les souris développent une fibrose de la peau et des poumons. Le porteur affirme que cette fibrose pulmonaire n'entraîne "pas de signes de difficulté ou de souffrance respiratoires", ne mentionne aucun point limite, et prévoit seulement que des sédatifs ou des antidouleurs "pourront" être donnés si des signes de souffrance apparaissent.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer la possibilité d’utiliser des cellules stromales mésenchymateuses d'origine adipocytaire (ASCs) en clinique (traiter des patients atteints de sclérodermie systémique). Ainsi, nous évaluerons leurs effets thérapeutiques (réduction de l’inflammation et de la fibrose cutanée et /ou pulmonaire), leurs interactions avec différents types de cellules immunitaires et le(s) mécanisme(s) impliqué(s) dans leurs effets thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet sera de valider si la thérapie cellulaire de cellules stromales et en particulier d'origine adipocytaire (ASCs) est efficace pour contrer les troubles majeurs de la sclérodermie systémique que sont la fibrose cutanée et pulmonaire et, dans une moindre mesure, la production d’anticorps et d’apporter de nouvelles connaissances sur leurs effets thérapeutiques.

Procédures

Les souris seront soumises à une injection intra-dermique (5 jours/semaine) pendant 4 semaines ou pendant 6 semaines et à une seule injection intraveineuse dans la veine caudale de cellules souches stromales d'origine adipocytaire (ASCs).

Impact sur les animaux

L'injection intra-dermique de Bléomycine ou d'acide hypochloreux peut entrainer une gène (démangeaisons) dans les 2-3 minutes post-injection et aussi parfois des petites plaies ou des irritations cutanées au point d'injection. Ces souris développent une fibrose cutanée au point d'injection et une fibrose pulmonaire modérée, limitée à la région sous-pleurale qui n'entraine pas de signes de difficulté ou de souffrance respiratoires.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements de tissus et d'organes (sang, poumons, rate et peau)

Remplacement

Il est important de voir les effets thérapeutiques des cellules mésenchymateuses stromales au niveau de l’animal entier portant une maladie surtout quand celle-ci touche plusieurs tissus ou organes et qu’elle est caractérisée par une autoimmunité (présence d’auto-anticorps dans la circulation sanguine), impossible à reproduire in vitro. La souris possède de nombreuses caractéristiques physiopathologiques communes avec l’homme, indispensables à l’extrapolation des résultats.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux pour ce projet, nous testerons la tolérance des souris à l'injection des cellules souches stromales adipocytaires (ASCs) uniquement dans la procédure N°1 et sur un nombre réduit de souris c'est à dire 5 souris/groupe au lieu de 10 pour les groupes de souris malades.

Raffinement

Les procédures ont été travaillées pour limiter le stress et la souffrance des animaux. Les souris seront au maximum 5 dans des cages enrichies. Une observation quotidienne des souris sera réalisée (apparence physique, comportement), une pesée sera réalisée une fois par semaine et, si des signes de souffrance sont détectés chez les animaux, des sédatifs ou anti-douleurs adaptés (après avis du vétérinaire) pourront être leur être administré.

Choix des espèces

Parmi les rongeurs, il n'existe pas d'autres modèles de sclérodermie systémique que le modèle murin. Par ailleurs, le modèle murin est indispensable pour suivre l'apparition des effets systémiques et en particulier l'autoimmunité caractérisée par la production d'autoanticorps. Les souris seront adultes car la sclérodermie systémique est une pathologie qui affecte les adultes

Une injection intrapéritonéale par jour pendant deux jours, sous anesthésie locale, puis une anesthésie générale sans réveil attendent la moitié des 162 souris de ce projet, l'autre moitié étant seulement endormie avant d'être tuée. Toutes sont mises à mort pour des prélèvements d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'équipe veut préciser le rôle du métabolisme dans l'altération de l'immunité des patients atteints de syndrome de détresse respiratoire aiguë, une insuffisance respiratoire mortelle dans 30 à 40 % des cas. Le porteur affirme avoir choisi "le modèle le plus pertinent" parmi dix qui reproduisent ce syndrome, sans dire lequel ni ce que contiennent les injections, et ne décrit comme effets qu'une "douleur légère de courte durée" et un "léger stress".

Objectifs

Le syndrome de détresse respiratoire aigüe (SDRA) est une forme gravissime d'insuffisance respiratoire avec une mortalité élevée (30-40%) sans traitement curatif disponible. Les patients atteints de SDRA présentent une altération des réponses immunitaires qui participent à la gravité de ce syndrome et donc au taux de mortalité. Nous avons pu mettre en évidence chez ces patients que l’altération de leur réponse immunitaire pourrait être liée à des anomalies métaboliques. Nos objectifs sont donc de préciser le rôle du métabolisme dans l’altération des réponses immunitaires afin d’identifier des cibles thérapeutiques pertinentes visant à corriger ces anomalies. Ce syndrome complexe et sévère fait intervenir plusieurs types cellulaires et seule l'expérimentation animale nous permettra de retrouver l'ensemble des acteurs au sein d'un même modèle.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels le métabolisme pourrait influencer la dysimmunité dans le SDRA pourrait aider à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et/ou permettre de développer des outils pour la prise en charge et le suivi de l'évolution clinique des patients.

Procédures

La moitié des animaux (9 groupes) subira 2 interventions, chacune de très courte durée (

Impact sur les animaux

Les injections induisent une douleur légère de courte durée limitée par l'application d'un anesthésique local. La contention nécessaire pour effectuer l'injection induit un stress de courte durée. L'induction de l'anesthésie nécessite une légère contention de l'animal pour le placer dans une cage d'induction et n'induit pas de douleur hormis un léger stress de courte durée.

Devenir

Euthanasies pour prélèvement d'organes à l'issue de la procédure pour des études de biologie moléculaire.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux dans l’étude du syndrome de détresse respiratoire aigüe est nécessaire pour reproduire au mieux ce syndrome. Il n'existe à ce jour aucune méthode alternative ou substitutive qui permette un remplacement in vitro car le métabolisme et la réponse inflammatoire et immunitaire représentent des systèmes intégrés qui ne peuvent être étudiés qu’in vivo. En effet, l’utilisation d’animaux permettra d’étudier de manière simultanée les interactions de plusieurs organes et types cellulaires : d’un côté le poumon, en particulier les cellules endothéliales pulmonaires, le parenchyme pulmonaire, les cellules immunes résidentes au niveau du poumon; de l’autre côté, les facteurs circulants, les médiateurs inflammatoires, les adipokines, les hormones et les cellules immunes circulantes ; enfin, le tissu adipeux.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en utilisant un test statistique de puissance qui permet de garantir l’observation de résultats exploitables. Grâce à ce test, nous obtenons n = 7 animaux par groupe.

Raffinement

Les souris bénéficieront d'un enrichissement de milieu avec du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois, raffinant ainsi leurs conditions de vie. Ces animaux ne seront jamais hébergés seuls dans des cages séparées et feront l'objet d'une période d'adaptation d'une semaine après leur arrivée avant de débuter une procédure. Les injections seront précédées d'une anesthésie locale afin de diminuer au maximum la douleur pouvant être engendrée. Pour la réalisation de la procédure, des points limites précoces ont été établis au moyen d'un score et seront appliqués si nécessaire, comme défini dans la description de la procédure. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de veiller à leur bien-être.

Choix des espèces

En ce qui concerne le modèle, nous avons choisi avec attention le modèle le plus pertinent pour notre projet parmi les 10 modèles qui miment le syndrome de détresse respiratoire aigu chez l’Homme. En ce qui concerne l’espèce, nous avons choisi la souris car nous prévoyons d’utiliser des animaux transgéniques. Afin que nos résultats soient comparés aux travaux de la littérature dans ce domaine, des souris âgées de 5 semaines et pesant 20 grammes chacune seront utilisées.

52 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'anticorps humains anti-contactine 1, des prélèvements de sang et d'urine et un isolement de quatre heures pour la collecte d'urine, avant prélèvement des reins et des nerfs, pour reproduire une maladie rénale auto-immune. Le porteur indique que les injections peuvent déclencher une atteinte rénale ou neurologique mimant la maladie humaine. Il justifie le choix du hamster par le fait qu'il exprime la contactine dans le rein, à la différence des souris, rats, lapins et cobayes testés, et qu'il est plus facile à élever que le porc.

Objectifs

La polyneuropathie démyélinisante chronique (PIDC) est une maladie auto-immune du système nerveux. Plusieurs cibles de ces anticorps dirigés contre soi ont été découvertes, parmi lesquelles des protéines présentes sur les neurones comme la contactine 1. La survenue concomitante chez certains patients d’une PIDC et d'une maladie auto-immune du rein (GEM : glomérulopathie extramembraneuse), dont l’évolution clinique est variable et peut aller jusqu’à la perte totale de la fonction rénale, est connue de longue date. Ces deux maladies concomitantes ont souvent été décrites mais leur lien n'a jamais été établi dans la bibliographie. Ainsi, la contactine 1 a été identifiée dans des petits amas de vaisseaux sanguins participant à la filtration rénale, puis la présence simultanée des anticorps anti-contactine dans le nerf et dans le rein a été mise en évidence. L’objectif principal de ce projet est de confirmer dans un modèle hamster l'implication des anticorps anti-contactine 1 dans cette maladie rénale via la reproduction de la maladie chez le Hamster mais aussi, à analyser les dysfonctionnements aux niveaux clinique et tissulaire provoqués par les anticorps anti-contactine humains afin de mieux connaitre cette maladie pour pouvoir ensuite adapter le diagnostic et les traitements de cette maladie chez l'homme.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de confirmer l'implication des anticorps anti-contactine et leur lien avec le développement d’une atteinte rénale induisant des modifications biochimiques et histologiques. Ce travail de recherche ouvrira de nouvelles perspectives thérapeutiques dans la prise en charge de la glomérulopathie extramembraneuse ainsi que dans le développement de tests de dépistage et d’évaluation de la maladie si le rôle pathogène des anticorps est confirmé et si leur concentration a une valeur pronostique.

Procédures

Les animaux seront impliqués dans deux procédures distinctes de sévérité modérée qui se dérouleront en plusieurs étapes et sur une durée de 11 jours pour la première procédure et 11 semaines pour la seconde. Concernant la première procédure, une injection d'anticorps dans la circulation sanguine des animaux aura lieu au tout début de l'expérimentation. Des prélèvements sanguin et urinaire auront lieu 3 fois sur la durée des 11 jours d'expérimentation afin de suivre la fonction rénale des animaux. Concernant la seconde procédure, 4 injections d'anticorps sont prévu sur une durée totale d'expérimentation de 11 semaines. Des prélèvements sanguins et urinaires seront réalisés en moyenne deux fois par semaine. Pour les prélèvement urinaires, les animaux seront isolés en moyenne deux fois par semaines pendant 4 heures afin de prélever leurs urines, cela pouvant provoquer du stress et de l'angoisse chez les animaux. Les animaux seront systématiquement anesthésiés avant chaque intervention afin de diminuer leur angoisse et leurs stress. Les injections et prélèvements réalisés ne dureront pas plus de 10 min. Au bout des 11 jours pour la première procédure ou 11 semaines pour la seconde, ou si les animaux montrent des signes de souffrance, les reins et nerfs seront prélevés dans le but d'étudier l'impact que les anticorps ont eu sur les hamsters. Ces prélèvement seront réalisés sous anesthésie et juste avant l'euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Ppour les prélèvements sanguins les animaux seront anesthésiés donc ils auront un leger stress du à l'injection IP d'anesthésique. Pour les Hamsters ayant reçu des injections d'anticorps anti-contactine1, des nuisances liées à l'apparition d'une maladie rénale et/ou neurologique qui mime la pathologie humaine, peuvent apparaitre.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure puisque leurs organes sont nécessaires à l'étude de la pathogénicité des anticorps anti-contactine1.

Remplacement

L’objectif principal de cette étude est de démontrer que l’injection des anticorps anti-contactine1 humains induit chez le Hamster des altérations neurologiques et de la fonction des reins similaires à celles observées chez l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif.

Réduction

52 animaux seront utilisés pendant 1 an pour cette étude. Le modèle hamster visant à recréer une maladie auto-immune rénale avec des injections d’anti-contactine1 étant unique, il est difficile de prévoir le juste nombre d’animaux nécessaire à cette étude. Le nombre d’animaux a été réduit en veillant toutefois à travailler sur un nombre suffisant pour obtenir une différence statistiquement significative entre les groupes en cas de comparaison. Ainsi, le nombre d’animaux par groupe a été fixé à 4 pour l'étude préliminaire visant à visant à confirmer que les immunoglobulines humaines contenant l’anticorps anti-contactine pourront se fixer sur les reins des hamsters et induire des dépôts immuns. Il y a deux groupe d'animaux pour cette analyse soit 8 animaux. Concernant la seconde partie de l'étude, si l'étude préliminaire est concluante, 4 animaux par groupe seront nécessaires, avec également deux groupes d'animaux, afin de déterminer les doses adéquate d'anticorps à injecter aux animaux. Enfin, 36 animaux seront nécessaire pour l'étude principale qui vise à induire la maladie cliniquement et à évaluer l’atteinte rénale. Les 36 animaux seront réparties dans 3 groupes de 12 animaux qui recevront des injections d'anticorps issues de patients ayant des pathologies nephrotiques et/ou neurologiques différentes.

Raffinement

Nous attachons une importance majeure sur les conditions d’hébergement et la qualité de vie des animaux. C’est pourquoi, une période d'acclimatation d'une semaine sera mise en place à l’arrivée des animaux. Ils seront hébergés en groupe afin de limiter leur stress. Pour les phases d'injections de substances et de prélèvements, une anesthésie sera réalisée afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal. Lors des quelques gestes possiblement douloureux, un antidouleur sera administré à l’animal. Dans le but de préserver le bien-être des animaux, nous avons prévu de mettre en place des critères d’interruption des interventions expérimentales basées sur des paramètres mesurables non invasifs.

Choix des espèces

Nous avons préalablement recherché in vitro la contactine dans les reins des animaux utilisés en routine dans les animaleries souris, rats, lapins et cochons d’Inde mais aucun d’entre eux n’exprime la contactine dans le rein. Seul le Hamster et le porc expriment cette protéine dans leur reins. Notre choix s'est ensuite porté sur le modèle Hamster car plus facile à élever. Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 10-14 semaines, pour des raisons techniques (poids entre 100-120g), permettant des groupes homogènes.

268 bars européens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée pour analyse et l'autre gardée vivante pour produire des gamètes. Au stade larvaire, ils reçoivent une injection de cellules souches germinales d'anguille européenne et, pour certains, une puce d'identification sous anesthésie, afin de tester le bar comme parent de substitution de l'anguille. Le porteur indique que les larves ne récupérant pas une nage normale dans les cinq minutes sont tuées par surdose d'anesthésique. Il présente l'anguille comme un "produit à haute valeur ajoutée" et affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" non animale, le bar étant lui-même le sujet de l'étude.

Objectifs

Ce projet étudie la possibilité d'utiliser des bars européens comme parent de substitution d'anguilles européenne afin de pallier à l'infertilité des anguilles maintenues en captivité.

Bénéfices attendus

L'anguille européenne est considérée comme un produit à haute valeur ajoutée sur les marchés européens et asiatiques, ce qui en fait une cible pour la pêche et l'aquaculture. Cependant, elle ne peut pas atteindre la maturité sexuelle normalement en captivité, et sa production est basée sur la capture de juvéniles (civelles) et leur engraissement ultérieur. La population d'anguilles européennes étant en grave déclin, la reproduction en captivité semble être la seule alternative réaliste pour réduire la pression sur les populations naturelles. Le développement de la technologie des géniteurs de substitution par la transplantation de celulles souches germinales permettra de produire les gamètes d'anguille nécessaires au développement de l'aquaculture de l'anguille et à la diminution des captures de juvéniles dans le milieu naturel.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule injection au stade larvaire pour injecter les cellules souches germinales. L'injection de cellules souches germinales ne dure pas plus de 20 secondes. Une partie de ces animaux sera marquée avec une puce électronique intramusculaire pour une identification individuelle. Ce marquage qui ne prend que quelques secondes, est réalisé sous anesthésie.

Impact sur les animaux

L'injection des larves est équivalente à une piqûre. Le marquage des poissons est équivalent à une piqûre. Pour chacun de ces gestes, l'anesthésie ne durera pas plus de 5 min.

Devenir

Une partie des animaux seront euthanasiés pour réaliser le suivi de la colonisation des cellules souches d'anguilles. Le reste sera gardés en vie pour produire des gamètes.

Remplacement

Il n’y a pas d’alternatives non animales disponibles pour cette expérimentation. Le bar est le sujet de l’étude. Il s'agit dans cette étude de tester le bar européen comme receveur de cellules souches germinales d'anguilles.

Réduction

Comme nous connaissons le taux de survie des bars après micro-injection, le nombre d'animaux utilisés sera le minimum possible afin d’assurer une puissance nécessaire des résultats des échantillonnages. Pour cette expérimentation, 2 lots de 134 poissons (soit 268 poissons) seront injectés afin d'obtenir entre 15 et 20 poissons greffés par lots. La survie à l'élevage larvaire peut être estimée à 85% et le taux de réussite de greffe est de 15% donc 134 poissons injectés x 0.85 de survie x 0.15 de succès de greffe = 17 poissons réellement greffés. Aux 268 poissons injectés, il faut ajouter 132 poissons-témoins ne subissant aucune procédure. Le total des poissons utilisés est 268 poissons injectés +132 poissons-témoins. Il s'agit d'une recherche descriptive du phénomène de colonisation des gonades du receveur par les cellules souches du poisson-donneur. Il ne sera donc pas réalisé de test statistique sur cette expérimentation. Le nombre de 15 poissons greffés a été choisi en accord avec le nombre d'invididus généralement étudiés pour ce type de recherche dans la littérature.

Raffinement

Pour favoriser le rétablissement des larves micro-injectées, celles-ci sont maintenues dans de l’eau iso-osmotique stérile et gardées sous une surveillance accrue pendant les 4 heures suivant l’injection. En dehors des procédures, les animaux seront maintenus dans des conditions d’élevage optimales pour leur espèce. Les poissons sont manipulés sous anesthésie pendant moins de 5 minutes. Suite à cette anesthésie, les poissons sont réveillés dans de l'eau de mer. Le point limite suivant sera observé après les phases d'injection des cellules souches germinales et de marquage: tous les animaux ne récupérant pas une nage normale dans les 5 minutes après ces actes seront euthanasiés par une surdose d'anesthésie précédée d'une anesthésie.

Choix des espèces

Le bar est une espèce dont l'élevage est maitrisé, et pour laquelle la technique de transplantation des cellules souches germinales a été mise au point. Les larves de bars utilisées seront âgées de 60 jours. Les larves âgées de 60 jours pèsent 15 mg, poids requis pour permettre leur manipulation. Leur jeune âge permet d'avoir 15% de succès de greffe, car leur système immunitaire n'est pas complètement mis en place ce qui évite le rejet de la greffe.

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent un régime gras de trois à six mois jusqu'à l'obésité, puis subissent une chirurgie abdominale de quatre-vingt-dix minutes avec pincement du pédicule du foie et des prélèvements de sang, pour mettre au point un modèle d'ischémie-reperfusion sur foie stéatosé. Le porteur indique que le régime réduit la mobilité et que la chirurgie provoque une perte de poids et une défaillance du foie plus ou moins transitoire. Sur le remplacement, il affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas un foie vascularisé et juge le recours à l'animal nécessaire.

Objectifs

La transplantation d’organe solide constitue le traitement curatif de choix des patients présentant des défaillances d’organe à un stade terminal. Malheureusement, les besoins augmentent plus vite que les organes disponibles et entraînent des pénuries de greffon, ce qui engendre des listes d’attente importantes. L’une des stratégies envisagées est l’élargissement des prélèvements chez des donneurs présentant des facteurs de comorbidité (association de plusieurs maladies) ; notamment des foies stéatosés atteints de stéato-hépatite non alcoolique (NASH), caractérisés par l’apparition de dépôts graisseux liée à un régime alimentaire trop riche en sucre et en graisse. Lors de la transplantation, des phénomènes liés à l’ischémie (défaut d’apport en nutriments et en oxygène) et aussi à la reperfusion (reprise du flux sanguin de l’organe chez le receveur) sont à l’origine de processus physiopathologiques qui vont contribuer aux lésions irréversibles du greffon. Dans le cas de la greffe de foie, la séquence d’ischémie-reperfusion peut entraîner des lésions sévères, à l’origine de dysfonctions du greffon et potentiellement du rejet de l'organe à plus ou moins long terme. L’utilisation de foies stéatosés pour augmenter le nombre d’organes transplantables doit être rigoureusement étudiée étant donné que les conséquences de la stéatose sur la qualité de la transplantation continuent à faire débat. Afin de répondre aux attentes cliniques, notre objectif est de mettre au point un modèle murin d’ischémie-reperfusion hépatique chez des souris atteintes de stéatose (obésité nutritionnelle) afin d’étudier les effets combinés de la stéatose et des lésions d’ischémie reperfusion. La première étape sera de définir les points limites de ce modèle en testant différentes durées de régime et de temps de reperfusion tout en évaluant l’impact sur les lésions d’ischémie-reperfusion hépatiques et la nuisance pour les animaux. La validation de ce modèle permettra ensuite d’établir la durée optimale de régime et de temps de reperfusion afin d’identifier les mécanismes immunitaires et métaboliques mis en jeu après ischémie-reperfusion d’un foie stéatosé et ainsi définir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir les effets de l’ischémie-reperfusion en transplantation de foies stéatosés chez l’homme.

Bénéfices attendus

A court terme, la mise en place de ce modèle permettra d’étudier in vivo les effets combinés de la stéatose et d’une ischémie-reperfusion sur les fonctions hépatiques, ce qui n’est pas possible chez l’homme. A moyen terme, après la validation de ce modèle, nous pourrons identifier les mécanismes immunitaires et métaboliques mis en jeu après ischémie-reperfusion d’un foie stéatosé et ainsi définir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour minimiser les lésions d’ischémie-reperfusion et améliorer la reprise de fonction. A long terme, ce projet vise à augmenter le pool de greffons disponibles à la transplantation chez l’homme.

Procédures

Régime riche en graisses et sucres durant 3 à 6 mois pour 144 souris. Pesée 1 fois par semaine pendant la durée du régime pour 288 souris (10s). Un jeûne de 4h avant tous les prélèvements sanguins. Prélèvements sanguins (8 maximum pour 32 animaux sinon entre 4 et 7 prélèvements pour 256 souris) sous anesthésie gazeuse d’une durée de 30s par prélèvement. Une procédure chirurgicale abdominale sous anesthésie gazeuse AVEC pincement du pédicule hépatique (durée de l'intervention : 90 min) pour 96 souris. Une procédure chirurgicale abdominale sous anesthésie gazeuse SANS pincement du pédicule hépatique (durée de l'intervention : 90 min) pour 96 souris.

Impact sur les animaux

Les animaux suivront un régime riche en sucres et graisses pendant 3, 4 ou 6 mois. Ce régime conduira à la prise de poids progressive des animaux tout au long du régime jusqu’à atteindre l’obésité. Les animaux obèses seront un peu moins mobiles mais sans conséquence sur l’accès à leur alimentation et eau de boisson et leur bien-être général. L’acte de pesée sur animal vigile pourra induire un léger stress très transitoire. Suite à l’anesthésie générale, l’effet attendu est un léger inconfort au réveil. Après la chirurgie abdominale, un stress transitoire peu intense, une mobilité réduite de quelques heures (due aux sutures abdominales) peuvent être observés. En post-opératoire, une perte de poids de quelques heures jusqu’à sept jours après la chirurgie pour les animaux obèses qui reprennent un régime normal peut également nuire à l’animal. L’autre effet indésirable attendu est une défaillance plus ou moins transitoire de la fonction hépatique dont l’impact principal sera la perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. Des prélèvements d’organes et tissus, incompatibles avec le maintien en vie des animaux, seront réalisés afin d’effectuer des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques.

Remplacement

Un modèle in vitro de cellules hépatiques stéatosées réalisé au laboratoire nous permet d’avoir une première approche des mécanismes mis en jeu au niveau cellulaire. A ce jour, il existe des modèles in silico ou in vitro permettant de recréer un foie, cependant ces modèles sont très limités et ne permettent pas de reproduire la physiologie hépatique notamment associée à une modulation du métabolisme d’un foie vascularisé. En effet, les méthodes d’études in vitro ou in silico sont très limitées pour étudier l’ischémie-reperfusion hépatique car quatre éléments très importants sont absents dans les modèles in vitro ou in silico : 1) la complexité des populations cellulaires du foie, 2) l’architecture hépatique, qui organise les relations entre ces populations cellulaires, 3) la vascularisation, qui permet la circulation des cellules immunitaires et des molécules entre différentes zones 4) ainsi que les interactions avec les autres organes. Il est donc nécessaire d’évaluer de manière intégrative et systémique la mise en jeu des éléments immunitaires et métaboliques dans les lésions d’ischémie-reperfusion en utilisant un modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux requis pour les analyses statistiques de la procédure découle d’une part d’un compromis entre les questions de minimisation et d’autre part d’un calcul de puissance pour définir le nombre d’animaux par groupe suffisant pour détecter des différences statistiques biologiques intra-groupes et intergroupes. Un total de 288 animaux maximum sera nécessaire pour la réalisation de ce projet de 5 ans. Les tissus prélevés chez les animaux seront placés dans une banque d’organes/tissus murins afin de mutualiser les échantillons.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (grille de suivi individuel), les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (enrichissement du milieu, hébergement en groupe). La répartition des souris en surpoids sera prise en compte pour le bien-être animal. Des points limites gradés avec un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de la souffrance seront mis en place à chaque étape de la procédure en pré-, per- et post- opératoire avec des grilles de score. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale et locale en asepsie stricte. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées en asepsie stricte, sous anesthésie générale, et les animaux bénéficieront d’une analgésie adaptée en pré, per et post opératoire. De plus, elles seront réalisées par un personnel compétent et expérimenté, permettant ainsi de réduire l’angoisse des animaux et de contribuer à leur bien-être.

Choix des espèces

Le choix porté sur la souris repose sur les critères principaux suivants : 1) Le modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris reflète les lésions physiopathologiques observées chez l’homme. Ce modèle est utilisé dans la littérature pour répondre à des questions pathologiques humaines. 2) Le modèle de régime obésogène et le modèle d’ischémie-reperfusion hépatique chez la souris, sont validés et adaptés pour répondre aux objectifs du projet. 3) La disponibilité dans cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques (cytokines, protéines recombinantes, anticorps de détection). Les animaux seront âgés de 6 semaines au démarrage des régimes. Il est important de démarrer les régimes de façon précoce pour une meilleure installation de la pathologie. Les chirurgies pour ischémie-reperfusion seront réalisées sur animaux adultes à maturité (3 à 6 mois après démarrage des régimes).

1 800 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent deux chirurgies cérébrales pour l'injection de virus et l'implantation d'une lentille d'imagerie, une consommation forcée d'alcool sur plusieurs semaines et une tâche d'auto-administration, pour étudier les circuits cérébraux de l'addiction. Le porteur indique que les rats ne développant pas de consommation excessive ou échouant à la tâche sont euthanasiés en cours de route, ce qui explique le grand nombre d'animaux engagés. Sur le remplacement, il affirme que ces effets ne peuvent être étudiés sur modèles cellulaires et que seuls des rats modifiés permettent de cibler les neurones visés.

Objectifs

L’alcoolo-dépendance est une maladie chronique et hautement récidivante en dépit des thérapies existantes puisque 70% des patients rechutent après 12 mois de prise en charge (plus de 90% après 4 ans). Le trouble de l’usage d’alcool (TUA) et toutes les conséquences liées à la consommation d'alcool représentent une charge importante pour la santé publique et les économies du monde entier, notamment en France et particulièrement dans notre région. À l'instar des autres dépendances aux drogues, le TUA est défini comme un syndrome pathologique caractérisé par une perte de contrôle et des envies incontrôlables (« craving »), la persistance de la consommation en dépit des conséquences (usage compulsif), un mal-être et des symptômes physiques à l’arrêt de la consommation (sevrage) et des rechutes qui peuvent survenir même après des années d'abstinence. C’est une maladie grave, complexe, fréquente et hautement invalidante qui est dévastatrice non seulement pour l’individu mais aussi pour l’entourage et la société. Pour identifier les cibles thérapeutiques qui amélioreront les options de traitement disponibles pour le TUA, il y a donc un besoin critique de comprendre les mécanismes neurobiologiques qui sous-tendent l'apparition, le maintien et la rechute de cette addiction à d'alcool.

Bénéfices attendus

Sur le plan scientifique, les données du présent projet offrent non seulement une meilleure compréhension des mécanismes neurobiologiques à la base de l’addiction à l’alcool, mais aussi ouvrent des possibilités en termes de nouveaux traitements cellulaires et génétiques de cette maladie. Ce projet scientifique est très ambitieux et très original car il va combiner des techniques de pointes avec l’utilisation des modèles animaux validés pour évaluer le développement d’addiction à l’alcool. Vu la pertinence et l’innovation du projet, les retombées seront importantes en termes de mise en place de techniques originales in vivo, chez l’animal vigile, ce qui n’est pas courant et mérite donc d’être souligné. Les résultats permettront aussi d’avoir des données en fonction du sexe, ce qui est important à l’heure actuelle car ce facteur est assez peu étudié dans les recherches du domaine. Le protocole est aussi original, dans le sens ou l’approche longitudinale va nous permettre d’obtenir des données aux différentes étapes des processus impliqués dans l’addiction et nous serons donc en mesure de proposer des interventions dans le champ de la prévention, avec l’idée d’intervenir précocement. Nous serons en mesure d’identifier des mécanismes dans des voies neuronales spécifiques et dans des types de neurones spécifiques et de démontrer que leur modulation permet de jouer sur la consommation d’alcool et sur certains critères de l’addiction. Cela avancera notre compréhension de comment les structures du circuit de récompense, impliquées dans l’évaluation de la récompense et le control cognitifs (système top-down), sont modifiées suite à l’exposition à l’alcool et comment ces régions cérébrales sont impliquées dans les comportements liés à l’addiction à l’alcool.

Procédures

Les animaux vont subir deux chirurgies espacées de 3 semaines dans le but d'injecter un virus dans différentes structures cérébrales en premier lieu, d'implanter une lentille d'imagerie et de placer une base crânienne d'un miniscope en deuxième lieu. La première chirurgie durera environ 30 minutes, tandis que la deuxième prendra environ une heure. Des prélèvements de sang pour évaluer l'alcoolémie seront réalisés à la lors des différentes étapes de la procédure 1 (début et à la fin de la procédure de la consommation volontaire et à la fin de l'apprentissage opérant d'alcool) et 2 (expériences visant à tester la compulsivité et de la rechute). Nous prévoyons de prélever entre 150 et 200 μL de sang veineux à chaque prélèvement, en respectant un intervalle d'au moins 2 semaines entre chaque prélèvement. Les rats seront anesthésiés pendant le prélèvement, ce qui prendra moins de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Ces expériences doivent être réalisées avec des animaux placés individuellement dans des cages, ce qui peut entraîner un stress social chez notre modèle animal. D'expérience, les étapes de consommation volontaire d'alcool ne conduisent à aucune souffrance ou douleur chez nos animaux. Les phases qui vont faire subir aux rats une certaine douleur sont les procédures chirurgicales visant à injecter les vecteurs viraux et à implanter des lentilles intracrâniennes.

Devenir

Pour induire une forte consommation d'alcool chez les rats, une première étape de consommation volontaire intermittente est réalisée pendant environ 8 semaines. Les rats ont accès à deux bouteilles pendant 24 heures : une contenant de l'alcool à 20% v/v et une contenant de l'eau. Certains rats développent une consommation excessive d'alcool après environ 10 à 12 sessions, tandis que d'autres ne le font pas. Ceux qui ne développent pas une consommation excessive d'alcool sont euthanasiés, et des échantillons de tissus tels que le foie ou le cerveau peuvent être prélevés sur ces animaux pour des tests ultérieurs. Les rats qui réussissent la tâche d'auto-administration opérante d'alcool sont sélectionnés pour les chirurgies. Ceux qui ne parviennent pas à acquérir cette compétence sont également euthanasiés eet des échantillons de tissus peuvent être prélevés sur eux. À la fin de l'étude, les animaux tous les animaux seront anesthésiés.

Remplacement

Les conséquences de l’exposition répétée à l’alcool sur le circuit de la récompense ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires, qui par nature ne récapitulent pas la complexité de l’organisation cérébrale en réseaux neuronaux complexes. L’étude de ces effets nécessite donc l’analyse d’organismes vivants et entiers. De plus nous utiliserons des rats génétiquement modifiés permettant de cibler spécifiquement les différentes population neuronale dans nos régions d’intérêt dans le cadre de ce projet, ces modèles n’existent que chez Le rongeur.

Réduction

Pour les tests comportementaux, nous identifions le minimum d’animaux nécessaires pour un résultat statistiquement significatif, qui est déterminé en utilisant une « power analysis » basée sur nos résultats précédents, et un n = 30/groupe est généralement suffisant. Il est donc nécessaire de commencer avec un grand nombre d'animaux dans nos groupes. Si nous avons initialement 30 rats par groupe, nous perdrons ensuite environ 15 à 20 % des rats après la première étape d'acquisition de consommation volontaire excessive d'alcool, puis encore 15 à 20 % à la seconde étape d'acquisition de tâche opérante. Cela nous amènera à avoir une vingtaine de rats par groupe avant les tests de compulsivité. Théoriquement, nous aurons au maximum 5 à 6 rats qui développeront un comportement compulsif. Cela représente le nombre minimum nécessaire pour effectuer des tests statistiques. A noter donc qu’il est des fois nécessaires de répéter chaque expérience sur deux cohortes indépendantes, si le nombre de rats compulsif est inférieur à 5. Ces études se feront de manière longitudinale, afin de tester plusieurs paramètres (la consommation du type «binge »; perte de contrôle ; motivation ; consommation compulsive ; abstinence et rechute) chez le même animal afin de réduire au maximum le nombre de rats utilisés. Par ailleurs, les animaux sont surveillés quotidiennement.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les rats sont hébergées en groupe sociaux de 2 animaux par cage (Sauf besoin expérimental), et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger et des papiers absorbants pour faire un nid. Enfin, les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie (anesthésique profond et un anesthésique local autour du site de chirurgie) et les animaux recevront un traitement antidouleur. La température corporelle de l’animal sera maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté jusqu’au complet réveil de l’animal. Les animaux seront ensuite suivis et la souffrance sera évaluée. En plus des points limites spécifiques à chaque procédure, nous utiliserons une grille d’évaluation jusqu’à la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus couramment utilisé dans les études d’auto-administration opérante d’alcool de part ses capacités d’apprentissage de la tâche opérante mais également pour son attrait naturel pour l’alcool. Les rats adultes seront agés de 8 semaines à leur arrivée au laboratoire pour une utilisation allant de quelques semaines à plusieurs mois.

186 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte de la capsaïcine pour provoquer une hypersensibilité douloureuse, puis on leur administre des composés par voie intrathécale et sous-cutanée sous anesthésie, avec des tests répétés de mesure de la douleur, pour améliorer un candidat médicament antidouleur. Le porteur indique qu'il lui est impossible de soulager la douleur de ces animaux pendant l'expérience, puisque c'est précisément l'objet de l'étude. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe et que l'intégration de la douleur impose des études sur l'animal vivant.

Objectifs

Parmi une série de composés chimiques synthétisés par le laboratoire, nous avons identifié une molécule ayant un effet anti-allodynique à la fois très puissant et prolongé sur des modèles murins d’allodynie mécanique inflammatoire comme neuropathique. Nous voulons améliorer cet effet anti-allodynique via l’optimisation de la formule chimique du composé, pour ensuite comparer l’effet thérapeutique des nouveaux composés à notre référence. Ce projet vise a répondre à deux questions : 1. Détermination de l'effet dose du composé de référence sur l'hypersensibilité mécanique d'origine inflammatoire induite par la capsaïcine. 2. Les nouveaux composés ont-ils un effet sur l'hypersensibilité mécanique d'origine inflammatoire induite par la capsaïcine ?

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de déterminer si l'amélioration du composé améliore son effet anti-allodynique, afin d'en faire un candidat médicament pour traiter l'allodynie.

Procédures

Toutes les injections intrathécales (1 par animal d'environ 3min) et sous-cutanées (1 par animal d'environ 2min) seront pratiquées sous anesthésie générale. Les tests de mesure de la douleur en comportement sont réalisés 7 fois en 1h30.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse. Cependant, puisque nous travaillons sur la douleur, il nous est impossible de soulager la douleur de ces animaux le temps de l’expérience. Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels. Une grille de score est mise en place afin d'évaluer le bien être des animaux au quotidien suite aux injections intratéchales et sous cutanées. Les résultats préliminaires obtenus au laboratoire ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort car ils ne peuvent pas être utiliser dans d'autres procédures.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après injection de produit inflammatoire.

Réduction

Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif. Les données sont traitées selon les données de la littérature. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. D’abord, un test de significativité sera réalisé afin de déterminer si les données suivent une distribution normale, puis un test d’égalité des variances avant de confronter les valeurs avec un test paramétrique. Dans le cas où le test de normalité soit significatif ou les variances ne puissent pas être considérées égales, nous allons donc utiliser des tests non paramétriques. La significativité sera définie pour une valeur de p≤0,05.

Raffinement

Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. Pour les injections, systémiques, locales ou sous-cutanées, les rats sont préalablement anesthésiés. L’anesthésie adéquate des animaux est confirmée par l’absence de réflexe de retrait de la patte en réponse à un pincement de la patte postérieure. De plus, en cas d’injection d’un produit inflammatoire , le suivi post-opératoire, avec un examen minutieux de la zone d’injection, est poursuivi dans les jours suivants. L'état général de l'animal est surveillé tous les jours avec contrôle du poids. Les points limites des animaux sont identifées par une liste définie.

Choix des espèces

La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années. C’est par ailleurs un bon modèle pour les études comportementales. Les animaux utilisés seront des rats adultes, par comparaison avec les autres données de la littérature.

1 032 souris et 600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit une parodontite par ligature ou injections répétées dans la gencive, certains subissant une chirurgie stéréotaxique avec injections intracérébrales, un hébergement isolé en cage métabolique et des prélèvements de sang et de liquide céphalorachidien, pour tester le lien entre infection buccale et maladies neurodégénératives. Le porteur indique n'attendre qu'un inconfort léger et des saignements gingivaux, sans effet secondaire notable. Sur le remplacement, il affirme que l'usage d'animaux vivants revêt un caractère de "stricte nécessité" et que ces évaluations ne peuvent se faire sans modèle animal.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives regroupent un ensemble de pathologies affectant le système nerveux, dont la plus prévalente est la maladie d’Alzheimer (MA) faisant partie des tauopathies. Dans les tauopathies, la protéine Tau est hyperphosphorylée et présente un repliement anormal, provoquant une perte de sa fonction physiologique et un gain de fonction toxique. La protéine Tau anormale est délocalisée vers le soma puis les dendrites où elle s’accumule, générant une dysfonction synaptique. Ces dernières années, est apparue l’hypothèse qu’une inflammation, progressive et auto-entretenue, du système nerveux central (SNC), peut constituer un terrain favorable à une neurodégénérescence. Les infections périphériques, en agissant sur les processus neuro-inflammatoires, contribueraient au déclenchement et/ou à l’évolution péjorative de ces pathologies. Les parodontites, pathologies buccales infectieuses figurant parmi les affections humaines les plus fréquentes, sont caractérisées par des lésions inflammatoires chroniques des tissus de soutien des dents. Elles sont reconnues comme associées à la progression négatives de diverses pathologies systémiques dont les pathologies neurodégénératives. Cependant le schéma spatio-temporel pouvant lier tauopathies et pathologie infectieuse/inflammatoire périphérique comme la parodontite est encore mal connu. Dans ce contexte général, notre projet vise a investiguer de manière large le schéma spatio-temporel liant infections et inflammation périphériques, neuroinflammation et tauopathie pour mieux définir dans quelle mesure l’immunité innée/adaptative dans le système nerveux central (SNC) mais également les processus immunitaires périphériques sont impliqués dans le développement de la tauopathie. Notre hypothèse est que les infections et/ou inflammations périphériques aggravent voire induisent les signes biologiques et cliniques des tauopathies.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l’obtention de données satisfaisantes permettant : - D’identifier les conséquences d’une infection périphérique buccale ou d’une inflammation systémique sur l’initiation ou la progression des tauopathies. - D’élucider des voies mécanistiques liant les tauopathies et les parodontites afin de mettre en évidence des cibles thérapeutiques ou des marqueurs diagnostiques. En effet, l’induction d’une parodontite expérimentale sur un terrain avéré de prédisposition à une pathologie neurodégénérative permettra de vérifier le rôle potentiel de la parodontite dans l’exacerbation, l’entretien voire le déclenchement de la neuroinflammation et de la neurodégénérescence chez un individu susceptible. Si la parodontite est un facteur aggravant les tauopathies, alors cliniquement les patients atteints de tauopathies devraient bénéficier d’un examen parodontal et d’une prise en charge parodontale en cas de pathologie détectée. Les données que nous obtiendrons avec ce projet sont importantes pour améliorer à moyen terme la prise en charge globale des patients atteints de tauopathies dont la maladie d’Alzheimer et à long terme la santé orale de ces patients. D’autre part, l’induction d’une parodontite expérimentale chez un animal sans prédisposition permettra de vérifier le rôle potentiel de la parodontite dans l’induction de la neuroinflammation et de la neurodégénérescence. Si ce rôle est vérifié, alors cliniquement les patients atteints de parodontite pourrait faire l’objet de dépistage de troubles cognitifs de manière préventive. Il serait alors interessant de pousser la recherche vers des études cliniques en fonction des stades et grades de la parodontite pour déterminer si une catégorie de patient atteint de parodontite serait plus à risque (parodontite sévère de stade III ou IV, à progression rapide grade C par exemple). Compte tenu de la charge mondiale des troubles du déclin cognitif due aux changements démographiques, la recherche et l’identification de facteurs de risque potentiellement modifiables de tauopathies comme proposé dans notre projet fait partie intégrante des efforts de recherche multidisciplinaires. De plus, l’emploi de différents modèles dans notre projet, devrait permettre d’identifier le modèle le plus optimal pour l’analyse des mécanismes et du schéma spatio-temporel des liens entre pathologies neurodégénératives et parodontite et donc raffiner la modélisation pour les études futures.

Procédures

Ce projet comporte 2 procédures chirurgicales (induction de la parodontite, injection par stéréotaxie). L’induction de la parodontite se fera par 2 techniques différentes, l’une nécessitant une seule intervention et un suivi pendant 4 semaines, l’autre nécessitant des injections répétées trois fois par semaine pendant 24 jours. L’emploi de ces deux techniques permet de reproduire des aspects différents de la parodontite (évolution lente ou évolution rapide) pour des groupes d’animaux différents. Pendant cette période, 540 rongeurs bénéficieront d’un suivi à l’aide de cages métaboliques où les animaux seront hébergés seuls afin de déterminer leur balance énergétique. Pour ces deux techniques il sera attendu 10 jours avant de placer les animaux dans les cages métaboliques et une période d’acclimatation d’au moins 48 heures avec de la litière identique à leur cage d’hébergement et dans un espace suffisant au regard de leur poids. La stéréotaxie sera effectuée une seule fois avec pose de canule permettant des injections intracérébrales une fois par jour pendant 6 jours. L’intégralité des animaux seront suivis d’un point de vue comportemental ayant pour objectif de tester les capacités cognitives des animaux. Au cours des deux procédures, des prélèvements sanguins seront effectués une fois par semaine et juste avant la mise à mort sur animaux vigiles pour lesquels la douleur sera prévenue par application d’un anesthésique local. Au cours de la procédure faisant appel à la stéréotaxie, du liquide céphalo-rachidien sera prélevé une fois sur les animaux anesthésiés, avant leur mise à mort.

Impact sur les animaux

Les procédures chirugicales (induction de parodontite, perfusion ou stéréotaxie) seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Le suivi post-opératoire sera réalisé par du personnel formé au bien-être animal. Les procédures comme la stéréotaxie ou la pose de perfusion sont des procédures courantes dans le laboratoire. Les conséquences attendues sont minimes sur le bien-être animal. Aucun effet secondaire n'est attendu sur les animaux du fait de l’induction de la parodontite. Les procédures exécutées ne provoqueront qu'un inconfort léger (pose d'une ligature à la base d'une dent, et injections dans la gencive). Une absence de perte de poids consécutive à la pose de ligature est attendue comme dans une étude précédente. Les injections au niveau gingival peuvent entrainer des saignements au point d’injection sans nuisance sur le comportement de l’animal. Les injections seront effectuées de manière lente pour éviter l’apparition de grosseurs/nodules au niveau de la gencive. Dans le cas où certains animaux rencontreraient tout de même des difficultés à l’alimentation, de la nourriture en gel sera mise en place.

Devenir

A l'issue des procédures (P1) et (P2), tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour permettre des analyses des tissus parodontaux et cérébraux.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer différents aspects de la physiopathologie des tauopathies en lien avec les performances cognitives et des pathologies induites au niveau périphérique. L'utilisation d'animaux vivants revêt donc un caractère de stricte nécessité. En effet, nos travaux visent à mettre en lien les atteintes périphériques infectieuses et inflammatoires avec des altérations comportementales, histologiques, biochimiques et moléculaires neuronaux et d’en étudier les facteurs modulateurs au cours du vieillissement. Cela nécessite donc le développement d’approches neurobiologiques intégrées. De plus les modèles expérimentaux sont largement utilisés pour vérifier les hypothèses biologiques de la relation entre la parodontite et d’autres maladies systémiques pour permettre le contrôle de facteurs étiologiques supposés. Ces évaluations particulières ne peuvent pas être réalisées en utilisant des alternatives aux modèles animaux.

Réduction

Le nombre total d’animaux concernant les procédures de notre protocole sur les 5 ans à venir est donc estimé à 1632 (1032 souris et 600 rats). Cette utilisation maximise les données obtenues de chaque animal, ce qui peut limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Pour chacun des groupes constitués, le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout en permettant l'obtention de résultats satisfaisant (différences statistiquement observables). Pour limiter le nombre d’animaux, une réutilisation des animaux des animaleries employés pour la formation sera effectuée pour la mise au point des modèles de parodontite. Un calcul du nombre d’animaux total nécessaire par groupe a été effectué pour respecter le principe des 3R. De plus les animaux seront utilisés pour plusieurs interventions au sein des procédures expérimentales afin de réduire leur nombre. Pour l’étude statistique, une comparaison des groupes d’animaux deux à deux entre les animaux contrôles et les animaux tests sera effectuée.

Raffinement

Les animaux seront observés tous les jours, et pesés au moins 1 fois par semaine, par du personnel spécialement formé. Durant l'étude, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Les animaux seront hébergés en groupe, et des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition: blocs à ronger pour les rats, coton pour la confection de nids... Les animaux seront suivis précisément pour chaque protocole, pour lesquels des points limites adaptés ont été définis. Toute souffrance, angoisse ou comportement inhabituel sera pris en charge par des approches appropriées. Les procédures expérimentales de chirurgies seront réalisées, après une prémédication analgésique, sous anesthésie générale par voie intrapéritonéale. En cas de douleur, un analgésique complémentaire sera administré. Les animaux présentant un des points limites spécifiés pour chaque approche expérimentale seront sacrifiés dans une salle dédiée; le tout en lien avec le responsable du bien être animal.

Choix des espèces

Ces espèces sont utilisées parce que rats et souris peuvent être évalués par des méthodes comportementales et être génétiquement modifiés par injections de vecteurs viraux ou transgénèse. Les souris transgéniques utilisées dans notre protocole reproduisent un certain nombre d’altérations retrouvées dans la Maladie d’Alzheimer et les tauopathies (lésions amyloïdes : APP/PS1dE9, APPP KI, hyperphosphorylation/troncation, agrégation/altération d’épissage/perte de fonction de la protéine Tau : THY-Tau22, THY-Tau30, TauKO, Tau-KI, MiniTau. Le parodonte des rongeurs et notamment du rat est assez similaire à celui de l'homme notamment d’un point de vue anatomique dans la région molaire. L’avantage de ce modèle animal est aussi de pouvoir mener une étude sur des groupes homogènes et alors minimiser les effets de la variabilité biologique. Dans la plupart des expérimentations, les souris et les rats seront utilisées à l’âge adulte : entre 2 mois à 12 mois.