Procédures modérées

1 370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation du gène tau, elles subissent des tests de mémoire, une privation d'eau limitant l'accès à dix minutes par jour et une diète déplétant les cellules immunitaires du cerveau, pour étudier le rôle d'ApoE4 dans la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique qu'environ 15 % des souris développent une paralysie progressive des membres postérieurs et que des crises d'épilepsie, une hydrocéphalie ou une malocclusion peuvent survenir, avec mise à mort au-delà de 20 % de perte de poids. Sur le remplacement, il affirme que la dégénérescence synaptique est très difficile à obtenir in vitro et juge le modèle murin "indispensable".

Objectifs

La maladie d'Alzheimer (MA) est la principale maladie neurodégénérative dans le monde et pour laquelle il n’existe aucun remède à ce jour. Dans la MA, les synapses (zone de contact entre deux neurones où a lieu la transmission du message nerveux) dégénèrent progressivement, menant aux troubles de mémoire bien connus dans la MA. L'apolipoprotéine E (ApoE) est une protéine essentielle aux fonctions synaptiques. L'isoforme E4 d’ApoE (ApoE4) augmente fortement le risque de développer la MA. Bien que nos études précédentes aient pu montrer qu’ApoE4 exacerbe la perte synaptique, on ne se sait pas exactement comment. Déterminer comment ApoE4 contrôle la dégénérescence des synapses dans la MA est essentiel pour comprendre la maladie, mais nécessite une caractérisation fine des fonctions ApoE4 au niveau des synapses. Ce projet testera l'hypothèse selon laquelle ApoE4 aggrave la perte synaptique dans la MA tau par 3 modules : 1) Identifier comment ApoE4 modifie la fonction des synapses endommagées par la MA. 2) Identifier comment ApoE4 modifie la structure des synapses endommagées par la MA. 3) Identifier si ApoE4 utilise les microglies (cellules immunitaires du cerveau) pour exacerber la perte synaptique. Ce projet devrait permettre de mieux comprendre les interactions entre l'ApoE4 et la perte des synapses dans la MA. Nous utiliserons un modèle de souris qui reproduit la perte synaptique comme observée chez les patients MA.

Bénéfices attendus

Nous espérons que ce projet nous apportera : A court/moyen terme : Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux menant à la dégénérescence synaptique dans la MA et le rôle d’ApoE4 et des microglies dans ce processus pathologique. A moyen/long terme : Le développement de stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la régulation des activités d’ApoE4 et des et microglies qui pourraient apporter des solutions thérapeutiques chez l’homme. La population européenne vieillissant, le nombre d'Européens atteints de la maladie d'Alzheimer doublera presque d'ici 2050, soulignant l'urgence de développer des traitements efficaces pour arrêter ou au moins retarder la maladie d'Alzheimer avant qu'elle n'atteigne des proportions épidémiques. À cet égard, on estime qu'un traitement qui retarde l'apparition de la MA de 5 ans réduirait automatiquement le nombre de cas de 50 %.

Procédures

- Une biopsie rapide de l'oreille (permettant l'identification et le génotypage des animaux) (2 secondes) - Trois tests comportementaux pour évaluer la mémoire (1 semaine à 3 semaines) - Une euthanasie sous anesthésie/analgésie (unique, 1 minute) - Possible développement d'un phénotype dommageable à partir de 7 mois (15% des souris P301S, développement progressif de quelques semaines à 1 mois) - Une diète spéciale permettant la déplétion des microglies (1 mois) - Une privation en eau contrôlée (accès à l'eau 10 minutes par jour )

Impact sur les animaux

Il n’y pas d’effet indésirable attendu sur les animaux lié à l’utilisation des traitements proposés (diètes). En ce qui concerne le comportement, il s'agit de manipulations répétées qui sont indolores et non invasives mais peuvent être stressantes pour les animaux. Les animaux seront privés en eau pour créer un niveau de motivation suffisant pour apprendre et mémoriser les indices olfactifs lors de l'helico Maze. Les souris seront privées en eau de la façon suivante: accès à l'eau 10 minutes par jour 5 jours avant le premier jour d'expérimentation. Puis, lors des jours d'expérimentation (5) les souris auront accès à l'eau pendant 10 minutes chaque jour en plus de l'eau bue pendant l'expérimentation. Les souris porteuses du transgène P301S peuvent développer plusieurs phénotypes dommageables qui seront discutés dans la procédure et pour lesquels des points limites stricts seront établis). Les animaux issus de la procédure 2 seront mis à mort à la fin de la procédure par surdosage anesthésique suivi d'une perfusion intracardiaque. Une heure avant l’injection d’anesthésiques, nous injecterons un analgésique en sous-cutané .

Devenir

Pour la partie du projet permettant la création et le maintien de lignées de souris transgéniques à phénotype dommageable, une partie des souris sera utilsée pour la deuxième procédure, l'autre partie sera mise à mort à la fin de la procédure. Pour la partie du projet avec les analyses comportementales, perfusion et prélèvements des tissus, tous les animaux seront mis à mort pour prélever le cerveau qui doit être analyser.

Remplacement

Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants, ces modèles n’offrent que des informations "physiopathologiques" très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, la dégénérescence synaptique est très difficile à obtenir in vitro. Ces souris P301S représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie d’Alzheimer car c’est l’un des rares modèles de la MA qui développent une dégénérescence synaptique et une atrophie cérébrale, comme observées chez les patients MA et responsables des troubles cognitifs. Puisque le but principal est de comprendre et combattre la dégénérescence synaptique dans la MA, nous devons utiliser un modèle qui développe une perte synaptique similaire à celle présente chez les patients atteints de la MA. Les modèles MA in vitro (culture cellulaire ou organoïdes) actuels ne développant pas (ou très peu) de perte synaptique, nous nous tournons donc vers ce modèle murin. De plus, les modèles de test comportementaux n'étant pas possible in vitro, l’utilisation d’un animal qui développe des altérations mnésiques similaires à celles observées dans la MA est donc nécessaire, avec des capacités mnésiques mesurables. Les souris P301S transgéniques permettent de reproduire ces symptômes mnésiques de la MA ainsi que les mécanismes à l’origine de ces troubles.

Réduction

Afin de calculer au plus juste l'effectif des lots d'animaux, nous avons effectué un calcul des effectifs nécessaires grâce à plusieurs tests statistiques. Du fait de la variabilité pathologique précédemment rapportée entre mâles et femelles dans le modèle P301S, nous n’utiliserons que les mâles afin de réduire la variabilité au sein des groupes et ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons les mâles car ils développent une perte synaptique plus tôt par rapport aux femelles. Les seules femelles utilisées seront celles nécessaires à la création et au maintien des différentes lignées de souris pour la reproduction. Nous avons conscience que l’utilisation des deux sexes serait un atout scientifique mais le nombre d’animaux nécessaires serait bien trop important d’un point de vue éthique. Nous proposons donc de faire cette étude exploratoire chez les mâles. Dans le futur, lorsque les mécanismes liant ApoE4 à la perte synaptique seront établi chez les mâles, nous ferons une nouvelle demande auprès du comité d’éthique afin de confirmer (ou non) les résultats principaux découverts chez les mâles sur une petite cohorte de femelles.

Raffinement

Les souris seront hébergées sous un cycle lumière-obscurité de 12 heures à 21°C(±1°C) dans des portoirs ventilés (12vol/h), sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi (alternance entre dômes de plexiglass et dômes en papier, accompagné de Nestlets en coton). Les animaux seront sous la responsabilité de personnels animaliers expérimentés. Une observation quotidienne des animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. Les souris peuvent perdre du poids avec la privation en eau ; Au-delà de 20% de perte de poids pendant l'expérience, la souris sera exclue du test comportemental et aura un accès illimité à l’eau afin de recouvrer un poids normal. Les souris P301S développant des phénotypes dommageables, des points limites stricts seront établis afin de réduire les nuisances causées aux animaux. Environ 15% des souris P301S développeront une paralysie des membres postérieurs à partir de l'âge de 7-8 mois. Les premiers signes sont la rétraction des membres postérieurs quand la souris est soulevée par la queue. Au début, les souris sont entièrement ambulatoires et peuvent accéder normalement à la nourriture et à l'eau. Cela peut évoluer vers une faiblesse des membres postérieurs et éventuellement une paralysie. Les souris sont observées quotidiennement pour leur capacité à atteindre la nourriture et l'eau. Ce processus, lorsqu'il se produit, progresse au cours des semaines à plus d'un mois. Points limites : Perte de plus de 20% du poids : euthanasie. Signes de souffrances continues (prostration, dos courbé, …) : euthanasie. Incapacité à se déplacer pour atteindre l’eau ou la nourriture : euthanasie. Notre objectif est de les amener à 10 mois maximum. Les souris P301S sont sensibles au bruit et à la manipulation. Si une crise épileptique se produit, nous laisserons la souris récupérer et observerons 5 minutes. Si elle est incapable de se remettre d'une crise, elle sera euthanasiée. Habituellement, les souris récupèrent et se comportent normalement. Si la souris développe une hydrocéphalie, elle sera euthanasiée. Si une malocclusion est identifiée, la souris sera évaluée. Si elle fait partie d'une procédure, les dents seront taillées chaque semaine par le personnel vétérinaire et le poids sera surveillé. Sinon, la souris sera euthanasiée.

Choix des espèces

Les souris P301S constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles de la MA, ainsi que comme modèle pré-clinique pour tester des molécules thérapeutiques potentielles. De plus, la dégénérescence synaptique responsable des troubles cognitifs dans la MA est très difficilement modélisable in vitro et nécessite des modèles transgéniques exprimant des protéines humaines mutées. Pour étudier l’impact d’ApoE4 sur la dégénérescence synaptique, nous utiliserons des souris sauvages et les souris génétiquement modifiées P301S exprimant la protéine tau humaine mutée menant au développement de la perte synaptique et des troubles cognitifs. Ces souris seront croisées avec des souris transgéniques exprimant les isoformes humaines ApoE2, ApoE3 ou ApoE4. - Une cohorte sera utilisé à 7 mois (avec tests comportementaux de un mois à une semaine avant) afin d'évaluer les stades précoces de la dégénérescence synaptique dans ce modèle - Une cohorte sera utilisé à 10 mois (avec tests comportementaux e un mois à une semaine avant) afin d'évaluer les stades tardifs de la dégénérescence synaptique dans ce modèle

792 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections par jour, par voie intrapéritonéale, sous-cutanée ou par gavage, d'un traitement chronique au THC destiné à provoquer une dépendance puis un sevrage, et 504 d'entre elles passent des tests comportementaux dont le porteur ne précise pas le détail. Il indique que la mise à mort est réalisée rapidement sans anesthésie préalable, pour ne pas fausser les mesures. Sur le remplacement, il décrit des analyses in silico et in vitro déjà menées, mais affirme que l'étude de systèmes intégrés ne peut se faire que chez l'animal.

Objectifs

Le cannabis est la drogue d’abus la plus utilisée dans le monde et compte environ 200 millions d’utilisateurs pour 15 millions de personnes dépendantes. Le cannabis contient naturellement des composés, appelés cannabinoïdes, parmis lesquels le ∆9-tétrahydrocannabinol (ou THC) est le plus abondant. Le THC est principalement responsable des effets toxiques et addictifs du cannabis de part ses propriétés psychoactives, et agit dans le cerveau en se fixant sur les récepteurs aux cannabinoïdes de type 1 (récepteurs CB1). Les récepteurs CB1 sont très abondants dans le système nerveux central et jouent un rôle majeur dans la régulation de l’activité neuronale. L’abus de cannabis, impliquant une action du THC sur les récepteurs CB1, peut donc être à l’origine de troubles neurologiques et psychiatriques importants. Ainsi, une meilleure connaissance du fonctionnement et de la régulation des récepteurs CB1 est primordiale pour comprendre les effets du cannabis et pouvoir les réduire. Dans ce cadre, le projet consistera à évaluer, chez des souris, la réponse comportementale à l’administration chronique de THC, mimant un état de dépendance, et à l’arrêt de ce traitement, induisant un état de sevrage. Nous chercherons à identifier des molécules pouvant diminuer les conséquences liées à la dépendance et au sevrage au THC. Cette étude contribuera ainsi à mieux comprendre les mécanismes de régulation des récepteurs CB1 dans le but de développer un traitement contre les troubles liés à l’abus de cannabis.

Bénéfices attendus

Les récepteurs aux cannabinoïdes CB1 comptent parmi les récepteurs métabotropiques les plus abondants dans le système nerveux, et participent à la régulation de nombreuses fonctions cérébrales. La dé-régulation de l’activité de ces récepteurs est ainsi associée à l’apparition de troubles neurologiques majeurs tels que l’addiction, les psychoses, l’anxiété ou encore les troubles cognitifs. L’idendification de mécanismes de régulation endogènes aux récepteurs CB1 offre donc de nouvelles pistes de recherche dans le but de développer des stratégies thérapeutiques innovantes permettant une amélioration de la qualité de vie des patients concernés. Ce projet consistera ici à produire une meilleure connaissance des mécanismes fondamentaux sous-tendant la régulation des récepteurs CB1.

Procédures

L’ensemble des gestes techniques décrits ci-après sera réalisé par une personne compétente formée à l’expérimentation animale et aux gestes techniques, qui sera sous la responsabilité du porteur de projet et sera en contact régulier avec le personnel zootechnique de l’animalerie d’expérimentation et les responsables du bien-être animal. 1) Administrations per os par gavage: Ces administrations seront réalisées sur un total de 216 animaux vigiles dans la limite des volumes d’injections préconisés pour la taille et l’espèce des animaux. L’ensemble des animaux recevra deux injections par jour espacées de 8h minimum pendant 6 jours maximum. 2) Injections sous-cutanées: ces injections seront réalisées sur un total de 144 animaux vigiles dans la limite des volumes d’injections préconisés pour la taille et l’espèce des animaux. L’ensemble des animaux recevra deux injections par jour espacées de 8h minimum pendant 6 jours maximum. 3) Injections intra-péritonéales: ces injections seront réalisées sur un total de 792 animaux vigiles dans la limite des volumes d’injections préconisés pour la taille et l’espèce des animaux. L’ensemble des animaux recevra deux injections par jour espacées de 8h minimum pendant 6,5 jours. 4) Tests comportementaux : L’ensemble des tests comportementaux prévus dans cette étude concernera 504 animaux. Les tests, classiquement utilisés chez la souris, seront réalisés sur des animaux vigiles. 5) Mise à mort : Un total de 792 animaux fera l’objet d’une mise à mort rapide. Celle-ci sera réalisée chez les animaux sans anesthésie au préalable dans la limite des contraintes techniques imposées par les analyses faites ex vivo.

Impact sur les animaux

L’administration de substances par voie intra-péritonéale, sous cutanée et/ou orale par gavage, ainsi que la contention nécessaire à la réalisation des administrations entrainent des douleurs et du stress. Des nuisances pourraient survenir à la mise en cage individuelle des animaux en raison du stress lié à l’isolement. De plus, les administrations de THC et l’exposition à des tests évaluant le comportement de type anxiété peuvent engendrer des effets indésirables et du stress.

Devenir

Procédures I et II : Les animaux seront mis à mort pour le prélèvement du sang et du cerveau pour des analyses ex vivo ultérieures. Ces procédures se feront sans utiliser d’anesthésie, celle-ci pouvant modifier les paramètres mesurés (quantification des endocannabinoïdes et neurostéroïdes) et induire ainsi des biais expérimentaux.

Remplacement

Dans le cadre de la stratégie de remplacement, des approches substitutives à l’expérimentation animale ont été réalisées en amont de ce projet. Des analyses in silico nous ont permis d’identifier le site de fixation allostérique de la pregnenolone sur le récepteur CB1. De plus, des études in vitro ont permis de montrer l’effet régulateur de la pregnenolone et de ses analogues sur le récepteur CB1. Ce projet s’applique maintenant à l’étude de systèmes intégrés qui ne peuvent être réalisés que chez l’animal.

Réduction

Dans le cadre de la stratégie de réduction, notre expérience au sein du laboratoire nous a permis de déterminer qu’un nombre de 8 souris par groupe expérimental est nécéssaire pour les prélèvements et analyses ex vivo, afin d’obtenir des données représentatives de l’échantillon de population. Ce nombre sera porté à 12 souris par groupe pour les analyses comportementales, afin de pallier à la variabilité inter-individuelle et pouvoir réaliser des analyses statistiques cohérentes. De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles afin de déterminer d’éventuelles différences liées au sexe. Le cas contraire, les données des mâles et femelles seront regroupées de sorte à augmenter le nombre d’individu par groupe pour étudier les effets traitement. Enfin, les études réalisées au cours du projet précédent et une connaissance accrue de la bilbiographie sur la pregnénolone et le récepteur CB1 nous ont permis de déterminer les doses effectives pour les traitements pharmacologiques. Ceci nous permet de proposer des groupes expérimentaux pertinants avec des conditions témoins appropriées.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne, et ce dès leur réception. La manipulation des animaux et les soins éventuels seront prodigués par des personnes habilitées à l’expérimentation animale et compétentes, en accord avec la grille de score des points limites. De plus, une personne habilitée sera en charge de vérifier le pourcentage d’humidité dans l’air et la température, ainsi que le niveau sonore (si un bruit anormal survient) dans les pièces d’hébergement et d’expérimentation afin de détecter d’éventuelles nuisances et alerter les personnes compétentes pour pallier à celles-ci. A leur réception, les souris seront maintenues en cages d’hébergement collectives en présence d’enrichissement (carrés de cellulose, sizzle, tunnels en carton), et ce jusqu’à une semaine avant le début des expériences. Les animaux seront alors placés dans des cages individuelles transparentes et rapprochées les unes des autres afin de maintenir des contacts olfactifs et visuels entre les animaux et en présence du même enrichissement. La mise en cage individuelle est ici nécéssaire afin de minimiser l’impact potentiel de la hierarchie sociale sur le phénotype des et afin de reproduire les conditions d’hébergement dans le projet précédent. De plus, les animaux seront manipulés par un expérimentateur habilité à l’aide des tunnels en carton, afin de réduire le stress lié à cette manipulation. Les expériences seront réalisées dans une pièce dédiée dans l’animalerie, et les animaux seront transférés au minimum 30 minutes avant le début des tests dans la pièce d’expérimentation afin de les familiariser à ce nouvel environnement. Le cas échéant, un enrichissement supplémentaire pourra être apporté dans les cages d’hébergement afin d’optimiser le bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal courant pour les études pharmacologiques et l'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permettra une éventuelle transposition des résultats obtenus dans le projet de recherche à l'homme (dans les études de recherche et de développement). De plus, les effets comportementaux des cannabinoïdes ont été bien décrits et validés chez la souris. Les expériences seront réalisées sur des animaux jeunes et adultes (âgés de 2 à 5 mois). Ce projet se fera dans la continuité des projets précédents menés sur des animaux du même âge, ce qui nous permettra de compiler les données obtenues entre les différents projets et ainsi faire progresser nos connaissances sur les mécanismes de régulation endogène du récepteur CB1.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'ablation de dépôts de graisse sous anesthésie, des prises de sang à la queue et des mesures de composition corporelle, pour étudier le rôle du tissu adipeux dans le vieillissement musculaire. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer une perte de poids et une douleur à court terme, et fixe la mise à mort à une perte de 20 % du poids. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode sans animaux n'existe pour une étude à l'échelle de l'"organisme entier" et juge le recours à la souris "indispensable".

Objectifs

Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes âgées afin qu'elles puissent être autonomes le plus longtemps possible représente un enjeu majeur de santé publique. La sarcopénie, qui se caractérise par une perte de la masse et de la force musculaire avec l’âge, joue un rôle critique dans la perte de mobilité du sujet âgé. Si le vieillissement d’un tissu a une origine intrinsèque, il peut également résulter du vieillissement global de l’organisme, notamment via des altérations de la communication entre les organes. Ainsi, le tissu adipeux blanc (TA), dont les fonctions endocrines vis-à-vis du muscle squelettique sont déjà établies, est très précocement affecté au cours du vieillissement. Il subit un remodelage important avec l’âge et il a récemment été montré qu’un vieillissement accéléré spécifique à l’adipocyte (type cellulaire majoritaire du tissu adipeux) pouvait mener à une perte de fonction musculaire in vivo, soulevant l’intérêt de comprendre la communication TA-muscle au cours du vieillissement. Parmi les médiateurs de cette communication, très peu d’attention a été portée jusqu’ici aux métabolites, petites molécules organiques intermédiaires du métabolisme. Or, nos données préliminaires ont permis de mettre en évidence que ce sont plus d’une centaine de métabolites qui sont différentiellement produits par le TA avec l’âge. Compte tenu de leur rôle crucial - sur le métabolisme lui-même mais aussi sur des processus plus généraux tels que la sénescence ou le stress oxydant - une dérégulation des métabolites de l’axe TA-muscle avec l’âge pourrait participer au développement du processus sarcopénique. Dans ce contexte, l’objectif du projet proposé est de démontrer que le tissu adipeux blanc (TA) participe au maintien du métabolome (ensemble des métabolites) circulant et musculaire chez un sujet jeune et que la dérégulation de ce tissu au cours du vieillissement contribue à l’altération profonde du métabolome circulant et musculaire rapportée avec l’âge. Dans ce but, nous réaliserons des lipectomies (résection des dépôts adipeux situés au niveau sous-cutané et viscéral) chez des animaux jeunes et âgées afin d'étudier l’implication de ce tissu dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de caractériser l’implication du tissu adipeux blanc (TA) dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement. Le vieillissement du TA ayant un impact négatif sur le fonctionnement musculaire, l’identification d’un pool de métabolites dérégulés avec l’âge appartenant à l’axe TA-muscle devrait nous permettre de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques d’intérêt à exploiter pour lutter contre la sarcopénie liée à l’âge.

Procédures

Les souris seront soumises à des prises de sang à la veine de la queue (2 fois au total, durée approximative d'intervention : 10 minutes par souris), leur composition corporelle sera mesurée de façon non invasive grâce à un système RMN (temps de mesure moyen par souris : 90 secondes) et elles subiront une chirurgie (30 minutes d’intervention environ) sous anesthésie et traitement analgésique afin de leur retirer un ou plusieurs dépôts adipeux.

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - stress des animaux au moment de leur réception (une période d’acclimatation d’au moins une semaine sera respectée) - perte de poids et douleur à court terme consécutives à la chirurgie (une administration d’analgésique sera effectuée lors de la chirurgie et un suivi post-opératoire quotidien sera mis en place pour s’assurer de la bonne récupération des animaux) - isolement/individualisation des animaux en cas d'agressivité (enrichissement des cages)

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de collecter leurs tissus et de procéder à des analyses métaboliques, biochimiques ou d'expression de gènes. Ces études permettront de mieux comprendre les mécanismes tissulaires et cellulaires mis en jeu dans les phénomènes observés.

Remplacement

Notre projet consiste à étudier la communication entre différents tissus (tissu adipeux et muscles squelettiques) via de petites molécules organiques, les métabolites. Bien qu'un volet de notre projet ait déjà été réalisé sur des cellules cultivées, aucune technique de remplacement du modèle animal n’existe à ce jour. Il s'agit d'une étude intégrée à l'échelle de l'organisme entier impliquant des échanges de métabolites entre différents tissus. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche.

Réduction

Au regard de la bibliographie et sur la base d'analyses statistiques, 10 souris par condition sont classiquement utilisées pour des études de métabolomique sur tissus de rongeurs. Les tissus prélevés seront utilisés non seulement pour étudier le métabolome au sein des tissus mais aussi pour des analyses d'expression de gènes, de protéines et des analyses biochimiques (mesures d’activités enzymatiques). Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation, pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet.

Raffinement

La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et un analgésique sera administré aux animaux afin d’éviter la perte de poids et les douleurs. Une surveillance des souris sera réalisée tous les jours pendant 7 jours suite à la chirurgie puis 2 fois par semaine par la suite, ce qui permettra de mettre à mort les animaux ou de les écarter du protocole en cas de comportements anormaux ou de souffrance. Les points limites sont : perte de poids rapide (20% en quelques jours), prostration, poil hirsute, dos rond, ou tout autre signe clinique, jugé par le technicien expérimenté, comme indiquant un état de souffrance. De plus le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage. Nous enrichirons également l’environnement de toutes les souris de façon à favoriser leur bien-être.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler sur la souris car cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et sa cinétique de vieillissement est elle aussi bien documentée. De plus, dans la mesure où nous travaillons sur la problématique du vieillissement, la souris nous permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (1 à 3 ans) en comparaison au rat (2 à 3.5 ans) ou au cobaye (4 à 8 ans). De plus, c’est un modèle pour lequel nous avons une expertise depuis de nombreuses années. Pour cette étude, nous utiliserons des souris wild-type C57BL/6J de différents âges (3-6 mois pour les souris « jeunes » et 18-24 mois pour les souris « âgées ») afin de caractériser la contribution du TA dans la régulation du métabolome circulant et musculaire au cours du vieillissement.

1 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une xénogreffe tumorale et reçoivent des séries d'injections intraveineuses, orales et intrapéritonéales de composés à base d'or, pour comparer l'efficacité anticancéreuse de ces molécules. Le porteur indique que la tumeur peut gêner les déplacements et que sa nécrose peut ouvrir une plaie susceptible de s'agrandir par frottement ou cannibalisme, paramètre qu'il comptabilise comme signe d'efficacité. Sur le remplacement, il souligne que les composés ont d'abord été identifiés in vitro sans animaux, tout en jugeant le passage in vivo nécessaire.

Objectifs

L'identification de nouvelles séries chimiques originales et efficaces sur les cibles thérapeutiques est devenue un des défis majeurs auxquels les industries pharmaceutiques sont confrontées. Dans l’optique d’étendre la diversité chimique et d’explorer de nouveaux territoires synthétiques, en utilisant la chimie organique nous pouvons envisager plusieurs approches et notamment le design de squelette in silico à partir de méthodes computationnelles. L'équipe de chimistes co-porteuse du projet s’intéresse à la conception et la synthèse d’outils chimiques par la synthèse de nouveaux complexes organométalliques de métaux de transition. Ces outils sont conçus en vue d’application en chimie médicinale. Deux familles de composés à base d'or ont été synthétisées, montrant une activité biologique vis-à-vis des cellules cancéreuses in vitro.

Bénéfices attendus

Les traitements anticancéreux à base de métaux sont apparus au milieu des années 1960 avec l’apparition de composé à base de platine comme le cisplatine. Bien que ces complexes soient utilisés en thérapie ils présentent des effets secondaires importants (neurotoxicité, néphrotoxicité...) sur l’Homme et/ou des résistances. Des études ont été menées pour remplacer le platine par de l’or (III). Ainsi nous avons synthétisé de nombreux complexes d’or avec des ligands CN (Carbone - Azote) ou PP (Phosphore-Phosphore) que nous avons testé sur des lignées cellulaires cancéreuses. Sur 28 composés des familles CN et des familles PP, nous avons mis en évidence une activité biologique anti-cancéreuse. Pour le projet présent nous souhaitons testés in vivo les 5 meilleurs par famille (famille CN et famille PP).

Procédures

Les souris seront soumises aux interventions suivantes : 9 injections en IV sur animaux vigiles sur réparties sur une durée de 19 jours. 5 injections per os sur animaux vigiles 5 jours d'affilés. 5 injections IV sur animaux vigiles sur 5 jours d'affilés 6 injections IV sur animaux vigiles sur réparties sur une durée de 19 jours. 1 injection IP sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

La xénogreffe provoque le développement d'une tumeur solide. Les tumeurs ne sont pas innervées et elles n'entraînent pas de douleur. En revanche la taille tumorale peut provoquer des difficultés de déplacement des souris. L'efficacité de nos composés à l'image des traitements chimiothérapeutiques standards, quand le traitement a un effet, se traduit par un ralentissement du développement de la tumeur, une stagnation ou encore une baisse de la taille tumorale. Ces effets sont la résultante de la destruction de la tumeur par des phénomènes de nécrose qui peuvent atteindre la surface de la tumeur et provoquer une plaie. Ces plaies peuvent s'agrandir soit par cannibalisme soit par frottement en raison du déplacement de la souris. Cependant plus le traitement est efficace plus la nécrose va se développer. Nous comptabilisons ce paramètre pour évaluer l'efficacité de la thérapie.

Devenir

A l'issus de la procédure 1 les animaux sont mises à mort afin de récupérer la tumeur et procéder à l'analyse fine de l'efficacité de nos composés. A l'issue de la procédure 2 les animaux sont mises à mort afin de récupérer la tumeur et procéder à l'analyse fine de l'efficacité en combinaison de nos composés

Remplacement

Le recours aux expérimentations in vitro a mis en évidence une action biologique des composés chimiques à base d'or parmi des centaines de composés obtenus par des synthèses chimiques. L'action biologique observée a été complétée par des expériences de biologie moléculaire et d'analyse cellulaire par cytométrie afin de mettre en évidence les cibles de nos composées et le mode d'action sur les cellules cancéreuses. Aucun animal n'a été utilisé dans cette découverte majeure pour un traitement anticancéreux.

Réduction

Nous avons limité le nombre d'animaux par groupe sans remettre en cause l'analyse statistique de nos résultats mais en prenant en compte la variabilité interanimales et intergroupes. En tenant compte de la bibliographie, notre expérience dans le domaine du traitement des cancers, des tests de puissance statistique pour la taille des groupes, et des effets attendus un nombre de 10 souris par groupe sera utilisé. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultat et d'analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été élaboré afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la règlementation, les animaux seront hébergés en portoir ventilé et ils disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de maison de type igloo et nous ajouterons des nids végétaux à base de fibres courtes de coton. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bienêtre des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites adaptés) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc...). L'administration des traitements devrait apporter un bénéfice pour les animaux avec un ralentissement de la progression tumorale. De plus, l’ensemble des gestes techniques qui sont réalisés sur animaux vigils sont pratiqués par des personnes formées et expérimentées avec du matériel adéquate permettant de réduire significativement les nuisances liées aux actes techniques.

Choix des espèces

Une espèce couramment utilisée et reconnue en oncologie. C'est un modèle ayant permis de déterminer l’importance du protocole d’administration, l’influence du volume tumoral et la toxicité des traitements. La physiologie de la souris est comparable à celle de l'Homme. Les souris seront achetées entre 4 et 5 semaines d'âges et après 1 semaine d’acclimatation entreront en protocole. Selon la fiche research models de la souche NMRI-Foxn1nu/nu proposée par le fournisseur, le poids des animaux se stabilise entre 28 et 35 jours d’âge. Ce stade de développement est couramment utilisé et validé par la communauté scientifique. L’identification par bague est privilégiée, car la plus pratique pour identifier les souris. Elle sera réalisée au cours de la semaine d’adaptation En cas de perte les animaux seront bagués de nouveau ou à défaut des marquages au feutre de couleur des queues pourront également être réalisées pour sécuriser l’identification.

96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont nourries douze semaines avec un régime hyperlipidique et gavées chaque jour de deux souches bactériennes, avec prélèvements fécaux et sanguins, mesures de composition corporelle et tests de tolérance au glucose et à l'insuline, pour évaluer l'effet de ces bactéries sur la prise de poids et les troubles métaboliques. Le porteur indique que ces procédures peuvent provoquer des hypoglycémies et un stress lié à la contention et au gavage. Sur le remplacement, il affirme que l'écosystème microbien digestif ne peut pas être étudié in vitro et conclut à la "nécessité" du modèle murin.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier dans un modèle murin d’obésité induite par le régime l’impact de l’administration de deux souches du genre Subdogranulinum sur la prise de poids et le développement d’altérations métaboliques, telles que l’insulino-résistance et l’hyper-lipidémie, susceptibles d'altérer la santé des patients souffrant d'obésité ou de syndrome métabolique.

Bénéfices attendus

Nous espérons réduire la prise de poids et les complications métaboliques associées en conditions obésogènes. Si ces résultats sont obtenus, la possibilité de l’utilisation future des souches sélectionnées chez l'Homme peut être envisagée. Si non, des résultats d'amélioration au niveau des paramètres physiologiques liés à la santé générale et à la santé intestinale sont attendus.

Procédures

La moitié des animaux seront nourris avec un régime hyper-lipidique pendant 12 semaines et 72 animaux en état vigile seront gavés quotidiennement rapidement (10 secondes maximum) en pendant toute la durée de l'étude. Des échantillons fécaux (4 fois en tout ; 15 min/prélèvement), des mesures de la composition corporelle avec résonance magnétique nucléaire (toutes les 3 semaines ; 3 min/mesure), des tests de tolérance au glucose (1 gavage et 5 prélèvements de sang de petit volume) et des tests de la sensibilité à l’insuline glucose (1 injection et 5 prélèvements de sang de petit volume) pour une durée totale de chaque test de 2h30 seront effectués avec un laps de temps d’au moins une semaine entre ces interventions. Finalement, un prélèvement de sang sera effectué sous anesthésie sur tous les animaux avant l’euthanasie.

Impact sur les animaux

La masse grasse et le poids des souris soumises à un régime hyper-lipidique devraient augmenter de façon plus importante que ceux de leurs homologues ayant suivi un régime standard. Ces souris devraient également présenter des altérations du métabolisme, ce qui fait partie du programme expérimental. Certaines procédures puissent entraîner des hypoglycémies, un léger inconfort ou du stress, comme la contention pour la résonance magnétique nucléaire, le gavage ou les challenges métaboliques. L'expérience antérieure d'études menées avec des méthodologies et des produits similaires nous laisse penser qu'aucun autre type d’effet indésirable ne se produira.

Devenir

À la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés pour collecter les tissus pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Actuellement, l’étude de l’écosystème microbien digestif et de son impact sur les maladies métaboliques ne peuvent pas être réalisés in vitro. La plupart des bactéries digestives ne survivent pas en dehors de leur hôte, d'où la nécessité d'utiliser le modèle murin. De plus, le projet vise à déterminer l'influence de la modification de l'écosystème microbien sur les grandes fonctions systémiques. Celles-ci jouent un rôle important dans la physiopathologie des désordres métaboliques et ne peuvent pas être évaluées en l’absence de ces systèmes.

Réduction

Afin d'utiliser le moins d'animaux possible et de réduire le nombre de groupes dans les expériences suivantes si les résultats sont conformes aux attentes, le design expérimental correspond au nombre minimal de souris nécessaires afin d’obtenir des résultats scientifiquement pertinents et statistiquement fiables (96 animaux dans 8 groupes). A cet effet, ce nombre a été évalué en tenant compte de la variabilité interindividuelle des paramètres mesurés et de la réplication au sein de chaque groupe. De plus, les groupes sans administration de bactéries seront utilisés comme témoins communs, pour éviter d'utiliser un nombre double de souris comme témoins dans deux expériences différentes. Parallèlement, tous les échantillons obtenus dans le cadre de cette expérience seront stockés en vue d'une utilisation future.

Raffinement

Les manipulations seront effectuées par des personnes expérimentées et compétentes afin de réduire au maximum la durée, la sévérité et l’intensité de la douleur. Parallèlement, le matériel utilisé dans les procédures a été choisi pour limiter le stress. En début d'expérience, les animaux bénéficieront d'une semaine d'acclimatation et d'une semaine d'entraînement afin de les habituer à être manipulés et de réduire leur stress. Les animaux seront contrôlés quotidiennement pour observer leur état général et leur comportement. Un contrôle hebdomadaire de la prise alimentaire et du poids sera aussi effectué pour s'assurer que les animaux sont en bonne santé. De plus, un laps de temps de minimum 1 semaine entre les procédures non continues de classe modérée sera respecté afin de laisser un temps de récupération aux animaux. Les souris seront regroupées à 4 par cage au maximum et 3 au minimum pour ne pas souffrir du manque d'interactions sociales. Les souris disposeront de matériel en carton pour enrichir l’environnement. De plus, il existe des points limites définis, adaptés aux différentes interventions de la procédure.

Choix des espèces

La souris C57Bl/6J est la plus utilisée dans la majorité des études antérieures portant sur les maladies métaboliques en raison de sa propension au développement de l’obésité et du diabète de type 2. Les souris sont faciles à manipuler et les administrations orales bien maitrisées et la présence du centre d’explorations fonctionnelles sur le site nous permet d’utiliser ce modèle dans de bonnes conditions d’expérimentation. Pour observer les effets sur l’état métabolique des animaux à l’âge adulte, les animaux seront donc âgés de 8 semaines au début du traitement et de la mise sous régime.

1 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit dans le cerveau une injection de neurotoxine détruisant les neurones dopaminergiques pour reproduire des symptômes de la maladie de Parkinson, puis subit jusqu'à sept tests moteurs et cognitifs, de rotation, d'agilité, de mémoire ou de force de préhension. Le porteur indique que la neurotoxine provoque une réduction de mobilité et une forte perte de poids, et qu'environ 33 % des souris ne survivent pas aux trois jours suivant la chirurgie. Il affirme que ces expériences ne peuvent être reproduites in vitro car elles reposent sur un modèle murin de la maladie.

Objectifs

La maladie de Parkinson est caractérisée par une dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques de la substantia nigra (SN) et une dérégulation de l'activité des interneurones dans le cortex moteur primaire. Ce projet vise à évaluer l'impact de cette dégénérescence sur l'expression des gènes, les marques épigénétiques, et le statut de maturation des interneurones du cortex moteur. Nous utiliserons un modèle de souris pour la maladie de Parkinson qui consiste en une ablation unilatérale des neurones dopaminergiques de la SN. Bien que ce modèle ne récapitule pas toutes les caractéristiques de la maladie de Parkinson, la perte importante de ces neurones entraîne plusieurs symptômes de la maladie de Parkinson, notamment des déficits moteurs, qui sont quantifiables. Les objectifs majeurs du projet sont d’analyser les changements moléculaires et physiologiques dans les interneurones du cortex moteur primaire suite aux lésions, de comparer les changements dû au sexe, et d'identifier des cibles thérapeutiques modifiables dans ces interneurones afin de restaurer une activité normale des neurones moteurs. Ce projet impliquera 1680 animaux et ne peux pas être remplacé par d’autres modèles. Plusieurs analyses seront effectuées sur chaque animale afin de réduire leur nombre, et des mesures spécifiques assureront le minimum de nuisances sur le bien-être des animaux. Ce projet permettra de mieux comprendre la maladie de Parkinson et d’ouvrir de nouvelles perspectives pour son traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet analysera les changements moléculaires et physiologiques dans les interneurones du cortex moteur primaire de la souris adulte en réponse aux lésions de la substantia nigra comme modèle de la maladie de Parkinson. Ce projet permettra d'identifier des cibles thérapeutiques modifiables dans ces interneurones pour restaurer une activité normale de neurones moteurs, et d’identifier les diffénces dû au sexe. Ce projet permettra de mieux comprendre la maladie de Parkinson et d’ouvrir de nouvelles perspectives pour le traitement de cette maladie.

Procédures

Une injection stéréotaxique intracérébrale sera effectuée sur des animaux anesthésiés ; cette procédure chirurgicale dure environ 1 heure et sera effectuée une seule fois. Certains animaux seront implantés avec une canule intracérébrale ; cette procédure chirurgicale stéréotaxique sera effectuée sur des animaux anesthésiés, dure environ 1 heure, et sera effectuée une seule fois. Les animaux seront soumis au test de tendance à la rotation qui durent 10 minutes et sera répété 4 fois. Les animaux seront soumis 2 fois à un test de capacité motrice qui durent 3 minutes par jour sur 5 jour. Certains animaux seront soumis à un seul test qui évalue le niveau d'anxiété et dure 30 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test d'agilité qui dure 2 minutes par jour sur 5 jour. Certains animaux seront soumis à un seul test de mémoire spatiale qui dure 30 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test de capacité sensorimotrice qui dure 5 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test de force de saisie qui dure 3 fois 1 minute. Certains animaux seront soumis à un seul test de force neuromusculaire qui dure 3 fois 1 minute..

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, il est possible que les animaux soient stressés après réveil, sujets à des fluctuations de poids ainsi que de la douleur locale. L’injection de la 6-OHDA (neurotoxine catécholaminergique) peut avoir des effets neurotoxiques qui durent plusieurs jours, entraînant une réduction de mobilité et une perte de poids importante ; le rétablissement complet est attendu au bout de 2 à 3 semaines. Environs 33% des souris ne survivent pas les 3 premiers jours suivant la chirurgie. Les tests de comportement et leur multiplicité peuvent provoquer du stress et de la fatigue chez les animaux. Ils seront soumis à un maximum de 7 tests différents sur une période de 5 jours afin d'évaluer divers aspects de leur comportement locomoteur.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort et leur cerveau sera collecté afin de permettre des analyses histochimiques et biochimiques.

Remplacement

Nos recherches sur les effets de la dégénérescence des neurones dopaminergiques nécessitent des souris pour comprendre comment cela impact les circuits cérébraux implicants notament les interneurones du cortex moteur. Nous utilisons la souris comme modèle pour s'appuyer sur les résultats de recherches antérieures. Ces expériences ne peuvent être reproduites in vitro car elles dépendent d’un modèle murin de la maladie de Parkinson.

Réduction

Nos travaux antérieurs sur des animaux soumis à des injections cérébrales suivies de plusieurs analyses comportementales nous ont permis de définir le nombre d’animaux par condition expérimentale afin d'obtenir une puissance statistique satisfaisante. Nous effectuerons plusieurs analyses (comportement, histologie, biochimie) sur chaque souris, ce qui nous permettra de réduire davantage le nombre d'animaux.

Raffinement

Toutes les expériences invasives sont réalisées sous anesthésie générale, associée à un traitement analgésique. Après la chirurgie, les animaux sont transférés dans une cage chauffée avec une lampe chauffante jusqu'à leur réveil. Ils sont ensuite hébergés dans leur groupe d'origine pour éviter le stress de l'isolement. Pour évaluer les points limites, les souris seront inspectées quotidiennement afin de détecter les signes d'infection et de douleur (changement de posture, de pelage, d'expression faciales), et des mesures de poids seront prises au moins deux fois par semaine. En cas d'infection ou de signes de douleur, les animaux recevront un traitement approprié. En cas de perte de poids, les animaux seront placés dans des cages chauffées et recevront un régime alimentaire enrichi. Les animaux seront euthanasiés si aucune amélioration n'est constatée après 2 jours de traitement ou si la perte de poids dépasse 20% du poids de départ.

Choix des espèces

La génétique de la souris est très bien connue et proche de celle de l'homme, ce qui en fait un modèle privilégié pour l'étude de la maladie de Parkinson. C'est un animal avec lequel nous avons l'habitude de travailler et pour lequel nous avons une bonne expertise pour réduire les conditions de stress, d'inconfort et de douleur. Il nous permet également de créer des modèles pour l'étude des pathologies humaines. Ce projet implique un modèl de la maladie de Parkinson qui nécessite des souris adultes. Les lesions de la subsantia nigra seront effectuées sur des souris agées de 60 jours, lorsques elles sont considérées comme jeunes adultes. Les injections stéréotaxiques sont effectuées 3 semaines après une lesion afin de respecter une période de récuperation. Le comportement sera évalué pendant 2 sessions : 1) vers 2 semaines après lesion et 2) vers 3 semaines après injections stéréotaxiques (entre 100 et 120 jours).

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit par chirurgie une greffe de cellules tumorales directement dans l'organe visé, prostate ou autre, puis passe deux séances d'imagerie par semaine sous anesthésie pendant six semaines, avant la mise à mort pour prélèvement des tissus. Le porteur indique que la chirurgie et la croissance des tumeurs peuvent provoquer des douleurs. Il justifie le choix de la souris par sa proximité génétique avec l'humain mais aussi par ses "faibles coûts", ses cycles de reproduction courts et sa "facilité de manipulation".

Objectifs

Le cancer touche 382000 personnes par an et avec 157400 décès annuel, soit environ 40 % du total, il représente la première cause de mortalité en France. C'est surtout la première cause de mortalité prématurée (avant 65 ans). Un homme sur deux et une femme sur trois sont concernés, avec des localisations différentes selon le sexe : le cancer de la prostate est de loin le cancer le plus fréquent chez l'homme avant le cancer du poumon et le cancer colorectal, et, chez la femme, le cancer du sein est le plus fréquent avant le cancer colorectal et le cancer du poumon. L'incidence globale du cancer augmente chaque année en raison du vieillissement de la population, de la généralisation des techniques d’exploration et de dépistage, et de causes environnementales. Grâce aux progrès de la prévention, du diagnostic précoce et de la prise en charge, le risque de mourir d'un cancer a diminué depuis 25 ans. Cependant, il n'en demeure pas moins un fléau déclaré priorité de santé publique. Les efforts de développement de nouvelles thérapeutiques doivent donc se poursuivre. Les deux premiers critères mis en jeu dans la sélection de nouveaux médicaments antitumoraux sont, d’une part, l’originalité du mécanisme d’action et, d’autre part, l’activité antitumorale expérimentale dans un modèle animal in vivo. Ce projet s'intéresse au suivi du développement tumoral par une approche d'imagerie non-invasive afin d'évaluer l'efficacité de molécules thérapeutiques chez le petit animal (souris). Il aura pour objectif (i) d'évaluer l'apport des modalités d'imagerie pour différents modèles pathologiques, et (ii) de d'évaluer l'efficacité thérapeutique des molécules thérapeutiques testées. Ce projet permettra également une détection précoce des tumeurs (avant qu'elles ne soient palpables), le suivi de la progression tumorale au cours du temps (croissance / invasion / dissémination), et la quantification 2D et/ou 3D des masses tumorales (tumeurs primaires et métastases).

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.

Procédures

Les animaux subiront une greffe de cellules tumorales en orthotopique c'est à dire sur le site d'intérêt de la pathologie (au niveau de la prostate dans le cas du cancer de la prostate par exemple). Cette procédure induit de la chirurgie et s'effectue sous anesthésie générale gazeuse (durée d'intervention

Impact sur les animaux

Les procédures chirurgicales pour l'implantation des cellules tumorales en orthotopique pourront entraîner des douleurs post-opératoires les premières 48h, c'est pourquoi une analgésie de type buprénorphine sera systèmatiquement appliquée en post-chirurgical pour pallier à une éventuelle souffrance. Malgré l'aseptie rigoureuse pratiquée lors de l'étape chirurgicale, il est également possible que l'animal présente de légères complications au niveau des zones incisées, une désinfection locale de la plaie sera alors mise en place et l'anial placé sous surveillance renforcée. En cas d'infection majeure, l'animal sera soumis à un traitement par antibiothérapie. Une observation clinique quotidienne sera également mise en place afin d'évaluer l'état général des animaux opérés. L'administration de traitements par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée et les prélèvements sanguins sont susceptibles d’induire un stress physique aux animaux. L’apparition des tumeurs induites pourra également induire un stress physique et de la douleur. Ces nuisances potentielles nous conduisent à classer ces procédures en classe modérée.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet auront tous subi une induction de tumeur par injection orthotopique de cellules tumorales. Ils seront tous mis à mort à l'issue des différentes procédures d'imagerie mises en œuvre afin de récupérer les différents tissus pour analyses.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle in vitro pouvant remplacer complètement la tumeur dans son microenvironnement et son évolution au sein d'un organisme vivant (prolifération, invasion, dissémination). Il existe cependant des modèles d'étude de clonogénicité, de migration et d'invasion cellulaires in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal

Réduction

Les molécules testées sur les animaux lors de ce projet ont déjà fait l'objet de tests sur des cellules en culture afin d'en vérifier l'efficacité sur les cellules cancéreuses implantées chez les animaux. L’exploration par imagerie permettra d’effectuer un suivi longitudinal des animaux (mesures répétées à intervalles réguliers) dans le but de diminuer le nombre d’animaux utilisés. L'utilisation également d’autres approches scientifiques complémentaires après la mise à mort de l'animal permettra également d'optimiser au maximum les résultats obtenus. Les résultats obtenus sont analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne 2010/63/UE). Nous veillerons à ce que chaque caged'hébergement bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel etc...). Les animaux seront anesthésiés pour chaque procédure d'imagerie et une attention particulière sera apportée au maintien de leur température corporelle pendant l'anesthésie. Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, l'utilisation d'analgésique sera mise en place ainsi que l'utilisation de points limites adaptés, d'un arbre décisionnel et des critères d'arrêt de souffrance.

Choix des espèces

Les petits mammifères, notamment la souris, sont à la base de la compréhension de la pathologie cancéreuse et se sont imposés comme modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. Ils sont d'un grand intérêt pour le criblage de nouvelles molécules car, par la présence de gènes équivalents chez l'homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et apportent de nombreuses connaissances sur les relations entre les cellules tumorales et les tissus normaux, notamment le système immunitaire. Ils permettent également l'étude des phénomènes de vascularisation tumorale et de dissémination métastatique, et aident à la compréhension de la résistance des cellules aux traitements. De plus, ils présentent certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Il est important de noter que les molécules utilisées actuellement en clinique, notamment en chimio- et immunothérapie, ont été découvertes ou évaluées sur ces modèles. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (~4 à 8 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. En effet, il est bien établi dans la littérature que l'induction tumorale par transplantation de cellules cancéreuses chez des animaux jeunes adultes est efficace, fiable et reproductible. Au-delà de cet âge, les tumeurs se développent plus lentement. Dans le cas de notre étude, ce stade de développement est en parfaite adéquation avec la pathologie humaine, notamment en lien avec ses similarités physiologiques et moléculaires. De plus, il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques.

61 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trente-huit reçoivent une greffe de tumeur mammaire, puis des injections de paclitaxel qui provoque une hypersensibilité au toucher et au froid, mesurée par des tests répétés pendant trois semaines, et toutes subissent une chirurgie cutanée avant la mise à mort. Le porteur affirme qu'en dehors des tests les souris ne montrent aucun signe de souffrance ni de perte de poids, tout en reconnaissant que la croissance de la tumeur peut endommager les tissus et provoquer des douleurs. Le projet vise à ajouter une tumeur aux modèles existants de neuropathie chimio-induite, un outil destiné à de futurs tests de molécules.

Objectifs

Les neuropathies périphériques associées de douleurs neuropathiques induites par les agents anticancéreux neurotoxiques représentent une des causes principales de l’altération de la qualité de vie des patients survivant à un cancer. Les neuropathies périphériques induites par la chimiothérapie (NPIC) sont très fréquentes, plus de 60 % des patients sous chimiothérapie anticancéreuse, et impactent fortement la bonne mise en œuvre des protocoles de chimiothérapie, pouvant conduire à une diminution des chances de survie des patients. A ce jour, il n’existe aucun traitement preventif contre les NPIC. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pharmacologiques spécifiques des NPIC représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge des patients traités par chimiothérapie anticancéreuse. Un modèle de neuropathie sensitive induite par le paclitaxel, un agent anticancéreux communément utilisé dans la prise en charge du cancer du sein triple négatif, a déjà été développé et caractérisé, et a permis de mettre en évidence les propriétés neuroprotectrices de plusieurs molécules. In vitro, l’effet de l’interaction bénéfiques des molécules neuroprotectrices sur l’activité cytotoxique des chimiothérapies, ainsi que leur potentiel anticancéreux propre a été mis en évidence sur des lignées cancéreuses humaines. Fort de ces résultats, nous souhaiterions poursuivre dans un modèle animal plus intégratif impliquant les phénomènes de douleur et d’inflammation. Aucun modèle animal de neuropathie sensitive induite par le paclitaxel et associée à un cancer n’a encore été développé. Un tel modèle permettrait de mieux comprendre le lien entre le cancer et le développement des neuropathies associées à la chimiothérapie neurotoxique et d’évaluer l’effet de molécules candidates neuroprotectrices sur les douleurs induites par la chimiothérapie, ainsi que sur l’activité antitumorale de la chimiothérapie. L’objectif est de mettre en place et caractériser un modèle syngénique de cancer de sein sensible au paclitaxel, et dévellopant une neuropathie induite par le paclitaxel. Le modèle syngénique (greffe de même fond génétique que l'hôte), contrairement au modèle de cancer humain xénogreffé, permet de conserver une immunocompétence. L’intérêt est de pouvoir mettre en évidence l’implication du système immunitaire et de l’inflammation dans le développement des neuropathies chimio-induites en présence d’un cancer.

Bénéfices attendus

L’intérêt principal de ce modèle de neuropathie chimio-induite est la présence de la tumeur. Ce modèle fournira un outil pour la mise en place de nouvelles thérapeutiques neuroprotectrices dans un contexte de chimiothérapie néoadjuvante neurotoxique associé à une chirurgie. Les modèles murins actuels de neuropathie chimio-induite sont exempts de tumeur. Le modèle proposé permettra d’évaluer l’impact de la présence d'une tumeur sur l'évolution de la neuropathie chimio-induite. Ce modèle permettra également, dans des porjets futurs, de valider si nos molécules neuroprotectrices, interagissent avec l’activité anti-tumorale du paclitaxel dans un modèle intégré.

Procédures

Trente huit souris recevront une injection sous-cutanée au niveau du flanc droit de cellules cancéreuses murines. Ving-trois souris recevront une injection sous-cutanée au niveau du flanc droit de 200 µL de sérum physiologique. Cette étape sera réalisée sous anesthésie légère à l'isoflurane pour l'ensemble des animaux. Le suivi de la croissance tumorale sera réalisée à l'aide de la mesure au pied à coulisse de la tumeur 3 fois par semaine, sous anesthésie légère à l'isoflurane, seuls les animaux ayant reçu des cellules cancéreuses subiront cette intervention. Ving-neuf animaux recevront 4 injections intrapéritonéales de chimiothérapie (1 injection tous les deux jours pendant 7 jours), et les animaux contrôles recevront 4 injections intrapéritonéales de sérum physiologique selon le même shéma. L'ensemble des animaux (soit 61) subiront une chirurgie cutanée, avec résection de la tumeur sous-cutanée pour les animaux ayant une tumeur et ouverture des plans cutanés pour les animaux sans tumeur. Durant la procédure chirurgicale, les animaux seront anesthésiés à l'isoflurane et recevront une injection sous cutanée de lidocaïne en pré-médication et une injection sous cutanée de buprénorphine en post-médication. L'ensemble des animaux sera soumis à deux test comportementaux; l'un évaluant la sensibilité tactile et l'autre la sensibilité thermique, tous les 3 jours pendant 21 jours environ.

Impact sur les animaux

La neuropathie périphérique induite par le paclitaxel, un agent anticancéreux, se manifeste chez l'Homme par des troubles de la sensibilité, des douleurs neuropathiques ou des faiblesses. Notre équipe a développé et caractérisé chez la souris un modèle de neuropathie induite par le paclitaxel dans lequel nous observons l'apparition d'une hypersensibilité tactile et d’une hypersensibilité au froid en réponse à un stimulus. Les animaux ne présentent aucun trouble moteur (la coordination motrice et la force musculaire ont été évaluées). En dehors de la phase de test, les animaux ayant reçu du paclitaxel ont un comportement similaire aux animaux contrôles et ne présentent aucun signe de souffrance ou de perte de poids. La croissance de la tumeur peut générer des nuisances telles que des dommages aux tissus environnants, induissant des douleurs et de l’inconfort, le développement potentiel de métastases. Les souris peuvent souffrir de faiblesse et de déficience physique en raison de la croissance tumorale et de la propagation de la maladie. Les points limites permettront de limiter au maximum ces nuisances.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les éventuelles altérations morphologiques associées au paclitaxel et au développement de la tumeur seront mises en évidence par l’analyse histologique et immunohistologique. L'ensemble des animaux seront mis à mort, puis les tissus d'intérêt seront prélevés sur chaque animal.

Remplacement

Il n'y a actuellement aucune méthode de remplacement pour l'expérimentation animale qui reproduit tous les mécanismes impliqués dans la génération de douleur causée par les cytotoxiques anticancéreux. Nous avons choisi un modèle qui suit le protocole d'injection des agents anticancéreux le plus proche de celui utilisé chez l'Homme. Une étude in vitro est en cours pour évaluer l'effet des molécules neuroprotectrices sur les neurones sensoriels humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites. Ce modèle cellulaire nous permet de déterminer les mécanismes physiopathologiques (neurotoxicité, hyperexcitabilité, dérégulation du transport axonal, etc.) impliqués au niveau des neurones sensoriels humains, mais exclut les phénomènes de neuroinflammation liés aux neuropathies induites par le paclitaxel (utilisé en chimiothérapie) ainsi que la complexité des phénomènes qui aboutissent à la sensation douloureuse. De même, l’effet de nos molécules neuroprotectrices sur l’activité cytotoxique du paclitaxel a été évalué in vitro sur des lignées cancéreuses humaines.

Réduction

Le nombre de 10 animaux par groupe pour l’étude principale a été déterminé avec un test statistique spécifique qui estime un nombre total de 32 animaux (avec 9 mesures de la sensibilité), soit 8 par groupes (en estimant une prise de tumeur de 100 %). L'analyse statistique sera réalisée à l'aide d'un logiciel dédié. Pour réduire le nombre d'animaux, chacun subira toutes les expérimentations les unes après les autres dans l'ordre chronologique : les injections, les tests de comportements puis la mise à mort pour prélèvements en fin d'expérimentation. Les prélèvements de tissus seront effectués sur chaque animal mort. Les résultats générés par les animaux de l'étude pilote (n = 3) pourront être utilisés pour l'analyse statistique de l'étude principale et ainsi permettre d’augmenter le nombre d'animaux de l'étude principale.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Un temps d'habituation et/ou d’entrainement sera respecté pour chaque test comportemental afin de limiter le stress de l’animal et de réduire la variabilité des résultats. Seuls des test d'évitements seront utilisés pour l'évaluation de la sensibilité, et une valeur limite est établie pour chaque test à partir de laquelle l’animal est soustrait au stimulus même s’il ne présente aucun signe d'évitement. Les animaux exposés à la molécule de chimiothérapie doivent présenter un comportement naturel similaire aux animaux contrôles pour pouvoir participer à l'analyse comportementale. Les animaux présentant des signes de fatigue, troubles moteurs ou souffrance qui pourraient générer un biais dans les réponses aux tests comportementaux seront retirés du protocole. L’équipe de recherche maitrise les modèles de neuropathie chimio-induite et les tests de sensibilité associés qui requiert un savoir-faire et un suivi précis des réactions de l'animal. Les animaux seront anesthésiés légèrement pendant l’injection sous-cutanée des cellules cancéreuses et à chaque contrôle de la croissance tumorale au pied à coulisse. Pendant la chirurgie, les animaux seront profondément endormis par anesthésie gazeuse. Une anesthésie local sera réalisée au niveau du site de la tumeur avant résection. Un onguent ophtalmique sera appliqué durant l’anesthésie afin d’éviter un dessèchement oculaire. Une injection sous-cutanée d'analgésique sera réalisée avant le réveil, afin de diminuer les douleurs post-opératoires et faciliter la récupération. La température corporelle sera maintenue tout au long de la chirurgie à l’aide d’un tapis chauffant, puis à l’aide d’une lampe chauffante durant la phase de réveil.

Choix des espèces

Ces modèles murins de neuropathie induites ont déjà été validés, publiés et ont montré leur intérêt pour tester l'effet neuroprotecteur de molécules. Leur physiopathologie est très proche de celle de l'Homme. Nous utilisons un équipement adapté à la souris. Ce matériel est maitrisé par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point et d’éviter une source de stress supplémentaire pour l’animal. Le choix de la lignée de cellule cancéreuse murine et de la souche de souris a été déterminé pour limiter les risques de réaction immunitaire et de rejet. Pour obtenir des résultats statistiquement fiables, malgré les faibles effectifs par lot, nous utilisons des souris présentant le moins de variabilité : même fond génétique, même âge, poids identique.