Procédures modérées

Pour comprendre le rôle de l'exportine 7, associée à la schizophrénie, dans la maturation des cellules du cerveau, 1 911 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements. Des femelles gestantes sont opérées pendant 45 minutes sous anesthésie générale pour une électroporation in utero, puis les souris transgéniques ou issues des embryons électroporés passent 6 h 40 de tests de comportement répartis sur un mois. L'anesthésie peut entraîner dans de rares cas une hypothermie, une détresse respiratoire ou un arrêt cardio-respiratoire, et la chirurgie un risque d'infection. Le porteur attend des effets sur la mémoire de travail, l'anxiété et la mémoire sociale, sans nommer les tests qui doivent les mesurer.

Objectifs

Des études récentes montrent que les mutations de certains gènes augmentent considérablement le risque de schizophrénie, une pathologie invalidante qui touche environ un pour cent de la population adulte et se caractérise notamment par des idées délirantes, un retrait social, des difficultés de concentration et de planification. L’ensemble de ces symptômes de la schizophrénie sont mal traités par les médicaments actuellement disponibles, et les effets secondaires de ces traitements sont importants. L’impératif de trouver des traitements efficaces implique de mieux comprendre les fondements neurobiologiques de la schizophrénie. Bien que rares, les mutations génétiques qui confèrent un risque fortement accru de développer la schizophrénie permettent d’identifier des mécanismes neurobiologiques impliqués dans la pathologie.

Bénéfices attendus

La schizophrénie est une pathologie courante (500 000 à 600 000 patients en France) et très invalidante. Les traitements pharmacologiques de la schizophrénie traitent principalement les symptômes positifs (par exemple, les hallucinations et les délires) et la réponse aux médicaments antipsychotiques existants est très variable, avec environ 30 pour 100 des patients classés comme résistants au traitement. Les grandes classes d’antipsychotiques et leurs modes d’action ont très peu évolué au cours des 50 dernières années. Le manque de progrès dans le développement thérapeutique est en grande partie une conséquence de notre compréhension limitée des troubles moléculaires sous-jacents. Très récemment, des mutations rares mais pénétrantes (qui augmentent très fortement le disque de la pathologie) dans certains gènes spécifiques ont été identifiées. Ces mutations sont très informatives car 1) elles ciblent un gène donné et 2) elles peuvent être modélisées chez l’animal. Les résultats de notre projet pourraient permettre, en modifiant l’expression d’un gène impliqué dans la schizophrénie dans les neurones de souris, d’identifier des mécanismes cellulaires et moléculaires qui sont pertinents pour comprendre les mécanismes de la schizophrénie, et possiblement d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

1) Femelles gestantes : chirurgie sous anesthésie générale (45 minutes) avec utilisation d’une analgésie (anti-douleur). Injection d’un composé par voie intrapéritonéale (5 minutes) 2) Souris transgéniques ou issues d’embryons électroporés : Tests de comportement (6h40 en tout, répartis sur un mois). Une euthanasie sera réalisée selon une méthode réglementaire, permettant les prélèvements et analyses ultérieurs.

Impact sur les animaux

La perte d’expression du gène étudié par électroporation in utero sera localisée uniquement dans le cerveau au niveau du cortex frontal. De ce fait, les phénotypes comportementaux liés à la perte d’expression devraient affecter sélectivement des comportements dépendants du cortex frontal (mémoire de travail, anxiété, mémoire sociale). Dans le cadre de la chirurgie, des nuisances sont attendues en période post-opératoire, correspondant à la cicatrisation. La chirurgie peut induire un risque infectieux et de douleur associée à l’infection. L’anesthésie utilisée peut induire dans de rare cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardio-respiratoire. L’injection intrapéritonéale implique une contention et donc un stress momentané. Un stress léger lié à la découverte de l’environnement du test des différents tests de comportements est attendu.

Devenir

Pour chaque procédure, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

L’étude d’un système intégré, requis pour la modélisation des altérations du cerveau associées à une pathologie psychiatrique, nécessite d’avoir recours à des animaux. De plus, notre étude de l'impact de la diminution d’expression d’un gène associé à la schizophrénie sur le fonctionnement du cortex nécessite d'utiliser des animaux pour pouvoir tirer des conclusions comportementales. Pour ces raisons, seule l’utilisation d’animaux permet d’aborder les mécanismes de régulation des fonctions corticales dans le cadre de cette étude. Cependant, notre laboratoire, dans le cadre de projets portant sur le même thème (bases neurobiologiques de la schizophrénie) utilise aussi des modèles de cellules pour des caractérisations d’effets génétiques.

Réduction

La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats significatifs et reproductibles. Sur la base de résultats d’expériences utilisant des techniques similaires, nous pouvons déterminer la taille des groupes grâce au calcul de puissance.

Raffinement

Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux de 5 individus maximums et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront exclus du protocole. Dans tous les protocoles, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux utilisés par la mise en place de période d’accoutumance et l’emploi d’anesthésiants et antalgiques adaptés. L’évaluation de la souffrance sera basée sur un suivi quotidien (attitude corporelle, aspect du pelage, poids corporel) de sorte à administrer un traitement antalgique supplémentaire, ou sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites établis.

Choix des espèces

Le choix de l'espèce Mus musculus (souris) repose en premier lieu sur l’anatomie du cerveau de souris qui est très bien caractérisée, ainsi que sur le fait que les grandes étapes de développement du cerveau, les systèmes de neurotransmission et la répartition et la fonction des aires cérébrales sont bien conservés entre souris et être humain. Ces paramètres sont importants dans le contexte de l’étude de mécanismes impliqués dans une pathologie humaine. Ce choix est aussi dicté par la possibilité d’effectuer chez la souris des manipulations qui permettent de cibler une population neuronale générée à un point précis du développement prénatal. Les souris impliquées dans l’étude du développement neuronal prénatal sont des embryons à un stade de développement embryonnaire qui permet d’étudier à la fois les conséquences de la modification d’expression du gène étudié sur la prolifération et sur la migration des neurones immatures. Les souris impliquées dans l’étude du développement neuronal posnatal sont des souris juvéniles (15 à 25 jours) ou jeunes adultes (60 à 100 jours).

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie deux greffes sous-cutanées de cellules cancéreuses humaines de côlon, pancréas, foie ou poumon, dont la croissance est suivie trois fois par semaine avant la mise à mort et le prélèvement des tumeurs. Le porteur indique que la croissance des tumeurs sous la peau peut provoquer une douleur modérée. Le projet vise à constituer un panel de tumeurs de patients pour de futures greffes, un modèle dont il affirme qu'il ne peut être remplacé par des cellules en culture faute de reproduire la complexité de l'"organisme entier".

Objectifs

La compréhension de la biologie des tumeurs est au cœur de la recherche actuelle. Issue de cette explosion de données et de connaissances, une multitude de thérapies ciblées a pu voir le jour. Ces dernières ont pour la plupart été préalablement testées sur des modèles animaux et reposent sur leur efficacité contre le cancer dans des expériences de greffe chez la souris qui consiste à injecter dans des souris des cellules cancéreuses. La sélection de nouvelles molécules repose notamment sur leur efficacité anticancéreuse dans des modèles animaux greffés. Dans ces derniers, des cellules cancéreuses issues de patients sont injectées dans des souris afin d’y faire se développer une tumeur et d’évaluer l’activité de ces molécules. Cependant, l’efficacité anticancéreux de ces molécules sur de telles greffes et sur les tumeurs issues de patients est souvent faiblement corrélée. L’amélioration du pouvoir de prédiction de ces modèles animaux peut être obtenue grâce à des modèles de greffe dérivée de la tumeur du patient dans lesquels un fragment du cancer du patient est greffé dans les plus brefs délais chez des souris. De plus, lorsque la tumeur est implantée, ces tumeurs issues de patients permettent parfois de mimer l’apparition de métastases. Pour ces raisons, un effort est actuellement en cours afin de générer un panel représentatif de tumeurs de patients pour chaque sous-type de cancer et plus particulièrement en ce qui nous concerne, les cancers (côlon, pancréas, foie et poumon). Le but de cette étude est d’établir un panel de différentes tumeurs de patients issus des 4 organes déjà cités, tumeurs qui pourront ainsi être des modèles cellulaires cancéreux qui seront greffés dans les modèles animaux dans nos futures études.

Bénéfices attendus

Communément, lorsque l’on parle de greffes, on fait référence au modèle qui consiste à injecter dans des souris des cellules cancéreuses. Pour la plupart des types tumoraux, des cellules ont pu être établies et sont fréquemment utilisées pour greffer des souris. Les cellules cancéreuses sont couramment utilisées car elles sont faciles à amplifier. Elles sont souvent bien caractérisées et relativement stables au cours du temps. Cependant, elles présentent quelques désavantages : i) une erreur de sélection lors de leur établissement et de leur propagation en culture, ii) une perte de l’aspect tridimensionnel de la tumeur puisque la plupart de ces cellules cancéreuses croissent en deux dimensions formant un tapis cellulaire ; iii) une perte de communication entre les cellules de l’environnement de la tumeur (cellules sanguines et immunitaires) et les cellules de la tumeur. Afin de palier la majorité de ces inconvénients, un modèle amélioré de greffe est de plus en plus utilisé : il s’agit de la greffe dérivée de la tumeur du patient. Ce modèle résulte d’une implantation après dissociation d’un fragment tumoral du patient fraîchement prélevé, chez des souris. La greffe dérivée de la tumeur du patient va alors se stabiliser et conserver dans la plupart des cas les caractéristiques pathologiques de la tumeur humaine initiale. Néanmoins, au vu de leurs avantages, les greffes dérivées de tumeurs de patients ont vu leur développement s’accélérer depuis quelques années et offrent aujourd’hui une approche pertinente pour mieux comprendre le développement des cancers afin d’explorer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

On réalise deux injections sous la peau de souris femelles adultes (1 injection sur chaque flanc de l'animal), de cellules cancéreuses humaines de côlon, pancréas, foie ou poumon sous anesthésie. Les cellules vont s’implanter à l’endroit de l’injection et commencer à croître. Cette injection dure moins de 30 secondes. La taille des tumeurs va être suivie par mesure régulière à l'aide d'un pied à coulisse électronique. L’ensemble des souris sera alors évalué 3 fois par semaine quant à leur état général, leur poids et la taille des tumeurs, mesurées à l’aide d’un pied à coulisse, au cours du temps.

Impact sur les animaux

(1) Un stress physique serait une nuisance induite par l’anesthésie lors de la xénogreffe et (2) une douleur modérée peut être engendrée par la croissance des tumeurs sous-cutanées. Les animaux ne subissent pas d'autres stress ou douleurs dans ce projet.

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés et les tissus cancéreux seront prélevés pour analyses, dissociation et mise en culture.

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être obtenues actuellement par d’autres méthodes compte tenu de la complexité physiologique de la tumeur comprenant plusieurs types cellulaires impossible à reproduire avec des cellules en culture, nous obligeant de travailler à l'échelle d'un organisme vivant entier. Des études sur cellules en culture sont, par ailleurs, prévues pour étudier d’autres paramètres qui complèteront ce volet d’expérimentation animale sans pouvoir le remplacer.

Réduction

Dans le but de répondre à la règle des 3R, nous avons déterminé le nombre d'animaux nécessaire et suffisant dans chaque sous-groupe pour avoir un nombre de cellules tumorales pour en evisager leur culture in vitro après la mort de l'animal et la dissociation des tumeurs. Dans le but de réduire le nombre d'animaux par groupe, celui-ci sera de 2 souris chacune implantée de 2 tumeurs issues de patients sur chaque flanc (droit et gauche), c'est à dire 4 tumeurs implantées par prélèvement issu de patient, ceci dans le but d’obtenir suffisamment des cellules tumorales issues de patients à mettre en culture in vitro en fin d’expérience. Ce nombre de 2 souris par tumeur issues de patient est le nombre suffisant pour obtenir une quantité utile de cellules (2 à 5 millions) pour envisager leur culture in vitro. Ce résultat est le fruit de l'expérience de ce type de procédure qui a déjà été proposé dans de multiples demandes d'autorisation à expérimention animale précédentes.

Raffinement

Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les animaux seront anesthésiés au moment de la greffe des cellules cancéreuses sous la peau. Au cours de l’expérience, une surveillance visuelle quotidienne et un suivi clinique (3 fois par semaine) seront réalisés dans le calme pour limiter au maximum le stress des animaux. L’administration d’analgésique sera réalisée si nécessaire (en cas de douleur). Des conditions d’hébergement standard adaptées sont appliquées avec une alimentation standard sans limite de quantité. Enfin, un enrichissement composé de coton et de lanières cartonnées en accordéon sera proposé aux animaux afin qu’ils puissent se confectionner des nids.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser l’espèce souris dans notre projet de recherche car la physiologie des cancers du côlon, du pancréas, du foie et du poumon induits dans cette espèce animale est proche de celle chez l’Homme. De plus, ce modèle apporte 2 autres avantages : sa taille et sa masse qui limite les quantités de traitement à administrer et le nombre extrêmement grand d'outils biologiques qui permettent la caractérisation des tissus cancéreux chez la souris. Les souris utilisées sont des femelles adultes pour que les animaux restent au même stade de développement tout au long de l’expérience. Nous avons privilégié des femelles pour limiter les conflits entre mâles hébergés dans une même cage.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit de la vincristine, un anticancéreux qui provoque une hypersensibilité douloureuse au toucher, mesurée par l'application de filaments sous la patte à plusieurs reprises, avant que les animaux soient tués pour l'analyse des nerfs. Le porteur affirme que les souris ne présentent en dehors des tests aucun signe de souffrance ni de perte de poids, et teste un composé censé prévenir cette neuropathie. Les bénéfices avancés, un futur essai clinique chez des patients sous chimiothérapie, sont renvoyés au conditionnel et au long terme.

Objectifs

Les neuropathies périphériques induites par la chimiothérapie sont le second effet indésirable le plus fréquent après l’hépatotoxicité. Dans le domaine de l’onco-hématologie, la vincristine, un agent anticancéreux commumément utilisée pour la prise en charge des lymphomes, constitue une des chimiothérapies les plus neurotoxiques et est responsable de la neuropathie induite par la vincristine, caractérisée notamment par l'apparition d'une hypersensibilité tactile douloureuse. Cette complication impacte autant la qualité de vie des patients que la bonne mise en œuvre des protocoles de chimiothérapie. Pour autant, il n’existe à ce jour aucune stratégie pharmacologique préventive reconnue. Avec une incidence croissante de 25 millions de cancers par an à travers le monde, on comprend que le développement de telles stratégies neuroprotectrices constitue un enjeu de santé publique. Le système rénine-angiotensine, bien connu dans la régulation de la pression artérielle, est également exprimé au niveau du système nerveux périphérique. Il a déjà été démontré que la modulation pharmacologique des récepteurs à l’angiotensine II, permettait d’exercer un effet neuroprotecteur dans plusieurs modèles murins de neuropathie induite par la chimiothérapie.

Bénéfices attendus

Le système rénine-angiotensine, bien connu dans la régulation de la pression artérielle, est également exprimé au niveau du système nerveux périphérique. Certains éléments du système rénine angiotensine, peu étudiés, pourraient jouer un rôle important dans les phénomènes de neuroprotection/neurorégénération du nerf périphérique. L’activation d'un récepteur du systéme rénine-angiotensine présenterait des propriétés analgésique et neurorégénérative au niveau du système nerveux périphérique. Nous supposons que l'activation de ce récepteur par un traitement préventif pourrait également avoir des effets neuroprotecteurs en l’administrant avant la chimiothérapie. A court terme, nous nous attendons à ce que ce traitement préventif améliore la sensibilité tactile chez des animaux ayant reçu de la vincristine et présentant une hypersentibilité tactile, et restaure/prévienne également les altérations morphologiques des tissus du système nerveux sensitif induites par la chimiothérapie. A plus long terme, nous espérons réaliser la même étude sur nos modèles de neuropathie induite par le paclitaxel et l’oxaliplatine, deux autres agents anticancéreux neurotoxiques, avec un effet bénéfique attendu du traitement préventif sur les troubles sensitifs et les atteintes nerveuses induites par les chimiothérapies. La mise en évidence d’un effet neuroprotecteur du traitement préventif dans nos modèles animaux permettrait de faciliter la translation chez l’Homme, avec la mise en place rapide d’un essai clinique évaluant son effet sur le développement des neuropathies induites par la chimiothérapie.

Procédures

Chaque animal (soit 100 animaux) recevra une injection intrapéritonéale quotidienne pendant 7 jours. Sur les 100, 35 animaux subiront une injection i.p. le matin du traitement préventif puis une injection i.p de vincristine l'après-midi. Sur ces 35 animaux, 10 recevront en plus une injection sous-cutanée d'un bloqueur une heure avant l'i.p. du traitement préventif. L'ensemble des animaux sera également soumis au test des filaments qui permet d'évaluer le dégré de sensibilité tactile, une fois avant le début des traitements puis à J1, J3 et J7. L'injection intrapéritonéale a été privilégiée par rapport à l'injection intra-veineuse. Les injections seront répétées tous les jours pendant 7 jours, ainsi la répétition des injections sera plus aisée en intrapéritonéal qu'en intraveineux. La pose d'un cathéter a été exclu afin de garantir une liberté de mouvement totale à l'animal nécessaire pour le test comportemental. L'injection du bloqueur, qui n'est pas un produit irritant, se fera en sous-cutanée, afin de ne pas dépasser le nombre de deux injections i.p. par jour.

Impact sur les animaux

Nous avons déjà dévellopé et caractérisé le modèle de neuropathie induite par la vincristine. Dans ce modèle, nous observons l’apparition d’une allodynie mécanique suite à l’administration de vincristine. Cette allodynie se traduit par une hypersensibilité en réponse à un stimulus focalisé qui est l’application d’un filament sur la voute plantaire. Les animaux ne présentent aucun trouble moteur (la coordination motrice et la force musculaire ont été évaluée). En dehors de la phase de test, les animaux ayant reçu de la vincristine présentent un comportement tout à fait similaire aux animaux témoins. Ils ne présentent aucun signe de souffrance ou de perte de poids. Ainsi, nous nous attendons à ce que les animaux recevant de la vincristine et le traitement préventif présentent une amélioration de leur symptômes, à savoir un retour à la normale de la sensibilité tactile.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les éventuelles altérations morphologiques associées à la vincristine et aux traitements seront mises en évidence par l’analyse histologique et immunohistologique des tissus du système nerveux sensitif. L'ensemble des animaux seront mis à mort, puis les tissus d'intérêts seront prélèvés sur chaque animal.

Remplacement

Il n'existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l'expérimentation animale disponible qui reproduit l'ensemble des mécanismes mis en jeu à la génération d'une douleur induite par des cytotoxiques anticancéreux. Nous avons choisi un modèle dont la séquence d'injection des agents anti-cancéreux est la plus conforme aux protocoles de chimiothérapies neurotoxiques utilisés chez l'Homme. En parallèle de cette étude chez la souris, une étude in vitro évaluant l'effet de la vincristine et de sa combinaison avec le traitement préventif sur des neurones sensitifs humains dérivés est en cours. Ce modèle cellulaire nous permet de déterminer les mécanismes physiopathologiques (neurotoxicité, hyperexcitabilité, dérégulation du transport axonal, ...) mis en jeu au niveau du neurone sensitif humain, mais exclut les phénomènes de neuroinflammation inhérents aux neuropathies induites par la chimiothérapie, ainsi que toute la complexité des phénomènes aboutissant à la sensation douloureuse.

Réduction

Le nombre de 10 animaux par groupe a été calculé à partir de résultats (moyenne et écart-type) obtenus au cours d'une étude sur le modèle de neuropathie induite par la vincristine. L'analyse statistique sera réalisée à l'aide de deux logiciels. Pour réduire le nombre d'animaux, chacun subira toutes les expérimentations les unes après les autres dans l'ordre chronologique : les injections, le test de comportement puis la mise à mort pour prélèvements en fin d'expérimentation. Les prélèvements seront effectués sur chaque animal mort avant qu'il soit placé dans le congélateur de cadavres.

Raffinement

Une étude pilote permettra d'évaluer l'effet du traitement préventif sur l’état général des animaux et le développement d'une neuropathie sensitive sans troubles moteurs dans nos conditions d"hébergement : l’apparition de signes de souffrance ou de toxicité sera évaluée à l’aide d’une grille de suivi biquotidien et l'apparition de la neuropathie sensitive sera évaluée à l'aide d'un test d'évaluation de la sensibilité tactile. Si le score pour au moins 1 souris est supérieur à 10 alors cette étude pilote sera renouvelée avec des doses deux fois inférieures. Si aucun signe de souffrance ou de toxicité n’est observé au cours de cette étude pilote, et que le traitement préventif ne présente pas d’effet positif sur la neuropathie, alors la même étude sera réalisée sur deux nouveaux groupes de 5 souris. Si aucun signe de souffrance ou de toxicité n’est observé au cours de l’étude pilote, et que le traitement préventif présente un effet positif sur la neuropathie alors nous procèderons à l’étude principale, à la dose efficace. Les animaux seront élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Un temps d'habituation et/ou d’entrainement sera respecté pour chaque test comportemental afin de limiter le stress de l’animal et de réduire la variabilité des résultats. Seul un test d'évitement sera utilisé pour l'évaluation de la sensibilité, et une valeur limite est établie pour chaque test à partir de laquelle l’animal est soustrait au stimulus même s’il ne présente aucun signe d'évitement. Les animaux exposés à la vincristine et/ou au traitement préventif doivent présenter un comportement naturel similaire aux animaux contrôle pour pouvoir participer à l'analyse comportementale. Les animaux présentant des signes de fatigue, troubles moteurs ou souffrance qui pourraient générer un biais dans les réponses au test comportemental seront retirés du protocole. L’équipe de recherche maitrise les modèles de neuropathie chimio-induite et les tests de sensibilité associés qui requiert un savoir-faire et un suivi précis des réactions de l'animal.

Choix des espèces

Des modèles murins de neuropathie induite par la chimiothérapie ont déjà été validés, publiés et ont montré leur intérêt pour tester l'effet neuroprotecteur de molécules. Leur physiopathologie est très proche de celle de l'Homme. Nous utilisons un équipement adapté à la souris. Ce matériel est maitrisé par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point et d’éviter une source de stress supplémentaire pour l’animal. Pour obtenir des résultats statistiquement fiables, malgré les faibles effectifs par lot, nous utilisons des souris présentant le moins de variabilité : même fond génétique, même âge, poids identique. Ces conditions sont les mieux réunies avec des adultes jeunes (7-8 semaines, poids 25-30g).

390 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par chirurgie une greffe sous-cutanée de tumeur pulmonaire humaine, puis des injections deux fois par semaine et un gavage quotidien pendant quatre semaines, avant d'être tuées à l'atteinte d'un point limite ou au bout de quatre-vingt-dix jours. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer une gêne et une perte de poids, et qualifie de "non toxiques" les composés administrés. Il décrit une étude exploratoire sans test statistique, dont les retombées pour les patients atteints de ce cancer rare restent renvoyées à l'avenir.

Objectifs

Nous travaillons sur les cancers du poumon avec une fusion NRG1. Cette fusion est un évènement très rare (moins de 1% des cancers du poumon non à petites cellules) et les patients ne répondent pas aux traitements ou sur une durée très limitée. Les modèles d’étude sont rares. Ce projet a deux objectifs : 1/ d’établir des modèles d'étude de cette pathologie dans la souris, à partir d'échantillons de patients. Ces modèles sont des modèles de choix pour évaluer l’efficacité d’une thérapie et ses effets néfastes à l’échelle de l’organisme ; 2/ d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle stratégie thérapeutique dans ces modèles. Ce projet pourrait permettre de proposer à l'avenir une meilleure prise en charge aux patients.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine. En effet, il n’y a pas aujourd’hui de stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de cancer du poumon avec une fusion NRG1. L’établissement de modèles dérivés de patients permettra de valider l’efficacité d'un nouveau traitement, seul ou en association avec un inhibiteur déjà utilisé en clinique, dans ce contexte dans des modèles robustes.

Procédures

Implantation de tumeurs en sous-cutané, chirurgie, degré de gravité modéré, durée du geste : 10 minutes - Pousse tumorale : gêne si le volume tumoral atteint le point limite - Injection intrapéritonéale (2 fois par semaine pendant 4 semaines), durée du geste : quelques secondes et gavage (une fois par jour, 5j/7, pendant 4 semaines), durée du geste : quelques secondes de composés thérapeutiques non toxiques - Pesée et mesure de tumeur : contention et geste de quelques minutes

Impact sur les animaux

Chirurgie pour implantation de tumeur en sous-cutané (degré de gravité modéré) - Développement tumoral : gêne si le volume tumoral atteint le point limite - Perte de poids possible - Pesées et suivi tumoral : stress lors de la contention et du geste (quelques minutes) - Gavage : irritation

Devenir

Tous les animaux ayant atteint un point limite, ou 90 jours après la greffe si aucun point limite n'est atteint, seront mis à mort. Les tumeurs seront collectées et analysées.

Remplacement

Les échantillons de patients sont précieux et la mise en culture in vitro difficile. La génération de modèles de cancers du poumon humain dans les souris permettra d'intégrer les cellules tumorales dans l'environnement d'un organisme entier et des interactions qui en découlent. De plus la sensisbilité des cellules tumorales aux traitements anticancéreux dépend fortement du microenvironnement. Pour ces différentes raisons, nous devons effectuer cette étude sur la souris. Avant le passage dans les souris, l’efficacité du nouveau traitement a été validée in vitro.

Réduction

Cette étude est exploratoire et descriptive. Nous avons choisi des effectifs permettant une analyse 'pilote' pertinente et une reproductibilité des résultats tout en réduisant au maximum le nombre d'animaux. Aucun test statistique ne sera effectué.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés et sensibilisés aux manipulateurs pendant 7 jours afin de limiter le stress. Les souris seront surveillées quotidiennement, pesées chaque semaine et nous serons attentifs à leur état général (prostration de l’animal, poil hérissé, difficultés locomotrices) à chaque visite afin de détecter rapidement une souffrance ou l'atteinte d'un point limite. Toutes les précautions seront prises pour détecter et minimiser la souffrance, la douleur et le stress des animaux. Les conditions d'hébergement des animaux permettent d'éviter l'apparition de phénotype dommageable. Les animaux sont hébergés en groupe de 6 souris par cage pour répondre au besoin de socialisation et chaque cage présentera des enrichissements. La chirurgie sera réalisée après anesthésie des animaux.

Choix des espèces

Nous proposons d’établir des modèles dérivés de patients atteints de cancer du poumon et d’évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement. Une souche murine fortement immunodéprimée est nécessaire pour éviter le rejet des tissus implantés et favoriser la prise de greffe d'origine humaine. Les autres modèles de mammifères immunodéprimés sont peu nombreux, il est préférable d’avoir recours aux modèles murins. L'efficacité du traitement a été évalué in vitro. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

368 souris et 136 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des ultrasons focalisés destinés à ouvrir la barrière protégeant le cerveau, avec injection de microbulles et d'agent de contraste, certains subissant en plus une chirurgie et jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que l'ouverture de la barrière peut provoquer une inflammation cérébrale transitoire et que les animaux présentant des effets visibles en imagerie sont tués sans réveil. Les retombées annoncées, un meilleur passage des médicaments contre les cancers du cerveau et une thérapie génique du syndrome de l'X fragile, sont renvoyées au conditionnel.

Objectifs

La principale limite à l’efficacité des thérapies dans le cerveau est leur accès restreint en raison d'une barrière protégeant le cerveau qui limite le passage de la majorité des médicaments. Récemment, les ultrasons guidés par imagerie de résonance magnétique et associés à des microbulles ont attiré l’attention en tant que moyen non invasif pour permettre temporairement ce passage. Pour améliorer les traitements, il faudrait pouvoir faire passer ceux-ci plusieurs fois d'affilée au travers de cette barrière. Dans cette étude nous étudierons donc les effets de cette méthode au niveau des vaisseaux sanguins mais aussi l’intérêt de plusieurs ouvertures en faisant des analyses sur le tissu cérébral sain. Dans un second temps nous évaluerons le potentiel thérapeutique de cette méthode chez des rats et des souris présentant le syndrome de l'X fragile, une maladie neuro développementale due à la déficience d'un gène menant à des problèmes de développement du cerveau. Notre but sera donc de déterminer les meilleures conditions d’ouverture de la barrière dans le cerveau (temps d’ouverture, taux d’augmentation du passage des molécules) afin d’améliorer le passage de molécules thérapeutiques de manière non invasive. En plus des données que nous obtiendrons par imagerie par résonance magnétique et l'acquisition des signaux reflétant le caractère réversible ou non de l’ouverture de la barrière, nous évaluerons le passage des molécules d’intérêt et étudierons les changements morphologiques des vaisseaux ayant reçu une onde ultrasonore afin d’en évaluer leur intégrité après traitement. La caractérisation de ces effets permettra d’optimiser les conditions pour déposer localement des médicaments dans un cadre thérapeutique. Pour la partie applicative, nous évaluerons le potentiel thérapeutique de l'injection de thérapie génique chez des souris mimant le syndrome de l’X fragile.

Bénéfices attendus

Les ultrasons représentent un espoir majeur de traitement de nombreuses pathologies cérébrales. Dans le cas des cancers cérébraux, la moyenne de survie chez l'homme est de 15 mois environ. Chez l'animal, plusieurs études ont montré que l'on pouvait guérir des cancers cérébraux, ce qu'aucun essai préclinique n'avait montré jusqu'ici. Les essais cliniques chez l'homme sont en cours. Nous souhaitons ici évaluer des approches plus performantes que les traitements habituels et profiter d'une délivrance par ultrasons. Avec le développement en cours des ultrasons chez l'homme, les méthodes que nous proposons pourraient être rapidement bénéfiques chez l'humain. Dans le cas du syndrome X fragile, une maladie génétique, nous souhaitons évaluer le potentiel des ultrasons pour réaliser de la thérapie génique. Cette approche pourrait permettre de corriger, au niveau génétique, des anomalies localisées dans le cerveau.

Procédures

Suivant les procédures, une partie des animaux subiront des chirurgies sous anesthésie et n'excedant pas 30 minutes. Tous les animaux seront exposés à des tests d'imagerie médicale pour une durée maximale de 2h, anesthésie incluse. Les animaux peuvent être amenés à participer à plusieurs séances d'imagerie (8 au maximum), dans ce cas celles-ci seront espacées d'au moins 24h. Pour les besoins de l'imagerie médicale effectuée dans ce projet, une partie des animaux recevront une injection d'agent de contraste. Tous les animaux recevront une séquence ultrasonore ainsi qu'une injection intraveineuse d'une solution de microbulles. Les injections de produits à visée thérapeutiques sera aussi effectuée sur une partie des animaux.

Impact sur les animaux

L'utilisation des ultrasons focalisés guidés par imagerie de résonance magnétique peuvent provoquer une inflammation transitoire du cerveau qui se résorbe au bout de quelques jours. Cette inflammation est un effet normal dû à cette procédure qui ne provoque pas de dommages apparents pour l'animal. Si des effets néfastes sont visibles en imagerie, les animaux seront mis à mort sans réveil.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Le projet portant sur l’étude de la réponse d’organe entier (cerveau), et plus particulièrement la frontière à l'interface entre le système vasculaire et le système nerveux central, il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. De plus, il n'existe pas à ce jour de méthodes alternatives, n'impliquant pas d'animaux vivants, qui permettent l'étude de l'effet sur le cerveau du passage de particules virales à travers la barrière grâce aux ultrasons. L’étude qui en découle comporte des analyses biologiques afin d'évaluer l’impact des ultrasons qui ne sauraient être remplacés par un modèle informatique ou cellulaire.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé avec l’aide d’un logiciel permettant d’évaluer le nombre d’animaux minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives sur les paramètres à mesurer (données préliminaires obtenues dans d’autres expériences). Ce nombre tient compte des risques de mort et d’exclusion d’un animal lors des différentes procédures. Le nombre d’animaux nécessaires à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats.

Raffinement

Les animaux seront herbergés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l'hébergement des animaux fixés par le ministère, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l'environnement. Toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance des animaux. L’ensemble des expérimentations seront réalisées sous anesthésie adaptée. Dans le cas où certains signes seraient observés, un traitement antalgique adapté sera mis en place.

Choix des espèces

L’ensemble des animaux sera utilisé à l'âge adulte (6 à 9 semaines pour la souris et 6 à 8 semaines pour le rat).

24 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie endoscopique de deux à trois heures pour la pose d'un dispositif anti-obésité, puis six anesthésies générales échelonnées sur trois mois pour des radiographies et des prises de sang, avant d'être tué et disséqué. Le porteur reconnaît une série de complications possibles, lésions digestives, infection, obstruction, déplacement du dispositif et carences. Le projet teste, pour une entreprise, la sécurité d'une alternative endoscopique à la chirurgie bariatrique, présentée comme "nécessaire" faute d'adhésion des patients à la chirurgie actuelle.

Objectifs

Le traitement de l’obésité est un enjeu sanitaire majeur. L’objectif du projet est de développer un dispositif médical délivré par voie endoscopique (c’est-à-dire par la bouche et l’œsophage) afin de traiter l’obésité. La solution proposée serait une alternative à la chirurgie bariatrique (chirurgie traitant l’obésité) tout en étant aussi efficace que celle-ci et en minimisant les complications associées. En effet, la chirurgie bariatrique est pratiquée sur moins de 2% des patients éligibles en France, ceci étant notamment dû aux complications associées. Une première phase de tests a été réalisée sur des modèles in vitro (en laboratoire) et ex vivo (cadavres humains et animaux). La seconde phase, sur modèles in vivo (animaux) et objet de cette demande d’autorisation, a pour objectif de développer un dispositif avec la simulation des phénomènes physiologiques attendus chez les patients humains (en particulier le phénomène de péristaltisme, c'est-à-dire le phénomène de contractions permettant aux aliments d'avancer dans le système digestif). Dans un premier temps la sécurité du dispositif doit être testée. Si cette phase est validée, nous collecterons, dans un second temps, des données sur la performance de notre approche. Ainsi, au final, la phase animale nous permettra de développer un produit permettant de répondre à la problématique, de tester son innocuité et de mesurer son efficacité. Les données sur l’efficacité seront complétées par celles disponibles dans la littérature. Actuellement, l’implantation du dispositif par voie chirurgicale chez le porc est privilégiée puisque l’anatomie de ce modèle rend l’approche endoscopique complexe.

Bénéfices attendus

L’obésité est définie comme une présence anormale ou excessive de tissu adipeux représentant un risque pour la santé. Ce problème est devenu épidémique avec près de 4 millions de personnes décédant de comorbidités liées au surpoids et à l’obésité chaque année. D’après l’Organisation Mondiale de la Santé, près de 39% des adultes dans le monde, représentant près de 1.9 milliards de personnes, étaient en surpoids en 2016. On estime aujourd’hui que plus de 700 millions de personnes souffrent d’obésité. Bien que l’efficacité de la chirurgie bariatrique ne soit plus à démontrer, seul 2% des patients éligibles décident de se faire opérer à cause du risque de complications sévères et des modifications anatomiques irréversibles. Et pour les solutions moins invasives, comme les ballons gastriques, elles sont aujourd’hui associées à une perte de poids limitée et temporaire. Ce projet est nécessaire pour le développement d’une solution endoscopique afin de traiter l’obésité de manière aussi efficace que la chirurgie bariatrique tout en minimisant les complications associées. En effet, il permettra de vérifier la sécurité et potentiellement l’efficacité des dispositifs testés par l’entreprise.

Procédures

Pour chaque porc : • L’intervention chirurgicale sous anesthésie générale qui dure 2-3 h maximum avec radiographie et prélèvement sanguin au cours de cette anesthésie • Sous anesthésie générale à J0, J7, J14, J30, J60 et J90 soit 6 au total : o Les radiographies : chaque examen radiographique prenant 45 min, il y en a 6 au total o Les prélèvements sanguins sont réalisés au même moment que les radiographies. Chaque prélèvement prenant environ 2-3 min, il y en a 6 au total

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus résident surtout dans la douleur suite au placement du dispositif. Néanmoins, la littérature décrit une série de complications éventuelles : • Lésion du système digestif ; • Infection avec ou sans fièvre ; • Obstruction gastrique ou intestinale ; • Déplacement ou rotation du dispositif implanté ; • Carence en vitamines et minéraux ; • Trouble du transit ; • Vomissement ponctuel post-implantation ; • Réaction inflammatoire locale des tissus. Notre protocole prévoit de surveiller et anticiper ces complications.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort. Pour comprendre l’impact du prototype et statuer sur sa sécurité, il est nécessaire d’inspecter, d’examiner et photographier les zones entourant le dispositif incluant les muqueuses et les organes. Suivant la phase du projet, des prélèvements d’organes pourront être effectués pour observations macroscopiques et analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet vise à confirmer l’adéquation du dispositif en cours de développement avec le système digestif. Avant d’initier ce projet, des essais sur sujets cadavres humains et sur carcasses d’animaux ont été effectués afin de simuler la procédure et confirmer l’adéquation des dimensions des prototypes en cours de développement. Des premiers essais pour valider la sécurité ont été menés sur animaux vivants. Les tests de cette présente DAP s’inscrivent dans la continuité de ces tests en affinant les prototypes évalués précédemment. De plus, des essais in vitro ont été réalisés en laboratoire afin de simuler le déploiement du dispositif ainsi que son comportement lors de contraintes mécaniques simulant le péristaltisme. Néanmoins, la complexité et l’adaptabilité du système digestif limitent notre capacité à simuler l’environnement exact. Le dispositif étant à visée clinique, il est nécessaire d’obtenir des données dans ces conditions réelles d’utilisation, ainsi l'utilisation d'un organisme complet et vivant est indispensable, notamment pour le suivi post-implantation.

Réduction

Avant d’effectuer une étude de preuve de concept, une étude pilote a été réalisée en utilisant un nombre réduit d’animaux. Cette étude nous a permis d’obtenir des estimations de l'effet et de la variation qui peuvent servir à calculer la taille de l'échantillon d'études plus importantes. Avant d’effectuer l’étude de confirmation, une première phase de preuve de concept a été initiée en janvier 2023 en utilisant un nombre réduit d’animaux (n=10). Pour arriver à une confirmation de cette preuve de concept, un nombre de 9 animaux est nécessaire sur une base de 3 sessions de 3 animaux. Dans le cas où un nombre inférieur à 9 animaux permettrait de prouver la preuve de concept, la phase 2 sera initiée et la phase 1 terminée sans utiliser les 9 animaux initialement prévus. La preuve de concept sera démontrée si le dispositif répond aux attentes c’est-à-dire s’il est bien toléré et les données obtenues sont concluantes, notamment : paramètres cliniques acceptables, tolérances locales macroscopique et microscopique acceptables (évaluées par un pathologiste indépendant), troubles digestifs acceptables, absence d’obstruction gastrique. Dans le cas où la preuve de concept est démontrée (avec un nombre d’animaux ≤ 9), il sera décidé de passer à la phase 2 du projet (vérification). Pour cette phase, un nombre de 15 animaux sera nécessaire : 3 groupes de 5 animaux (un groupe avec suivi jusqu’à 1 mois, un groupe suivi jusqu’à 3 mois et un groupe contrôle). Dans le cas où la preuve de concept n’est pas démontrée, il sera décidé de relancer une étude afin d’améliorer les caractéristiques du dispositif, si celui-ci ne répond pas aux attentes. Cette étape permettra de réduire le nombre d’animaux (ne pas utiliser les 15 animaux prévus en phase 2).

Raffinement

Les porcs seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec enrichissements propres à l’espèce. Des enrichissements du milieu, tels que jouets en caoutchouc, sont mis à disposition. Les animaux auront un patch de fentanyl 3 jours après la chirurgie protégé par un bandage. Un isolement individuel pendant 24h après la chirurgie sera nécessaire afin de suivre individuellement l’état clinique des animaux (vomis, selles et urines). Pour compenser cet isolement de 24h, les animaux seront hébergés dans des box attenants avec contact olfactif et visuel. De plus, la température de la salle d’hébergement sera maintenue à 21± 2°C. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier habilité et habitué à travailler avec ces animaux. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. Tout acte douloureux ou fortement stressant sera réalisé sous sédation ou sous anesthésie (locale ou générale selon les besoins). La douleur sera prise en charge par l'administration de traitements analgésiques adaptés. En cas de perte de poids importante se rapprochant des 20%, les rations pourront être enrichies avec une solution de nutrition entérale hyperénergétique. Au cours de l’étude, une série d’examens sera effectuée afin de détecter les signes de douleur incluant : - Examens du comportement des animaux avec pesée au minimum hebdomadaire ; - Rayons-X avec ou sans agent de contraste (si indisponible échographie) ; - Examens sanguins afin de confirmer l’absence de carence et de signe d’infection.

Choix des espèces

Le Porc est l’espèce animale la plus étudiée dans la littérature pour la chirurgie bariatrique. En effet, elle possède de grandes similarités avec les humains au niveau du système gastro-intestinal en termes de dimensions et de physiologie. Pour les porcs, le critère de sélection principal sera le poids (environ 60-80 kg) afin d’avoir des correspondances anatomiques similaires à celles observées en clinique. Cela correspondra à des animaux adolescents.

120 saumons atlantiques et truites de mer vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, relâchés dans le milieu naturel après pose du matériel puis, pour une partie, recapturés et tués. Chaque poisson reçoit sous anesthésie un émetteur inséré dans l'estomac par la bouche et une puce RFID par trocart, un geste que le porteur décrit comme induisant un malaise passager et une douleur modérée. Les individus sont suivis par radiopistage jusqu'à la reproduction, certains mourant naturellement ou par pêche, d'autres euthanasiés à la recapture pour récupérer l'émetteur. L'étude vise à décrire la recolonisation d'un bassin côtier après l'arasement de barrages.

Objectifs

Les populations de saumon Atlantique et de truites de mer (Salmonidés) ont chuté de 70% depuis les années 1970. La France abrite des populations de ces espèces qui ont une très forte valeur patrimoniale et leur conservation est un enjeu fort. La fragmentation des cours d'eau par des ouvrages comme les barrages est une des causes principales du déclin de ces espèces et la reconnexion des habitats essentiels à l’accomplissement du cycle de vie est un levier pour gérer les populations. L'objectif du projet est d'évaluer les modalités de recolonisation, par les salmonidés migrateurs amphihalins, d'un bassin versant côtier suite à l'arasement de grands barrages. entre 2019 et 2022, une première phase du projet a eu vocation a décrire les déplacements des poissons dans le bassin versant avant l'arasement du barrage et a fourni un état de référence.

Bénéfices attendus

Les connaissances produites sur le comportement des poissons permettront de mieux gérer les populations en protégeant leur habitat par exemple.

Procédures

Les animaux sont soumis à 2 interventions consécutives (réalisées lors de la même anesthésie) et ponctuelles dans la même procédure : l'insertion d'un émetteur dans l'estomac via la bouche et l'oesophage à l'aide d'un tube poussoir et l'insertion d'une puce RFID pour l'identification à l'aide d'un trocart.

Impact sur les animaux

L'insertion d’un émetteur radio dans l’estomac par la bouche est susceptible d'induire un malaise passager (par la suite, la présence de l'émetteur dans l'estomac par la suite est supposé ne pas être problématique car les individus ne s'alimentent plus à ce stade de leur développement). L'insertion d’une puce électronique RFID pour identification à l'aide d'un trocart dans la cavité générale des salmonidés est susceptible d'induire une douleur modérée. Ces interventions sont réalisées sous anesthésie de façon à limiter les nuisances.

Devenir

Après l'insertion du matériel biologique entre juin et août, les poissons sont relâchés dans le milieu naturel pour être suivi par radiopistage jusqu'à la reproduction qui a lieu en décembre. A l'issue de cette période, soit les individus sont morts naturellement ou par pêche, soit ils sont recapturés après la reproduction et euthanasiés par surdose d'anesthésique de façon à récupérer l'émetteur et les données enregistrées.

Remplacement

L’objectif étant l’apport de connaissances sur les comportements migratoires et l’utilisation de l’habitat de ces deux espèces en milieu naturel, le remplacement est impossible.

Réduction

Le nombre annuel d’adultes du genre Salmo (40, essentiellement des saumons, les truites de mer étant très rares dans les captures) résulte d'un compromis entre 3 éléments : 1- la nécessité de ne pas impacter significativement les populations sauvages (par ailleurs sujettes à la pêche de loisir) et la difficulté de capturer les individus. 2- l'acquisition d'une quantité de données suffisante pour fournir une image de la diversité des comportements. L'expérience de 4 années de suivi montre que les comportements varient entre individus au sein d'une année, mais également d'une année à l'autre (en lien avec les conditions environnementales notamment). Ainsi, l'accumulation de données sur plusieurs années est nécessaire pour bien décrire la migration des salmonidés. 3- Il existe une mortalité naturelle et liée à la pêche de loisir (cette dernière pouvant atteindre 10% des effectifs de poissons étudiés) qui réduit les effectifs au cours de l'étude.

Raffinement

Les principales mesures de raffinement concernent la limitation des nuisances (angoisse et douleur) lors de la manipulation des animaux avant, pendant et après les procédures. Les poissons capturés seront anesthésiés avant toute manipulation. Les conditions environnementales d'importance première pour les poissons (température et oxygénation de l'eau) seront contrôlées avant, pendant et après la capture et l'opération. Les individus seront gardés en observation dans un vivier placé dans la rivière afin de contôler la façon dont ils récupèrent de l'anesthésie et seront relâchés lorsqu'ils auront retrouvé un comportement actif normal (équilibre dans la colonne d'eau, nage).

Choix des espèces

Les populations de saumon Atlantique et de truites de mer (Salmonidés) ont chuté de 70% depuis les années 1970. La France abrite des populations de ces espèces qui ont une très forte valeur patrimoniale et leur conservation est un enjeu fort. La fragmentation des cours d'eau par des ouvrages comme les barrages est une des causes principales du déclin de ces espèces et la reconnexion des habitats essentiels à l’accomplissement du cycle de vie est un levier pour gérer les populations. L'objectif du projet est d'évaluer les modalités de recolonisation d'un bassin versant côtier suite à l'arasement de grands barrages par les salmonidés migrateurs amphihalins. Les individus seront des adultes de retour en rivière après la phase de croissance en mer. Les connaissances sur ce stade de vie sensible sont encore très éparses, mais on sait que les individus sont exposés à de multiples stress en particulier les modifications de la continuité écologique qui peut réduire l'accès aux sites de reproduction situés en amont.

374 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un implant hormonal sous chirurgie, une greffe de cellules de cancer du sein dans la glande mammaire, des injections répétées de nanoparticules magnétiques, l'application d'un champ magnétique et des séances d'imagerie, avant d'être tuées pour prélèvement des tumeurs et des organes. Le porteur indique un risque d'infection, de nécrose tumorale, de perte de poids et de lésions liées aux injections. Les nanoparticules sont présentées comme une alternative "moins coûteuse" aux anticorps conjugués contre les cancers triple négatifs.

Objectifs

Malgré les avancées notables dans la prévention, le dépistage et la prise en charge du cancer du sein, celui-ci reste un problème de santé publique majeur en raison de ses taux alarmants d’incidence et de mortalité prématurée dans le monde. Le cancer du sein est une maladie très hétérogène. Les cancers mammaires les plus agressifs et les plus résistants aux traitements conventionnels sont appelés triples négatifs. C’est pourquoi développer des nouvelles thérapies capables de cibler spécifiquement ce type de cancer est plus que nécessaire. A ce titre, des anticorps conjugués à des médicaments (ADC) ont été récemment développés et mis sur le marché. Cependant, la production d'ADC est très complexe, longue et surtout coûteuse. Il est donc nécessaire de développer une alternative aux ADCs offrant une nouvelle voie pour le traitement du cancer. Notre projet s’inscrit dans cette logique. Notre objectif est de proposer un nouveau concept de ciblage des tumeurs mammaires en utilisant des nanoparticules magnétiques de polymères emprisonnant des médicaments. La délivrance de ces derniers se fera grâce aux propriétés d’échauffement local des nanoparticules magnétiques sous champ magnétique alternatif (AMF), permettant un contrôle spatio-temporel du relargage du médicament ainsi encapsulés dans le polymère.

Bénéfices attendus

Le projet présente plusieurs bénéfices pour la santé humaine. En effet, ces nanomatériaux, rapides et moins coûteux à synthétiser, présentent de nombreux avantages par rapport aux anticorps conjugués à des médicaments développés récemment. Ils sont faciles et rapides à synthétiser, très peu couteux, présentent une bonne biocompatibilité, sont capables de traverser la membrane cellulaire en absence de toutes réponse immunogène. Cette approche permet de délivrer de façon spatio-temporelle des médicaments anti-cancéreux grâce à ses propriétés de ciblage et de délivrance contrôlée. Ainsi, notre approche transforme potentiellement des agents thérapeutiques non spécifiques avec des effets secondaires prononcés en un système thérapeutique ciblé utile pour la médecine de précision.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de cancers mammaires et à leurs traitements. Les différents gestes réalisés sur les souris incluront au maximum les étapes suivantes en fonction des questions scientifiques : i) Pose chirurgicale d’un pellet contenant des hormones en sous-cutanée sous anesthésie et analgésie (1x/animal, 5-10 minutes) ii) Injections unique orthotopiques dans la glande mammaire de cellules tumorales sur animal vigile (15 seconde/animal) iii) Suivi du poids et de la croissance tumorale mesure de la taille de la tumeur 3 fois par semaine (2 minutes/animal) iv) Injection intraveineuse ou intra-tumorale des nanoparticules sur animal vigile (1x/semaine, 2min/animal pendant 28 jours soit 4 injections/animal) v) Imagerie sur animal anesthésié (1x/vie, 30 min) vi) Application d’un champ magnétique alternatif sur animal vigile (4x/vie, 30min-1heure) vii) Euthanasie selon une méthode réglementaire à la fin de la procédure et prélèvements des tumeurs et des organes pour analyse.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus dans ce projet sont : i) le risque infectieux et la sensation de douleur, conséquence potentiel de la pose d’implants d’œstrogènes nécessaire au développement préalable des glandes mammaires avant de pouvoir greffer les cellules cancéreuses. ii) le risque d’une croissance tumorale importante pouvant entrainer dans les cas les plus sérieux : une nécrose des tissus (peu probable d’après notre expérience sur le modèle), des difficultés de mobilité, ou encore une perte de poids. iii) le stress et le risque de lésion au niveau de la queue ou de la tumeur suite aux injections des nanomatériaux par voie intraveineuse ou intra-tumorale. iv) les risques liés aux anesthésies (hypothermie, hypoventilation, arrêt cardio-respiratoire, etc.) v) le stress potentiel pour les animaux lors du transport des animaux sur un autre site en vue de l’imagerie.

Devenir

A la fin des différents actes et de la période de maintien prévu, l’ensemble des animaux (n=374) sont euthanasiés par une méthode réglementaire en vue de réaliser les différents prélèvements. Les tumeurs et les organes seront récupérés et analysés.

Remplacement

Les études in vitro déjà menées ont permis de sélectionner/affiner au mieux les conditions expérimentales du projet afin de réduire au maximum le nombre d’animaux impliqués dans cette étude. En effet, cette étude doit être conduite in vivo car celle-ci prend en considération la tumeur, son environnement ainsi que l’ensemble des interactions mises en jeu. Ainsi, il n’y a pas de modèles alternatifs au modèle animal permettant de recréer l’ensemble des acteurs impliqués dans le développement tumoral et l’action des traitements proposés. Nous avons besoin d’un modèle qui mime ce qui se passe en clinique chez les patients traités. Travailler sur des cellules en culture cellulaire ne permet pas de répondre à ce que sera l’efficacité d’un médicament sur une tumeur en trois dimensions et avec son microenvironnement. C’est pourquoi, le modèle de xénogreffe chez la souris permet de créer un modèle d’étude qui se rapproche de celui observé chez les patients.

Réduction

Le projet impliquera un total de 374 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Notre procédure expérimentale a été affinée pour éviter l'utilisation inutile de souris. Une étude pilote sur 20 animaux permettra d’optimiser les conditions expérimentales en validant le modèle murin ayant le meilleur taux de prise de greffe permettant par la suite de réduire la taille des groupes (moins de variabilité). L’étude de biodistribution sera réalisée sur des groupes de 3 souris maximum. Enfin, chaque groupe de traitement comportera 10 souris au total. Par ailleurs, l'analyse statistique sera réalisée avec les tests adaptés. Pour ce faire, nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.).

Choix des espèces

Justification de l’espèce : La souris est un mammifère comme l’Homme, la souris Nude est l’un des rares modèles permettant de créer des xénogreffes de tumeurs humaines sans qu’il n’y ait de rejet du non-soi (modèle immunodéficient). Enfin, la réglementation demande à ce que tout développement de médicaments soit testé chez deux modèles animaux différents avant toute administration chez l’humain. La souris est le modèle le plus utilisé en première ligne et il permet d’acquérir un grand nombre d’information dans un temps relativement court. Description du ou des modèle(s) : Nous utiliserons des souris Nude qui présentent une mutation de leur système immunitaire. Les souris peuvent ainsi recevoir des cellules d’une autre espèce (l’homme dans le cas présent), et il n’y aura pas de réaction du non-soi, les cellules injectées pourront alors pousser sans être rejetées. Le choix de la souche de souris Nude sera effectué à la suite d’une étude pilote nécessaires pour optimiser les conditions de prise des xénogreffes et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaire au projet. Justification du stade de développement : Livraison des animaux âgés de 4 semaines. Début de l’expérimentation après deux semaines d’acclimatation soit à 6 semaines ; ce stade est couramment utilisé dans la littérature ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec les données publiées.