Procédures modérées

264 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une irradiation corporelle totale puis une greffe de cellules humaines, parfois leucémiques, et développent une réaction du greffon contre l'hôte ou des tumeurs, pour évaluer un sous-type de lymphocytes censé limiter cette réaction. Le porteur indique que les souris présentent une perte de poids d'environ 20 %, des diarrhées et une altération de l'état général, et ne seront pas conservées au-delà de 80 jours. Sur le remplacement, il affirme que ce modèle murin est "indispensable" à toute étude préclinique de thérapie cellulaire dans la greffe de moelle.

Objectifs

Ce projet de recherche concerne les lymphocytes NKT invariantes (iNKT), qui sont des cellules importantes dans notre système immunitaire qui ont la capacité de réguler les réponses immunitaires et de tuer les cellules cancéreuses. Lorsqu'une personne subit une greffe de moelle osseuse pour traiter une leucémie, les cellules du donneur peuvent attaquer les tissus sains du receveur, causant des dommages graves appelés "réaction du greffon contre l'hôte" (GVH). L'ajout d'iNKT au greffon pourrait aider à réguler la réponse immunitaire pour éviter les problèmes de santé associés à la GVH tout en maintenant l'effet anti-leucémique de la greffe de moelle osseuse. Pour cela, il est important d'étudier comment les iNKT régulent la réponse immunitaire pour éviter les problèmes de santé et déterminer la quantité d'iNKT nécessaire pour obtenir un effet bénéfique. Il est également essentiel de vérifier que l'ajout d'iNKT n'empêchera pas l'effet anti-leucémique de la greffe de moelle osseuse. Pour atteindre ces objectifs, des modèles animaux seront utilisés pour étudier les effets de différentes quantités et sous-types d'iNKT sur la réponse immunitaire. Les interactions entre les iNKT et d'autres types de cellules immunitaires seront également examinées pour mieux comprendre leur rôle dans la régulation de la réponse immunitaire. Enfin, il sera étudié si l'ajout d'iNKT au greffon empêchera l'effet anti-leucémique de la greffe de moelle osseuse. Les résultats de cette étude pourraient améliorer les traitements de greffe de moelle osseuse et réduire les risques associés à la GVH, tout en maintenant l'effet anti-leucémique de la greffe.

Bénéfices attendus

Dans le contexte de la greffe de moelle osseuse, les cellules humaines intégrées dans le greffon détruisent les cellules leucémiques du receveur mais peuvent également reconnaitre et attaquer les tissus sains du receveur (réaction du greffon contre l'hôte appelée GVH). La GVH est responsable de la mortalité de 20% des patients greffés. Par ailleurs, l’effet anti-leucémique ne se développe pas chez tous les patients et le taux de rechute de la leucémie survient chez environ 30% des patients greffés. Ce projet vise à valider un sous type particulier de cellules humaines (les iNKT) qui favorisera l’effet anti-leucémique, avec un moindre effet sur les tissus sains. L’utilisation de ces cellules pourrait par conséquent améliorer le devenir des patients greffés. Les résultats de ce projet pré-clinique sont indispensables à la poursuite du développement de ce traitement innovant en vue de mettre en place des études cliniques chez l’homme.

Procédures

Une radiothérapie corporelle totale de faible dose (2 gy) de chaque animal soit 264 souris pendant 40 secondes par carrousel (6 à 8 souris). -Une injection intraveineuse (IV) sur animal vigile, une seule fois en début d’expérience pour 216 souris, et trois injections pour 48 souris, pendant 1 minute par injection. -Une injection intra-péritonéale (IP) sur animal vigile, au maximum 4 fois pendant 8 semaines sur 76 souris, pendant 1 minute par injections. -Un prélèvement de sang sur animal vigile sur 188 animaux, et cela à 21, 28 et 35 jours après la greffe de cellules humaines, pendant 2 minutes par prélèvement..

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un stress modéré lors de la procédure de radiothérapie à faible dose préalable à l’injection dans la veine caudale des cellules humaines. Ils développeront des signes cliniques de GVH à partir de 3 à 4 semaines après la greffe. Ces signes cliniques sont une perte de poids (-20% par rapport au poids pré-greffe) avec ou sans diarrhée et des signes de fatigue et d’altération de l’état général : voussure, perte de brillance du pelage, hérissement des poils, inflammation des yeux et diminution de l’activité dans les cas sévères. Ces signes sont gradés par le même expérimentateur selon le score de GVH. Le niveau de souffrance sera modéré. Dans les expériences où seront injectées des cellules leucémiques, les animaux présenteront à partir de 3 semaines après l’injection des signes de croissance tumorale avec prise de poids et développement de masses abdominales qui pourront altérer leur état général (augmentation du score clinique utilisé pour grader le degré de GVH). Le niveau de souffrance sera modéré.

Devenir

Les souris étant partiellement dépourvu de système immunitaire et ayant reçu une injection de cellules humaines plus ou moins avec des cellules leucémiques, une GVH ou une progression tumorale vont pouvoir se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animale, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 80 jours post injections, ou en cas de point limite atteint.

Remplacement

Nous continuons à réaliser des expériences in vitro pour valider la fonctionnalité des cellules humaines de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. Le projet est essentiellement basé sur la recherche d’efficacité et des meilleures conditions d’administration des cellules, ce qui ne peut pas être déterminé in vitro, et ce qui permettra de prévoir les conditions des essais cliniques.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris pour chaque étape du projet au minimum nécessaire pour les études statistiques : ainsi, l’expérimentation s’arrêtera dès l’obtention d’une différence significative entre les groupes (minimum 8 souris totales par groupe), et ne sera pas poursuivie en l’absence de différence statistiquement significative observée à 12 souris receveuses par groupe. Par ailleurs, les différentes étapes du projet seront conditionnées par les résultats obtenus dans les précédentes. Ainsi, au maximum 264 souris seront utilisées.

Raffinement

Les souris seront dans une cage contenant de l’enrichissement (buchette en bois, frisure de papier Craft et coton) avec maximum 4 à 5 individus par cage de 500 cm2, dans un portoir ventilé, dans un secteur spécifique pour les animaux immunodéprimés en animalerie EOPS avec contrôle de la température (22+/-1°C), de l'humidité (55 +/-10%), du cycle jour de 7h à 19h. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évalution sera utilisé. Des points limites sont mise en place.

Choix des espèces

La souris NSG permet l’élaboration d’un modèle de greffe de cellules humaines car cette souris, ne possédant pas de système immunitaire, accepte les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire dans la greffe de moelle osseuse. Ce modèle permet d’une part d’étudier l’impact de nouvelles thérapies cellulaires sur la GVH et l’effet anti-leumique, et d’autre part d’analyser les mécanismes d’action des cellules de thérapie cellulaire. Les résultats obtenus seront indispensables à l’élaboration d’essais cliniques chez l’homme dans un second temps. Les souris sont expérimentées à partir de 8 à 15 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe humaine est meilleure dans cette période de vie.

6 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection intrathécale sous anesthésie et plusieurs prélèvements de liquide céphalo-rachidien et de sang, certains sur animal vigile, avant une autopsie, pour valider une technique d'administration en vue de futures études réglementaires de toxicologie. Le porteur indique qu'au réveil peuvent survenir une désorientation, une hypothermie ou une apnée, et que les prélèvements sur animal vigile peuvent être désagréables. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune alternative non animale n'existe et que le macaque est "pertinent" par sa proximité phylogénétique avec l'humain.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de valider le modèle d’administration intrathécale (voie basse [lombaire] et voie haute [base du crane]) chez le primate non-humain. Ce modèle sera validé grâce à l’injection d’un produit pharmaceutique de référence dont la pharmacocinétique et la biodistribution seront évaluées et via une évaluation histopathologique complète afin de confirmer que la procédure d’administration intrathéchale (voie haute et voie basse) sera compatible avec une étude de toxicologie générale. Ce modèle permettra de répondre aux exigences réglementaires dans le cadre de l’évaluation de la sécurité des produits pharmaceutiques utilisant des stratégies thérapeutiques innovantes du système nerveux central qui seront injectées par voie intrathécale chez l’homme.

Bénéfices attendus

La validation du modèle d’administration intrathécale chez le primate non-humain permettra la réalisation d’études de toxicologie règlementaire qui sont nécessaires pour démontrer la sécurité des produits pharmaceutiques en développement, avant leur mise sur le marché ou les premiers essais cliniques (notamment pour le développement de thérapie innovante telle que la thérapie génique administrée par voie intrathécale chez l’homme). De plus la validation pourra contribuer à la mise sur le marché de nouvelles thérapies sûres pour les patients atteints de pathologie du système nerveux central (exemples: maladies de Parkinson et Alzheimer ou le dystrophie musculaire).

Procédures

L’injection unique intrathécale et les prélèvements de liquide céphalo-rachidien (4 temps, d’une durée d’envion 45 min par procédure) seront réalisés sous anesthésie générale volatile (après intubation endotrachéale) avec surveillance anesthésique et analgésie périopératoires (induction anesthésique via une injection intramusculaire). Une évaluation neurocomportementale sera réalisée en post-administration/prélèvement (durée d’environ quelques minutes) afin de déceler toute potentielle atteinte neurologique en lien avec la procédure. Une analgésie préventive (pré et post procédure pendant 2 jours), des grilles d’évaluation et des points limites spécifiques seront mis en place afin d’anticiper toute douleur ou détresse chez les animaux. Des prélèvements sanguins seront réalisés à raison de 4 temps (durée d’environ quelques minutes) dans les 24h suivant l’injection. Dès que possible, les prélèvements sanguins seront réalisés sur animal anesthésié à l’occasion des prélèvements de LCR. Pour les autres occasions, les prélèvements sanguins seront de courte durée (quelques minutes).

Impact sur les animaux

Les procédures d’administration/prélèvement intrathécale se faisant sur animaux anesthésiés qui seront mis à jeun la veille de la procédure. Lors du réveil anesthésique une désorientation/perte d’équilibre et une hypothermie peuvent être observées temporairement. En cas d’hypothermie, une prise en charge par lampe chauffante sera mise en place. Des évènements anesthésiques liées à l’anesthésie volatile peuvent survenir (apnée). Certains prélèvements sanguins (PS) seront réalisés sous anesthésie et seront donc sans effet attendu pour les animaux. Pour les prélèvements sanguins (PS) qui seront réalisées sur animaux vigiles celles-ci pourraient être associées à des sensations désagréables de ponction mais seulement pendant une courte durée. Les signes cliniques suivant pourraient être observés en cas de réaction exagérée au produit pharmaceutique de référence : • Troubles de la coordination des mouvements • Diminution de l’appétit • Somnolence • Vomissement • Diarrhée Ces signes cliniques devraient être seulement transitoire et seront surveillés.

Devenir

Les animaux seront autopsiés à la fin de la procédure afin d’évaluer l’impact de la procédure d’ administrations/prélèvements de liquide céphalo-rachidien (LCR) d’un point de vue histopathologique. Ceci afin de valider le modèle, dans le contexte des études réglementaires de toxicologie.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas d’alternative non animale permettant d’évaluer la sécurité et la toxicité, notamment systémique et neurocomportementale des futurs candidats médicaments dans le cadre du développement de thérapie innovante, telle que la thérapie génique. Il n’existe pas non plus d’alternative non animale pour valider que la technique d’administration intra thécale aboutit à une exposition de l’animal au produit pharmaceutique de référence et que celle-ci est bien tolérée (analyse histopathologiqueà. Le macaque cynomolgus est un modèle animal pertinent car il est proche de l'Homme d’un point de vue phylogénétique, transcriptomique et anatomique, permettant le développement de candidats médicaments et/ou de formulations innovantes dans les études de toxicologie.

Réduction

Le nombre d’animaux dans ce projet a été défini sur la base du nombre minimum d’animaux requis pour pouvoir conclure à la validation de la technique (pharmacocinétique et la biodistribution du produit réference). De plus, dans les études réglementaires de toxicologie 3 animaux par groupe sont généralement utilisés. Au total, 6 animaux seront utilisés dans ce projet : 3 animaux par localisation (zone lombaire ou cisterna magna).

Raffinement

Le produit pharmaceutique de référence sera injectée à une seule occasion et à une dose subclinique pour laquelle aucun effet toxique n’est attendu. Des points limites basés sur le comportement, l’état clinique et la perte de poids sont décrits dans des procédures internes et présentés dans la section points limites de ce projet (section 4.2). L’injection intratéchale sera réalisée sous anesthésie générale volatile (après intubation endotrachéale) avec surveillance anesthésique. Une analgésie préventive sera mise en place avant administration de l’élément de référence/prélèvements de liquides céphalo-rachidien (LCR) afin d’anticiper toute douleur ou détresse chez les animaux. Des mesures de prévention de l’hypothermie seront appliquées pendant l’anesthésie et au réveil. En raison du potentiel impact de l’administration intrathécale et des prélèvements de LCR, une évaluation neurocomportementale sera réalisée à deux occasions après adminisration et chaque prélèvement de LCR (+4h et +24h post-procédure). De plus, lorsque possible, les prélèvements sanguins (PS) seront réalisés sur animal anesthésié, à l’occasion des prélèvements de LCR. Pour les PS qui seront réalisées sur animaux vigiles (sans anesthésie) celles-ci pourraient être associées à des sensations désagréables de ponction mais seulement pendant une courte durée. L’euthanasie sera considérée pour les signes cliniques suivants : • convulsions ne rétrocédant pas spontanément ou à l'administration d'anti-convulsivants ou convulsions répéétes dans la même journée • Incapacité prolongée de l'animal à se déplacer ou pertes d'équilibres durables impactant la qualité de vie de l'animal.

Choix des espèces

Les études réglementaires de toxicologie doivent se faire chez une espèce pertinente pour l’évaluation de la sécurité des futurs candidats médicaments. La pertinence du primate non-humain est basée sur une homologie phylogénétique, anatomique et transcriptomique importante avec l’Homme. De nombreuses nouvelles stratégies thérapeutiques actuelles du système nerveux central (SNC) sont basées sur des produits biologiques ou de thérapie génique (oligonucléotide) qui nécessitent une homologie phylogénétique ou transcriptomique importante avec l’Homme afin d’évaluer les propriétés pharmacodynamiques du produit mais également les potentiels effets toxiques. Par conséquent, l’utilisation d’autres modèles non-rongeur (tel que porc et chien) est inapproprié dans ces études. L’utilisation du primate non humain pour la validation du modèle d’administration intrathécale est donc justifiée puisque les études précliniques non rongeurs sur ces nouvelles thérapies seront réalisés chez le macaque. La validation du modèle d’administration intrathécale ne nécessite pas de pré-requis d’âge et se fera sur jeunes adultes/adultes comme pour les études de toxicologie réglementaire.

200 souris "nude" vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules de cancer du sein triple négatif dans le flanc et la glande mammaire, puis des injections de peptides trois fois par semaine pendant trois semaines, pour évaluer l'effet anti-tumoral de ces molécules. Le porteur indique qu'une perte de poids et une gêne à la locomotion liée au volume tumoral peuvent survenir. Sur le remplacement, il affirme n'avoir "pas d'autres choix" que le modèle animal, la culture in vitro ne recréant pas l'environnement tumoral.

Objectifs

Depuis plus de 10 ans, le cancer est la première cause de mortalité en France. Or il a été démontré qu’une protéine de la matrice extracellulaire est surexprimée et sécrétée par les cellules cancéreuses au sein du microenvironnement tumoral sous une forme immature. Cette protéine est considérée comme un marqueur de mauvais pronostic et de récurrence dans de nombreux cancers tels que le cancer du sein, cancer le plus fréquent chez les femmes en France, ce qui en fait une cible thérapeutique d’intérêt et notamment dans le cancer du sein triple négatif, un sous type pour lequel la plupart des stratégies thérapeutiques proposées sont déficientes. Il a été montré qu’une accumulation anormale de cette protéine stimule la prolifération des fibroblastes (cellules saines autour de la tumeur) qui vont à leur tour stimuler et entrainer la multiplication des cellules cancéreuses. C’est donc dans ce contexte que différents peptides ont été synthétisés afin de répondre à un besoin thérapeutique non satisfait notamment dans le cancer du sein triple négatif (TNBC). Ce projet permettra de déterminer l’effet anti-tumoral des différents peptides développés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus par ce traitement sont une diminution de la croissance tumorale liée à une diminution de la prolifération fibroblastique. La réalisation de ce projet d’expérimentation animale permettrait de valider les résultats obtenus in vitro et ex vivo et confirmerait la pertinence de la stratégie thérapeutique associée aux peptides dans un modèle complexe de progression tumorale in vivo.

Procédures

- Injection de cellules tumorales au niveau du flanc droit (1 fois, moins de 5 minutes) - Injection de cellules tumorales au niveau de la glande mammaire (1 fois, moins de 5 minutes) - Injection de traitement par voie intra-péritonéale, 3 fois par semaine pendant 3 semaines (2 min) - Identification des souris par tatouage au niveau des oreilles (durée moins d’une minute – 1 fois)

Impact sur les animaux

Une perte de poids peut être observée suite à l’injection des cellules tumorales et doit être prise en considération. Une gêne à la locomotion due au volume tumoral ainsi qu’à la localisation de la tumeur peut être observée.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de limiter la douleur et/ou l’inconfort liés au développement des tumeurs.

Remplacement

Une étude in vitro seule ne peut suffire pour représenter les mécanismes physiologiques d’un organisme entier et les approches informatiques ne permettent pas à ce jour de mimer la fonction d’un organisme et sa réaction face aux traitements. En effet, il est notamment très difficile de recréer exactement, in vitro, l’environnement tumoral. Ainsi, nous n’avons pas d’autres choix que d’utiliser le modèle animal pour apporter la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique des peptides « LBC ».

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé de manière à réduire au maximum la quantité d’animaux tout en permettant une interprétation fiable des résultats basée sur des analyses statistiques adaptées.

Raffinement

Une observation à raison de trois fois par semaine des souris sera réalisée afin de garantir leur bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou de stress. L’utilisation d’anesthésiques, d’analgésiques et d’antalgiques permettra de prévenir et/ou traiter toute douleur éventuelle. Une attention particulière sera portée à l’observation des points limites fixés tout au long du projet afin d’éviter toute souffrance non soulagée par les soins apportés, auquel cas l’animal sera euthanasié. Un soin sera apporté aux conditions d’hébergement permettant de limiter le stress (enrichissement du milieu de vie, respect de leur vie en groupe, surveillance trois fois par semaine). En ce qui concerne les souris nude, elles seront hébergées dans des cages homologuées sur portoir ventilé, dans une litière en cellulose. Des outils d’imagerie non invasifs seront utilisés.

Choix des espèces

Les cellules MDA-MB-231 et Hs578T sont des lignées de cancer mammaire triple négatif humain. Des souris Balb/c nude (immunité réduite) seront donc utilisées pour l’injection de ces cellules afin qu’elles ne soient pas rejetées par le système immunitaire et qu’une tumeur puisse se développer. Des travaux antérieurs ont été réalisés sur ce modèle murin dans le cadre de l’évaluation de nouveaux agents thérapeutiques dans le traitement de différents cancers. La protéine étudiée est la même chez l’Homme et chez la souris. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique, les souris seront utilisées à l’âge de 8 semaines, ce qui correspond à un stade adulte (jusqu’à environ 1 an chez la souris).

2 248 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau ou dans le côlon, certaines une chirurgie d'imagerie sous anesthésie sans réveil, pour analyser la réponse immunitaire et le mode d'action d'immunothérapies anticancéreuses. Le porteur indique attendre peu d'effets de la tumeur sous-cutanée et fixe la mise à mort au dépassement d'un volume tumoral limite. Les bénéfices avancés pour les patients sont renvoyés au moyen et long terme, tandis que les souris reçoivent d'emblée des cellules tumorales et ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de s’appuyer sur l’imagerie d’animaux entiers afin (1) d’analyser l’organisation de la réponse immunitaire anti-tumorale et (2) d’identifier le mode d'action des traitements cancéreux ainsi que de leurs répercussions sur l’organisme. Pour cela nous tenterons d'identifier le rôle de chacune des populations cellulaires retrouvées au sein d'une tumeur (ex. les neutrophiles, les macrophages et les lymphocytes T). Nous tenterons d'évaluer leur contribution directe ou indirecte sur l’efficacité de l’immunothérapie. Enfin, nous souhaitons mettre en lumière les limitations de ces thérapies afin d’apporter de nouvelles hypothèses de travail pour l’amélioration des traitements. En résumé, ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur l’utilisation des immunothérapies dans les cancers primaires de la peau et du colon pour ainsi contribuer, au moyen/long terme, à l’amélioration de la prise en charge des patients en clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche permettra d’apporter des connaissances essentielles sur le mode d’action d’immunothérapies actuellement utilisées en clinique ou en cours de développement pour le traitement des cancers solides (ex : cancer du sein, de la peau, du colon, lymphome de la peau etc) et pour lesquelles une majorité des patients rechutent ou ne répondent pas. Comprendre les raisons pour lesquelles ces immunothérapies guérissent seulement une petite fraction des patients est alors primordial afin d’en générer des nouvelles de plus grande efficacité ou d’identifier les patients à même de répondre positivement au traitement. A court terme, ce projet offrira des pistes de travail pour générer des immunothérapies capables de contourner les limitations que nous aurons identifiées et donc avec une meilleure efficacité. Ainsi, nos travaux offriront au long terme de nouvelles thérapies pour traiter la majorité des patients atteint de cancer solide et améliorer leur espérance de vie.

Procédures

La greffe de la tumeur consistera à une injection de quelques secondes au début de l’expérience. Les animaux seront ensuite manipulés quotidiennement pour mesurer la pousse de la tumeur. Certains animaux subiront une intervention chirurgicale de 30minutes pour effectuer de l’imagerie et seront ensuite maintenus endormis pendant 2 à 3h mais cette procédure sera sans reveil.

Impact sur les animaux

Notre projet propose d’étudier les immunothérapies anti-tumorales et nécessite donc la greffe de tumeur aux souris en sous-cutanée au niveau du flanc et aussi au niveau du colon. Le bien-être de chacune des souris sera contrôlé fréquemment. Notre connaissance précédente suggère que les souris rencontrent peu d’effets indésirables causés par la pousse tumorale sous-cutanée. La localisation (le flanc) de la tumeur ne semble pas impacter leur mobilité, elles ne perdent pas de poids, leur pelage reste soyeux et leur comportement demeure inchangé. L’injection des thérapies que nous proposons d’étudier dans ce projet pourra ne pas causer d’effets indésirables ou avoir un effet à court terme (24-72h) par exemple sur la température corporelle de l’animal liée à l’élimination des cellules tumorales. Des mesures pour soulager l’inconfort des animaux seront mises en place et sont décrites plus loin dans ce protocole.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront reçu initialement des cellules tumorales.

Remplacement

De nombreuses expériences seront validées au préalable in vitro à l’aide des lignées cellulaires pour remplacer les animaux. Ces expériences pourront être effectuées dans des cultures cellulaires 2D ou des organoïdes (Structures 3D mimant les certains aspects des tumeurs solides in vivo) et nous permettront de déterminer des doses ou la cinétique sur laquelle nous souhaiterions étudier le mode d’action de la thérapie in vivo. Différentes doses seront utilisées in vitro afin de déterminer la dose optimale de la thérapie. Ces travaux nous permettront de réduire le nombre d’animaux que nous utiliserons par la suite pour identifier le mode d’action de la thérapie in vivo. Une telle approche permettra de réduire de façon significative le nombre d’animaux dont nous aurons besoin pour notre recherche. Néanmoins, les tests in vitro ne permettent pas de récapituler la complexité des réponses immunitaires ayant lieues in vivo. C’est la raison pour laquelle nous avons recours aux animaux afin de décortiquer le mécanisme d’action de certaines thérapies.

Réduction

L'utilisation de l'imagerie sur l'animal vivant permet de réduire le nombre d'animaux utilisés car l'observation en temps réel permet d'acquérir plusieurs données à partir d’un un même animal, en observant les cellules immunitaires avant traitement, puis dans les heures qui suivent l'administration des traitements. Dès que possible, les expériences de cytométrie et de dosage protéiques (ou d’imagerie multiplex) seront effectuées sur les même animaux afin de limiter leur utilisation. D'après notre expertise issue des projets précédents et notre collaboration avec le département de statistiques, nous avons déterminé́ le nombre d'animaux par groupe qui nous permettront d'utiliser les tests statistiques robustes. Selon les procédures, les paramètres évalués seront variables, cela entraine des nombres de groupes variables que nous avons optimisés et réduits au maximum pour obtenir des résultats significatifs tout en prenant en compte la variabilité de la croissance tumorale. Les animaux ne pourront pas être réutilisés car ils seront porteurs de cancer et auront reçu un traitement anti-tumoral.

Raffinement

Pour épargner toute douleur, les animaux seront suivis fréquemment et des points limites (poil ébouriffé, prostration, taille de la tumeur) sont établis pour raffiner les procédures et soulager les animaux à l’aide d’analgésique ou de les mettre à mort si la souffrance persiste. Pour la pousse de tumeur sous-cutanée, la tumeur sera mesurée 3 fois par semaine afin de contrôler la pousse tumorale et de mettre à mort l’animal si le volume de la tumeur atteint 1500mm2. Ce volume est calculé selon la formule longueur x largeur x hauteur. La hauteur est difficile à mesurer et une approximation en est faite. On considère la hauteur comme étant la longueur divisée par deux. La formule finale est donc : Longueur x largeur x (largeur/2). Cette limite est idéale pour limiter l’impact de la tumeur sur le bien-être de l’animal qui n’aura aucune difficulté à bouger ou à s’alimenter. Après l’administration de l’immunothérapie, la température corporelle de l’animal sera mesurée afin de s’assurer d’une bonne tolérance au traitement. Concernant l’intervention chirurgicale pour la greffe de tumeur au niveau du colon, l’animal sera administré en amont de l’opération avec une dose d’antalgique afin de minimiser la douleur et sera anesthésié sur plaque thermo contrôlée pour limiter la perte de chaleur corporelle. La cage sera supplémentée avec du dietget et la litière pourra être remplacée par une litière en cellulose en post-chirurgie.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris est très proche du système immunitaire humain. Les souris sont l’espèce la plus appropriée pour nous éclairer sur les mécanismes d’action des immunothérapies pour le traitement des cancers chez l’humain. Par ailleurs, l’imagerie intravitale en temps réel peut être réalisée relativement facilement sur des souris. Tous les animaux utilisés dans ce projet de recherche seront adultes (>5 semaines). Notre étude s’effectue sur un système immunitaire adulte afin de se rapprocher au mieux de la clinique et des patients porteurs de ces cancers.

4 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issues du croisement de deux lignées génétiquement modifiées, elles sont pesées puis soumises à des tests d'agrippement et de rotarod, le porteur prévoyant de les laisser atteindre les points limites pour évaluer un éventuel gain de survie dans un modèle de sclérose latérale amyotrophique. Il indique que l'atteinte de ces points limites peut occasionner des effets indésirables et une difficulté à se nourrir en fin de vie. Sur le remplacement, il décrit des modèles in vitro qu'il juge seulement "complémentaires" de l'approche in vivo.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) ou maladie de Charcot est une maladie caractérisée par une dégénérescence des neurones commandant les muscles. La SLA survient pendant la vie adulte et conduit à une paralysie fatale. Aucun traitement n'est disponible pour cette maladie. La plupart des études se sont focalisées sur les périodes symptomatiques ou pré-symptomatiques et non sur les mécanismes initiaux conduisant fort probablement à la survenue de la SLA. La présente DAP est basée sur nos récents travaux montrant que la transmission synaptique inhibitrice est réduite aux stades périnataux au niveau des neurones moteur de la moelle épinière de souris modèle de la maladie SLA. Notre projet est donc basé sur l’hypothèse que les premières dérégulations liées à la SLA débutent dès le développement du système nerveux central et sont accompagnées de mécanismes de compensation. L'effondrement tardif de ces mécanismes de compensation conduirait à l'apparition des symptômes de la SLA. Nos travaux montrent un déficit dans la transmission synaptique inhibitrice à des stades précoces de développement. Nous proposons donc d’augmenter la transmission synaptique inhibitrice chez la souris en utilisant une approche génétique et nous émettons l’hypothèse que cette augmentation aura des répercussions positives sur le développement de la maladie chez la souris adulte.

Bénéfices attendus

Le présent projet a pour but de mettre en évidence un défaut d'inhibition chez une souris modèle de la maladie sclérose latérale amyotrophique (SLA). Cette démonstration pourra être bénéfique aux patients SLA qui pourraient être traités par des molécules agissant sur l'inhibition synaptique.

Procédures

Aucune procédure chirurgicale n'est prévue dans le présent projet. Les souris seront pesées de manière hebdomadaire, soumises au test d'agrippement (grip-test) et au test du rotarod (locomotion sur un cylindre mobile). La survie des souris sera également évaluée. Enfin, certaines souris seront euthanasiées afin de collecter les tissus nerveux (moelle épinière).

Impact sur les animaux

Notre projet prévoit de laisser les souris atteindre les points limites afin d'évaluer l'éventuelle amélioration de leur durée de vie après croisement avec des souris ayant un niveau d'inhibition accru. L'atteinte des points limites, bien que ces derniers soient controlés, peut occasionner des effets indésirables sur les animaux. Certaines souris seront enthanasiées en vue de prélever des tissus nerveux pour étude immunohistochimique à posteriori. Là encore, bien que réduits au maximum par des injections de produits anesthésiants, des effets indésirables sur les animaux sont à considérer.

Devenir

Les souris modèle de sclérose latérale amyotrophique ayant atteint les points limites et les animaux contrôles du même âge seront euthanasiés afin de prélever des tissus nerveux et réaliser à postériori des analyses immunohistochimiques.

Remplacement

Les souris utilisées dans notre projet sont des souris transgéniques modèles murins de la maladie sclérose latérale amyotrophique (SLA) et des souris génétiquement modifiées afin d'augmenter le niveau d'inhibition au sein du système nerveux. Les deux souris seront croisées pour obtenir des animaux doublement génétiquement modifiés. Des animaux contrôles de la même lignée (et même portée) seront utilisés. Les modèles murins de la maladie SLA sont les animaux les plus utilisés pour tenter de comprendre les mécanismes de développement de cette maladie neurodégénérative touchant les neurones moteurs. Des modèles in vitro ont été développés pour l'étude du dysfonctionnement des motoneurones issus de patients SLA mais ces modèles restent complémentaires aux approches in vivo. Il est donc logique que le modèle murin de la SLA soit utilisé dans le cadre de la présente DAP.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, notre projet basé sur des méthodes variées permet d'utiliser au maximum tous les embryons et animaux néonataux disponibles issus d'une portée. Concernant les expériences réalisées chez l'adulte, un nombre minimum d'animaux est programmé en accord avec les tests statistiques qui seront réalisés à posteriori.

Raffinement

Les souris sont élevées avec un enrichissement. Des points limites sont établis afin de réduire au maximum la souffrance des animaux liée à leur difficulté à se nourrir en fin de vie.

Choix des espèces

La souris modèle de la maladie sclérose latérale amyotrophique (SLA) que nous utilisons reproduit les symptômes de la maladie de manière fiable et reproductive. L'autre souris présente un taux d’inhibition accru. Ces deux souris seront croisées afin d'obtenir des souris SLA ayant un niveau plus élevé d'inhibition (souris présentant une double modification génétique). Ces souris et leur contrôles non génétiquement modifiés seront testées chez des mâles puis femelles, au niveau comportemental à l'âge de 8 semaines jusqu'à l'âge de 20 semaines environ (= âge moyen de fin de vie de nos souris modèles de SLA).

400 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la moitié tuée à l'issue et l'autre proposée à l'adoption. Ils sont placés en cage individuelle pendant 48 heures pour recueillir urines et fèces, subissent des prélèvements sanguins à la queue et une injection d'un traceur avant la mise à mort, pour mesurer la qualité nutritionnelle de différentes sources de protéines à la demande de la FAO. Le porteur indique que l'isolement en cage peut provoquer un stress car les rats vivent habituellement en groupe. Sur le remplacement, il affirme que les données in vitro ne sont pas comparables et que le recours à l'animal reste "nécessaire" pour obtenir des données fiables.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la qualité nutritionnelle de différentes sources de protéines à destination de l’alimentation humaine. Il répond notamment à une demande de l'Organisation pour l'alimentation et l'agriculture (FAO) de produire une base de données sur la digestibilité et la qualité de l’ensemble des sources protéiques. La caractérisation de la qualité de ces nouvelles sources de protéines permettra également de promouvoir certaines sources de protéines ou de recommander l’association de différentes sources de protéines pour répondre aux besoins de populations spécifiques.

Bénéfices attendus

De très nombreuses études montrent que le niveau de consommation des protéines animales des pays les plus riches ne pourra pas se généraliser à l’échelle planétaire en l’état actuel des ressources. Dans ce contexte, le maintien de la part des protéines dans l’alimentation nécessite de développer de nouveaux régimes et pratiques alimentaires qui viseront à augmenter la part relative des produits végétaux et inclure de nouvelles sources de protéines plus durables. L’évaluation de la qualité des protéines durables issues de ressources alternatives est une étape essentielle lors du développement d’ingrédients protéiques à haute valeur ajoutée. Ce projet permettra d’obtenir ces données. La caractérisation de la qualité de ces nouvelles sources de protéines permettra également de promouvoir certaines sources de protéines ou de recommander l’association de différentes sources de protéines pour répondre aux besoins de populations spécifiques.

Procédures

Afin de collecter leurs urines et fèces, les rats sont placés durant une durée limitée (48h) dans des cages individuelles spécifiquement conçues pour ces recueils. Lors de la procédure 3, Des prélèvements sanguins de 0,5mL de sang sont collectés à la veine de la queue des rats vigiles. Trois prélèvements sont réalisés par animal (avant, 1h après et 3h après l’ingestion du repas contenant la protéine à tester). Du matériel spécifique est utilisé pour limiter le temps et le stress engendrés par ce geste ; la durée ne dépasse pas 5 minutes par prise. Un anesthésique local est également appliqué sur la queue avant la prise de sang afin de minimiser la douleur. Des pesées quotidiennes sont réalisées pour lesquelles les rats sont emmaillotés dans une lingette afin de les habituer à être emmailloté. Ce même emmaillotage est également réalisé lors de la prise de sang pour contenir le rat. 30 minutes avant la mise à mort des animaux, l’injection d’un marqueur permettant d’évaluer la formation des protéines dans différents organes et tissus est réalisée sous anesthésie gazeuse en moins de 3 minutes.

Impact sur les animaux

La qualité nutritionnelle des protéines est évaluée en déterminant la consommation alimentaire individuelle des rats et en collectant les urines et fèces ponctuellement. Ceci permet de calculer plusieurs indices de qualité connus pour être transposables à l’homme. Il est donc nécessaire de les héberger en cage individuelles. Le placement en cage individuelle peut induire un stress lié à l’isolement car les rats sont des animaux vivant habituellement en groupe. Les prélèvements sanguins sont susceptibles d’induire de la douleur et un stress modéré.

Devenir

Selon les critères de qualité des protéines évalués, la mise à mort des animaux n’est pas nécessaire. Ainsi, les animaux pourront soit être placés pour l’adoption, soit être mis à mort à la fin de l’étude en fonction des critères de qualité à mesurer.

Remplacement

Un protocole de digestion des protéines in vitro a été harmonisé via un réseau international ces dernières années. Cependant les données obtenues in vitro ne sont pas complétement comparables avec les données obtenues chez l’animal. Le recours à des modèles animaux est donc aujourd’hui encore nécessaire pour obtenir des données fiables de digestibilité des acides aminés et donc des données sur la qualité des sources protéiques. Aussi, il n’y a pas de modèle n’utilisant pas d’animaux actuellement sur les effets des sources de protéines sur les concentrations d’acides aminés dans le sang ainsi que sur la formation de protéines dans les différents organes.

Réduction

Le nombre minimum d’animaux par groupe a été calculé à 8 rats/groupe à partir de données comparables déjà publiées afin de garantir qu’avec ce nombre d’animaux les résultats soient interprétables. Afin de limiter le nombre d’animaux, les rats pourront être ré-utilisés pour évaluer un ou plusieurs critères de qualité des protéines. Les résultats pour chaque groupe sont comparés entre à l’aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de limiter l'impact de l'hébergement individuel, les cages sont en plexiglas transparent permettant le plus d’interactions visuelles entre les animaux et elles sont enrichies avec des tunnels en plexiglas opaque. Les animaux sont regroupés (entre animaux de même sexe et de même lot), deux fois par semaine durant 2 heures dans des espaces spécialement conçus, appelés parcs. Les parcs sont des espaces de 1 m² environ, avec des tunnels suspendus, des zones où se cacher et des zones à escalader. Ces périodes de regroupement permettent aux animaux d’exprimer leur comportement d’exploration et d’interaction sociale. Lors des prises de sang, un anesthésique local est appliqué sur la queue. L’animal est également habitué à l’emmaillotage dans un tissu lors des pesées quotidiennes afin de limiter le stress induit par ce même emmaillotage lors des prises de sang. Lors des injections du traceur permettant la mesure de la formation des protéines, les rats sont anesthésiés. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permet de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.

Choix des espèces

LLe régime alimentaire et le système digestif du rat présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. Ainsi, l'Organisation pour l'alimentation et l'agriculture (FAO) recommande l’utilisation de l’être humain, ou des modèles animaux que sont le porc et le rat pour l’évaluation de la qualité des protéines. Le critère de qualité des protéines se basant sur la capacité de la protéine à soutenir la croissance se mesure chez de très jeunes rats mâles et femelles, après le sevrage (3 semaines, ~50 g) . Le critère de qualité des protéines évaluant l’utilisation et la digestibilité de la protéine en collectant les fèces et les urines se mesure chez de jeunes rats mâles et femelles encore en phase de croissance (8 semaines, ~250 g). Le critère de qualité des protéines évaluant la digestibilité des acides aminés au niveau de l’intestin se mesure chez des rats mâles et femelles encore en phase de croissance (10 semaines, ~300 g).

Infectées par voie intranasale sous anesthésie avec des souches mutantes de Mycobacterium bovis, l'agent de la tuberculose bovine, les souris reçoivent aussi une puce télémétrique et subissent une prise de sang chaque semaine. 264 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes, afin de préciser le rôle de trois gènes de virulence de la bactérie. Le porteur part de groupes de 24 souris pour en garder 6 au dernier jour, les autres étant mises à mort au fil du protocole quand elles atteignent les points limites, en général entre J21 et J35, avec perte de poids rapide et prostration. Il annonce une mise à mort "dès l'apparition des premiers signes de souffrance comme définis par le point limite", sans chiffrer ce seuil.

Objectifs

La tuberculose bovine est une pathologie majeure en santé animale. L'espèce mycobactérienne adaptée aux animaux, Mycobacterium bovis (Mb), est le principal agent pathogène responsable de la tuberculose bovine en Europe et au Royaume-Uni. C'est un pathogène zoonotique multi-hôtes capable d'infecter les ruminants (bovins, caprins, ovins), la faune sauvage et l'homme. Les programmes de surveillance et d’éradication, basés sur des campagnes de tests et l'abattage systématiques des bovins réactifs, n'ont pas permis d'éradiquer la tuberculose bovine (bTB). La bTB représente donc un risque direct pour les économies agricoles, la santé animale et humaine et la biodiversité dans les pays touchés. Il existe une hétérogénéité dans la réponse immunitaire de l'hôte à l'infection par Mb, ce qui influence directement le risque de transmission par les bovins infectés et la faune sauvage. Une meilleure compréhension des interactions hôte-pathogènes lors des infections à Mb est essentielle pour développer de nouvelles approches visant à éradiquer la tuberculose bovine. Le projet a pour objectif de comprendre comment Mb interagit avec le système immunitaire de l’hôte et comment cette bactérie module la progression et la transmission de la maladie. Pour cela, nous souhaitons identifier les gènes de Mb essentiel pour sa persistance et sa dissémination. Pour cela nous souhaitons i) Comparer la virulence de mutants de Mb (ii) Suivre la réponse immunitaire et le développement du granulome en réponse aux différents mutants.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, nous mettrons au point pour la première fois la vidéosurveillance d’animaux infectés en isolateur pour raffiner nos points limites (détection plus précoce de comportements). La validation du matériel, son installation, et de la méthode d’analyse permettra de proposer ce suivi pour nos prochains projets. Les résultats permettront de caractériser le rôle de 3 gènes de virulence pour la physiopathologie et la dissémination de Mb. Enfin, nous nous attacherons à une description exhaustive des réponses immunitaires chez les animaux infectés par les différentes souches.

Procédures

Pose de la puce d’identification et télémétrique : 1 fois et 1min/animal. Anesthésie par administration médicamenteuse par voie intrapéritonéale + infection par voie intranasale : 1 fois et 15 min/animal. Prise de sang : 1 fois par semaine et 3 min/animal/prélèvement. Pesée : bi hebdomadaire et 1min/pesée/animal. Les prises de sang peuvent engendrer un hématome et la contention peut engendrer du stress pour l’animal.

Impact sur les animaux

Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après l’injection de la puce d’identification pourraient être observés. Nous savons par expérience que les souris sont sensibles aux infections mycobactériennes. Ces animaux sont plus susceptibles d'atteindre les points limites lors d'infections avec la souche M.bovis de référence. Nous pourrons observer une perte de poids assez rapide associée à une prostration des animaux. Afin d'assurer un bon suivi de ces animaux, une grille d'évaluation de bien-être des animaux a été mise en place basée sur une observation quotidienne et une pesée bi-hebdomadaire.

Devenir

L'ensemble des animaux du projet seront euthanasiés à la fin du protocole afin de permettre le prélèvement post mortem des organes (poumons, foie, rate, cerveau, ganglion médiastinal) et fluides biologiques (sang, urine et fèces). Ces prélèvements nous permettront d'effectuer l'ensemble des analyses souhaitées comme l'analyse de charge bactérienne, des lésions, du recrutement cellulaire ou de la sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

A ce jour, aucun système in vitro ne permet de reproduire la complexité du tissu pulmonaire et les processus complexes de recrutement des cellules immunitaires. Le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, un test statistique de calcul de la puissance ou de l'effectif nécessaire en utilisant un test de comparaison de deux échantillons indépendants a été réalisé. Pour les données mesurées que ce soit le recrutement cellulaire, cytokines secrétées, nous obtenons une puissance de test pour un effectif de 6 animaux de 87% pour un test statisitique. Pour obtenir un groupe de 6 souris au dernier jour du protocole, nous savons qu’il nous faut partir d’un groupe de 24 animaux. En effet, tous les animaux ne réagissent pas pareil à l’infection, certains la contrôlent en formant des granulomes pulmonaires matures (25% des animaux), et les autres doivent être sacrifiés au fur et à mesure du protocole car ils atteignent les points limites (entre J21 et J35 classiquement). Chez ces animaux sensibles, des lésions désorganisées sont observables dans le poumon. En résumé, nos protocoles comprennent 24 souris, nous analysons les réponses immunitaires de deux groupes : les animaux résistants (5-6 souris) et sensibles (18-19 souris). Nous utilisons des souris consanguines dont la variabilité génétique est très faible. Nous utilisons des tests statistiques non paramétriques spécialement conçus pour comparer des groupes de petits effectifs. Un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène).

Raffinement

Les animaux seront élevés en communauté dans des cages enrichies avec du papier essuie tout, tunnel carton. Des visites des animaliers seront quotidiennes et la vidéosurveillance sera mise en place pour mieux suivre les souris. Les animaux seront 6 par cage de 530 cm2. Nous réduisons, et limitons au maximum l'inconfort, la douleur, pouvant être subie par les animaux. les animaux seront habitués en amont à la cellule d’expérimentation, une semaine avant le début de l’expérimentation Pour cela les animaux sont anesthésiés lors des infections et leur état général est suivi tout le long de l’expérimentation (poids, prostration…). Ainsi les animaux sont euthanasiés dès l’apparition des premiers signes de souffrance comme définis par le point limite. Après chaque prise de sang, une récompense positive alimentaire de type bouchée fruités ou rondelle de banane séchée ou popcorn sera réalisée.

Choix des espèces

Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexité de la réponse immunitaire d'un organisme entier. De plus, les modèles murins d'infections mycobactériennes sont très bien établis et permettent de mimer la physiopathologie observée chez l'homme et le bovin. De plus le modèle murin permet une manipulation en animalerie A3 et nous avons à notre disposition de nombreux outils pour cette espèce. Le modèle murin nous offre la possibilité d’utiliser des souris génétiquement modifiées pour les voies de signalisation ou cytokines impliquées dans les réactions immunitaires. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 semaines (sexe indifférent). Pour ce projet, il nous faut des animaux ayant un système mature compétent pour cela il nous faut des animaux adultes mais pas trop âgées. De plus nous utilisons un modèle validé par la communauté scientifique.

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Placées dans un dispositif générant des ondes 5G, elles subissent des dépilations et des anesthésies générales répétées pour des mesures cutanées, dont une exposition de la patte à une chaleur montant jusqu'à 44 degrés, afin d'évaluer l'effet des ondes de 3,5 et 26 GHz sur la peau saine et vieillissante. Le porteur qualifie les techniques de non invasives et indolores, la principale nuisance étant le risque de détresse respiratoire lié à la répétition des anesthésies. Il situe l'étude dans un contexte où "les enjeux commerciaux et financiers de la 5G sont importants" et où les autorités "souhaitent une mise en œuvre rapide".

Objectifs

La téléphonie mobile est en perpétuelle évolution pour répondre à une demande croissante des usagers. La cinquième génération (5G) d’infrastructures de communication est en phase de déploiement en France malgré un certain nombre de questions auxquelles la communauté scientifique tarde à apporter des réponses. Alors que la bande de 26 GHz couvrira les besoins de communication pour les objets connectés, ou des « hot spots » à très haut débit (arrêt de bus, quai de métro …), c’est la bande de fréquence autour de 3,5 GHz qui assurera la couverture en téléphonie mobile 5G (contre 2,6 GHz pour la 4G). L’effet sur les systèmes biologiques de ces fréquences de 3,5 GHz reste très mal connu et il n’est pas possible d’extrapoler de façon rigoureuse les résultats d’études scientifiques menées dans d’autres gammes de fréquence. L’augmentation de fréquence lors du passage de la téléphonie 4G à la 5G pourrait en théorie moduler d’éventuels effets biologiques. En effet, si la pénétration de l’onde dans les tissus est d’autant plus superficielle que sa fréquence est élevée, la puissance associée à l’onde augmente avec sa fréquence. Il est donc nécessaire d’évaluer précisément les conséquences biologiques d’une augmentation de fréquence sur les tissus exposés. Il est nécessaire d’étudier les effets des ondes électromagnétiques (OEMs) sur la peau, premier organe touché par les stress environnementaux et dont la fonction barrière est essentielle au maintien de l’intégrité de l’organisme. De plus, pour les fréquences à partir de quelques GHz, l’énergie des OEMs est presque entièrement absorbée dans les premières couches cutanées, notamment dans l’épiderme, et pénètre très peu en profondeur. Les données ne sont pas non plus suffisantes pour conclure à l’existence ou non d’effets sanitaires dans la bande de 26 GHz, aucune donnée d’exposition n’étant disponible à ce jour car les applications de type objets connectés sont encore à l’état de projet. L’objectif de ce projet est d’étudier les conséquences sur la peau d’une exposition chronique aux OEMs de 3,5 GHz, associée à une exposition ponctuelle aux OEMs de 26 GHz afin de mimer la situation que pourront rencontrer les populations utilisant la téléphonie mobile 5G dans leur vie quotidienne ainsi que, plus ponctuellement, des objets connectés dans leur vie professionnelle ou des stationnements sous la couverture de « hot spots ».

Bénéfices attendus

L’objectif de cette étude est d’évaluer l’impact de l’exposition aux OEMs 5G dans la population générale, y compris chez des personnes dont la peau est fragilisée par le vieillissement, ce qui représente une part importante et croissante de la population française. Les enjeux commerciaux et financiers de la 5G sont importants et les autorités souhaitent une mise en œuvre rapide pour offrir des débits bien supérieurs à ceux actuellement disponibles avec le réseau 4G. Dans un contexte général de grande défiance des populations vis-à-vis des nouvelles technologies et d’inquiétude concernant leur potentiel impact sur la santé, l’attente de la société est forte envers les experts. Nous devons donc répondre à l’attente des populations en évaluant de façon rigoureuse et avec des modèles pertinents les effets biologiques de ces nouvelles fréquences. Il est donc d’un grand intérêt à la fois scientifique et de santé publique d’étudier les effets des OEMs, en particulier dans la gamme de fréquences de la 5G.

Procédures

Après une période d’acclimatation d’une semaine minimum dans une cage standard avec un enrichissement adapté à leurs besoins, les souris seront hébergées en groupe à l’intérieur d’un dispositif capable de générer des ondes de type 5G. Une période d’habituation à leur nouvel environnement (dispositif éteint sans ondes) sera ajustée à l’âge des souris (1 semaine minimum). Pour étudier les effets des ondes sur la peau, une dépilation de la partie basse du dos sera réalisée sous anesthésie générale induite par un gaz (1 à 3 min) 1 à 3 jours précédant les mesures fonctionnelles nécessitant une nouvelle anesthésie générale (anesthésie par injection pour une durée de 30 à 45 min). Afin de limiter le nombre d’animaux, ces 2 anesthésies consécutives seront répétées une deuxième fois pour dépiler à nouveau la zone si besoin et réaliser une 2ème série de mesures en respectant un minimum de 3 semaines entre les deux séries de mesures. L’anesthésie générale par injection (30-45 min) permettra de prélever du microbiote cutané en frottant un écouvillon sur les faces interne et externe des 2 oreilles (moins de 1 min/oreille) puis de réaliser séquentiellement des mesures non invasives pour évaluer la fonction barrière (moins de 1 min), les propriétés viscoélastiques (moins de 1 min), la perfusion sanguine (moins de 2 min) et la capacité des vaisseaux à se dilater en réponse à l’application locale d’une drogue vasodilatatrice (20 à 30 min) de la peau au niveau du dos. En même temps que la mesure vasculaire au niveau dos, une autre mesure vasculaire sera réalisée lors d’une exposition à une chaleur croissante (33 à 44°C ; +1°C/minute) au niveau d’un coussinet arrière pour évaluer les capacités de thermorégulation. Toutes les techniques utilisées sont indolores ; elles sont également utilisées chez l’homme. Afin de comparer l’effet des OEMs de type 5G sur la peau saine ou fragilisée par le vieillissement chronologique, nous étudierons des souris à l’âge jeune (15 mois). La principale nuisance est liée à la répétition d’anesthésies générales, qui pourrait augmenter le risque de détresse respiratoire au réveil. Pour cela, chaque souris aura au maximum 2 séries qui nécessitent 1 anesthésie à l'isoflurane (dépilation environ 2 min) et 1 au thiopental (mesures fonctionnelles 45 min au maximum). Les deux anesthésies au thiopental seront espacées au minimum de 3 semaines.

Impact sur les animaux

Toutes les techniques envisagées sont non invasives et utilisées dans les études cliniques. Aucune douleur n’est attendue. Sous anesthésie générale, l’exposition à un chauffage local (augmentation de la température de la peau de 33 à 44°C à +1°C/min) sur 1 coussinet (patte arrière) ne représente pas de nuisances particulières d’après notre expérience. Les souris prévues dans cette étude ne sont pas des souris transgéniques (pas de phénotype dommageable). Au cours du vieillissement, les souris peuvent perdre du poids et baisser leur température interne. Ces deux paramètres seront suivis au minimum 1 fois par semaine pour les souris âgées de 15 mois et plus.

Devenir

Mise à mort. En effet, plusieurs prélèvements terminaux seront réalisés à différentes durées d’exposition pour permettre des analyses tissulaires et moléculaires approfondies.

Remplacement

L'objectif de ce projet étant d'étudier les effets des OEMs sur plusieurs aspects fonctionnels de la peau (fonction barrière, fonction vasculaire, propriétés viscoélastiques), il est nécessaire de travailler sur un organisme entier, car il est actuellement impossible de reproduire l’intégrité fonctionnelle dans un modèle de peau in vitro, en particulier la réactivité vasculaire cutanée qui repose sur une interaction fonctionnelle des systèmes nerveux et vasculaires.

Réduction

Le nombre total de souris prévues pour ce projet est de 288 afin d'étudier 16 souris à 3 types d'expositions, des 2 sexes, à 3 âges différents. Ce nombre maximal inclut la possibilité d’étudier un âge intermédiaire. L’étude débutera en comparant les effets des OEMs entre les souris âgées et les souris jeunes. En absence de différences, les souris d’âge intermédiaire ne seront pas utilisées. Afin de réduire le nombre d’animaux, 5 mesures (4 sur le dos et 1 sur une patte arrière) seront réalisées au cours d’une seule anesthésie et 2 séries de mesures par souris. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions sur ces mêmes modèles. Nous avons prévu d’utiliser des tests statistiques adaptés aux petits groupes pour évaluer les différences intra- ou inter-individuelles pour toutes les mesures. Nos expériences précédentes nous ont amené à conclure que 8 mesures au minimum étaient nécessaires pour chaque phase étudiée.

Raffinement

Une période d’habituation à leur changement d’environnement lié au dispositif qui va générer les ondes 5G sera respectée et adaptée en fonction de l’âge des souris (1 sem pour les souris jeunes, 2 sem pour les souris matures, et 3 sem pour les souris âgées). Les souris seront suivies avec un soin particulier, elles seront observées 3 fois par semaine au minimum et pesées une fois par mois avant 15 mois puis plus régulièrement pour les animaux vieillissants (pesée et mesure de la température rectale hebdomadaires). Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance. Toutes les interventions et les mesures sur la peau seront réalisées sous anesthésie générale.

Choix des espèces

La souris, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, reste largement utilisée pour étudier l’intégrité fonctionnelle de la peau. Cette espèce possède en effet une physiologie cutanée proche de celle de l'Homme et permet d'étudier la fonction vasculaire par les mêmes approches techniques (laser Doppler, iontophorèse) ainsi que les autres explorations cutanées (propriétés viscoélastiques, perte insensible en eau, perfusion sanguine, microbiote), tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaire et moléculaire. Nous utiliserons des souris âgées minimum de 10 semaines lorsque leur système sensoriel et vasculaire est développé. Afin d’étudier l’impact des OEMs sur la peau saine ou fragilisée par le vieillissement chronologique, les souris seront utilisées à 3 âges différents : à l’âge jeune (15 mois). La durée maximale de la procédure sera de 20 semaines, et l’âge des souris les plus âgées ne dépassera pas 22 mois en fin de procédure.