Procédures modérées
Implications du facteur von Willebrand (VWF) dans les dommages tissulaires liés aux maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, vingt-six sous anesthésie sans réveil et les autres dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un composé colitogène dans l'eau de boisson pendant quinze jours puis un gavage, pour étudier le rôle du facteur von Willebrand dans un modèle de maladie inflammatoire chronique de l'intestin. Le porteur indique que le traitement peut provoquer une perte de poids, des postures anormales, des vocalisations et des hémorragies rectales. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" in vitro pour induire cette colite.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI), maladie de Crohn et rectocolite hémorragique (RCH), affectent plus de 2 millions de personnes en Europe et leurs causes restent inconnues. Malgré la présence de saignements dans l’intestin, le risque de formation d’un caillot sanguin est augmenté chez les patients atteints de MICI. En dépit d’années de recherches intensives les implications cellulaires et moléculaires responsables de l’état procoagulant restent mal définies. Les MICI sont associées à une augmentation des taux circulants d’une protéine de l’hémostase (le facteur von Willebrand (VWF)). Ainsi, Ce projet a pour objectif d’étudier le rôle du facteur Willebrand dans un modèle murin de MICI.
Bénéfices attendus
Ce travail répondra aux questions suivantes : 1) La coagulation sanguine est elle importante pour limiter les altérations tissulaires (en particulier du tissus colique) au cours des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin? 2) La préservation de la perméabilité intestinale au cours des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin fait-elle appel au processus de coagulation ? De manière plus générale, ce projet permettra d’évaluer si la modulation du processus de coagulation pourrait présenter un intérêt thérapeutique chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin.
Procédures
Les animaux seront soumis à un traitement colitogène dans le but de mimer une maladie inflammatoire chronique de l’intestin telle que la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique. Une partie des animaux sera soumis à un gavage de FITC-Dextran pour évaluer la perméabilité intestinale. Le nombre d'interventions sera de 2 au maximum avec administration de substance colitigène dans l'eau de boisson pendant 15 jours (3 fois 5 jours) et 1 gavage avec la substance fluorescente (FITC-dextran), qui dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
Le traitement colitogène est susceptible de provoquer une souffrance de l’animal mais il s'agit ici d'un modèle chronique qui est moins sévère que le traitement en aigu. Il est toutefois possible que les souris présentent une perte de de poids, des postures anormales, des vocalisation, une réduction de la mobilité, un mauvais état du pelage ou encore des hémorragies rectales.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélever les tissus qui seront analysé par la suite.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative in vitro pour étudier les mécanismes des maladies inflammatoire chroniques de l’intestin et induire des colites en particulier dans le cadre de l’étude de la fonction d’un facteur hémostatique.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux, plusieurs types de mesures seront effectuées sur un même animal. De plus, sur la base des résultats issus des expérimentations précédemment menées, il nous a été possible d’évaluer la force de l’effet à 0.4. En conséquence, sur la base d’un plan expérimental à 4 groupes relevant d’une Anova à 2 facteurs (facteur « génotype » et facteur « induction d’une colite »), pour une puissance statistique requise de 0.8 et un seuil de significativité établi à 0.05, il nous a été possible de déterminer les effectifs minimums requis par groupe via une simulation par le logiciel G-Power, laquelle nous a fourni un effectif minimum de n = 13.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques. L’ensemble des expériences seront effectuées par une personne habilitée à expérimenter sur animaux. En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et des organes prélevés pour permettre des analyses biologiques. L'utilisation de médicaments analgésiques sera mise en place en cas de signes de mal-être des animaux. De plus, des points limtes stricts et spécifiques au projet seront appliqués.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce souris se justifie par l’existence de modèles transgéniques pour notre protéine d'intérêt et de modèles bien établis de colite 8 à 12 semaines : adulte, poids d’au moins 20 g
Étude de l’effet du blocage du métabolisme des acides gras par traitement curatif dans un modèle murin d’asthme chronique allergique
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
144 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à vingt-trois instillations intranasales d'allergène sous anesthésie et deux injections intra-péritonéales, avant des mesures respiratoires par trachéotomie, pour tester si le blocage d'une enzyme du métabolisme des acides gras réduit le remodelage bronchique dans un modèle d'asthme chronique. Le porteur indique que la sensibilisation peut provoquer une inflammation des voies respiratoires et une dyspnée. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'évolution du remodelage bronchique et conclut au recours à la souris.
Objectifs
L’asthme est une maladie très fréquente des voies respiratoires qui touche 300 millions de personnes dans le monde. Le terme « d’asthme sévère » s’applique aux patients présentant un asthme dont le contrôle est impossible malgré des traitements inhalés à fortes doses. Un des besoins non couvert dans l’asthme sévère est la prévention efficace des exacerbations. Ces exacerbations sont des épisodes caractérisés par une majoration des symptômes d'essoufflement, de toux, de respiration sifflante ou d'oppression thoracique et par une diminution de la fonction respiratoire. L'asthme est caractérisé par une hyperréactivité, une inflammation et un remodelage bronchique. Le remodelage bronchique est un changement structurel qui comprend entre autres l’augmentation de la taille du muscle lisse bronchique. La taille du muscle lisse bronchique est une valeur très importante, car son augmentation est associée à une fonction respiratoire dégradée et à un taux d’exacerbation plus élevé. L’objectif de ce travail est d’étudier si le blocage du métabolisme des acides gras par un fragment d’anticorps contre une des molécules de cette chaine métabolique à un moment où tous les signes de l’asthme sont bien développés peut réduire les symptômes de la maladie dans le modèle murin de l’asthme chronique allergique.
Bénéfices attendus
Ce projet montrera si le blocage d’une des molécules qui jouent le rôle important de régulation du métabolisme énergétique dans les muscles lisses bronchiques permet de diminuer les symptômes d’asthme et notamment de remodelage du muscle lisse bronchique chez les animaux de laboratoire. Les données ainsi obtenues ouvriront la voie pour la nouvelle thérapie de cette pathologie respiratoire.
Procédures
Les animaux seront soumis aux vingt-trois (maximum) instillations intranasales sous anesthésie gazeuse (durée jusqu’à 2 minutes) et les deux injections intra-péritonéales de l’allergène (2 injections). Les mesures de paramètres respiratoires d’une durée de 10 minutes seront faites par la méthode de trachéotomie sur les animaux anesthésiés dans la procédure sans réveil.
Impact sur les animaux
Les animaux vont subir un léger stress suite aux contentions pour l’injection/l’instillation des allergènes et un bref placement dans une boîte en plexiglass. Les souris ressentiront une légère douleur des piqûres pendant l’injection. L’anesthésie sous isoflurane induit également un léger stress. La sensibilisation aux allergènes induit des symptômes asthmatiques chez l’animal : l’inflammation des voies respiratoires et éventuel remodelage bronchique. Ces symptômes peuvent survenir après l’instillation de l’allergène et éventuellement provoquer une dyspnée (un essoufflement).
Devenir
L’objectif de ce projet est d’estimer l’efficacité de traitement contre le remodelage bronchique dans l’asthme. Suite au développement des symptômes d’asthme, les animaux recevront le traitement et les paramètres respiratoires seront réalisés. Puis les animaux seront mis à mort et les organes seront prélevés et analysés au laboratoire.
Remplacement
En raison de la complexité de la communication intercellulaire menant à la maladie, il n’existe pas de modèle in vitro qui permet d’estimer l’évolution du remodelage bronchique dans l’asthme. Grace au modèle animale, nous testerons les hypothèses apparues après nos résultats in-vitro sur les lignées cellulaires. Il est bien que l'asthme bronchique chez l’homme est une maladie multifactorielle, où les facteurs génétiques, l'âge, les conditions environnementales, l'ontogenèse et l'anamnèse de la maladie jouent un rôle important. Le contrôle de ces facteurs dans nos expériences avec des souris de laboratoire nous permettra de révéler l'effet physiologique réel du blocage du métabolisme des acides gras sur le développement des symptômes de la maladie. L’utilisation du modèle murin d’asthme chronique allergique dans nos études nous donnera une meilleure compréhension des phénomènes et à terme de proposer des traitements plus efficaces pour la prise en charge des personnes asthmatiques.
Réduction
Se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, comme pour chaque test statistique, nous avons défini le nombre de souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs, et nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes et selon différentes techniques. Nous allons comparer les organes des groupes de souris asthmatiques avec ceux des animaux témoins qui recevront ou non le traitement pouvant diminuer les symptômes d’asthme. Chez une partie des souris de chaque groupe, les paramètres du système respiratoire seront mesurés par pléthysmographie invasive. Comme il a été déjà démontré par nos travaux précédents, les groupes de souris doivent être composés de 10 souris minimum afin de mettre en évidence une différence significative sur les différents paramètres analysés grâce à la pléthysmographie invasive notamment la résistance bronchique dont la variabilité est importante. Dans la deuxième partie des souris de chaque groupe, nous étudierons les processus inflammatoires dans le lavage broncho-alvéolaire (BAL). Dans ce but, nous avons besoin 6 souris dans chaque groupe. Le nombre de souris à inclure a été réduit au maximum selon les tests statistiques définis.
Raffinement
Afin de diminuer la souffrance et l’angoisse des animaux, des dispositifs sont prévus (anesthésie pour les instillations), raffinement des conditions d’hébergement (hébergement en groupe sociaux, frisottis et bâtonnets), vérification par la structure en charge du bien-être des animaux et nous avons soigneusement décrit des points limites en relation avec notre protocole (critères de perte de poids, comportement anormal ou difficulté respiratoire). La dyspnée éventuelle induite par les instillations intranasales peut être traitée par la nébulisation pendant 15 s d’un broncho-dilatateur d’action rapide.
Choix des espèces
La souris est une espèce classiquement utilisée pour l’étude de la réactivité des voies aériennes normales et pathologiques. De plus, le laboratoire utilise cette espèce depuis plusieurs années, et dispose donc dans cette espèce, de nombreuses données sur lesquelles s’appuie la présente étude. Les animaux utilisés sont des femelles. La majorité des études sur l’asthme est menée sur les souris femelles. L’utilisation des femelles permet de rapprocher le modèle murin de la maladie humaine car la sévérité de l’asthme est plus fréquente chez la femme que chez l’homme. Les animaux utilisés pour commencer le protocole sont des jeunes souris âgés de 5 à 10 semaines. La plupart des études scientifiques dans le domaine pneumologique sont réalisées sur les animaux de cet âge.
Traitement par thérapie cellulaire de la cystite radique chez le rat III
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
1 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Leur vessie est irradiée à 40 Gy puis ils reçoivent des injections de cellules souches et subissent des cystoscopies sous anesthésie et des séjours en cage à métabolisme, pour tester une thérapie cellulaire contre la cystite provoquée par la radiothérapie. Le porteur indique l'apparition possible, à partir de douze mois, de masses le long des chaînes mammaires, avec euthanasie au-delà de trois centimètres de tumeur. Il reconnaît qu'aucun modèle de vessie en trois dimensions n'existe et que la culture cellulaire ne reproduit pas la cystite radique chronique.
Objectifs
LLes rayonnements ionisants sont à ce jour un outil incontournable de l’arsenal thérapeutique de la cancérologie. En France, chaque année, la moitié des cancers sont traités par radiothérapie externe. Malgré les nombreux progrès dans ce domaine, il est important de noter que la radiothérapie s’accompagne fréquemment d’effets secondaires en raison de la présence de tissus normaux dans le champ d’irradiation. Certains de ces effets disparaissent spontanément alors que d’autres apparaissent de façon inéluctable. Cinq ans après traitement, 5 à 10 % des patients développent des complications tardives plus ou moins sévères de leur radiothérapie. L’objectif de cette étude sera de développer une stratégie thérapeutique innovante afin de traiter la cystite radique suite à l’application d’un protocole de radiothérapie. Cette étude vise à apporter des preuves précliniques de l’utilisation des cellules souches mésenchymateuses (CSM) pour le traitement de la cystite radique. Après vérification de la qualité des CSM, des rats seront soumis à une irradiation locale au niveau de la vessie puis traités par injection de cellules souches (CSM). Les effets de l’irradiation seront suivis à long terme.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont la mise au point un traitement cellulaire de la cystite radique par thérapie cellulaire en utilisant des cellules particulières, les CSM. Pour cela, il faudra évaluer l’effet de ces cellules sur les lésions de la vessie grâce à un modèle animal. Les bénéfices sont à terme une amélioration des traitements pour les patients atteint de cette pathologie.
Procédures
Quatre mois après irradiation localisée au niveau de la vessie à 40 Gy (durée 30mn), des injections de cellules souches en intraveineuses seront réalisées chez les rats au niveau de la veine caudale sous anesthésie gazeuse. Des injections de intra vésicales seront également réalisées pour vérifier la perméabilité de la paroi vésicale. Un suivi en cage métabolique (durée de 24 heures) mensuel sera réalisé. Plusieurs cytoscopies seront réalisées sous anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Les animaux seront sous anesthésie gazeuse lors de l’irradiation pour une période de 30mn. Les animaux subiront trois injections intraveineuses à 15 jours d’intervalle sous anesthésie gazeuse. Il est possible que suite aux injections des rougeurs apparaissent au niveau de la queue : cela sera surveillé les jours suivants les injections. La mise en cage métabolique sera réalisée une fois par mois, pour une durée de 24h. Plusieurs cytoscopies seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Compte-tenu des temps tardifs, de la lignée choisie et du sexe des animaux, il est possible de voir apparaitre chez les animaux à partir de 12 mois, des masses, surtout localisées le long des chaines mammaires. Les animaux seront palpés avec attention régulièrement afin de détecter précocement l’apparition de ces masses.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de pouvoir réaliser les analyses ultérieures notamment histologiques sur les organes d’intérêt.
Remplacement
Le modèle d’organe en trois dimensions de la vessie à partir de cellules, n’a pas encore été mis au point. La raison est la complexité de la structure de la vessie. L’utilisation de culture primaire de vessie de rat sera mise en place pour l’étude des mécanismes d’action des CSM mais ne représente pas la cystite radique de manière chronique et l’effet du traitement dans cette condition.
Réduction
Pour chaque groupe le nombre d’animaux a été ajusté au plus juste pour obtenir des résultats statistiquement utilisables. Pour les temps précoces, les groupes seront composé de 20 rats. 10 serviront aux analyses transcriptomiques, histologiques et protéiques et 10 serviront aux analyses de cytométrie qui nécessitent l’utilisation d’une vessie entière. Pour les temps les plus tardifs, le nombre de rat a été augmenté à 30 rats par risque de perte des animaux en raison de la présence de tumeurs ou d’abcès chez les rats.
Raffinement
Les animaux seront observés durant toute l’expérimentation. La surveillance de l’animal sera effectuée une fois par jour (comportement, aspect du poil, consommation alimentaire, perte de poids, diarrhée importante…). Si, au cours de l’expérience un animal montre des signes de souffrance, il sera retiré de l’expérimentation et euthanasié si son état est jugé irréversible. En fonction des signes observés, il pourra être décidé de changer le type de litière ou d’augmenter la fréquence de change des cages. Une attention particulière sera portée sur les tumeurs. Les tumeurs seront mesurées. Si la tumeur est - Inférieur à 1cm --> pas d’opération mais à surveiller et voir l’évolution - Entre 1cm et 3cm --> opération de la rate (selon la date d’euthanasie prévue) - Supérieur à 3 cm --> euthanasie de la rate. En cas d’abcès, une ponction sera réalisée.
Choix des espèces
Le protocole d’irradiation a été mis au point au laboratoire chez le rat. Les caractéristiques des CSM de rats sont proches des CSM humaines. De plus, nous disposons de rats transgéniques porteurs d’un gène marqueur vert appelé GFP, donneurs de cellules et nous permettant de réaliser des greffes homologues. Les cellules greffées seront donc repérables dans les tissus receveurs grâce à l'expression de la molécule fluorescente GFP. Nous utiliserons des animaux de 275 g à 300 g pour les différentes études citées ci-dessus (rats 12 semaines) et des rats de 6 semaines pour la mise en culture des CSM (la multi-potentialité des CSM et leur capacité réparatrice est réduite avec l’âge, nous isolerons donc les CSM à partir de rats jeunes).
Mise en oeuvre des études pharmacocinétiques/pharmacodynamies chez les rongeurs
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 1500
Cochons d'Inde : 100
2 000 souris, 1 500 rats et 100 cochons d'Inde vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un composé à tester puis subit jusqu'à neuf prélèvements de sang en vingt-quatre heures et des séjours en cage à métabolisme en isolement, certains portant un dispositif chirurgical pour recueillir la bile, pour mesurer le devenir de molécules candidates. Le porteur reconnaît un stress lié à la contention et à l'isolement ainsi que des douleurs et des lésions internes possibles aux sites de prélèvement. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la diffusion d'un produit dans l'organisme entier, ce qui rendrait le recours à l'animal "indispensable".
Objectifs
L'objectif de ce projet est de pouvoir conduire différents protocoles dans lesquels différents éléments d'essai seront testés (classe thérapeutique anti inflammatoire, anti cancéreux, antibiotique, neurologie principalement) ainsi que l'évaluation des excipients et des produits exploratoires. Suite à ces différentes études, l'objectif est de pouvoir identifier de nouveaux éléments qui pourront pas la suite peut être donner lieu à de nouveaux médicaments. Il peut s'agir de conduire des études de PK simple: suivre les paramètres de l'élément testé dans les matrices plasma/serum principalement. Il peut s'agir de conduire des études PK/PD: suivre les paramètres de l'éléments testés dans les matrices plasma/serum principalement mais également de suivre les effets de ces éléments test en suivant certains paramètres biologiques. Il peut s'agir de conduire des études pour mettre en avant les phases Administration, Distribution, Métabolisme et Elimination. Dans ce cas les éléments test peuvent être suivis dans les urines, fécès, bile ...
Bénéfices attendus
L'intéret de ce projet est de pouvoir mener différentes études en testants différents éléments d'essai sur des rongeurs. Cela permettra d'identifier les composés intéressants qui pourront peut être déboucher sur de nouveaux médicaments humain ou vétérinaires. Les différents protocoles entrant dans le scope de ce projet (études PK, études PK/PD, études ADME) seront primordiaux pour avoir des données sur les paramètres phamacocinétiques et pharmacodynamiques des éléments testés pour pouvoir déterminer les relations dose/effet.
Procédures
Les animaux seront soumis à différents types d'intervention - Premièrement l'administration de l'élément test. Cela sera fait sur animal vigile par un personnel formé pour éviter tout stress à l'animal -Puis des prélèvements de sang seront réalisés. En fonction de l'espèce animale les volumes et le nombre pourront varier. Pour les rats et les cobayes, 9 prélèvements maximum sur 24h, volume prélevé environ 60 μL Pour les souris, 9 prélèvements maximum sur 24h , volume prélevé environ 30 μL. La durée d'un prélèvement est inférieur à la minute. Les animaux pourront être placés en cage à métabolisme pour des recueils d'excrétas si demandés. La durée de l'hébergement dans ces cages à métabolisme sera réduite au maximum. Jusqu'à 7 jours maximum pour le recueil d'urine ou de fecès et jusqu'a 72h maximum pour le recueil de bile. Les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux.
Impact sur les animaux
Suite aux différentes administrations et durant les prélèvements sanguins, les animaux peuvent ressentir du stress, de la peur à la contention. Les prélèvements sanguins seront réalisés à différents sites de prélèvements, mais il peut y avoir de la douleur, des lésions internes. Lors des recueils de bile, de fécès ou d'urine, les animaux seront hébergés en cage à métabolisme. Cela signifie un hébergement individuel. Cela peut également occasionner du stress pour l'animal. Si l'animal a subit une chirurgie pour un recueil de bile, ou une administration duodénale cela necessite que l'animal porte un dispositif particulier qui peut influer sur sa liberté de mouvements. Tous ces gestes seront réalisés par un personnel expérimenté pour éviter au maximum toutes ces nuisances
Devenir
A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort. Cela sera pratiqué par un personnel expérimenté conformément à la réglementation en vigueur.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux ni d'évaluer les effets d'une molécule sur un ou plusieurs paramètres pharmacodynamiques au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier.
Réduction
Pour ce projet, il est envisagé d'utiliser environ 1500 rats, 2000 souris, 100 cobayes sur 5 ans. Ce sont des chiffres approximatifs pour une durée de 5 ans. Le nombre d'animaux inclus dans chaque étude entrant dans le scope de ce projet sera réduit au minimum pour avoir des résultats interprétables. Par exemple en utilisant la technique du micro sampling ( prélèvement de 30 µL de sang par animal) ou en utilisant des animaux cathétérisés cela permettra de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés car 9 points de pK pourront être réalisés sur le même animal.
Raffinement
Une attention particulière sera portée à l'enrichissement du milieu. Animaux hébergés en groupe autant que possible avec présence d'enrichissement au maximum au niveau des hébergements ( présence de buchettes, cachettes, tunnels ...) Les animaux seront observés quotidiennement pour une prise en charge rapide. Pour préserver les sites de prélèvement au maximum, un point de compression sera réalisé aprés chaque prélèvement avec la possibilité d'appliquer de la glace afin d'éviter la formation d'hématome. Les sites seront alterner autant que possible et le nombre de prélèvement de sang par site sera réduit au minimum.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont les espèces majoritairement utilisées dans ces études. Ces espèces sont bien décrites et caractérisées dans la littérature et leur utilisation est conseillée (OCDE) pour les essais de produits pharmaceutiques. Le cobaye est minoritairement utilisé mais peut permettre d'identifier des métabolites absents chez les deux précédentes espèces, par exemple. Nouveau nés, jeunes, adultes. Le stade de développement sera justifié pour chaque étude. Cela dépendra de la cible concernée pour le produit testé.
Impact de la neuroinflammation et des encéphalites virales sur le développement précoce du système nerveux
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
10 345 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère, une partie gardée vivante comme géniteurs et les autres tués à l'issue. Aux stades larvaires surtout, ils sont infectés par des virus neuroinvasifs ou reçoivent des injections de cytokines et une activation optogénétique, pour étudier l'impact d'une inflammation précoce sur le système nerveux. Le porteur indique que l'infection peut provoquer perte d'équilibre, hémorragies, arythmies et nécrose cérébrale, les larves atteignant un point limite étant alors anesthésiées. Il affirme que ces interactions complexes ne peuvent être "totalement remplacées" in vitro, tout en signalant un modèle mathématique réduisant le nombre d'animaux.
Objectifs
L’objectif général de ce projet est de comprendre les mécanismes par lesquels une neuroinflammation précoce peut conduire à des déficits neurologiques ou des maladies psychiatriques, en utilisant le poisson-zèbre comme modèle animal. D’une part, nous étudierons les conséquences de cette inflammation dans le contexte d’une infection virale neuroinvasive, comme modèle d’encéphalite virale du nouveau-né. Nous utiliserons pour cela le modèle d’infection par le virus de Sindbis (SINV), bien établi, et nous développerons un autre modèle par le virus de herpès simplex (HSV-1). Nous chercherons à distinguer les impacts du virus lui-même sur ceux de l’inflammation dans les déficits neurologiques observés. D’autre part, nous analyserons les impacts d’une inflammation stérile sur le système nerveux en cours de développement ou de réparation. L’inflammation peut se manifester de diverses façons avec l’induction du plusieurs cytokines (molécules permettant la communication entre cellules) aux effets parfois antagonistes. Pour clarifier notre analyse, nous aurons essentiellement recours à l’injection de cytokines recombinantes. Nous développerons par ailleurs des systèmes optogénétiques pour induire l’expression de cytokine in vivo sans avoir recours à une injection. Afin de disséquer les mécanismes impliqués, nous aurons recours à différents mutants dans les voies de signalisation des cytokines ou dépourvus de certains types cellulaires importants. Nous vérifierons d’éventuelles modifications neurologiques chez ces mutants adultes. Nous étudierons le comportement de nos animaux ainsi que la morphologie et la composition cellulaire du système nerveux, avec un intérêt plus particulier pour le système dopaminergique (système particulier de transmission nerveuse) impliqué dans plusieurs maladies psychiatriques qui ont été liées à des infections précoces.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait nous permettre de mieux appréhender le rôle de la neuroinflammation dans les déficits neurologiques constatés après une encéphalite d’origine infectieuse ou stérile. Ceci devrait aider à décider du bien-fondé des traitements anti-inflammatoires dans ces situations. L’identification de gènes protecteurs contre l’infection sans effet indésirables lors d’une surexpression par des neurones ouvrira de nouvelles pistes vers le traitement ou la prévention des encéphalites virales par thérapie génique.
Procédures
Aucun prélèvement sur animaux vigile. Pour du génotypage de routine, des prélèvements d'un fragement de nageoire seront réalisés sous anesthésie. Microscopie intravitale effectuée sous anesthésie (durée maximale une heure, avec des sessions quotidennes pendant 10 jours au plus). Tests de comportement: enregistrement de la locomotion spontanée ou après stimuli lumieux ou sonore (durée maximale 1 heure, avec deux sessions par semaine au plus). Suivi d'une infection virale établie par microinjection sous anesthésie (pendant 7 jours au plus). Suivi des conséquences d'une inflammation précoce obtenue par microinjection de protéines sous anesthésie (pendant 14 jours au plus). Suivi des conséquences d'une inflammation précoce obtenue par activation optogétique (pendant 3 jours au plus). Suivi des conséquences d'une inflammation précoce obtenue par transgénèse (pendant 7 jours au plus). Suivi de le régénération du cerveau après arrêt d'une infection virale (pendant 17 jours au plus).
Impact sur les animaux
Les infections virales des larves sont susceptibles d’entraîner les effets suivants : perte d’équilibre, hyperactivité, apathie, hémorragies localisées, arythmies cardiaques, oedèmes, et ceci tant que l’infection persiste. Dans les cas d’infection létale (attendue chez certains mutants notamment) un assombrissement du cerveau sera préalablement observé, traduisant un début de nécrose, qui entraînera une anesthésie profonde évitant tout décès non traité. Les injections de cytokines inflammatoires (ou leur équivalent optogénétique) devraient causer hyperactivité ou apathie, comportements anxieux, arythmies cardiaques. Ces effets devraient être transitoires (moins de 24 heures) pour la plupart. Lors des tests de surexpression des ISGs (gènes induits par les interférons, qui sont des cytokines antivirales) par des neurones, ces effets sont attendus pour les ISGs qui seraient neurotoxiques. Dans les cas les plus extrême une nécrose localisée pourrait être observée, entraînant là aussi une anesthésie définitive. Dans les expériences de régénération du cerveau chez les juvéniles, une perte d’appétit et une apathie globale est attendue. Chez les adultes mutants pour les gènes immunitaires d’intérêt, une susceptibilité aux infections opportunistes peut se traduire par l’apparition plus précoce de signes classiques tels que cachexie, lordose, pétéchies, ou nage anormale.
Devenir
Les animaux utilisés à des fins d'élevage et entrant dans les procédures de génération de lignées transgéniques, de génotypage de routine, ou de caractérisation de lignées potentiellement délétères, seront conservées pour servir de géniteurs. Tous les autres animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure.
Remplacement
Nous travaillons sur des interactions complexes entre les nombreux types cellulaires du système nerveux, du système immuntiaire, et un pathogène, qui ne peuvent être totalement remplacées par des modèles in vitro ou in silico. Nous avons toutefois développé un modèle mathématique de la progression virale et de la réponse interféron de type I dans le système nerveux et la périphérie, à partir de nos données d'imagerie et de mesure d'expression des gènes par biologie moléculaire. Ce modèle permet de déduire certains paramètres expérimentaux, comme l'évolution du titre viral, réduisant le nombre d'animaux nécessaires à certaines de nos expériences.
Réduction
Les nombres d'animaux employés dans les expériences sont basés sur notre expérience passée pour des tests comparables, nous permettant de prédire la variance attendue et donc de réaliser des tests de puissance statistique. Lorsqu'il n'y a pas d'nterférence attendue entre deux tests, les animaux sont réutilisés pour plusieurs mesures.
Raffinement
Grâce à la transparence de la larve de poisson-zèbre, il nous est possible de mesurer la localisation de l'infection et la charge virale par des approches d'imagerie intravitale non-invasives. Pour limiter la douleur liée à l'infection de la larve sans interférer avec le déroulement de l'expérience, nous suivons les larves infectées en mesurant un score clinique quotidien; si l'infection est avancée avec atteinte de point limite, les larves sont anesthésiées pour éviter toute souffrance, tout en nous permettant de continuer à suivre l'évolution de l'infection.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est un modèle animal bien établi. En tant que vertébré, les principes de fonctionnement de ses systèmes nerveux et immunitaire sont semblables aux nôtres. Sa manipulation génétique est aisée et la petite taille, la transparence, et l’anesthésie facile de ses larves en fait un excellent système pour la microscopie intravitale. De nombreuses lignées transgéniques fluorescentes permettent d’observer la localisation et/ou l’activité de diverse populations neurales ou immunes. Combinées avec des pathogènes eux-mêmes porteurs de gènes fluorescents, on peut suivre en temps réel la propagation d’une infection et la réponse immune et neurale. La très grande majorité de nos expériences seront réalisées au stade larvaire, qui se prête le mieux à la microscopie et requiert le moins d’espace. Toutes les infections, notamment, seront réalisées à ce stade, avec des animaux maintenus en plaques multi-puits en incubateur dans un laboratoire de sécurité de niveau 2, facilitant le confinement des pathogènes. L’élevage de poissons adultes aura pour finalité principale la production des larves destinées à nos expériences. Si le(s) transgène(s) et/ou la mutation portés par ces adultes sont potentiellement dommageables, nous mesurerons cela aux stades juvénile et adulte. Les conséquences à long terme de certaines manipulations au cours du stade embryonnaires seront évaluées chez des poissons juvéniles.
Etude de la physiopathologie du syndrome de Marfan dans un modèle de poisson-zèbre
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
2 814 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Porteurs de mutations reproduisant le syndrome de Marfan, ils subissent des prélèvements de nageoire, des exercices de nage forcée pour mesurer vitesse et endurance et un protocole d'entraînement de plusieurs semaines, pour étudier les atteintes musculo-squelettiques de la maladie. Le porteur décrit une possible émaciation et des comportements d'anxiété ou de résignation, avec arrêt du protocole au-delà de 20 % de perte de poids. Il affirme que le poisson zèbre est le modèle vertébré "le plus simple" pour cette étude, plus rapide et moins coûteux que le rongeur.
Objectifs
Le syndrome de Marfan (SM) est une maladie génétique rare (1/5000), touchant aussi bien les hommes que les femmes. Les patients présentent des atteintes cardiovasculaires, oculaires et musculo squelettiques. Les anomalies cardiaques sont responsables d’une mortalité précoce, qui est maintenant contrôlable grâce aux progrès dans la prise en charge de la maladie. Par contre, la fatigue chronique et la moindre endurance physique sont des affections fréquentes des patients atteints de SM avec un impact important sur la qualité de vie, aussi l’intérêt de recherche s’est tourné vers une meilleure compréhension des atteintes musculosquelettiques. Une fragilité des tissus de soutien et un déficit musculaire, à l’origine d’un stress accru sur le système musculosquelettique, pourraient participer à ces symptômes. Une étude clinique a rapporté un déficit en masse maigre dès l'enfance et s'aggravant avec l'âge, et la pertinence d'un programme d'entraînement est actuellement évaluée. Comprendre les mécanismes à l’origine de ce déficit musculo-squelettique pourrait permettre l’identification de cibles thérapeutiques spécifiques et le développement de traitements. Nous proposons donc de développer un modèle animal original de la maladie et d’explorer les paramètres osseux et musculaires. Le poisson zèbre représente le système vertébré le plus simple disponible à ce jour pour évaluer l’impact d’une mutation d'un gène associé à une maladie génétique sur le système musculo squelettique à l’échelle tissulaire, cellulaire et moléculaire et de pouvoir évaluer les bénéfices éventuels d’un entrainement. Nous souhaitons donc développer et caractériser des lignées de poisson zèbre portant des mutations équivalentes aux mutations responsables du SM chez l'Homme. Leur comparaison permettra de mieux comprendre la physiopathologie du SM, afin d’identifier de possibles cibles thérapeutiques et d’optimiser les protocoles d’entrainement personnalisé.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux documenter la physiopathologie du SM, qui est à l’heure actuelle mal comprise, et d’identifier des stratégies thérapeutiques allant de programme d’entrainement à des approches pharmacologiques qui pourront toutes deux être testées dans ce modèle poisson -zèbre de la maladie.
Procédures
-Prélèvement unique à la nageoire caudale pour génotypage sous anesthésie -Mesure mensuelle de la taille et du poids sous anesthésie -Analyse locomotion et comportement; durée 3h avec acclimatation; isolement -Exercice de nage forcée pour détermination de la vitesse maximale; durée
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus concernent essentiellement le phénotype associé à la perte de fonction du gène muté chez les patients atteints du syndrome de Marfan, qui devrait reproduire le syndrome de Marfan humain, et associe des malformations cardiovasculaires, oculaires et musculo-squelettiques. D’après les quelques données de la littérature, le développement du phénotype chez le poisson zèbre ne s’observe qu’à l’état homozygote (c'est-à-dire quand les 2 exemplaires du gène sont mutés) ou sur des doubles mutants. Cependant, le SM étant une maladie dominante (c'est-à-dire que la mutation sur un seul exemplaire du gène suffit à déclencher la maladie) chez l’Homme, une attention sera portée sur les hétérozygotes (un seul exemplaire du gène muté). En lien avec ces atteintes, les individus peuvent présenter une perte de poids, ou émaciation, accompagnée de changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qui sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Pour les procédures expérimentales, le prélèvement caudal pour le génotypage est réalisé sous anesthésie et les animaux recouvrent leur capacité à nager normalement dès le réveil. L’analyse du comportement de nage nécessite l’isolement du poisson dans le bac où le film est réalisé, isolement qui est maintenu pendant une durée maximale de 3 heures. Pour la nage forcée, la durée de nage à la vitesse maximale est une source de stress, mais ne pourra excéder 3 minutes. L'ensemble des points limites est détaillé dans chaque procédure.
Devenir
A l'issue des différentes procédures les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus pour des analyses histologiques et de l'expression génique (taille des fibres musculaires, structure des tissus de soutien, analyse du squelette, inflammation).
Remplacement
Comprendre la physiopathologie du SM nécessite l’utilisation d’un organisme intégré dans lequel l’étude des différents systèmes (cardiovasculaire, musculosquelettique) altérés dans cette maladie soit possible de même qu’une évaluation comportementale transposable à l’Homme. A ce jour, ces informations ne peuvent être obtenues à partir de modèles non animaux (cultures cellulaires ou organoïdes). Le poisson -zèbre représente pour cela le modèle vertébré le plus simple à ce jour, avec de nombreux systèmes moléculaires et cellulaires conservés avec les mammifères, et présente l’avantage de pouvoir facilement réaliser de la mutagenèse in vivo et produire des lignées transgéniques d’intérêt.
Réduction
A notre connaissance, 3 équipes ont développé des modèles de SM (perte de fonction) mais qui ne sont pas rendus disponibles à ce jour. De plus, dans l’idée de réaliser des corrélations phénotype/génotype entre ces mutations perte de fonction et des mutations ponctuelles générées de façon originale par notre équipe, il est essentiel de comparer des animaux de même fond génétique afin de s’affranchir de l’effet de gènes influenceurs pouvant différer d’un fond génétique à un autre. Nous effectuerons cependant une veille régulière des différents dépositaires afin de stopper la production de modèles redondants avec ceux disponibles. Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observés au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 8 animaux par condition seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Pour le suivi longitudinal des cohortes, des sous-groupes de 4 animaux seront nécessaires pour documenter les différents phénotypes au cours du temps. Les différents tissus seront biobanqués (congélation et inclusion paraffine) afin d’optimiser l’utilisation des animaux. Si un phénotype est présent sur les lignées simple mutation, les autres lignées ne seront pas produites. De même, si un phénotype est présent dès le stade hétérozygote, les élevages seront réalisés de façon à ne pas produire d’homozygotes. Afin de réduire le nombre d’animaux, les expérimentations n’ayant pas d’impact les unes sur les autres seront réalisées sur les mêmes animaux.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres pourra induire une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supérieure à 20% du poids de référence de l'animal (poids maximal atteint) conduira à l'arrêt du protocole expérimental. Lors des expérimentations, des phases d’isolement ou des mises en reproduction, les bacs seront posés sur des photos représentant des fond aquatiques. Pour les suivis longitudinaux nécessitant une séparation des différents animaux d’une même ponte, les animaux d’intérêt seront maintenus avec des animaux d’un autre fond génétique afin de ne pas rester isolés. Pour les tests fonctionnels (tunnel de nage), une phase d’habituation au nouvel environnement sera systématiquement réalisée. Tous les poissons sont nourris deux fois par jour, avec notamment des artémies (crevettes fraiches) vivantes, cultivées sur place, qui représentent une source de nutriments frais et une forme d'enrichissement, puisque les poissons les chassent dans le bac.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est génétiquement modifiable, rendant aisé la génération de mutant d’un gène d’intérêt reproduisant une maladie génétique humaine comme le SM, et permet des études de grande envergure tout en étant plus rapides et beaucoup moins couteuses que celles menées chez le rongeur. Le poisson zèbre est aussi un modèle pertinent pour étudier les dysfonctions musculo- squelettiques et cardiovasculaires, et récapitule les processus physiopathologiques observés chez l'Homme. De plus, beaucoup d’événements biologiques sont analysables par des approches non invasives et quantitatives. Actuellement, un très grand nombre de lignées rapportrices ont été générées et sont facilement disponibles dans la communauté scientifique, permettant de répondre à de vraies questions biomédicales. Pour toutes ces raisons, le poisson zèbre est à l’heure actuelle un modèle très pertinent utilisé dans de nombreux laboratoires académiques pour modéliser un large spectre de pathologies avec la possibilité d'aller très en profondeur pour l'exploration mécanistique. Un suivi du développement des signes de la maladie sera réalisé depuis le stade larvaire jusqu’au stade adulte, le SM étant une maladie se développant dès l’embryogenèse mais évoluant tout au long de la vie. De plus, une finalité du projet étant d’identifier des leviers thérapeutiques potentiels, l’évaluation du potentiel curatif d’approches thérapeutiques sur des traits cliniques installés est nécessaire.
Caractérisation de gènes contribuant à l’action thérapeutique de cellules des défenses immunitaires, utilisées en immunothérapie chez l’Homme, dans des modèles murins de Myélome Multiple (cancer du sang
- Recherche appliquée
- Cancers
794 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par voie intraveineuse des cellules de myélome puis des lymphocytes T modifiés, avec jusqu'à douze séances d'imagerie et des prélèvements de sang, pour comprendre les rechutes d'une immunothérapie. Le porteur indique que le cancer peut provoquer une perte de mobilité puis une paralysie des pattes arrière et une perte de poids, l'euthanasie intervenant avant ces signes quand l'imagerie le permet. Il affirme que l'évaluation à long terme de ces cellules rend "indispensable" le recours à un "organisme vivant entier".
Objectifs
Le myélome multiple (MM) est caractérisé par le développement incontrôlé (prolifération) d'un type particulier de cellules sanguines de la famille des globules blancs appelées plasmocytes. Ces plasmocytes, cellules productrices d’anticorps, s’accumulent dans la moelle osseuse. Les traitements actuels du MM reposent sur la chimiothérapie et la greffe de moelle osseuse. Bien que ces traitements aient amélioré la survie des malades, certains patients répondent mal aux traitements conventionnels. Une nouvelle stratégie thérapeutique, ayant déjà fait ses preuves dans le traitement d'autres cancers du sang, vise à forcer les défenses immunitaires à reconnaitre et à détruire les cellules cancéreuses. Ainsi il est possible de modifier génétiquement une population de cellules du système immunitaire (les lymphocytes T) afin qu'ils reconnaissent spécifiquement les cellules tumorales et les éliminent. Le but ultime étant d'améliorer la prise en charge des patients résistants aux traitements classiques. Les plasmocytes tumoraux ont à leur surface des molécules qui vont être reconnues par les lymphocytes T modifiés entrainant l’élimination des cellules cancéreuses avec des taux de réponse de l’ordre de 80% chez des malades ayant reçu différentes stratégies de traitement. Cependant des rechutes surviennent encore et la survie reste au mieux de l’ordre de 2 ans. Dans notre projet, nous cherchons à mettre en évidence les mécanismes liés à ces rechutes et parmi eux le défaut de persistance des cellules thérapeutiques (lymphocyte T modifié) in vivo.
Bénéfices attendus
Cette étude va apporter des informations importantes pour la thérapie du MM où actuellement il n’y a pas de thérapie curative. En effet le défaut de persistance des cellules thérapeutiques est une des causes de rechute chez les patients atteint de cancer soigné avec l’immunothérapie, approche thérapeutique qui agit sur le système immunitaire d’un patient pour lutter contre sa maladie. La découverte de gènes influençant la persistance et l’efficacité des cellules thérapeutiques ciblant spécifiquement des molécules à la surface des cellules tumorales du MM pourraient ouvrir des portes pour le traitement d’autres cancers où l’immunothérapie est utilisée ou dans les études de nouvelle stratégie immuno-thérapeutique qui sont actuellement en phase de test préclinique ou clinique.
Procédures
Les modèles murins de MM consistent en l’injection par voie intraveineuse de cellules tumorales de MM humain ou murin à des souris éveillées (durée 1 min). Après 14 jours, notre stratégie thérapeutique sera injectée (par voie intraveineuse sur souris éveillées ; durée 1 min). Le développement de la tumeur et l'efficacité de nos cellules thérapeutiques seront suivis par imagerie in vivo sous anesthésie générale et ce une fois par semaine pendant toute la durée de l'étude (durée de la session : 10 min). Dans le cas où la prolifération des cellules cancéreuses serait rapide, nous Pourrions faire deux acquisitions d'imagerie par semaine. Sur toute la durée du protocole, chaque souris aura eu au maximum 12 séances d'imagerie. Nous réaliserons également des prélèvements de sang hebdomadaire (au niveau de la veine de la joue, sur souris éveillée; durée 30s; 5 prélèvements au maximum) afin de détecter les cellules tumorales circulantes. Ce type de suivi ne concernera qu'un petit nombre de souris pour lesquelles les cellules tumorales utilisées ne peuvent pas d'être détectées par imagerie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant être observés sont liés au développement du cancer du sang. Dans le modèle de MM humain, les cellules tumorales se multiplient dans la moelle osseuse. Ceci entraine fréquemment, quand le traitement n’est pas efficace, l’apparition d’une perte de mobilité qui dans la plupart des cas est suivi par une paralysie des pattes inférieures, s’accompagnant d’une perte de poids. Il est à noter que des tumeurs au niveau du crane sont également des évènements susceptibles d’être attendus sur ce modèle, néanmoins ces tumeurs apparaissent à long terme à environ 2 mois post injection des cellules tumorales. Dans le modèle de MM murin, les cellules tumorales s’accumulent au niveau de la rate, pouvant générer une douleur abdominale. Les souris pourront donc ressentir un stress lié à leur manipulation (anesthésie/imagerie répétée), des douleurs liées au développement de la maladie. Etant donné que les lignées utilisées n'ont pas de système immunitaire pour se défendre contre les microbes, un environnement non adapté (absence de barrière sanitaire) pourrait entraîner une mortalité précoce.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Nous analyserons à partir de la moelle osseuse et de la rate prélevées en post-mortem, les cellules thérapeutiques présentes afin d’identifier les gènes responsables de leur persistance sur le long terme.
Remplacement
Nous avons réalisé le maximum d'expériences in vitro afin de valider l'efficacité de nos cellules thérapeutiques. Cependant ces tests ne nous permettent pas d'évaluer à long terme ces cellules thérapeutiques. L’utilisation d’un organisme vivant entier est donc indispensable afin de reproduire les conditions observables chez l’Homme dans le cadre de leur utilisation en thérapie. De plus, il est nécessaire de vérifier ces résultats dans un modèle in vivo, car celui-ci intègre la plupart des caractéristiques de ces pathologies humaines telles que l’hétérogénéité des cellules tumorales, l’existence de tissus sains, la présence de barrières limitant l'efficacité des traitements
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris utilisés au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Plusieurs groupes de souris seront analysés simultanément permettant de n’avoir qu’un seul groupe d’animaux « contrôle ». L’utilisation de l’imagerie in vivo permet également de réduire le nombre d’animaux utilisé grâce à l’analyse d’une même souris sur toute la durée de l’expérience.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes procédures. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, un enrichissement sera mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux, en utilisant une grille d'évaluation prenant en compte l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. Ce suivi clinique sera réalisé une fois par semaine. De plus la mesure hebdomadaire voire bi-hebdomadaire par imagerie in vivo, nous permettra d'évaluer la propagation tumorale et euthanasier les animaux si celle si devient trop invasive et avant que les signes cliniques n’apparaissent (paralysie par exemple).
Choix des espèces
L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont le comportement est bien connu et proche de l’humain. Ainsi, l’évaluation du bien-être et de la douleur liée à l’expérimentation peut être effectuée aisément (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, isolement) permettant une prise en charge rapide et adapté. De plus, les modèles de MM humains et murins sont bien décrits dans la littérature scientifique. Les souris utilisées dans ce projet sont des animaux adultes de 2 à 3 mois au début de la procédure (injection des cellules tumorales) qui est l’âge de référence utilisé dans de nombreux modèle expérimentaux sur souris adultes.
Evaluation de l’efficacité thérapeutique d’une thérapie génique dans le modèle murin de la maladie de Pelizeus Merzbacher
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle de la maladie de Pelizaeus-Merzbacher, elles reçoivent une injection intraveineuse de thérapie génique sous anesthésie, une IRM d'environ deux heures et quatre tests comportementaux dont le contenu n'est pas précisé, tout en développant tremblements et paralysie progressive liés à la maladie. Le porteur mentionne un risque d'arrêt cardiaque et d'hémorragie lors de l'injection ainsi qu'une hypothermie sous IRM. Il affirme qu'aucun modèle in vitro n'existe pour cette maladie et que la souris "reste le modèle de choix".
Objectifs
La maladie de Pelizeus Merzbacher (PMD) est un défaut héréditaire de formation de la myéline (membrane isolante permettant le transport du message nerveux dans les neurones) du système nerveux central (SNC). Cette forme est causée par des mutations du gène de la protéine appelée proteolipide protein 1 (PLP1) indispensable à la bonne formation des gaines de myeline. La PMD se caractérise chez les patients de sexe masculin par une altération précoce du développement psychomoteur (inférieur à 6 mois de vie). Au cours des premières années de myélinisation active, le manque de force musculaire est associé à des signes neurologiques progressivement modifiés par la maturation du système nerveux. Il existe un modèle murin de la pathologie présentant une bonne similitude avec la maladie rencontrée chez l’Homme pour nous permettre de tester nos thérapies géniques. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement pour cette pathologie. Notre objectif est de tester différentes stratégies thérapeutiques basées sur une approche de thérapie génique au moyen d’une construction d’ADN appelée vecteur adeno-associé (AAV) conduisant à la surexpression d’un gène médicament (confidentiel). Nous avons d’ores et déjà démontré l’efficacité de notre gène médicament dans d’autres modèles de maladies neurologiques avec des atteintes similaires. L’objectif du projet étant d’établir la preuve de concept de l’approche thérapeutique afin ensuite de mener les étapes précliniques pour une application chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Des bénéfices pour les animaux ayant reçus la thérapie qui doit s’apprécier dans les tests comportementaux Le bénéfice du projet est d’etablir la preuve de concept de l’efficacité de nos approches de thérapie génique dans le modèle murin de Pelizeus Merzbacher pour pouvoir le transposer chez l’Homme afin de prendre en charge des patients aujourd’hui démunis et leur proposer un traitement.
Procédures
- Une injection intraveineuse sous anesthésie générale (durée 5 min au total) - Une Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 2h)) sous anesthésie générale Des tests comportementaux basés sur une appréciation de comportements spontanés (4 tests réalisés à 1 et 2 mois d’âges d'une durée de 2 à 20 min chacun). - phenotype dommageable des animaux avec un tremblement et une paralysie progressive
Impact sur les animaux
- Une injection intraveineuse avec un risque d’arrêt cardiaque et un risque d’hémorragie - Une Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 2h) avec un risque anesthésique et une hypothermie - Des tremblements et des signes de paralysie liés au modèle de la maladie - pas d'effets secondaires du traitement attendu - stress et angoisse et fatigue lié aux tests comportementaux
Devenir
En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires post-mortem
Remplacement
À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle In vitro ou de système cellulaire pour étudier les symptômes et marqueurs moléculaires associés à la maladie de Pelizeus Merzbacher (PMD). Nous avons donc besoin de modèles animaux pour reproduire et étudier cette maladie et surtout évaluer l’effet thérapeutique de nos approches de thérapie génique. Le modèle souris reste le modèle de choix car il reproduit les atteintes cliniques présentent chez les patients.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire. De ce fait un nombre de 20 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Un nombre total maximal de 300 souris sera nécessaire pour ce projet.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, la procédure a été mise en oeuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress. La procédure fait l’objet de raffinement : la lutte contre l’hypothermie lors des anesthésies, la surveillance des anesthésies notamment lors de l’IRM. Pour les souris étant en evaluation de survie, une surveillance quotidienne sera mise en place ainsi qu’un acces à la nourriture facilitée avec croquettes et nourriture gélifiée mise en place dans la cage mais aussi de l’eau gélifiée avec la mise en place de points limites. Les animaux seront hébergés en groupe dans des conditions protégées avec la couverture de tous leurs besoins physiologiques. La température, l'hygrométrie sont surveillées. un cycle nycthéméral est mis en place, l'alimentation et l'abreuvement sont à disposition sans restriction. Le changement des cages est assuré toutes les 1 à 2 semaines en fonction de la densité d'animaux (avec une litière faite de copeaux de bois) De l'enrichissement adapté aux besoins des rongeurs est disponible : coton et kraft pour fabriquer un nid, des maisonnettes pour être dissimulés, des bâtonnets à ronger voire des barrières visuelles pour complexifier la circulation dans la cage et permette là aussi la dissmulation, si besoin.
Choix des espèces
Nous avons besoin d’un modèle animal pour évaluer l’efficacité thérapeutique de notre stratégie de thérapie génique de la maladie de Pelizeus. Nous prévoyons de conduire notre étude sur un modèle murin déjà connu qui reproduit la pathologie développée chez les enfants Les souris seront utilisées juste après leur sevrage et analysées jusqu’à l’âge de 2 mois pour la majorité avant l’apparition des symptômes invalidants. Seul un groupe de souris permettant d’apprécier la survie sur le meilleur de nos traitements sera gardé au-delà de l’âge des 2 mois avec suivi attentif.
Impact du microbiote intestinal sur le métabolisme énergétique des cellules hôtes : rôle dans la santé et dans les maladies inflammatoires de l’intestin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
12 540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Elles subissent des gavages et des injections répétés et, pour certaines, une colite provoquant une inflammation intestinale douloureuse et des diarrhées, pour étudier l'effet du microbiote sur le métabolisme des cellules intestinales. Le porteur justifie ce nombre par la variabilité inter-animale et quinze ans d'usage de ces modèles, chaque animal étant euthanasié pour prélever plusieurs organes entiers. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne recrée la complexité d'un "organisme entier", ce qui rendrait le recours à l'animal "nécessaire".
Objectifs
Les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI), dont la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, sont des maladies caractérisées par une inflammation intestinale inappropriée. Leur incidence a augmenté de façon spectaculaire dans les pays occidentaux au cours des dernières décennies, ce qui démontre le rôle des facteurs environnementaux. Malgré le développement de nouveaux traitements, les MICI sont insuffisamment contrôlées chez une grande partie des patients, induisant une altération de la qualité de vie et un fardeau socio-économique. Il est donc urgent de mieux comprendre leur origine et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce contexte, le microbiote intestinal a été reconnu comme un acteur important au cours des MICI. Pour leur bon fonctionnement, nos cellules humaines ont besoin d’énergie et dépendent pour cela de plusieurs voies d’approvisionnement possibles que l’on appelle le « métabolisme énergétique ». Au cours des MICI, il a été observé une altération du métabolisme énergétique dans les cellules intestinales et immunitaires et cela pourrait jouer un rôle dans la maladie. Le métabolisme énergétique joue un rôle crucial dans la mise en place de la réponse immunitaire appropriée, et des données émergentes indiquent que le microbiote intestinal peut l'affecter directement. L'hypothèse principale est que l'altération du microbiote intestinal dans les MICI contribue à l'altération du métabolisme énergétique des cellules humaines intestinales et immunitaires, et au développement de la maladie. Le projet, en s’appuyant sur des expériences in vivo sur souris, a pour objectif (i) d'identifier les composant du microbiote ayant un impact sur le métabolisme énergétique des cellules et les mécanismes impliqués, (ii) de déchiffrer les conséquences des altérations du microbiote intestinal sur le métabolisme énergétique dans les maladies inflammatoires de l'intestin, et (iii) de concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur le microbiote pour manipuler l'état énergétique cellulaire. La compréhension du rôle du microbiote intestinal dans la physiologie est d'une importance cruciale, car il est impliqué dans de nombreuses maladies humaines, notamment les MICI, mais aussi, le cancer, le syndrome métabolique et les troubles neuropsychiatriques.
Bénéfices attendus
Ce projet représente un programme de recherche complet avec de multiples bénéfices susceptibles de découler de ces travaux : (i) la caractérisation de la modulation fine du métabolisme énergétique des cellules hôtes par le microbiote intestinal ; (ii) l'identification des principaux acteurs microbiens dans ces processus ; (iii) l’identification de nouvelles stratégies thérapeutiques potentielles dans les maladies inflammatoires de l'intestin et probablement dans plusieurs autres maladies humaines affectées par le microbiote intestinal (maladies inflammatoires rhumatologiques, maladies métaboliques, cancer…). Les résultats obtenus chez la souris seront confrontés à des données obtenues à partir d’échantillons humains, ce qui ouvrira la voie au développement de nouvelles interventions thérapeutiques. Ce projet va donc relever des défis importants en produisant des résultats d’avant- garde pour une meilleure compréhension du dialogue entre microbiote et cellules humaines. Ces résultats ouvriront la voie au développement de nouveaux traitements dans les maladies inflammatoires de l'intestin d'abord, puis pour de nombreuses autres maladies affectées par une altération du microbiote.
Procédures
Les différents gestes réalisés sur les souris en fonction des groupes concernés seront les suivants : * Gavage (2 secondes) une fois par jour durant un à 20 jours * une injection unique (2 secondes) +/- un gavage (2 secondes) une fois par jour durant 1 jour à 12 semaines
Impact sur les animaux
Le projet comprend différentes interventions (gavages, injections intrapéritonéales ou encore intraveineuse) pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste. Les modèles de colites sont associés à des effets indésirables attendus. Dans ces modèles la douleur imposée aux animaux est liée à l’inflammation intestinale. Il peut s’y associer une diarrhée.
Devenir
L’ensemble des animaux (n=12540) seront euthanasiés à la fin des expériences afin de pouvoir réaliser les différents prélèvements d’organes et réaliser les analyses nécessaires au projet de recherche. Sur chaque animal, plusieurs organes sont prélevés en entier pour analyse ce qui impose une euthanasie.
Remplacement
Malgré le développement et l’utilisation de modèles non animaux tels que les organoïdes ou les systèmes d’intestin artificiel, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans les interactions complexes entre le microbiote intestinal et son hôte en situation basales et inflammatoires. A l’heure actuelle il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et microbiens rentrant en jeu.
Réduction
Nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Du fait des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les nombre d’animaux utilisés par groupe est basé sur notre expérience de plus de 15 ans d’utilisation des modèles en question. Pour prendre en compte la variabilité biologique et assurer la robustesse des résultats obtenus, nous avons besoin de réaliser les expériences décrites dans des groupes expérimentaux de 10 souris et ce dans au minimum 2 expériences indépendantes (10 x2 = 20 souris en tout par condition, qui seront poolées dans les analyses statistiques si besoin). Le recours à une troisième expérience indépendante ne sera réalisé qu’en cas d’interprétation impossible des résultats après la 2eme expérience. Ce projet impliquera donc un maximum de 12540 animaux. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. D’une façon générale, les modèles seront testés avec un seuil de validité de 5%. Nous utiliserons des tests statistiques non paramétriques (test de Kruskall-Wallis suivi par Mann-whitney) car les conditions de normalités ne sont fréquemment pas remplies.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Le personnel impliqué dans le projet est formé en continu pour garantir leur compétence et une veille scientifique et technique en continue. Il y aura une vérification quotidienne des animaux et une observation individuelle hebdomadaire à l’occasion des interventions d’entretien (litière/abreuvement/nourriture). Les animaux seront hébergés dans des cages standards (4 à 5 souris par cage). Du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et du sizzlenest seront ajoutés dans les cages comme enrichissement de milieu. Les souris recevront ad libitum un aliment standard stérilisé par irradiation à 25 kGy et de l’eau autoclavée.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence en immunologie, microbiologie et métabolisme, qui sont les thématiques de notre projet. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies intestinales humaines. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, entre 6 et 14 semaines.
Identification et manipulation des réseaux neuronaux contrôlant les comportements dirigés vers un objectif et habituels chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 824 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie cérébrale puis un enregistrement de l'activité neuronale, de l'imagerie calcique et de l'optogénétique pendant une tâche comportementale opposant actions dirigées et habituelles, avant prélèvement du cerveau. Le porteur cite la chirurgie, l'euthanasie et l'isolement en cage individuelle comme sources de souffrance, sans détailler le contenu des tests comportementaux. La rubrique réduction avance 912 souris et 16 par groupe, chiffre inférieur au total de 1 824 déclaré, et présente ces travaux comme une étape "indispensable" contre la toxicomanie et les troubles compulsifs.
Objectifs
L’objectif principal du projet est double. Premièrement, développer et valider une tache comportementale pendant laquelle des souris libres de leurs mouvements performent des actions dirigées et habituelles. Deuxièmement, identifier et manipuler les réseaux neuronaux contrôlants les deux types d’actions. Ces objectifs seront atteints en combinant des approches comportementales, électrophysiologiques, d’imagerie calcique et d’optogénétiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont doubles. Premièrement, la compréhension des mécanismes neuronaux contrôlants les actions dirigées et habituelles, et leur interaction chez le même sujet est une étape indispensable pour dans le développent de nouvelles stratégies thérapeutiques des troubles psychiatriques comme la toxicomanie et les comportements obsessionnels compulsifs. Deuxièmement, nous pensons que notre approche nous permettra d’améliorer le phénotypage des actions dirigées et habituelles chez la souris. Les procédures de psychologie expérimentale actuellement utilisées allongent le temps d’expérience et le stress des animaux.
Procédures
Opérations chirurgicales : les animaux sont soumis à une procédure chirurgicale d'une durée maximale de 1h15.
Impact sur les animaux
Les sources éventuelles de douleurs ou souffrance dans notre procédure : la chirurgie, l’euthanasie ainsi que l'isolement des animaux en cage individuelle.
Devenir
Euthanasie de l'ensemble des animaux à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever le cerveau.
Remplacement
Le rat reste encore le modèle animal de prédilection pour étudier les fondements comportementaux et neuronaux du comportement instrumental. Cependant, les souris peuvent remplacer les rats. Les souris peuvent apprendre un comportement instrumental et faire une distinction claire entre les actions dirigées et habituelles. Nous étudierons les circuits neuronaux des souris pendant qu’elles exécutent une tâche comportementale. Pour comprendre les mécanismes des circuits neuronaux contrôlant les actions instrumentales, nous devons utiliser des méthodes permettant de mesurer et de manipuler l'activité de neurones spécifiques avec des résolutions spatiales et temporelles élevées sur un cerveau intact et vivant. Il est impossible d’étudier des réseaux neuronaux avec des méthodes in vitro ou in silico. Il n'existe donc pas de méthodes alternatives.
Réduction
En calculant l’estimation de la variance observée avec ce type de données pour atteindre une signification statistique, nous avons besoin de 16 souris par groupes expérimentaux. La mise en œuvre de cette tache comportementale nous permettra l’étude de ces deux types d’action chez le même sujet, ce qui n’est pas le cas des taches comportementales classiques dans lesquelles actions dirigées et habituelles sont étudiées séparément avec des groupes expérimentaux distincts. Pour la réalisation de toutes les expériences de ce protocole nous utiliserons 912 souris.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la souffrance des animaux, nous appliquons systématiquement un traitement antalgique avant et trois jours suivant les actes chirurgicaux qui sont réalisées sous anesthésie gazeuse. L’évaluation du poids de l’animal est effectuée de façon journalière à partir du moment où il est isolé en cage individuelle et rentre dans la phase expérimentale. Ces mesures ont lieu lors de la manipulation journalière des animaux en même temps que la vérification de l’état général de l’animal. Ces mesures sont consignées dans un cahier d’expérience prévu à cet effet. Pour identifier les dommages et contraintes subis par l’animal, nous avons définis des points limites au nombre de 5. Ces cinq aspects évalués au cours de nos expériences nous aident à déterminer un point final à l’expérimentation. Chaque critère est évalué de 0 à 3 et si un critère obtient le score maximal, ceci induit un arrêt immédiat de l’expérience. Sur la base des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et les zootechniciens seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez les souris.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour les études comportementales. Son utilisation est généralisée dans le domaine des neurosciences et en particulier pour l’étude des circuits neuronaux impliqués dans les comportements instrumentaux. Les animaux seront utilisés entre 2 et 6 mois post natal afin de permettre une comparaison avec des résultats précédemment publiés.
Etude d’un anticorps comme cible thérapeutique dans le traitement du mélanome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome humain, des gavages quotidiens pendant trois semaines et des injections d'anticorps, pour tester une cible thérapeutique contre le mélanome métastatique. Le porteur indique que la tumeur peut gêner les déplacements et que les métastases pulmonaires peuvent provoquer perte de poids et troubles respiratoires, la mise à mort intervenant à 2 cm³ de tumeur. Il vise une collaboration avec l'industrie pharmaceutique et affirme que les méthodes in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes de la tumorigenèse.
Objectifs
Le mélanome cutané est un cancer de la peau agressif et malgré le développement de thérapies ciblées et d'immunothérapies, les patients diagnostiqués au stade métastatique ont toujours un mauvais pronostic. Il est donc urgent de trouver de nouvelles cibles pour les tests de diagnostic précoce et pour les traitements de la maladie métastatique. Ce projet vise à démontrer que cibler une protéine exprimée de façon non conventionnelle par les cellules tumorales peut altérer la formation de mélanome et la progression des métastases, en association avec les traitements déjà existants. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique pour démarrer des essais cliniques.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre la validation préclinique d'une nouvelle approche thérapeutique pour le mélanome cutané. Si les résultats obtenus confirment ceux des précédentes expériences in vitro, des essais de xénogreffes de tumeurs provenant de patients humains dans un modèle murin, pourront être envisagées. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique afin d’étudier l’effet de notre approche d’immunothérapie lors d'essais précliniques, dans l'objectif final d'identifier de nouveaux traitements pour le mélanome cutané.
Procédures
Toutes les souris seront injectées une fois avec des cellules tumorales humaines (200 microlitres). Les injections se font sous anesthésie gazeuse et durent une dizaine de secondes. Les injections d'anticorps (2 fois par semaine, 100 microlitres) ou de produit luminescent (une fois par semaine, 100 microlitres) sont faites sur animal vigile et durent quelques secondes. Le gavage oral sera quotidien à raison de 100 microlitres, est réalisé sur animaux vigiles et dure une dizaine de secondes. Les traitements durent au maximum trois semaines.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont l'introduction d'une canule de gavage pour l'administration des molécules per os. Une douleur peut apparaitre à cause de la répétition des gavages (1 fois par jour pendant 3 semaines maximum). L’introduction d’une aiguille pour les différentes injections entraine une légère douleur au point d’injection mais qui est brève. L'injection de cellules tumorales va provoquer la croissance d'une tumeur primaire à l'endroit de l'injection et/ou la formation de métastases distantes, notamment dans les poumons. La tumeur primaire pourra générer un inconfort physique lors des déplacements des souris. Les métastases ne seront pas visibles mais pourront entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés notamment problèmes respiratoires liés aux métastases sur les poumons.
Devenir
Il est prévu de mettre à mort tous les animaux pendant ou à la fin du projet : l'injection de cellules tumorales devant conduire à la formation de tumeurs voire de métastases chez les souris, les animaux seront mis à mort pendant le projet si la taille de(s) tumeur(s) atteint les points limites, en cas de signes de souffrance ou à la fin du projet. Les tumeurs et métastases seront prélevées à des fins d'histologie pour étudier les marqueurs de cancer et la composition des tumeurs ainsi que pour d'autres analyses : séquençage d'ARNs, quantification protéique afin d'évaluer le résultat des différents traitements.
Remplacement
Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’effet du traitement par un anticorps spécifique sur la croissance tumorale in vivo. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis.
Réduction
Le nombre total de souris expérimentales sera de 200 réparti comme suit : 4 cohortes de 20 animaux injectés avec 4 lignées de cellules tumorales puis traités ou non avec l'anticorps et 3 cohortes de 40 animaux injectés avec 3 lignées cellulaires différentes, puis traités ou non avec l'anticorps en présence ou en absence d'une thérapie ciblée complémentaire. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides). Les paramètres étudiés seront la taille de la tumeur (mesurée avec un pied à coulisse) ainsi que sa vitesse de croissance et le développement des métastases pulmonaires. Les mélanomes humains sont des tumeurs hétérogènes dont les cellules ont un potentiel d’invasion plus ou moins important. Leur étude n'a pas permis d'isoler une lignée cellulaire modèle unique : il est donc nécessaire de tester plusieurs lignées cellulaires par différentes voies d'injection.
Raffinement
Des souris femelles seront utilisées : moins agressives que les mâles, elles seront hébergées en cohorte pour conserver l’interaction sociale. Les expérimentateurs établiront le contact avec les souris 8 jours avant le début de l’expérimentation les habituer à la manipulation et réduire leur angoisse. Les cages seront enrichies. Nous surveillerons quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. Nous mesurerons la taille de la tumeur primaire trois fois par semaine pour suivre la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 2 cm3 par souris. Nous adapterons la période de mesure pour chacune des lignées cellulaires utilisées en fonction de la vitesse de croissance tumorale. La migration des cellules métastatiques sera suivie par l'utilisation du système d’imagerie in vivo (IVIS) une fois par semaine.
Choix des espèces
In vitro, nous avons validé nos techniques expérimentales et obtenu des premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques environnementales de la tumorigenèse in vivo et ne peuvent donc fournir le niveau d'information requis. La souris est un modèle reconnu dans la communauté scientifique pour la greffe de lignées cancéreuses humaines afin de tester des traitements potentiellement transférables en médecine humaine. Pour éviter le rejet des cellules humaines de mélanomes après injection, nous utiliserons des souris immunodéprimées NOD/SCID/IL2GammaR. Ces souris présentent un système immunitaire déficient et nécessitent des conditions d'élevage stériles. Nous utiliserons des souris ayant atteint le stade adulte (6 semaines) qui seront injectées avec les cellules tumorales par voie sous-cutanée dans le flanc ou intraveineuse rétro-orbitale. La croissance tumorale ne devrait pas être impactée par l'âge des souris. Il est cependant préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes n'entravent pas leur capacité de mouvement.
Rôle des lymphocytes T résidents dans la réponse anti-cancéreuse pulmonaire dans des souris post-septique
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une infection pulmonaire par voie intra-trachéale puis, pour certaines, une greffe de cellules cancéreuses et des injections répétées, pour étudier le rôle de lymphocytes dans la défense anti-cancéreuse du poumon après une infection. Le porteur indique une perte de poids transitoire et modérée après l'infection et présente le modèle de métastases comme sans souffrance jusqu'au jour de l'euthanasie. Il affirme que la complexité de la réponse immunitaire rend le recours aux modèles animaux "indispensable" et évoque une valorisation par brevet.
Objectifs
Notre laboratoire a montré que suite une infection bactérienne pulmonaire, une cicatrice immunitaire se mettait en place, avec l’apparition de plusieurs populations de lymphocytes. Nous avons montré que ces lymphocytes jouaient un rôle majeur dans la défense anti-cancéreuse pulmonaire. Les objectifs du projet sont de caractériser le rôle de ces populations de lymphocytes 1) au cours de la défense anti-cancéreuse ; 2) lors d’une 2ème infection bactérienne.
Bénéfices attendus
Notre projet nous permettra d’améliorer nos connaissances de l’immunité anti-cancéreuse dans le poumon. Ce projet nous aidera à comprendre les modifications induites par la cicatrice immunitaire pulmonaire créée lors de la 1ère infection sur les fonctions des lymphocytes et les conséquences de ces modifications au cours d’une 2ème infection ou dans un modèle de cancer pulmonaire. Ceci nous permettra en finalité la valorisation (brevet) et la mise en place de traitements adaptés pour lutter contre le cancer et les infections bactériennes.
Procédures
Tous les animaux de ce projet sont soumis à une administration intra-trachéale sous anesthésie générale Un quart des animaux sont soumis à une administration unique par voie rétro-orbitale sous anesthésie générale. La moitié des animaux sont soumis à plusieurs injections intrapéritonéales en condition vigile. La moitié des animaux sont soumis à une injection intra-veineuse par voie caudale sur souris vigile. Tous les gestes sont de courte durée (au maximum 1 minute) et pour les souris anesthésiées, le réveil est quasiment instantané. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanées d’analgésiques pourraient être réalisées.
Impact sur les animaux
Modèles d’infection bactérienne : Les modèles d’inflammation respiratoires aiguës sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3jours) et modérée (< 10%) est observée, sans perte de motricité. Après J2, les souris reprennent une courbe de poids normale. Les modèles cancéreux de métastases pulmonaires sont sans souffrance jusqu’à J21, temps d’euthanasie pour analyse. La déplétion des cellules gamma delta par administration intra-péritonéale de toxine diphtérique n’induit pas d’effets indésirables connus chez la souris (Sandrock et al. JEM. 2018).
Devenir
Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.
Remplacement
Les paramètres étudiés dans ce travail ne peuvent être aujourd’hui remplacés par des procédures in vitro et le recours à l’utilisation de modèles animaux est indispensable. Les multiples interactions entre types cellulaires différents et la complexité de la mise en place de l’immunité entraînée nous oblige à utiliser les modèles animaux pour appréhender ces phénomènes dans leur globalité.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=5) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Le test statistique utilisé sera une Anova suivie d’un test post-hoc. Une valeur de p
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux dans des cages enrichies en frisottis, de taille suffisante et dont la litière est changée une fois par semaine. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place (annexe 2). Les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite de lidocaïne (1mg/kg) afin d’anesthésier localement la trachée.
Choix des espèces
Les modèles murins d’infections bactériennes ainsi que les modèles tumoraux sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche. 7-14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature