Procédures modérées

130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales de tamoxifène pour inactiver un gène, puis des prélèvements réguliers de touffes de poils et de fèces pendant six mois, pour étudier le rôle des hormones somatotropes dans le maintien des tissus au cours du vieillissement. Le porteur qualifie ces gestes de peu invasifs et compare la douleur du prélèvement de poils à celle d'interactions entre souris. Il affirme que la souris est la seule espèce vertébrée permettant cette approche transgénique et qu'un "organisme entier" est "indispensable".

Objectifs

Vieillir en bonne santé est un objectif majeur de notre société. La découverte de traitements anti-âge efficaces ou de comportements nutritionnels mieux adaptés pourrait avoir un impact spectaculaire sur la santé publique, en réduisant les problèmes de santé liés à l'âge tels que la démence, les accidents vasculaires cérébraux et les maladies cardiaques. Cette découverte devrait permettre de maintenir une qualité de vie acceptable au sein d’une population de plus en plus vieillissante. Plusieurs caractéristiques d’un vieillissement en bonne santé ont été identifiées à ce jour. Notamment, au cours du temps, il est connu que les tissus constituant les organes s’altèrent et ont donc besoin d’être renouvelés voire remplacés. Ce maintien tissulaire dépend fortement de l’alimentation, qui peut être considérée comme le premier stress environnemental d’un organisme à travers l’action des nutriments sur les tissus. D’ailleurs, une restriction calorique montre en effet une meilleure longévité dans des modèles animaux. L’expression des hormones somatotropes qui participent à la détection des nutriments est diminuée lors de cette restriction alimentaire. Ces hormones somatotropes et leurs récepteurs cellulaires ont été clairement identifiées comme étant des facteurs qui influencent la durée de vie des mammifères. Elles ont de plus des rôles critiques dans le développement, la croissance et le métabolisme des organismes. Le blocage de cette régulation hormonale somatotrope conduit à une augmentation de longévité. Selon notre hypothèse, cet accroissement de longévité devrait s’appuyer sur un meilleur maintien des tissus au cours du vieillissement. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de ces hormones somatotropes dans le maintien et le renouvellement tissulaire au niveau de différents organes. Le rôle de ces récepteurs hormonaux dans le maintien tissulaire sera exploré dans des modèles où cette signalisation somatotrope est altérée. Notamment, nous ferons varier les taux de blocage du récepteur impliqué et nous suivrons le devenir des cellules inactivées au sein des tissus au cours du vieillissement par des mesures longitudinales des taux d’inactivation sur des souris transgéniques mutantes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre comment l’axe somatotrope influence le devenir des cellules souches responsables du bon maintien des tissus au cours du vieillissement. Cette étude ne peut être effectuée qu’in vivo sur des modèles animaux de mammifères proches de l’homme où les tissus/organes sont dans un contexte permettant à différents types de cellules d’interagir entre eux au cours du temps. L’aspect intégré du modèle est essentiel pour comprendre dans son ensemble les mécanismes gérant l’activité des cellules souches dans les processus de régénération et de maintien à l’équilibre des tissus constitutifs d’organes. L’évaluation du rôle du récepteur hormonal dans l’homéostasie tissulaire proposée ici sera bénéfique en santé humaine, car elle permettra de proposer des pistes dans la prévention d’une meilleure santé humaine dans notre population vieillissante.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques afin de répondre aux objectifs scientifiques. Les interventions sont majoritairement peu invasives. Les souris seront injectées en intrapéritonéale avec contention sur animal vigile par trois doses différentes de tamoxifène afin d’induire l’inactivation du gène cible (environ 30 secondes par animal). Les poils et les fèces seront prélevés sur l’ensemble des animaux vigiles sur une période de 6 mois à raison d’un prélèvement par quinzaine, soit au total 14 prélèvements de touffes de poils et de crottes par souris (nombre maximum). Ces prélèvements ne durent pas plus de quelques minutes par animal (environ 2 minutes). A la fin de la période de maintien, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales de tamoxifène nécessaire pour induire le modèle implique une contention qui entraine un léger stress et une douleur de courte durée liée à l’injection. La récolte de fèces nécessite un isolement de quelques minutes qui peut également être source d'un léger stress mais n’a aucun impact sur le comportement global de l’animal. Le prélèvement de poils sera effectué par prise de petites touffes avec une pince plate et sera espacé d’au moins deux semaines. Ce type de prélèvement induit une légère douleur similaire à celle des interactions sociales entre deux souris.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à l’issus des actes mis en œuvre par une méthode réglementaire effectuée selon les bonnes pratiques. L’euthanasie des animaux est requise pour limiter la souffrance animale et pour l’étude histologique ou biochimique des tissus. La récupération des tissus post-mortem permettra une analyse des taux d’inactivation du gène cible par amplification quantitative de l’ADN.

Remplacement

Dans la mise en œuvre de ce projet, utiliser l’animal vivant est indispensable pour étudier les acteurs mis en jeu dans le maintien des tissus d’un organisme au cours du vieillissement. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu, notamment pour caractériser les compétitions/interactions existant entre des cellules inactivées pour le récepteur hormonal au sein des tissus d’un organisme multicellulaire. De plus la stimulation de croissance suite à l’inhibition de la voie de signalisation ne peut être obtenue que dans des modèles in vivo où les régulations hormonales peuvent se mettre en place. Notre objectif étant d’évaluer la possibilité de remplacement cellulaire au sein d’un tissu complexe, il ne peut être atteint que dans notre modèle de souris transgénique.

Réduction

Le projet impliquera un total de 130 animaux. Nous limitons systématiquement le nombre d’animaux au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Chaque souris est utilisée pour un maximum de protocoles expérimentaux, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. La procédure expérimentale a été affinée pour éviter l'utilisation inutile de souris comme un ajustement des doses de tamoxifène à injecter. Le suivi longitudinal du taux d’inactivation du récepteur qui sera effectué par prélèvement de petites touffes de poils et de fèces au cours de la vie de la souris, permet de réduire substantiellement le nombre de souris nécessaire pour l’étude proposée. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée tout en tenant compte des impératifs de réduction. Les taux d’inactivation seront comparés au sein de chaque groupe par un test statistique adapté.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la règlementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi en continu à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés quand cela est possible/nécessaire. Les prises de touffes de poils prélevés seront réduites au minimum nécessaire pour les analyses par amplification quantitative de l’ADN et les volumes injectés de tamoxifène seront adaptés au poids de chaque animal afin de ne pas induire de stress supplémentaire.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce vertébrée qui permet une approche par transgénèse avec élaboration de modèles génétiques complexes. Dans le cadre d’une étude intégrée au sein d’un organisme du devenir du maintien des tissus, elle représente un modèle de choix. De plus, l’utilisation de souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifiées dans lesquelles les gènes de l’axe somatotrope peuvent être invalidés. La souris représente un modèle de choix pour l’analyse exploratoire de ces gènes impliqués dans l’homéostasie tissulaire au cours du vieillissement. Les premières études menées sur ces modèles transgéniques ont permis d’aborder des questions fondamentales au niveau du maintien de la fonctionnalité des organes qui n’auraient pas pu être obtenues à partir de lignées cellulaires. Les expériences seront réalisées sur des animaux adultes âgés de 3 mois ou d’un an, et seront suivies pendant six mois. Les deux âges choisis sont les plus adaptés à l’étude du maintien tissulaire au cours du vieillissement et sont assez éloignés des stades du développement où la croissance de l’animal peut perturber le remplacement tissulaire.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous-cutanée, des gavages répétés d'antibiotiques puis de solution fécale, des mises à jeun et des prélèvements de sang et de fèces, pour étudier le rôle du microbiote et des cellules MAIT dans une stéatose du foie induite. Le porteur indique des effets possibles de perte de poids, de selles liquides, de déshydratation et de prostration, avec euthanasie si l'état ne s'améliore pas. Il affirme que ces interactions complexes seraient "impossibles à reproduire" in vitro, ce qui rendrait le recours aux animaux "indispensable".

Objectifs

Les maladies métaboliques sont des affections qui touchent des sujets génétiquement prédisposés, chez lesquels le dialogue entre le microbiote intestinal et le système immunitaire est altéré. Bien que leur incidence soit en croissance et que leur impact socio-économique soit majeur, ces maladies ne connaissent pas de traitement curatif. Les malades présentent une dysbiose du microbiote intestinal, une altération de la barrière intestinale et une inflammation des tissus incluant le foie et les tissus adipeux. En plus des macrophages connus pour leur rôle dans l’inflammation, il a été récemment démontré que les cellules MAIT (mucosal-associated invariant T cells) jouent un rôle clé dans l’initiation et l’entretien de l’inflammation. Il est à noter que les cellules MAIT sont une sous-population de lymphocytes T particulièrement abondantes dans le sang, le foie, l'intestin et le tissu adipeux. Les MAIT reconnaissent des métabolites bactériens et sont aussi dotées de propriétés antibactériennes.

Bénéfices attendus

La compréhension du dialogue entre les cellules MAIT et le microbiote et le rôle des MAIT dans l’inflammation durant les maladies métaboliques et la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD pour "Non Alcoholic Fatty Liver Disease") pourrait permettre d’envisager à l’avenir de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur l’inhibition de ces cellules.

Procédures

Les souris seront soumises aux interventions suivante : - Implantation sous cutanée unique de puces pour l’identification individuelle - Gavages : 4 gavages seront réalisés. • Gavage quotidien avec un mélange d’antibiotiques pendant 1 semaine • 2 gavages avec un produit marqué à 10 semaines d’intervalle • Gavage deux fois par semaine de solution fécale pendant 2 semaines - 2 mises à jeun pendant 4 heures à 10 semaines d’intervalle - Prélèvement de sang : 2 prélèvements seront réalisés sur souris vigiles à 10 semaines d’intervalle. Un prélèvement unique de sang sera réalisé sur animal anesthésié. - 15 prélèvements de fèces provenant d’une défécation spontanée seront réalisés au minimum 1 fois par semaine - 84 pesées seront réalisées à une fréquence d’une pesée par jour.

Impact sur les animaux

Une observation quotidienne des animaux et après chaque geste expérimental sera effectuée incluant une vérification de l’état général de l’animal observé. Pour cette procédure, les nuisances prévisibles sont : une perte de poids, des selles liquides accompagnées d’un pli cutané persistant (synonyme d’une déshydratation importante), et/ou un état de prostration (souris immobile, dos voûté, peu réactive aux sollicitations des congénères ou du manipulateur, yeux fermés, absence de toilettage).

Devenir

L’étude portant sur une maladie hépatique, le prélèvement post-mortem du foie est nécessaire.

Remplacement

Les mécanismes impliqués dans le développement de la NAFLD mettent en jeu des interactions complexes au sein de l’hôte, qui sont impossibles à reproduire dans un modèle cellulaire ou de culture d’organe. Ainsi, utiliser uniquement une approche in vitro pour ce projet exclurait les différentes interactions pouvant survenir chez l’hôte. De ce fait, le recours aux animaux est indispensable.

Réduction

Le nombre minimum d’animaux nécessaire a été déterminé en se basant sur les données acquises lors des expériences préliminaires, des études précédentes publiées dans la littérature, mais aussi grâce à un test de puissance permettant de calculer le nombre minimum d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Pour ce projet, nous utiliserons 4 groupes de souris conventionnelles (n = 20). Le nombre total d'animaux nécessaires est alors 20*4 = 80 souris.

Raffinement

Les souris seront hébergées par lot de 4 dans des cages collectives. L’eau et la nourriture seront disponibles à volonté et les paramètres ambiants seront contrôlés régulièrement (température, humidité…). Un enrichissement de leur milieu sera mis en place afin de favoriser le bien-être des animaux et se matérialisera par du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter, des tunnels en carton pour se cacher et des tiges métalliques pour grimper. La durée de l’expérience sera limitée à 12 semaines, temps nécessaire et suffisant pour la mise en place de la maladie, sans altérer l’état général de l’animal. Au cours de l’étude, les animaux seront examinés individuellement de façon quotidienne (à l’occasion de l’examen clinique et de la pesée) ce qui permettra de réagir le plus rapidement possible en cas d’anomalie.Dans le cas où un ou plusieurs points limites sont identifiés, la cause de ces signes sera recherchée afin d'apporter la solution appropriée. L'animal présentant ces points d'alerte fera l'objet d'une surveillance particulière afin d'être soigné et limiter sa douleur. Si ces signes, pour des raisons inconnues, persistent et l'état de santé de l'animal ne s'améliore pas, une décision de'euthanasie sera prise par le personnel compétant afin de mettre fin à la souffrance de l'animal.

Choix des espèces

Les souris sont couramment utilisées pour étudier les maladies métaboliques et l’effet du microbiote intestinal sur ces dernières. Ce modèle est facile à gérer (petite taille, très facile à manipuler et la maladie est facile à mettre en place) et reproduit plusieurs caractéristiques physiopathologiques de la stéatose hépatique développée par l'être humain. Ainsi, ce modèle sera utilisé pour étudier l’interaction entre les cellules MAIT et le microbiote intestinal dans le contexte de NAFLD. Au commencement de l'expérience, les souris seront de jeunes adultes (6-8 semaines) ce qui correspond à un âge où le métabolisme ainsi que le système immunitaire de cette espèce sont matures. Ceci limite leur fragilité et permet alors d’obtenir un modèle animal qui reflète au mieux la physiologie de l’humain adulte, âge de plus grande fréquence d'apparition des maladies métaboliques et de la stéatose hépatique.

11 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont immunodéprimées puis infectées par instillation pulmonaire de Mycobacterium abscessus, et reçoivent des composés par voie orale ou injectable une à deux fois par jour pendant cinq semaines, pour tester de nouveaux antibiotiques. Le porteur indique que l'infection peut provoquer une respiration difficile, un écoulement des yeux et du museau et de l'apathie, avec mise à mort anticipée si les points limites sont atteints. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la dynamique de l'infection, ce qui rendrait "nécessaire" le recours à l'animal entier.

Objectifs

Les mycobactéries non tuberculeuses ou mycobactéries atypiques sont des bactéries opportunistes dont le réservoir réside dans l’environnement (sol et eaux). Ce sont des bactéries non pathogènes intrinsèquement pour l’homme, elles sont dites opportunistes car elles vont devenir infectieuses sur un terrain affaibli. Elles vont être responsables d’infections pulmonaires chez des sujets fragilisés, atteints de mucoviscidose, de bronchopneumopathie chronique obstructive ou immunodéprimés. Ces sujets vont alors développer une infection pulmonaire progressive entrainant une insuffisance respiratoire sévère voire la mort si elle n'est pas traitée. Avec une moindre incidence, ces bactéries peuvent être responsables d’infections cutanées, toujours sur des sujets affaiblis. Ces maladies pulmonaires dues aux mycobactéries non tuberculeuses sont en augmentation dans le monde et dans plusieurs pays, dont les États-Unis et le Canada, le taux d'incidence de ces maladies est supérieur à celui de la tuberculose. Les approches thérapeutiques sont limitées et les infections sont difficiles à traiter en raison de la résistance aux antibiotiques conférée par une paroi cellulaire imperméable, des pompes à efflux ou des enzymes de résistance. Parmi les mycobactéries non tuberculeuses, le groupe Mycobacterium abscessus complex est l’un des plus cliniquement pertinents. La prévalence de groupe a augmenté au cours des deux dernières décennies. Afin d’éviter l’émergence de mutants résistants, les traitements sont des cocktails d’antibiotiques sur de longues périodes, plusieurs mois voire plusieurs années. Le développement de nouvelles thérapeutiques s'impose donc de toute urgence. L’objectif de notre projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés dans des modèles d’infection pulmonaire chez la souris induite par des bactéries appartenant au groupe Mycobacterium abscessus complex. Ces composés auront par ailleurs montré leur efficacité in vitro sur ces mêmes bactéries.

Bénéfices attendus

Après avoir montré leur efficacité in vitro sur un panel de Mycobacterium abscessus complex, et démontré de bonnes caractéristiques pharmacocinétiques, les molécules d’intérêt seront testées in vivo dans un ou des modèles d’infection pulmonaire chez la souris. Comme chez l’homme, les mycobactéries non tuberculeuses ne sont pas intrinsèquement pathogènes chez la souris saine. Afin d’obtenir un niveau d’infection permettant d’observer une efficacité, nous devons diminuer voir supprimer leurs défenses immunitaires. Nous utiliserons 2 types de modèles : Un premier, court (maximum 2 semaines) utilisant des souris immunodéprimées, nous permettra de savoir rapidement si le composé testé est efficace pour diminuer significativement la charge bactérienne pulmonaire. Un second, plus long (4 à 5 semaines) utilisant des souris immunocompétentes à l’immunité affaiblie nous permettra de savoir si malgré la présence d’une réaction immunitaire même diminuée le composé reste efficace. Pour chaque modèle, une première procédure, nous permettra d’établir les conditions optimales d’infection. Les nouvelles molécules seront tout d’abord évaluées sur le modèle utilisant des souris immunodéprimées, puis les meilleures d’entre-elles seront évaluées sur le modèle utilisant des souris immunocompétentes.

Procédures

1/ Administration des composés à tester ou de leur solvant, par voie orale ou sous-cutanée ou intra-veineuse ou intra-péritonéale, une à deux fois par jour pendant un maximum de 5 semaines. 2/ Injection en intra-péritoneale, d’un immuno-suppresseur, 2 fois pendant l’étude. 3/ Injection sous-cutanée d’un anti-inflammatoire, une fois par jour pendant un maximum de 6 semaines. 4/ Instillation en intranasale ou en orotrachéale d’une souche infectieuse 5/ Prélèvement sanguin après anesthésie gazeuse, une fois pendant l’étude

Impact sur les animaux

Les nuisances principales et effets indésirables sont ceux d’une infection pulmonaire : Respiration difficile et/ou bruyante, yeux et museau qui coulent, apathie. Les animaux recevront également les différents traitements par gavage oral ou par injection en sous cutané, en intrapéritonéal ou en intraveineux, traitements susceptibles de créer de l’inconfort voir de la toxicité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédures expérimentales, des analyses sur les organes étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.

Remplacement

A ce jour, aucun modèle cellulaire ne récapitule complètement, ni sur une durée de quelques semaines, la dynamique bactérienne dans un organisme, la complexité cellulaire impliquée et la cinétique d’absorption et d’élimination d’une molécule. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour évaluer l’efficacité de potentiels candidats médicaments.

Réduction

Nous utiliserons des modèles bien établis dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de limiter le nombre d’animaux. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique. Dans la littérature, le nombre d’animaux par groupe est compris entre 6 à 10. Une analyse statistique rétrospective permettra de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe afin d’obtenir pour chaque paramètre étudié une puissance de 80% et alpha=0.05. Tous les composés qui seront testés dans ce modèle seront sélectionnés sur la base de leurs efficacité in vitro et leur bonne distribution pharmacocinétique. Un grand nombre de composés synthétisés par notre recherche sont éliminés sur la base de ces résultats et ne sont pas évalués in vivo.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance journalière avec administration d’analgésique dans l’eau de boisson dès l’infection. Si les points-limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera mis à mort de façon anticipée afin d’éviter toute souffrance. Lors de la mise à mort, les animaux seront placés sous anesthésie profonde. Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. Pour éviter tout risque de surinfection, un couvercle filtrant sera placé sur toutes les cages. Les animaux à phénotype dommageable seront hébergés en portoir ventilé. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la durée de l’expérimentation.

Choix des espèces

L’espèce choisie sera la souris, espèce majoritairement utilisée dans la littérature dans les modèles d’infection pulmonaire et qui permet de recourir à des animaux génétiquement modifiés ou mutants, immunodéprimés. Les animaux seront utilisés à un stade adulte afin d’avoir une maturité pulmonaire.

120 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie du cerveau pour implanter des électrodes de stimulation profonde, avec une IRM sous anesthésie de deux à quatre heures, une injection de vecteurs viraux ou de cellules souches et des prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien, pour valider ces dispositifs avant un usage chez l'humain. Le porteur indique des risques de douleur post-opératoire, d'infection et de fibrillation, un défibrillateur restant disponible en salle. Il affirme que le recours au cochon est "nécessaire" pour la proximité de son anatomie cérébrale avec celle de l'humain, aucun modèle in silico valide n'existant selon lui.

Objectifs

La stimulation cérébrale profonde (DBS) est une procédure neurochirurgicale souvent pratiquée chez les personnes souffrant de troubles du mouvement. La stimulation interfère avec les signaux pathologiques dans la structure cible pour restaurer les fonctions motrices normales. Cette thérapie a été reconnue comme sûre et efficace pour l'amélioration des symptômes chez les patients atteints de la maladie de Parkinson (MP). Cette méthodologie a été une évolution technique majeure pour le traitement de la MP et l’intervention chirurgicale est maintenant explorée pour d'autres troubles, comme l'épilepsie et la dépression. Le développement de nouvelles sondes DBS capables d'enregistrer l'activité cérébrale dans les structures cibles pourraient contribuer au développement de nouvelles thérapies chez les patients atteints d’autres affections neurologiques. D’un autre côté, de nouvelles stratégies innovantes basées sur la thérapie génique ou cellulaire pourraient également bénéficier aux patients atteints de ces affections. Cette approche utilise des virus modifiés atténués ; ils ont perdu leur pouvoir de se multiplier mais peuvent apporter après modification de leur génome, dans des cellules ou des organes malades, un gène réparé, ou des molécules qui soignent. D'autres approches thérapeutiques par injection de cellules souches "réparatrices" pourront également être évaluées. Pour le cerveau, la voie la plus efficace d’administration de ces candidats thérapeutiques, tout comme la DBS, reste l’approche chirurgicale suivie de différentes mesures et prélèvements. Les études précliniques nécessitent de valider ces outils (sondes pour la DBS ou vecteurs viraux ou cellules souches) chez le porc. Le projet a donc pour objectif de valider d’une part de nouveaux vecteurs viraux qu’ils soient porteurs d’une molécule «contrôle» ou de protéines d’intérêt à visée thérapeutique, ou des cellules souches, et d’autre part de nouvelles sondes DBS chez le porc. Les deux approches pouvant être combinées en conditions proches de la clinique avant leur utilisation chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament ou d’un nouveau dispositif médical (électrode), indispensable avant les essais chez l’homme. Le développement de nouvelles électrodes sur les animaux visant à améliorer l’impact de la DBS dans les troubles neurologiques sont fondamentaux pour confirmer que les prototypes atteignent les niveaux de sécurité, d’efficacité et d’ergonomie attendus et pourrait permettre à terme de maximiser le temps du patient "en thérapie". Ce projet est mené obligatoirement sur l’animal. En effet, il n’est pas envisageable d’implanter un nouveau dispositif médical ou d’administrer un nouveau composé à l’homme - sain ou malade - compte tenu des risques non connus susceptibles d’apparaître. A terme, nous souhaitons démontrer l’efficacité et la tolérance d’outils de thérapie génique ou cellulaire chez un modèle de grand animal, pour demander par la suite une autorisation d’essai clinique chez des patients atteints de maladies neurodégénératives ou neurologiques.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes, sous anesthésie générale (nécessitant une injection intramusculaire de quelques secondes) : examens d’imagerie non-invasifs par IRM (durée 2-4 heures), une chirurgie stéréotaxique (identique à celle réalisée chez le patient humain) pour l'implantaton, l'enregistrement ou la stimulation d'électrodes intracérébrale ou l'administraation d'inoculum sous imagerie par rayons X (durée 2-4 heures). En fonction du test réalisé, certains animaux pourront avoir une phase de récupération et de répétition, d’une à deux semaines après la chirurgie, de l’imagerie et enregistrements electrophysiologiques afin d’évaluer les résultats chroniques de l’intervention réalisée (durée 4-6 heures). Des prélèvements pourront être réalisés (sang et liquide cephalo-rachidien), le plus souvent lors de l'anesthésie pour d'autres actes: chirurgie ou imagerie. Cependant, en cas d'immunosupression, un suivi est nécessaire, et des prises de sang pourront être effectuées 1 fois par semaine (durée env. 2 minutes)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie ou aux prélèvements biologiques. Pour la chirurgie: stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible, infection au niveau des points de sutures. Pour les prélèvements (sang, LCR) : stress de la contention et de l’anesthésie, hématome, douleur possible. Pour l'imagerie: stress de la contention et de l'administration d'anesthésique. Une surveillance des paramètres biologiques et comportementaux (anxiété, motricité, etc..) permettra de détecter ces complications inattendues.

Devenir

A la fin du projet les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses ex-vivo, des organes pourront également être proposés à des équipes de recherche.

Remplacement

Ce projet concerne exclusivement une utilisation du porc. Ce recours à l’animal peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) l’éthique interdit l’utilisation d’approches neurobiologiques invasives chez l’homme, rendant ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf, bien sûr, lorsque ceux-ci sont non-invasifs) ; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux ; 3) Enfin, dans le cadre des modèles de maladies neurodégénératives, l’objectif à terme (bien que non décrit dans le présent projet) est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (moteur, cognitif) de ces affections qui en tant que telles ne peuvent être étudiées sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le porc (du fait de sa proximité avec l’homme en termes d’anatomie cérébrale) apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques.

Réduction

Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques ou le développement de nouveaux dispositifs médicaux (ici électrodes de stimulation/enregistrement) avec un nombre estimé de 4 études par an, comprenant 6 animaux par étude, soit un total de 120 animaux sur 5 ans. Bien qu’un nombre de 6 animaux soit faible pour avoir une puissance statistique élevée, il est suffisant pour effectuer des tests statistiques de comparaison. Il est également important de noter que les études de neurophysiologie ou de développement de neurotechnologies sur «gros animal» se limitent généralement à un nombre de 3 à 5 animaux, en raison de la complexité technique et expérimentale inhérente à ce domaine. Il s’agit du nombre généralement attendu par les comités de lecture dans le cadre de l’évaluation par les pairs, qui attendent dans ce cas les résultats individuels sur chaque animal. Les candidats thérapeutiques auront été testés préalablement in vitro ou chez le petit animal (rongeur) pour déterminer les doses à utiliser et s’affranchir d’éventuels effets toxiques. Dans le cadre d’une étude de validation de dispositif médical (électrode), la chirurgie implantatoire ne concerne qu’un seul hémisphère cérébral, l’autre hémisphère pouvant être utilisée comme contrôle. Ce qui permet de réduire le nombre d’animaux de moitié. Enfin des males comme des femelles pourront indépendamment être utilisés dans nos projets.

Raffinement

Pendant la procédure chirurgicale, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Ceux-ci nous permettent d’apporter la nécessaire hydratation ou de fournir des antiarythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire. Un défibrillateur est toujours disponible en salle d’opération pour éviter la mort précoce de l’animal durant les tests. Pendant l’hébergement, l’animal est placé dans des locaux adaptés, avec maintien en groupe social et enrichissement adapté (jeux à macher, tapis de repos, système encourageant le fouissage...) Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’ensemble de ces informations sont reportés dans des fiches de suivi adapté. Cette surveillance permet une intervention rapide auprès du vétérinaire et du responsable de projet pour adapter les soins analgésiques si nécessaire. Si une étape du protocole chronique affecte l’état de santé au point d’atteindre l’un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal alors le protocole sera interrompu et l’animal mis à mort selon les modalités éthiques. Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adaptés au poids de l’animal, et sont réalisé sur animaux sédatés. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme le porc a été retenu car (i) les modèles sont bien décrits et caractérisés et constituent donc une référence dans la communauté scientifique ; (ii) le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ces modèles animaux. De plus, l'anatomie cérébrale du porc est proche de celle de l’homme en terme de taille. Il existe de plus une forte homologie entre les structures cérébrales du porc et celles de l’homme (basées sur des atlas) ce qui est indispensable dans le cadre de l'étude de la faisabilité de la procédure thérapeutique. Porc : jeune de 35-40kg environ (environ de 3-4 mois) ou miniporc de taille similaire Au stade défini, la taille et les caractéristiques du cerveau des animaux sont proches de celle de l’homme ce qui permet une évaluation fiable des cibles pour la chirurgie.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie cérébrale d'une heure, des injections de morphine puis de naloxone provoquant un sevrage, et jusqu'à sept tests comportementaux dont le RNT ne précise pas la nature, pour mesurer l'activité de neurones par fibre optique. Le porteur indique mettre les souris à mort pour vérifier l'implantation de la fibre. Sur le remplacement, il affirme que ces effets ne s'étudient que sur des "organismes vivants et entiers" et que les souris génétiquement modifiées utilisées n'existent que chez cette espèce.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mesurer l’activité des neurones répondant aux opiacés lors de comportements liées aux réponses émotionnelles chez des animaux naïfs et dépendants aux opiacés ( comme la morphine ou l’héroïne). Le rôle des circuits neuronaux qui répondent aux opiacés dans les réponses émotionnelles positives (activité sociale ou consommation de boisson sucrée) et négatives comme le stress est encore peu étudié. L’objectif de ce projet sera de mesurer l’activité des neurones répondants aux opiacés en utilisant une technique d’imagerie.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier des nouveaux circuits neuronaux lors de réponses émotionnelles positives et négatives. Ce projet aura de nombreux bénéfices, en particulier d’identifier l’implication des neurones critiques dans le développement de l’état émotionnel négatif à l’état pendant le sevrage aux opiacés. Les états négatifs (anxiété et depression) pendant le sevrage aux opiacés sont important car il contribue en grande partie au risque de rechute et donc la fin de l’abstinence. Ceci permettra de caractériser un circuit important dans le développement des troubles affectifs tels que l’anxiété et la dépression, ainsi que les mécanismes d’adaptation du cerveau à l’exposition répétée aux opiacés. Ceci aidera aussi d’identifier de nouvelles cibles neuronales pour des traitements des troubles affectifs et du sevrage aux opiacés, permettant de faire face à la forte augmentation des troubles émotionnelles et de la dépendance et de la consommation d’opiacés. Les implications sont à la fois fondamentales et cliniques.

Procédures

Procédure chirurgicale sous anesthésie générale 1 fois pendant 1 heure avec une injection d’anesthésiant local et une injection d’analgésique pendant la chirurgie pour chaque souris. i) Groupe 1 : Nous allons effectuer 7 tests comportementaux par souris de maximum 45 minutes séparées par 7 jours. ii) Groupes 2 et 3 : Les souris recevront 9 injections sur animal vigile par souris d’une durée de 30 secondes iii) Groupes 4 et 5 : Nous allons effectuer un test comportemental sur 5 jours (15-30 minutes). Les souris recevront 8 injections sur animal vigile par souris d’une durée de 30 secondes

Impact sur les animaux

Chirurgie stéréotaxique : Après la chirurgie, Il existe aussi un risque d’inflammation de la plaie, d’infection et de douleur post-opératoire. Injections multiples : Les souris seront injectées par la morphine ou saline (6 fois) en intrapéritonéale et avec la naloxone et saline en sous-cutanée (2 injections), donc il y a la possibilité d’irritation du site d’injection. Tests : les tests comportementaux choisis ne posent aucun risque corporel pour l’animal. Les tests de comportementaux sont potentiellement stressant pour l’animal, donc il y aura 7 jours de repos entre chaque test. Sevrage précipité : les animaux pourront présenter des symptômes d’addiction et de sevrage pouvant entrainer une douleur considérée comme modérée. Le sevrage précipité avec la naloxone peut induire des symptômes somatiques de sevrage, tels que les tremblements de corps ou de pattes, la piloérection, le ptosis, et des sauts.

Devenir

Mise à mort afin de vérifier l'implantation de la fibre optique permettant la mesure d'activité.

Remplacement

"Remplacement" : les effets comportementaux des opiacés ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires, qui par nature ne récapitulent ni la complexité de l’organisation cérébrale en réseaux neuronaux complexes. L’étude de ces effets nécessite donc l’analyse d’organismes vivants et entiers. De plus nous utiliserons des souris génétiquement modifiées permettant de cibler les circuits neuronaux répondant aux opiacés, ces modèles n’existent que chez la souris.

Réduction

"Réduction" : les animaux utilisés étant consanguins, la variabilité phénotypique est limitée, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux tout en mettant potentiellement en évidence un effet statistiquement significatif. De plus ces études se feront de manière longitudinale, afin de tester l’activité des neurones pendant plusieurs comportements (dépression et anxiété) chez le même animal afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées. Ainsi, au regard des données de la littérature et de la variabilité interindividuelle attendue, les groupes expérimentaux destinés à caractériser les comportements liés aux i) troubles affectifs et ii) effets aversifs des opiacés seront constitués de 12 souris chacun.

Raffinement

"Raffinement": nous avons choisi d’utiliser des protocoles expérimentaux qui minimisent au maximum l’inconfort des animaux tout en permettant néanmoins d’étudier les réponses comportementales au sevrage à la suite d’une administration d’opiacés. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les souris sont hébergées en groupe sociaux de 3 à 5 animaux par cage, et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger, une ‘’maison’’ en carton, et des papiers absorbants pour faire un nid. Enfin, les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie (anesthésique profond et un anesthésique local autour du site de chirurgie) et les animaux recevront un traitement antidouleur (traitement par un anti-inflammatoire). La température corporelle de l’animal sera maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté jusqu’au complet réveil de l’animal. Les animaux seront ensuite suivis et la souffrance sera évaluée. Des points limites prédictifs seront établis permettant d’interrompre l’étude limitant ainsi la souffrance, la douleur et le stress pour l’animal.

Choix des espèces

La souris est un modèle de prédilection pour la recherche biomédicale et sont aujourd'hui utilisés comme modèles standards pour l’étude de la plupart des pathologies, grâce aux connaissances de plus en plus précises de leurs génomes permettant la création de modèles transgéniques de ces maladies. Des souris adultes seront utilisées (agées de 8 semaines au début des expériences).

12 750 animaux non-humains, soit 5 100 souris, 5 100 rats et 2 550 lapins, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation de l'œil leur est provoquée par injection oculaire ou systémique, suivie d'examens ophtalmologiques parfois sous anesthésie, avant mise à mort pour analyse des tissus. Le porteur attend des modèles servant à évaluer de futurs traitements et décrit une inflammation, un gonflement au point d'injection et de possibles diarrhées. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit l'œil "dans sa globalité fonctionnelle".

Objectifs

Les uvéites sont des inflammations, réactions de défense de l'organisme à une agression, de la partie de l'oeil appelée uvée qui est composée de plusieurs structures internes de l’oeil. Elles entrainent une rougeur de l'oeil, altèrent la vision, occasionnant des troubles ou l'apparition de taches, et peuvent conduire à la cécité en l'absence de soins. Dans les pays occidentaux, elles seraient à l’origine de 5 à 20% des cas de cécité. Les causes des uvéites sont variées: d’origine infectieuse, associées à une autre pathologie ou auto-immunes. L’objectif du projet est la mise en place de modèles expérimentaux d'uvéite chez le rongeur et le lapin, afin de contribuer au développement de nouveaux traitements médicaux pour diminuer les symptômes. Compte tenu des particularités physiologiques et anatomiques de l’organe concerné et l’absence pour l’instant de modèle alternatif, nous devrons avoir recours à des animaux pour établir notre modèle. Les informations bibliographiques recueillies, les analyses statistiques ainsi que notre expérience, nous permettrons de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements contre les signes et les origines des uvéites est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleures conditions possibles et dans le plus grand respect du bien-être animal.

Procédures

Selon la procédure, l'induction de la pathologie peut se faire soit par une injection directement au niveau de l'oeil soit par une injection systémique, intraveineuse pour le lapin, sous cutanée pour le rat, sous-cutanée ou intrapéritoneale pour la souris. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations par une lampe à fente d'phtalmologie). Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif ou tout autre marqueur d'intérêt. Les prélèvements de sang se feront par ponction et basé sur des recommandations et durent moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Les signes cliniques attendus sont une inflammation de tissus de l'oeil, conjonctive, iris, humeur aqueuse, rétine, vitré et photophobie. De même un gonflement au niveau du site d'injection de l'inducteur est attendu (patte, dos, et base de la queue). Des diarrhées peuvent se produire, les animaux seront pesés juste avant l’induction le lendemain et chaque semaine qu’à la fin de la procédure.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo sur les tissus impactés (évaluations histologiques, dosages de produits...).

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’oeil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’oeil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse) de physiologie différente soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de modèle alternatif.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est limité pour cependant rester adapté à l'analyse des résultats par des tests statistiques afin de permettre de conclure sur la présence ou l'absence d'effet de la molécule testée sur le paramètre étudié. Des évaluations non invasives des structures internes de l'oeil par des techniques d'imagerie ou de mesure de la fonctionnalité de la rétine sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal. L'analyse des deux yeux sera effectuée chaque fois que possible afin de réduire le nombre d'animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum pour les rongeurs, de l’enrichissement adapté (abri et morceaux de bois à ronger). Les lapins seront placés individuellement ou par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'oeil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie légère pour son confort. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l‘établissement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’oeil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dans les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les rongeurs ont minimum 6 semaines au début de l’étude, les lapins 8-12 semaines, âge minimum pour la maturation de la rétine comme il convient au modèle.

120 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés, après accord du vétérinaire, dans une autre étude du même projet ou dans un autre projet. Chacun subit une chirurgie d'environ trois heures sous anesthésie générale pour l'implantation définitive d'un émetteur de télémétrie, parfois suivie d'une heure de plus pour poser une chambre vasculaire, et peut être réopéré pour repositionner un cathéter. Les candidats médicaments sont ensuite administrés sous contention, par voie orale, intraveineuse ou quatre autres voies, avec des mises à jeun pouvant durer 30 heures, et leurs effets sur le cœur et les vaisseaux sont enregistrés sur des porcs éveillés. Après chaque chirurgie, les porcs restent isolés six à huit jours, isolement dont le porteur écrit qu'il engendrera "un stress de durée moyenne et d'intensité modérée", avant d'ajouter qu'il "permettra aussi d'accélérer la récupération post-chirurgicale".

Objectifs

Chaque étude de ce projet consiste à évaluer les effets cardio-vasculaires de différents candidats médicaments chez le mini-porc éveillé, en utilisant un dispositif électronique permettant la mesure et l’enregistrement automatique des paramètres cardio-vasculaires (télémétrie). Pour cela, une chirurgie initiale est prévue afin d'implanter de manière définitive ce dispositif électronique. Les enregistrements se font dans les pièces d'hébergement, sur des animaux libres de leurs mouvements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Dans ce projet les animaux pourront être soumis à deux types de chirurgie sous anesthésie générale : une chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie (dispositif permettant la mesure des paramètres cardiovasculaires), et parfois une chirurgie d'implantation de chambre vasculaire (dispositif permettant l'administration intraveineuse de produit, ou la réalisation de prélèvements sanguins). La durée de ces interventions sera d'environ 3h pour l'implantation de l'émetteur, plus 1h supplémentaire en cas d'implantation de chambre vasculaire. En cas de besoin, l'animal pourra être soumis à une nouvelle chirurgie pour repositionner le cathéter de l'implant ou de la chambre vasculaire, voir pour changer la chambre (durée 1h environ). Les animaux seront maintenus pendant l’administration du candidat médicament (ou du placebo) par voie orale, intrapéritonéale, sous-cutanée, transdermique, intramusculaire ou intraveineuse (bolus ou perfusion) (durée 1 -2minutes). Et si l’administration se fait par une perfusion de longue durée (supérieure à 1h), les animaux porteront des gilets (avec une minipompe embarquée) pendant maximum 24h. Ainsi, les effets sur les paramètres cardiovasculaires seront évalués. Cette évaluation se fera chez un animal éveillé et libre de ses mouvements dans sa pièce d'hébergement pendant plusieurs heures ou jours. Dès que possible, les animaux seront hébergés avec un animal congénère afin de ne pas être isolé. Des prélèvements sanguins, sans anesthésie, pourront être effectués durant les phases expérimentales (moins de 2min par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les contentions des animaux pour induire l'anesthésie ou administrer le produit peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. Dans ce projet, les animaux seront anesthésiés à une ou plusieurs reprises, pour l'implantation de l'émetteur de télémétrie, et dans certains cas, de la chambre vasculaire. Ces chirurgies peuvent induire des douleurs post-chirurgicales qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie, une analgésie et un protocole de soins post-opératoire. Les animaux seront isolés pendant la période de récupération post-opératoire (6 à 8 jours après chaque chirurgie). Cet isolement engendrera un stress de durée moyenne et d'intensité modérée (désocialisation). Cependant en contrepartie, l'isolement permettra aussi d'accélérer la récupération post-chirurgicale. Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements de sang (moins de 2min/prélèvement, et 2mL max par prélèvement). Par ailleurs, les animaux seront mis à jeun avant les chirurgies, et parfois avant l'administration du produit à tester. Cette période de jeun durera au maximum 30h. La mise à jeun engendre un stress physiologique et psychologique d'intensité modérée mais de courtes durées. Enfin, les effets potentiellement indésirables provoqués par le candidat médicament à tester font l'objet d'échanges avec les fabricants du candidat médicament afin d'adapter les outils d'observation des animaux, pour anticiper au mieux de potentiels signes cliniques.

Devenir

Réutilisation des animaux dans une étude du même projet ou dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré, après accord du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le mini-porc car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets cardiovasculaires de ces candidats médicaments. Or, avant toute utilisation chez l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité ou la sécurité d'un médicament. A ce jour, le mini-porc est l’une des espèces les plus adaptées à ce type de modèle car il présente un système cardiovasculaire proche de celui de l'homme.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe (n=4 à 8 par groupe) est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences, et d’effectuer des analyses statistiques robustes. Une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, •l'utilisation de la télémétrie sans fil (animal libre de ses mouvements pendant les phases d'enregistrement), • la validation du système de télémétrie et la validation pharmacologique du modèle, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • l'utilisation d'une chambre vasculaire permettant des prélèvements sanguins sans une restriction physique importante • Le suivi d’éventuels signes cliniques, • La détermination des points limites, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire.

Choix des espèces

Le mini-porc est une espèce animale adaptée et couramment utilisée pour évaluer les effets cardio-vasculaire d'un candidat médicament car son système cardiovasculaire est physiologiquement et anatomiquement proche de celui de l'homme. Animaux sevrés en croissance et animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

1 155 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des nouveau-nés et leurs mères allaitantes sont exposés pendant 14 jours à des concentrations variables d'oxygène pour reproduire la rétinopathie du prématuré, puis les ratons sont anesthésiés pour un examen de la rétine avant d'être tués pour prélever leurs yeux. Le porteur indique que les mères sont elles aussi mises à mort et signale des lésions cérébrales possibles sans surmortalité observée. Sur le remplacement, il affirme que la complexité de la rétine rend les études in vitro insuffisantes et l'animal "nécessaire".

Objectifs

La rétinopathie du prématuré est une des principales causes de cécité infantile. Son incidence est en augmentation en lien avec des changements de pratiques récents visant à administrer l’oxygène à une saturation plus élevée afin de favoriser la survie des grands prématurés. Cependant, l’excès d'oxygène est délétère pour la rétine immature du prématuré et un des principaux facteurs de risques pour le développement de la rétinopathie du prématuré. L’excès d’oxygène induit un stress oxydant qui conduit à un arrêt du développement de vaisseaux et à la mort de neurones de la rétine. De plus, plusieurs facteurs non associés à l’excès d’oxygène favorisent le développement de la maladie par l'intermédiaire d'un stress oxydant. Cependant, le lien entre certains de ces facteurs et la rétinopathie du prématuré n’a pas été clairement établi. Les traitements actuels de la rétinopathie du prématuré reposent sur des interventions invasives et/ou destructrices pour les tissus rétiniens intervenant de façon tardive dans le développement de la maladie et se limitent à diminuer le risque de cécité par décollement de rétine. Il n’existe aucun traitement pharmacologique préventif à l’heure actuelle. L’objectif de ce projet est de déterminer le rôle d'un ion métallique dans la physiopathologie de la rétinopathie du prématuré et l’effet bénéfique des molécules fixatrices de cet ion dans la prévention de la rétinopathie du prématuré et/ou dans la sévérité de la maladie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont importants pour plusieurs raisons. La rétinopathie du prématuré est l'une des principales causes de déficience visuelle dans la population pédiatrique. Sa prise en charge vise à lutter contre les complications tardives de la maladie, mais il n'existe actuellement aucun traitement pharmacologique préventif. Ce projet ouvrira des perspectives pour des études translationnelles visant à lutter contre le handicap visuel lié à la ROP. Nous espérons montrer 1) un lien entre une concentration élevée d'un ion métallique et la survenue et/ou la sévérité d’une rétinopathie du prématuré en utilisant un modèle animal répandu et connu pour mimer la pathologie du nouveau-né prématuré 2) un effet bénéfique des molécules fixatrices de cet ion dans la prévention de la rétinopathie du prématuré et/ou dans la sévérité de la maladie. • Les avantages à court terme comprennent une meilleure compréhension de la rétinopathie du prématuré ainsi que la détermination des cibles thérapeutiques potentielles dans cette maladie • Les bénéfices à moyen terme comprennent la traduction clinique des cibles thérapeutiques potentielles dans la rétinopathie du prématuré, ainsi que le développement de collaborations internationales dans le domaine. • Les avantages à long terme comprennent la réduction du handicap visuel lié à la rétinopathie du prématuré et les coûts économiques qui en découlent. Le coût estimé aux États-Unis pour un enfant déficient visuel suite à une rétinopathie du prématuré est d'environ 1 260 000 $ incluant les coûts directs et indirects (perte de productivité à l'âge adulte et perte de productivité parentale).

Procédures

Les expériences seront menées chez des ratons nouveau-nés, dont le développement rétinien postnatal est superposable à celui d’un bébé prématuré, grâce à un modèle de rétinopathie induite par l’oxygène qui mime la rétinopathie de l’enfant prématuré. Des rongeurs nouveau-nés et leur mère allaitante seront soumis à des concentrations oscillantes d’oxygène, pendant 14 jours, avant de les ramener à l'air ambiant. Les animaux seront soumis à une anesthésie générale une seule fois pour des examens de la rétine et de la fonction visuelle pendant 20 minutes, puisimmédiatement après ils seront euthanasiés pour l’analyse ex vivo des tissus rétiniens. Afin d'analyser les différentes phases physiopathologiques de la maladie trois temps seront étudiés: à 14 jours (1er phase), à 18 jours (2ème phase) et à 28 jours (phase de régression) après la naissance. L’administration des traitements étudiés sera faite par voie orale (gavage, 3-5 minutes), en injection intrapéritonéal (1-3 secondes) ou en injection périoculaire (1-3 secondes). En cas d'inefficacité de la voie péri-oculaire, des injections intraoculaires seront effectuées sous anesthésie générale (1-3 secondes), dans ce cas les animaux aurons 2 anesthésies générales. Il n'y aura pas de prélèvements sur animaux vivants. Aucune procédure chirurgicale n'est prévue.

Impact sur les animaux

Le modèle de rétinopathie induite par l'oxygène, consiste à exposer des rongeurs nouveau-nés et leur mère allaitante à des concentrations variables d'oxygène pendant 14 jours. Le retentissement sur l’état général des animaux est habituellement faible. Le modèle néonatal de supplémentation ionique n’a pas de retentissement sur l’état général des animaux. Il a été observé des lésions cérébrales mais ces lésions n’ont pas été associées à une incidence augmenté de mort, convulsions ou apnées. Les nuisances associées aux explorations in vivo et aux traitements administrés sont liées à la nécessité d’effectuer une anesthésie générale (douleur légère de courte durée due à a réalisation d’une injection intra-péritonéale). L’injection intraoculaire d’un agent thérapeutique est utilisé en pratique clinique courant chez les nouveau-née prématurés. Les effets indésirables sont rares : infection, cataracte, hémorragies.

Devenir

Les analyses seront effectuées sur les rétines ce qui nécessite de prélever les yeux en post-mortem. Cela implique que tous les animaux devront être euthanasiés par une méthode réglementaire afin d'effectuer ces prélèvements tissulaires. Les mères seront euthanasiées par une méthode réglementaire.

Remplacement

La rétine est un tissu complexe composé de nombreux types cellulaires qui fonctionnent en réseau, et interagissent en permanence avec les autres tissus oculaires et la circulation (vaisseaux rétiniens et choroïdiens). Des études in vivo dans des modèles animaux mimant la rétinopathie du prématuré humaine sont nécessaires afin d’établir une preuve de concept thérapeutique, car les études in vitro ne permettent pas de prendre en compte la multiplicité de ces interactions, ni la physiopathologie complexe de cette maladie. Le recours à l'expérimentation animale pour la recherche de traitements efficaces est justifié par les conséquences visuelles graves de la rétinopathie du prématuré. Nous avons prévu des analyses immunohistochimiques des rétines des fœtus humains après interruption de grossesse et chez des enfants prématurés afin de vérifier que nos observations chez l’animal sont concordantes avec les données chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux impliqués est de 989 ratons et 166 mères, soit un total de 1155 animaux. Le nombre d’animaux par groupe est réduit au maximum, sans toutefois grever la possibilité d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Nous avons ainsi calculé un minimum de n=5/ groupe pour des analyses comparatives. Pour minimiser le nombre d'animaux, les deux yeux d'un même animal seront utilisés pour les expériences ex vivo, ce qui divise par 2 le nombre d’animaux nécessaires. Afin d'éviter les doublons un seul œil/animal sera analysé par chaque technique en en immunohistochimie et en biologie moléculaire. Aussi, nous avons choisi de réaliser des coupes rétiniennes (à la place des montages à plat) permettant l'utilisation de plus d'anticorps par rétine pour explorer plusieurs marqueurs tout en réduisant le nombre d'animaux nécessaires. Le même groupe d’animaux témoins sera utilisé pour l’analyse de l’efficacité des différentes posologies ou voies d’administration des molécules chélatrices.

Raffinement

Les femelles gestantes seront reçues à l’animalerie au moins 8 jours avant la date présumée de mise bas pour leur permettre de s’acclimater, et hébergées en conditions stables et adaptées à l'espèce, en stabulation conventionnelle, avec un régime alimentaire spécial femelles gestantes/allaitantes. Les cages seront enrichies de nids végétaux. Afin de limiter stress, angoisse et douleur, les nouveau-nés seront manipulés lentement et doucement sous lampe chauffante. Les injections intrapéritonéale d’anesthésiantes seront effectuées en les contenant doucement dans la paume de la main. Ces anesthésies générales seront effectués lors des explorations in vivo et en cas d’effectuer des injections intraoculaires. Une anesthésie locale sera également effectuée en cas d’injection intraoculaire. Le comportement des ratons et de leur mère sera observé tous les jours. Dans le cas où les traitements ou explorations effectués seraient à l'origine de douleurs visibles, de détresse ou de signes de toxicité (diminution des mouvements, perte d'appétit/absence de réplétion gastrique, perte de poids, changement d’aspect physique, hypothermie, isolement) le traitement sera interrompu et le raton sera euthanasié.

Choix des espèces

Le développement rétinien de rongeurs à la naissance correspond à celui d’un enfant prématuré né vers 6 mois 1/2 de grossesse : la rétine est largement avasculaire et très susceptible à la rétinopathie du prématuré. Chez les rongeurs, l'angiogenèse rétinienne commence peu après la naissance, les capillaires superficiels atteignent les bords de la rétine 9 jours après, et la vascularisation rétinienne est terminée à 15 jours. Les différentes caractéristiques de la rétinopathie du prématuré peuvent être reproduites en exposant des rats ou des souriceaux nouveau-nés à une hyperoxie. Les rats et les souris sont donc particulièrement adaptés pour étudier l'angiogenèse rétinienne dans des conditions tant normales que pathologiques; la très grande majorité des modèles animaux de rétinopathie du prématuré utilisent ces espèces. Nous avons préféré d’utiliser les rats aux souris car grâce à la taille des yeux plus importante les injections des molécules est plus facilement effectué avec moins de complications pour l’animal. Les expériences utiliseront de ratons nouveau-nés de J1 à J28 postnatal. La fenêtre pour étudier le développement rétinien, dont l’angiogenèse rétinienne normale et pathologique, est courte chez le rongeur et correspond à la période post-natale immédiate. De plus, le stade de développement rétinien des rongeurs à la naissance correspond à celui d’un prématuré né à environ 6 mois 1⁄2 de grossesse. Il est possible de reproduire chez les rongeurs nouveau-nés des lésions de rétinopathie semblables à celles observées dans la rétinopathie du prématuré par hyperoxie.

281 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par obstruction d'une artère au moyen d'un filament inséré au cou, retiré une heure plus tard, suivi d'un traitement puis de tests comportementaux avant prélèvement du cerveau. Le porteur indique que le modèle peut entraîner des pertes d'équilibre et une faiblesse musculaire, et héberge les rats isolément pour éviter l'arrachage des sutures. Il présente le rat comme un "modèle préférentiel" pour l'AVC et affirme qu'aucune méthode in silico ou in vitro n'apporterait le même niveau d'information.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients est réalisée par l’injection de tPA. Toutefois, seule une faible proportion des patients peut être traitée du fait des effets secondaires de l’injection de tPA. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouveaux médicaments visant à traiter efficacement cette pathologie.

Bénéfices attendus

Cette étude pourra mettre en évidence de nouveaux traitements dans la lutte contre l’AVC.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du cou afin de pouvoir insérer un monofilament dans une artère pour l'obstruer et induire l'accident vascualire cérébral. Cet acte chirurgical durera 15 minutes. Une heure plus tard, une seconde chirurgie sur le même site sera réalisée afin d’extraire ce monofilament et ainsi permettre à nouveau une circulation sanguine. Cet acte chirurgical durera 10 minutes. Le traitement sera administré 10 minutes après le rétablissement de la circulation sanguine. A J+1 un prélèvement sanguin sera réalisé. A J-1 et J+2, ces mêmes animaux suivront une série de test comportementaux. Un total de 20 minutes est prévu pour l'ensemble des tests comportementaux. Enfin, à la fin du projet, le cerveau sera prélevé. Les procédures pouvant engendrer une douleur seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie.

Impact sur les animaux

L’utilisation d’une analgésie lors de la chirurgie va permettre de limiter au maximum la souffrance des animaux. L’hébergement en cage individuelle des animaux, pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les points de suture, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque rat de voire au moins un de ses congénères et également par l’utilisation d’enrichissements. Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire. Les fonctions motrices peuvent également être altérées durant les premières heures après la chirurgie. Pour pallier à ces problèmes, les animaux seront habitués quelques jours avant la chirurgie à une nourriture sous forme de gel nutritif en plus de leurs granulés conventionnels. Ce gel améliore la prise en charge des rats après la chrirugie, et demeure davantage accessible (placé sur le sol de la cage, contrairement aux granulés situés en hauteur). Une litière à forte granulométrie sera également utilisée pour éviter les risques d’étouffement après la chirurgie.

Devenir

Tous les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort à la fin du protocole expérimental.

Remplacement

L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que le rat est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, le rat est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, les études in silico ou in vitro ne permettant pas de prédire l’efficacité d’un traitement dans le cadre d’une intervention visant par exemple à limiter la taille des lésions cérébrales au cours d’un AVC chez l’Homme. Le nombre et la complexité des mécanismes mis en jeux au cours de l'AVC chez l’Homme ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez le rat. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos traitements. Le nombre d’animaux utilisés est fixé à 18 rats par groupe + 60% liée à la variabilité du modèle. Cette variabilité, bien que comparable à ce qui se passe dans la réalité clinique, entraine l’utilisation d’un nombre important d’animaux par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles. Les rats seront 3 par cage avec plusieurs enrichissements, auront un accès non restreint à de la nourriture et à de l’eau. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Une attention toute particulière sera portée aux animaux pendant la chirurgie (analgésie, anesthésie générale, maintient de la température corporelle, désinfection et anesthésie locale) ainsi qu’après. Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, limitant le risque pour l’animal de rompre ses points. Après chirurgie, les animaux seront placés en cage individuelle dans une pièce dédiée chauffée à 28°C jusqu’à leur réveil. Les animaux resteront en cage individuelle pendant le restant de la durée du projet. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les fonctions motrices peuvent être altérées durant les premières heures après la chirurgie. Pour pallier à ces problèmes, les animaux seront habitués quelques jours avant la chirurgie à une nourriture sous forme de gel nutritif en plus de leurs granulés conventionnels. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si après la chirurgie, nous constatons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques. Enfin, une surveillance stricte des rats sera réalisée pendant les jours suivants l’opération : pesée des animaux et contrôle des points limites.

Choix des espèces

Les mécanismes et les conséquences physiologiques de l'AVC sont similaires chez le Rat et chez l’Homme. Le Rat est donc une espèce pertinente pour modéliser les AVC chez l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la récupération fonctionnelle, la perfusion cérébrale ainsi que le devenir des lésions induites par l'AVC. Les animaux utilisés seront âgés de 7-8 semaines soit un poids d’environ 250-300 g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie cérébrale d'une heure puis des séances comportementales cinq jours par semaine pendant huit semaines, dont le RNT ne précise pas la nature, pour construire un modèle d'addiction reposant sur une stimulation lumineuse des neurones. Le porteur indique que les animaux peuvent présenter des symptômes d'addiction et de sevrage jugés modérément douloureux et sont ensuite tués pour prélever le cerveau. Sur le remplacement, il affirme que les effets des opiacés sur le cerveau ne peuvent être étudiés que sur des "organismes vivants et entiers".

Objectifs

Ce projet de recherche vise à identifier les circuits neuronaux participant à la dépendance aux substances d'abus et plus particulièrement aux opiacés. De plus, il permettra de créer un nouveau modèle d’addiction, ou les drogues d’abus seront remplacées par une stimulation lumineuse par optogénétique, technique qui consiste en le fait d’induire dans une cellule un gène codant pour une protéine photosensible, qui s’activera lorsque celle-ci sera éclairée par une lumière spécifique. Le système opioïde est un système neuromodulateur complexe composé de trois récepteurs (mu, delta et kappa), largement distribués dans le cerveau et peuvent moduler plusieurs fonctions dont la réponse à la douleur, au stress ou encore au contrôle des émotions. Ces derniers sont activés par des peptides opioïdes endogènes. Le système opioïde régule la douleur, les processus de récompense, la régulation des réponses émotionnelles et des réponses au stress. Les altérations de ce système sont centrales dans le développement de troubles addictifs. L’objectif de ce projet est de modéliser les dimensions comportementales de l’addiction communes à toutes les drogues d’abus (impulsivité, résistance à la punition, motivation, rechute), grâce à l’optogénétique et au comportement opérant.

Bénéfices attendus

Ce projet permettera d'améliorer nos connaissances sur mécanismes moléculaires impliqués dans l'addiction aux drogues d'abus, c’est-à-dire sur l’usage excessif de substances qui induisent des modifications des fonctions physiologiques, entraînant une dépendance du consommateur à celles-ci. De plus, il permettera d'établir un nouveau modèle d'addiction sans utilisation de drogues d'abus. ce modèle permettera l'étude de l'ensemble des dimensions comportementales de l’addiction communes à toutes les drogues d’abus (impulsivité, résistance à la punition, motivation, rechute), grâce à l’optogénétique, (technique qui consiste en le fait d’induire dans une cellule un gène codant pour une protéine photosensible, qui s’activera lorsque qu’elle sera éclairée par une lumière spécifique à celle-ci) et au comportement opérant, méthode d’apprentissage qui est basée sur l’associations de récompenses et de punitions à un comportement particulier.

Procédures

Procédure chirurgicale : 1 fois sous anesthésie générale pendant 1 heure Tests comportementaux : 5 sessions comportementales par semaine seront réalisées pendant 8 semaines (2 jours de repos par semaine), les sessions seront limitées à 60 minutes, sauf pour une session qui sera limité à 4 heures.

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale peut induire des effets indésirables sur les animaux, tels que des ouvertures de la plaie et des infections. Un suivi rigoureux et quotidien sera mis en place pour chaque animal. Les animaux peuvent également présenter des états de stress en lien avec les expérimentations. Une habituation sera réalisée plusieurs jours avant le début des expérimentations afin de réduire au maximum le stress engendré. De plus, les animaux pourront présenter des symptômes d’addiction et de sevrage pouvant entrainer une douleur considérée comme modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des cerveaux.

Remplacement

"Remplacer" : les effets moléculaires des opiacés, sur le cerveau et d’autres tissus de l’organisme, ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires, qui par nature ne récapitulent ni la complexité de l’organisation cérébrale en réseaux complexes de structures interconnectées, ni les communications inter-tissulaires. L’étude de ces effets nécessite donc l’analyse d’organismes vivants et entiers.

Réduction

"Réduire" : les animaux utilisés étant consanguins, la variabilité phénotypique est limitée, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux tout en mettant potentiellement en évidence un effet statistiquement significatif. Ainsi, au regard des données de la littérature et de la variabilité interindividuelle attendue, les groupes expérimentaux destinés à caractériser les comportements liés aux effets de récompense seront constitués de 15 souris chacun (par sexe). En effet, chaque expérience sera menée en parallèle chez des souris mâles et femelles. Alors que l’addiction aux opiacés est plus fréquente chez l’homme que chez la femme, on sait très peu de choses sur les mécanismes neurobiologiques qui pourraient différer selon le sexe et contribuer à expliquer cette différence de vulnérabilité. Sur le plan éthique, il apparait essentiel d’aborder systématiquement cet aspect sur le plan de la recherche fondamentale, aussi bien pour maximiser la relevance des données obtenues pour la compréhension de l’addiction aux opiacés chez l’homme, que pour l’utilisation de tous les animaux obtenus lors de la reproduction de la lignée de souris que nous utiliserons.

Raffinement

"Raffiner" : nous avons choisi d’utiliser des protocoles expérimentaux qui minimisent au maximum l’inconfort des animaux tout en permettant néanmoins d’étudier les propriétés aversives des opiacés. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les souris sont hébergées en groupe sociaux de 3 à 5 animaux par cage, et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger et des papiers absorbants pour faire un nid. Enfin, lors de la réalisation de procédures chirurgicales, les animaux seront sous anesthésie générale et recevront un traitement antidouleur (anesthésique local autour du site de chirurgie et traitement par un anti- inflammatoire non stéroïdien). De plus, des points limites seront déterminés avant et après les procédures chirurgicales afin d’apporter un suivi individuel à chaque animal permettant de limiter ou arrêter la souffrance de l’animal. Avant de commencer les expérimentations les animaux seront pris en mains afin d’être habitués aux manipulateurs. Les souris seront également habituées aux expérimentations en étant enveloppées dans du papier afin d’être branchées à la fibre optique. Enfin, elles seront branchées à la fibre laser et seront libre d’explorer leur cage, afin d’être habituées à la sensation.

Choix des espèces

La souris est aujourd’hui utilisée comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies de son génome (99 % identique à celui de l'humain). De plus, le modèle souris permet la création de lignées génétiquement modifiées (délétion/surexpression globale ou locale d’un gène ou d’un marqueur neuronal, manipulation de neurones ciblés). Pour notre étude, les souris MOR-Cre permetteront de cibler et manipuler spécifiquemenent les neurones aux opiacés. Nous utiliserons des souris agées de 8 semaines au début de l'expérience.