Procédures modérées

20 chiens vont être utilisés, gardés vivants et destinés à être réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un produit vétérinaire immunosuppresseur par voie intraveineuse à jeun, subit deux prélèvements de ganglions et dix-sept prélèvements sanguins répartis sur 44 jours. Le porteur décrit une prestation destinée à mesurer l'efficacité et la sécurité du produit et signale des vomissements comme effet possible. Il justifie le recours au chien par l'absence de méthode reproduisant la diffusion d'un produit dans "l'organisme entier" et par le fait qu'il s'agit de l'espèce cible.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer les paramètres pharmacocinétiques de l'élément d'essai testé (avec un effet cumulatif ou non) à six doses différentes ainsi que son efficacité et d'évaluer la sécurité du produit test . Ce produit test sera mis en comparaison avec un contrôle positif ( la référence).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir démontrer l'efficacité du produit test en le comparant au groupe contrôle , d'identifier à partir de quelle dose des signes cliniques apparaissent, d'évaluer la dose maximale que peut recevoir l'animal sans signe clinique et sans modifications des paramètres sanguins mais également de démontrer l'efficacité du produit administré grace aux prélèvements des cellules des noeuds lymphatiques.

Procédures

Dans ce projet les nuisances sont: 1) l'administration des éléments tests par voie intraveineuse pendant 30 minutes avec mise à jeun au moins 10h avant. Aministration répétée 14 jours aprés la première administration 2) Deux prélèvements au niveau des noeuds lymphatiques seront réalisés 6 jours avant administration et 20 jours après . Durée d'un prélèvement de l'ordre de la minute 3) Dix-sept prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigiles répartis sur 44 jours au total. Durée de l'ordre de la minute.

Impact sur les animaux

Le produit test fait partie de la classe thérapeutique anti inflammatoire/immunosuppresseur. L'effet indésirable susceptible d'être observé suite aux traitements est un vomissement qui a été observé en intraveineuse bolus dans un projet antérieur. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires. Dans ce projet les nuisances sont: 1) l'administration des éléments tests par voie intraveineuse avec mise à jeun au moins 10h avant. Cela necessite une contention legère des animaux. Effets indésirables susceptibles, vomissement . 2) Prélèvements aux niveaux des noeuds lymphatiques . Cela necessite une contention legère des animaux. Effets indésirables irritation et inflammation post ponction au niveau du site de prélèvement. 3) Les prélèvement sanguins seront réalisés. Les sites de prélèvements seront alternés autant que possible. Les prélèvements seront réalisés par un personnel formé et conformément à la réglementation en vigueur. On ne s'attend pas à d'autre effet indésirable en particulier.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier. Aucune méthode alternative ne permet d'évaluer l'efficacité et la sécurité d'un produit test chez le chien.

Réduction

Pour la phase 1; 6 animaux seront inclus pour la mise en place de la technique pour le prélèvement des noeuds lymphatiques. Necessité de déterminer le site de prelèvement (ganglion lymphatiques au niveau des membres ou au niveau des mandibules, technique par aspiration ou par un système de va et vient). Pour la phase 2; 14 animaux seront inclus pour le réalisation de l'étude. Ils seront réparti en 5 groupes: un groupe contrôle de deux animaux recevra l'élément de référence à deux occasions et 4 groupes de 3 animaux recevront l'élément d'essai. C'est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats représentatifs et interprétables. Pas de test statistique réalisé aupréalable.

Raffinement

Pendant la période d'acclimatation, les animaux seront hébergés par groupe de 2 ou 3. Puis ils seront hébergés en condition individuelle à partir de l'administration jusqu'à 4h aprés. Cet hebergement en individuel est necessaire pour faciliter l'observation des animaux. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires. De l'enrichissement ( exemple: balle, corde) sera présent autant que possible dans les boxes. Dans ce projet les points limites sont: - Des vomissements qui seraient trés fréquents et qui impacteraient le bien être de l'animal - Des douleurs, saignements, gonflements observés au niveau de la zone de prélèvement des noeuds lymphatiques - Des douleurs, irritation ou inflammation importantes au niveau de la zone des prélèvements sanguins. Si de nombreux vomissements sont observés, un traitement antivomitif pourra être appliqué. Cette décision sera prise par le vétérinaire désigné. Un maximum des 10 vomissements sur 24h sera toléré au delà de 10 vomissements cela sera consideré comme un critère d'arrêt. S'il y a une forte présence de sang dans les vomissements cela sera considéré comme un critère d'arrêt immédiat. Si un gonflement, un léger saignement ou une douleur est présente au niveau d'une zone de prélèvement de noeuds lymphatiques alors un autre site de prélèvement sera choisi et l'animal sera suivi pour suivre l'évolution de la zone douloureuse. Des antalgiques, anti inflammatoires pourront être utilisés si nécessaire. Décision prise par le vétérinaire désigné. Les sites de prélèvements sanguins ( au niveau des veines jugulaires) seront alternés autant que possible pour éviter toute douleur ou inflammation au niveau des sites de prélèvements.

Choix des espèces

Espèce cible pour ce produit vétérinaire Adultes. Animaux adultes necessaire pour ce type de projet. Animaux qui ont fini leur croissance.

5 346 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent des injections quotidiennes entre le 7e et le 17e jour de gestation, des mesures répétées de tension pouvant irriter la queue jusqu'à des plaies, et se voient retirer leurs petits à trois jours, le suivi allant jusqu'à quinze mois après. Le porteur étudie la prééclampsie et ses conséquences cérébrales tardives, dont la valeur thérapeutique reste annoncée au conditionnel. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'interaction entre placenta et système neurovasculaire dans la durée.

Objectifs

Ce projet porte sur la prééclampsie, la principale pathologie de la grossesse, et plus particulièrement sur l’implication d’une famille de facteurs dénommés les prokinéticines au cours de cette pathologie. Nous nous intéressons également aux conséquences à long terme de cette pathologie qui ont pu être observées en clinique chez les femmes ayant fait une prééclampsie. Au cours de la grossesse normale, les niveaux des prokinéticines circulants augmentent graduellement avec un pic au premier trimestre puis chutent significativement aux deuxième et troisième trimestres. En revanche, chez les patientes prééclamptiques, leurs taux circulants sont significativement plus élevés et le restent au deuxième et au troisième trimestres, associés à de l’hypertension. Ceci est dû à une anomalie au moment de la formation des vaisseaux sanguins du placenta, qui permettent les échanges entre la mère et le fœtus. De ce fait le placenta ne reçoit pas suffisamment de nutriments et d’oxygène et développe un retard de croissance. Chez la mère, le manque d’oxygénation du placenta a diverses conséquences : une hypertension artérielle gravidique, des lésions au niveau des vaisseaux des reins, du foie et du cerveau, ainsi que des troubles de la coagulation sanguine. Le placenta, qui est pour sa part en hypoxie, et va alors se mettre à sécréter et libérer de nombreux facteurs pro-inflammatoires, dont les prokinéticines, dans la circulation sanguine maternelle Il est connu que les femmes ayant fait une prééclampsie sont plus tard, davantage sujettes aux pathologies cardiovasculaires. Récemment, plusieurs études cliniques ont également reporté qu’elles sont aussi susceptibles de développer des troubles de l’attention et de la mémoire, associés à des modifications du tissu cérébral, observées par imagerie médicale, 10 à 20 ans plus tard. L’objectif du projet est donc d'investiguer les mécanismes impliquant les prokinéticines à long terme dans l’apparition des modifications anatomiques cérébrales qui provoqueraient des troubles cognitifs et d’éventuelles pathologies neurodégénératives. Actuellement, ces facteurs sont en cours de certification comme biomarqueurs de la pathologie de la prééclampsie. Donc le but ultime de notre projet est de déterminer s’ils pourraient constituer des cibles thérapeutiques pour traiter la pathologie et ses conséquences à long terme.

Bénéfices attendus

•Les analyses, réalisées précédemment sur des sérums de patientes prééclamptiques, ainsi qu’en provenance d’animaux modèle de la pathologie, suggèrent une implication de la famille des prokinéticines dans le développement de la pathologie grave de la grossesse, qu’est la prééclampsie. •Cette étude in vivo nous permettra de mieux comprendre le rôle des facteurs pro-inflammatoires, que sont les prokinéticines, dans la prééclampsie et sur leurs conséquences à long terme. Enfin ces études nous permettrons de démontrer la valeur thérapeutique des antagonistes des prokinéticines dans le cadre d’un traitement de la pathologie.

Procédures

•les souris gestantes seront traitées par injection (durée : 1 minute), une fois par jour et tous les jours, entre le 7ème et le 17ème jour de la gestation. •Mesure du poids (durée: 5 min) et de la tension artérielle (durée : 20 min) des souris gestantes, tous les 2 jours, pendant 17 jours. • L’IRM des cerveaux sera réalisée 1 fois après la gestation (durée : maximum 2h). •Au moment de l’euthanasie les souris seront analgésiées 30 minutes avant de procéder à l’anesthésie.

Impact sur les animaux

• L’étude implique des injections intrapéritonéales répétées ce qui risquent de provoquer un peu de stress, un léchage de la région d’injection et/ou l’adoption d’une position recourbée suite à l’injection et durant quelques minutes, comme toutes injections chez les souris. •Les souris donnant naissance et allaitant jusqu’au sevrage pourront avoir une perte de poids. •L’enlèvement des souriceaux à J+3 peut représenter un stress pour la mère. •Les mesures de la pression artérielle répétée peuvent provoquer une irritation de la queue avec parfois l’apparition de plaies. •Cette étude porte sur des temps longs (jusqu’à 15 mois après la prééclampsie), des troubles cognitifs, i.e. stéréotypie, pourraient apparaitre.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés pour effectuer soit des dosages sanguins et tissulaires, soit d’une recherche in situ de marqueurs de l’inflammation et du développement de démence cérébrovasculaire.

Remplacement

•Le projet porte sur l’étude des conséquences cérébrales au cours du vieillissement suite à une pathologie de la grossesse, il nous est donc impossible à ce jour de remplacer par un modèle cellulaire la complexité d’interaction entre organes et cellulaires sur la durée qui existe lors de ce processus in vivo. •Ces mécanismes résultent d’interaction entre le placenta et le système neurovasculaire. A ce jour, il n’existe pas de modèle qui puisse reproduire ce contexte in vitro, sur une seule population cellulaire ou des explants en culture. En effet, l’organisme entier offre la possibilité d’étudier les lésions et les réponses inflammatoires, par dosage des cytokines circulantes, et, in situ, au niveau du site inflammatoire, i.e. : le cerveau dans notre projet. •Ce projet nécessite donc l’approche sur des animaux modèles de la pathologie permettant l’étude des mécanismes physiologiques complexes mis en oeuvre.

Réduction

Cette étude se déroule sur une cinétique de 15 mois pour chacun des antagonistes testés, avec 6 points de cinétique. Pour obtenir des résultats statistiquement robustes, chaque groupe de souris comportera 10 souris femelles pour chaque étude. Afin de valoriser totalement les animaux engagés dans cette étude, une étude sera mise en place d’expérimentations in vitro, avec les souriceaux qui vont naitre au cours du projet.

Raffinement

Les animaux femelles sont hébergés en groupe et sans mâles dans un environnement enrichi : tube de cartons, petites maisons en plastique, matériel de nidification, ... L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux hébergés permettent de garantir leur bien-être. L’état de santé des animaux sera surveillé (état général) tout au long de l’expérience et quotidiennement, ce qui nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. •Les modifications de comportement et le degré de mal être des animaux seront surveillés quotidiennement, les points limites seront estimés à l’aide d’une grille d’évaluation du bien-être animal spécifique au projet. Plus l’état de la souris se détériore, plus le score établi dans cette grille augmente. La grille attribue un score suivant l’aspect général, le comportement et la locomotion ainsi que la perte de poids. Des points limites spécifiques à ce projet seront également pris en compte Un arbre décisionnel est mis en place permettant d’intervenir en cas de douleur voir d’euthanasier l’animal, mettant un arrêt à son expérimentation. Dans ce cas les tissus seront prélevés pour être analysés. •Avant les procédures d’IRM et de collecte du sang, les animaux seront analgésiés et anesthésiés.

Choix des espèces

•L’objectif du projet est d’étudier les conséquences de la prééclampsie, c’est à dire de la réaction inflammatoire du placenta au moment de la grossesse, sur le vieillissement du cerveau des années plus tard. Donc le choix de travailler sur un modèle animal est nécessaire pour avoir cette interaction inter-organe et dans le temps. •L’usage de la souris pour ce projet est approprié car comme chez l’humain, la placentation chez la souris est hémochoriale (le sang maternel est au contact direct avec les cellules foetales placentaires). •Par ailleurs, plusieurs études ont montré qu’il existe une grande similitude dans l’expression et la régulation des gènes clés de la placentation chez les deux espèces et que plusieurs facteurs impliqués sont exprimés et régulés de la même façon. •Les travaux de l’équipe, depuis dix ans, ont montré qu’il existe une grande similitude dans l’expression et la régulation des prokinéticines, facteurs inflammatoires étudiés dans ce projet, chez les deux espèces également. •Le projet s’attache à étudier les troubles cognitifs des années après un épisode de prééclampsie, les souris femelles seront étudiées au moment de la prééclampsie (pendant et jusqu’à la fin de la gestation) puis au cours de leur vieillissement, jusqu’à 15 mois post-gestation, ce qui correspond à un âge d’environ 70 ans chez la femme.

1 890 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit l'ablation chirurgicale de 40 % d'un tissu adipeux sous-cutané, suivie d'injections d'une molécule orientant la cicatrisation ou la régénération, avant prélèvement d'organes. Le porteur décrit un suivi du bien-être adapté à l'inflammation provoquée par la chirurgie. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de la régénération d'un organe ne peut se faire que sur des animaux vivants, les hypothèses étant d'abord testées in vitro et in silico.

Objectifs

La réparation tissulaire d’une lésion peut conduire à l’activation de deux processus : la régénération qui correspond à la restauration de la structure du tissu et de sa fonction, ou la cicatrisation qui est caractérisée par un dépôt excessif de matrice extracellulaire(MEC) affectant l’architecture globale du tissu et sa fonction. La faculté de régénérer certains membres ou organes est retrouvée chez les vertébrés non mammifères ou chez des organismes inférieurs tels que la salamandre, le poisson zèbre ou encore le planaire. En revanche, chez les mammifères, les capacités régénératrices sont restreintes à une courte période périnatale. Cette perte de capacités régénératrices post-natales chez les mammifères adultes suggère la mise en place de mécanismes inhibant la régénération au profit des processus cicatriciels. Notre projet consiste désormais à explorer comment les propriétés mécaniques de la matrice extracellulaire contrôlent les processus de régénération chez les mammifères. Ce projet sera développé sur un modèle de lésion du tissu adipeux (lipectomie) chez la souris, puisque notre équipe a déja démontré la capacité de ce tissu à régénérer, sous certaines conditions bien maîtrisées.

Bénéfices attendus

La compréhension du mécanisme de régénération, en particulier la maîtrise de la production de MEC, pourrait permettre d’améliorer la réparation tissulaire chez le mammifère adulte, y compris l'homme, afin de rétablir les fonctions tissulaires après lésion.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une seule intervention chirurgicale permettant d'initier le modèle lésionnel. Il s'agit d'une lipectomie : résection partielle (40%) d'un seul tisu adipeux sous-cutané, réalisée en 10 minutes. Puis tous les animaux seront injectés (maximum 1 minute) avec une molécule pharmalogique afin d'orienter l'issue du modèle vers la régénération ou la cicatrisation et d'en étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires. Celles ci n’excèderont pas 200 μL par voie sous-cutanée ou par voir intra-péritonéale, et leur fréquence (1seule par jour) pourra varier selon les molécules, de J0 à J4, ou bien tous les 3 jours pendant la durée du protocole.

Impact sur les animaux

L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux sur l’état global de santé des animaux, et sera adaptée à l’expérience et aux potentiels effets indésirables des procédures, tels que l'inflammation générée par la chirurgie. Les protocoles sont réfléchis afin d’être le moins douloureux possible pour l’animal (mode et volume d’injection, durée du traitement…) et les études antérieures nous ont permis de mieux appréhender les points limites pour le bien-être des animaux.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour prélevements d'organes.

Remplacement

Même si l’étude de la régénération d’un organe ne peut se faire qu’’en utilisant des animaux vivants, de nombreuses hypothèses sont au préalable testées in vitro et in silico. Le recours à l’animal est donc restreint uniquement aux expériences indispensables.

Réduction

Chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience et d’établir un protocole d’étude adapté à l’obtention de résultats fiables permettant d’atteindre l’objectif, et en évitant la répétition des groupes contrôles indispensable à la validation des résultats. D'après notre expertise le nombre minimum d'animaux pour obtenir des résultats reproductibles et statistiquement interprétables est de 5 animaux par groupe, et doit être répété 3 fois pour obtenir une significativité des résultats. Ce sont également les résultats des simulations dans notre modèle in silico qui nous permet de ne réaliser que les expérimentations les plus pertinentes.

Raffinement

Les conditions d’expérimentation font l’objet d’un travail de raffinement continu dans le but d’aboutir à des procédures de travail définies, et avec une procédure de suivi du bien-être animal adaptée aux expériences. En effet, les animaux ne seront jamais seuls en cage afin de respecter le caractère grégaire de la souris. Nous proposons aussi d’enrichir l’environnement des souris, favorisant le bien-être de l’animal. L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux, adaptée à l’expérience et aux potentiels effets indésirables des procédures, sur l’état global de santé des animaux. Les protocoles sont réfléchis afin d’être le moins douloureux possible pour l’animal (anesthésie gazeuse, mode et volume d’injection, durée du traitement…) et les études antérieures nous ont permis de mieux appréhender les points limites pour le bien-être des animaux. La surveillance des souris sera réalisée tous les jours. Ceci permettra de proposer des soins adaptés, de sortir de l’étude, ou bien d’euthanasier les animaux en cas de comportements anormaux ou de souffrance (points limite : perte de poids, prostration, poil hirsute).

Choix des espèces

Afin d’étudier les processus de régénération, il est indispensable d’étudier les mécanismes mis en place au cours du temps, après lésion tissulaire. Notre laboratoire a montré que le fond génétique, ou bien les récepteurs aux opioïdes jouaient un rôle majeur dans la balance régénération/cicatrisation. Afin d’en étudier les effets de ces paramètres, nous disposons au laboratoire ou par l’intermédiaire de collaborations plusieurs lignées transgéniques de souris tout à fait pertinentes pour mener à bien notre étude. C’est pourquoi l’ensemble de ce projet nécessite l’utilisation de l’espèce mus musculus. Les animaux seront utilisés à l’âge de jeune adulte (de 6 à 8 semaines) afin d’utiliser des animaux à maturité sexuelle. Les procédures décrites dans ce protocole ont déjà été validées sur des animaux de cet âge et les résultats ont été publiés.

142 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur pancréatique leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent chaque jour pendant cinq semaines une injection d'une molécule candidate, la taille de la tumeur étant mesurée deux fois par semaine. Le porteur cite parmi les signes possibles la prostration, l'ulcération de la tumeur, l'automutilation et des vocalises. Il présente le recours à la souris comme "indispensable" et justifie le choix de souris immunodéficientes par un coût réduit et des autorisations moins contraignantes que pour des espèces qu'il dit "plus évoluées".

Objectifs

Le cancer du pancréas est une tumeur maligne très grave. Asymptomatique et métastatique, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement efficace. L’urgence à laquelle la recherche est confrontée nous a amené à développer de nouveaux agents pour combattre ces cancers. Dans ce contexte, des inhibiteurs contre des protéines essentielles dans les tumeurs ont été développé et se sont avérés très efficace sur plusieurs lignées cellulaires dérives des patients. Des résultats prometteurs obtenus, montrent une réduction significative du taux de prolifération cellulaire. L'efficacité de cette famille des molécules est justifiée par son affinité pour une protéine clef dans le processus de carcinogenèse pancréatique. Dans ce contexte, ce projet a l'objectifs d'évaluer si ces molécules ont un effet curatif et sont efficaces pour réduire la tumeur dans ce modèle animal en ciblant ce proteine.

Bénéfices attendus

Notre objectif est de présélectionner la meilleure molécule candidate pour poursuivre nos essais précliniques.

Procédures

Une injection de cellules tumorales (par voie sous-cutanée) sera effectuée. Lorsque le volume de la tumeur est suffisant, les animaux seront traités quotidiennement par une injection d’une solution par voie intrapéritonéale à l’aide d’une seringue de 0.5 mL, aiguille de 27G pendant 5 semaines. L’intervention dure 20-30 secondes. 2 fois par semaine, la taille des tumeurs seront mesurés avec un pied à coulisse. L’intervention dure 20-30 secondes.

Impact sur les animaux

Des signes de maladie peuvent être : cyphose dorsale, prostration, diminution du poids de l’animal, volume tumoral >1,5 cm3, ulcération de la tumeur, automutilation, vocalises. Bien que nous n'avons jamais observé de lésions chez les souris dues à cette procédure, les injections répétées quotidiennenment pourraient générer des lésions cutanées. Nous tenons à souligner que ces inhibiteurs n'ont montré aucune toxicité lors d'expériences précédentes aux doses qui seront utilisées dans ce projet, en traitements quotidiens pendant un mois.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever les tissus pour différents analyses.

Remplacement

Concernant le remplacement, le recours aux animaux est indispensable pour ce projet. De nombreuses données antérieures ont été réalisées sur des cellules en culture, y compris celles provenant de patients humains. Cependant, nous avons besoin d'un modèle animal pour prouver que le composé et ses dérivés induisent un effet antitumoral dans un modèle beaucoup plus complexe proche de l'être humain. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.

Réduction

Toutefois, nous n'utiliserons que le nombre de souris nécessaires pour l'exploitation statistiques des données, à savoir 142 individus (4 groupes de 8 souris pour chaque somposé, 8 souris control pour touts les composés, et 6 souris de plus au cas où certaines souris ne les développeraient pas) conformément à la règle de réduction.

Raffinement

Concernant le raffinement, les souris seront hébergées collectivement (4 à 5 animaux par cage de 530cm 2 ) et le milieu sera enrichi par la présence dans chaque cage de matériel de nidation : en alternance tiges de papier, abris en carton, pelotes de lanières de papier. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Le changement des litières aura lieu une fois par semaine. En ce qui concerne le protocole d'injection, la solution sera chauffée avant l'injection. De plus, nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal: un contrôle quotidien de l'état clinique de nos animaux sera réalisé selon un système d’évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) pour différents critères physiologiques et comportementaux (tableau de score fourni en annexe). Tout animal obtenant un score total supérieur ou égal à 7 ou un score de 3 dans une des catégories sera mis à mort.

Choix des espèces

Les souris immunodéficiences sont des modèles très répandus dans la littérature et établis depuis longtemps. Leur utilisation est simple, peu coûteuse, rapide et permet de s’affranchir d’autorisations plus complexes et restrictives concernant des espèces animales plus évoluées Les animaux seront âgées de 4 semaines au moment de leur réception afin d’obtenir des souris adultes et en pleine forme (poids supérieur à 20g) au moment de commencer l’expérimentation. En effet, nous prévoyons une période d’acclimatation de 7 jours minimum après réception avant d’inoculer les cellules en sous-cutanées puis encore 2 à 3 semaines d’attente pour obtenir une tumeur d’un volume satisfaisant. Le traitement commencera alors sur des souris âgées entre 7 et 9 semaines selon la vitesse de développement de la tumeur.

576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie cérébrale d'une heure, onze injections sur animal éveillé et trois tests comportementaux dont le RNT ne précise pas la nature, pour étudier les neurones impliqués dans le sevrage aux opiacés. Le porteur indique induire une aversion liée au sevrage tout en cherchant à la minimiser, et met les souris à mort pour prélever leur cerveau. Sur le remplacement, il affirme que les modèles cellulaires ne reproduisent pas l'organisation cérébrale et que les souris génétiquement modifiées utilisées n'existent que chez cette espèce.

Objectifs

Ce projet de recherche vise à identifier le rôle des circuits neuronaux participant au développement de troubles cérébraux, en mettant l'accent sur les troubles émotionnelles négatifs induit par la dépendance et le sevrage aux substances aux opiacés. Ce projet est centré sur les récepteurs aux opiacés. Le système opioïde est un système neuromodulateur complexe composé de trois récepteurs (mu, delta et kappa) activés par des peptides opioïdes endogènes. Le système opioïde régule la douleur, les processus de récompense, la régulation des réponses émotionnelles et des réponses au stress. Les altérations de ce système sont centrales dans le développement de troubles addictifs et de l'humeur. L’objectif de ce projet vise à déterminer le rôle des neurones exprimant les récepteurs aux opiacés dans différentes régions cérébrales dans le processus de sevrage aux opiacés.

Bénéfices attendus

Les implications sont à la fois fondamentales et cliniques, car elles nous permetteront une meilleur connaissance des mécanismes moléculaires responsables des états émotionelles négatifs suite au sevrage aux opiacés. Ce projet aura de nombreux bénéfices, en particulier d’identifier les neurones critiques dans le développement de l’état émotionnelle négatif pendant le sevrage aux opiacés. Ceci permettra de caractériser les mécanismes d’adaptation du cerveau à l’exposition répétée aux opiacés, afin d’identifier de nouvelles cibles neuronales pour des traitements pour la prévention et le traitement du sevrage aux opiacés et de faire face à la forte augmentation de la dépendance et de la consommation d’opiacés dans le monde.

Procédures

Procédure chirurgicale sous anesthésie générale 1 fois pendant 1 heure avec une injection d’anesthésiant local et une injection d’analgésique pendant la chirurgie. Injections multiples sur animal vigile pour administrer les traitements, qui fera un total de 11 injections sur animal vigile par souris. Chaque injection sur animal vigile dure 30 secondes. Nous allons effectuer 3 tests comportementaux par souris (chaque test dure entre 6 et 30 minutes).

Impact sur les animaux

Chirurgie stéréotaxique : Pendant la chirurgie, il y a un risque de surdose d’anesthésiant et d’hypothermie due à l’anesthésie. Il existe aussi un risque d’inflammation ou de réouverture du site d’incision,. Injections multiples : Les souris seront injectées il y a donc la possibilité d’irritation du site d’injection. Tests : les tests comportementaux choisis ne posent aucun risque corporel pour l’animal et il y aura un jour de repos entre chaque test. Les symptômes de sevrage seront minimisés en utilisant le plus faible pour induire une aversion. De plus, les tests ne durent pas plus de 30 minutes

Devenir

les animaux seront mis à mort pour prélèvement du cerveau

Remplacement

"Remplacement" : les effets comportementaux des opiacés ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires, qui par nature ne récapitulent ni la complexité de l’organisation cérébrale en réseaux neuronaux complexes. L’étude de ces effets nécessite donc l’analyse d’organismes vivants et entiers. De plus nous utiliserons des souris génétiquement modifiées permettant de cibler les circuits neuronaux répondant aux opiacés, ces modèles n’existent que chez la souris.

Réduction

"Réduction" : les animaux utilisés étant consanguins, la variabilité phénotypique est limitée, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux tout en mettant potentiellement en évidence un effet statistiquement significatif. De plus ces études se feront de manière longitudinale, afin de tester plusieurs paramètres (dépression et anxiété) chez le même animal afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées. Ainsi, au regard des données de la littérature et de la variabilité interindividuelle attendue, les groupes expérimentaux destinés à caractériser les comportements liés aux effets effets aversifs des opiacés seront constitués de 12 souris chacun.

Raffinement

"Raffinement": nous avons choisi d’utiliser des protocoles expérimentaux qui minimisent au maximum l’inconfort des animaux tout en permettant néanmoins d’étudier les réponses comportementales au sevrage à la suite d’une administration d’opiacés. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les souris sont hébergées en groupe sociaux de 3 à 5 animaux par cage, et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger, une ‘’maison’’ en carton, et des papiers absorbants pour faire un nid. Enfin, les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie (anesthésique profond et un anesthésique local autour du site de chirurgie) et les animaux recevront un traitement antidouleur (traitement par un anti-inflammatoire). La température corporelle de l’animal sera maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté jusqu’au complet réveil de l’animal. Les animaux seront ensuite suivis et la souffrance sera évaluée. Des points limites prédictifs seront établis permettant d’interrompre l’étude limitant ainsi la souffrance, la douleur et le stress pour l’animal.

Choix des espèces

La sourisest aujourd’hui utilisée comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies de son génome (99 % identique à celui de l'homme). De plus, le modèle souris permet la création de lignées génétiquement modifiées (délétion/surexpression globale ou locale d’un gène ou d’un marqueur neuronal, manipulation de neurones ciblés). Pour notre étude, l’utilisation de la souris souris génétiquement modifiée est centrale, car elle nous permet d’étudier spécifiquement les neurones qui répondent aux opiacés, de manipuler leur activité et d’en voir les conséquences sur le comportement. Aucun autre organisme ne permet d’utiliser cette approche très puissante. Les modèles étudiés étant des modèles de pathologie neuropsychiatrique se manifestant principalement à l’âge adulte chez l’humain, les études se feront chez des animaux ayant atteint le stade mature de leur développement, c’est à dire au minimum 2 mois pour les modèles souris.

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un antibiotique dans l'eau puis un gavage de bactéries E. coli, avant des traitements à base de phages administrés par gavage trois fois par semaine pendant deux semaines, le côlon étant ensuite prélevé. Le porteur précise que les souris sont génétiquement modifiées et développent spontanément un cancer colorectal, mais affirme arrêter l'expérience avant que la maladie n'affecte leur état. Sur le remplacement, il indique avoir mené des essais in vitro mais juge l'étape in vivo "nécessaire" pour vérifier l'efficacité du traitement.

Objectifs

Les Escherichia coli (E. coli) sont des bactéries colonisant naturellement le tractus digestif. Ces bactéries sont dans la plupart des cas inoffensives. Cependant, elles ont tendance à céder et à acquérir du matériel génétique pouvant dans certains cas les rendre pathogènes pour l’Homme. Ce matériel génétique peut être composé de facteurs de virulences (toxines par exemple) et/ou de nombreux gènes de résistance aux antibiotiques rendant leur éradication extrêmement difficile voir dans certains cas impossible (bactéries dites multi-résistantes). A titre d’exemple, Santé publique France estime pour l’année 2015 à 125 000 le nombre d’infections par des bactéries multi-résistantes aux antibiotiques en France et à plus de 5 500 le nombre de décès imputables à ces bactéries. Ces chiffres étant en constante augmentation, de nouvelles méthodes d’éradication de ces bactéries sont nécessaires pour continuer à traiter efficacement les patients. Le projet aura comme objectif d’éliminer le portage digestif des E. coli possédant soit des gènes codant pour des toxines soit des gènes de multi-résistance aux antibiotiques. Dans ce projet, nous utiliserons au maximum 220 souris. Les animaux seront hébergés dans des cages standards avec un accès illimité à l’eau et à la nourriture et le milieu sera enrichit à l’aide de maisons en plastique. Un suivi quotidien des animaux sera effectué de manière à repérer toute détresse animale.

Bénéfices attendus

D’une façon globale, ce projet apportera la preuve de concept in vivo que notre traitement peut être une excellente approche pour éliminer le portage digestif de bactéries E. coli indésirables (producteurs de toxine et/ou multi-résistants aux antibiotiques). La production de notre traitement décolonisateur testé est peu couteuse et extrêmement facile à mettre en place (son administration est elle aussi extrêmement simple). Ainsi, si la preuve de concept de leur pourvoir décolonisant sur nos bactéries modèles s’avère être un succès, il serait alors envisageable d’imaginer de développer chez des patients porteurs de bactéries similaires cette stratégie thérapeutique.

Procédures

Les animaux seront tous gavés, ce qui représente un maximum de 220 souris. Le gavage se fera sur animal vigile par du personnel expérimenté, habitué à cet acte qui hormis la contention n'induit aucune douleur à l'animal et ne dure que quelques secondes. En ce qui concerne la fréquence des gavages, les animaux recevront tous 1 gavage des souches bactériennes d'intérêt. Les traitements décolonisateurs seront administrés quand à eux 3 fois par semaine pendant 2 semaines (110 souris). Si les expériences sont un succès, nous les répèterons en administrant le traitement décolonisateur seulement 1 seule fois (un maximum de 110 souris).

Impact sur les animaux

Les animaux se verront administrer un antibiotique via l'eau de boisson. Cette pratique est très fréquente pour faciliter l'implantation intestinale de souches bactériennes d'intérêts et n'entraine aucune gêne chez les animaux. L'administration des bactéries se fera par gavage. Cet acte n’induit pas de nuisance particulière hormis un stress léger lié à la contention de l’animal. Les souches bactériennes utilisées sont couramment employées au laboratoire et n’induisent aucun stress ou dégradation de l’état général de l’animal. Les effets indésirables résident plus dans le modèle murin lui-même, puisque les souris utilisées sont altérées génétiquement et développent spontanément un cancer colorectal. Cependant l’expérience sera arrêtée bien avant que la pathologie ne se traduise par un impact sur le bien-être des animaux.

Devenir

Les animaux auront reçu des antibiotiques, des bactéries et des phages. C'est pour cela qu'ils seront mis à mort. De plus, nous voulons nous assurer que les phages ont été capable d'éliminer les bactéries associées à la muqueuse intestinale et pour cela, les côlons doivent être récupérés et les animaux mis à mort.

Remplacement

Notre approche expérimentale inclut une première analyse in vitro ayant démontré l’efficacité des traitements décolonisateurs utilisés in vivo. Cependant, la densité du microbiote intestinal est telle dans le tractus digestif, que l’étude de l’efficacité des traitements décolonisateurs in vivo est nécessaire pour nous assurer qu’ils sont réellement efficaces.

Réduction

Nous n’utiliserons que le nombre nécessaire d’animaux pour la bonne interprétation des données. D’expérience, nous savons que les expériences de colonisations intestinales par des E. coli nécessitent 10 animaux/lot (il y a une grande variabilité en termes de colonisation et moins de souris rend l’interprétation impossible). En effet, le laboratoire a publié des données comparant chez des souris prédisposées à développer le cancer colorectal, la colonisation d’une souche de E. coli de laboratoire à celle d’une souche de E. coli associée au cancer colorectal chez l’Homme. Les groupes comportaient entre 14 et 17 animaux. Par ailleurs, le laboratoire réalise de nombreuses infections bactériennes de souris dans le cadre de l’étude du pouvoir inflammatoire des E. coli associés à la maladie de Crohn, une maladie inflammatoire chronique de l’intestin. Bien souvent les chiffres de colonisations présentent des variations et le nombre d’animaux utilisés s’en trouve impacté. Des groupes de 8-12 animaux sont fréquemment constitués. Nous prévoyons une administration répétée ou unique des traitments décolonisateurs. Les epxériences d'administration unique ne seront faites que si l'administration répétée montre un effet bénéfique. Si ce n'est pas le cas, l'expérimentation prenda fin.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans une salle climatisée avec un cycle jour/nuit de durée égale et un taux d'humidité constant. Les animaux auront libre accès à la boisson et à la nourriture. Le milieu sera enrichit à l’aide de maisons en plastique. Un suivi quotidien des animaux sera effectué de manière à repérer toute détresse animale. Le poids des souris sera également suivi avec attention car c’est un très bon marqueur de pathologies intestinales et de la sévérité d’une diarrhée. Nous utiliserons également un système de score de manière à limiter au maximum la souffrance et définir des points limites. Si un animal présente des signes de douleur, un antalgique lui sera administré par gavage pour en contrôler la prise. Les expériences seront réalisées en toute sécurité, notre animalerie permettant notamment la manipulation de pathogènes.

Choix des espèces

Pour les souris de fond génétique sauvage, nous gaverons des animaux âgés de 6-8 semaines. C'est un âge classiquement utilisé dans les expériences de gavage et d'étude de la colonisation intestinale par les bactéries. Pour les souris prédisposées à développer le cancer colorectal, nous gaverons des animaux âges de 6 semaines. C'est l'âge classique pour ce modèle.

72 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent chaque jour pendant 14 jours une injection sous-cutanée d'isoprénaline pour provoquer un stress cardiaque, une partie recevant en fin de protocole une injection d'un inhibiteur, avant prélèvement du cœur. Le porteur indique que le traitement augmente la fréquence et le débit cardiaques et que l'inhibiteur peut provoquer une hypertension. Sur le remplacement, il conclut qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier le remodelage cardiaque et qualifie le recours aux animaux d'"indispensable".

Objectifs

Le stress adrénergique cardiaque peut entraîner un remodelage physiologique du cœur, comme on l'observe en réponse à l'entraînement physique. Cependant, lorsque ce stress est chronique, il conduit à un remodelage cardiaque défavorable qui est associé à un dysfonctionnement. À ce jour, le principal traitement efficace pour limiter le remodelage myocardique consiste à réduire la surcharge de pression. Par conséquent, il est impératif de mieux comprendre les voies de signalisation qui sous-tendent les (mauvaises) adaptations cardiaques dépendantes du stress adrénergique afin de fournir des pistes pour le développement de nouvelles thérapies. En réponse à la stimulation des recepteurs β-adrénergiques, le myocarde produit des quantités accrues d'oxyde nitrique (NO). Jusqu'à récemment, on considérait que la signalisation du NO impliquait principalement l'activation des voies de la protéine kinase dépendante de la guanosine monophosphate cyclique (GMPc) (GMPc-PKG). Cependant, le NO peut également se fixer directement de manière covalente aux résidus thiol de cystéines, un processus appelé Snitrosylation (SNO). Ce second mécanisme a été moins étudié et fait l'objet du présent projet. La SNO est une modification post-traductionnelle réversible majeure impliquée dans la régulation de l'activité des protéines ; il permet également de protéger les protéines contre l'oxydation irréversible des fragments thiols. Ce processus a été bien décrit dans les mitochondries où il est associé à une production réduite d’espèces réactives de l’oxygène. Les myofilaments cardiaques sont également rapportés comme étant sensibles à l'oxydoréduction et, par conséquent, potentiellement affectés par la signalisation du NO. La question est de tenter de mieux comprendre comment la SNO des protéines myofilamentaires est impliquée dans la régulation de la machinerie contractile cardiaque. L’objectif du projet NitrosoCard est de tester l'hypothèse selon laquelle, en réponse au stress adrénergique, la eNOS (enzyme responsable de la synthèse de NO) peut se relocaliser vers les mitochondries pour moduler la SNO de protéines clés dans la régulation de la réponse du cœur à une situation de stress.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux identifier les voies de signalisation impliquées dans la réponse du coeur à un stress adrénergique. En effet, il est bien connu qu'un stress adrénergique transitoire peut aboutir à une adaptation bénéfique du coeur alors qu'un stress chronique peut conduire à un remodelage cardiaque défavorable. Néanmoins, à ce jour, les mécanismes cellulaires permettant d'expliquer qu'un même stimulus puisse aboutir à des réponses adaptatives différentes n'ont jamais été identifié

Procédures

Les animaux seront traités quotidiennement, pendant 14 jours, avec un agoniste des récepteurs β-adrénergiques, l’isoprénaline, par injection sous-cutanée (une injection sous cutanée tous les jours pendant 14 jours). A la fin des 14 jours, certains animaux (groupe taités avec l'inhibiteur des NOS, L-NAME) reçoivent une dernière injection cette fois en intrapéritonéale.

Impact sur les animaux

Le traitement sub-chronique à l’isoprotérénol peut avoir des conséquences sur l’état de bien-être des animaux (principalement augmentation de la fréquence et du débit cardiaque). Les animaux seront donc surveillés, tout particulièrement dans les heures qui suivent l’injection sous-cutanée d’isoprotérénol, par un personnel habilité et formé pour ce type d'acte expérimental. L'injection de L-NAME peut aussi être à l'origine de stress (hypertension artérielle). Dans ce cas aussi, les animaux seront particulièrement surveillés dans les heures suivant l'injection. Les autres expérimentations seront réalisées sur des organes, des cellules, des myofilaments isolés et necessiteront l'euthanasies des animaux avant le prélèvement des tissus.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement du coeur et ainsi permettre l'isolement primaire de cardiomyocytes, de mitochondries ou des analyses biochimiques.

Remplacement

Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro pour évaluer l’impact du stress adrénergique sur le remodelage myocardique. Par ailleurs, l’utilisation d’animaux permet d'étudier des mécanismes cellulaires qui ne peuvent être analysés chez le patient. Par conséquent l'utilisation de modèles animaux apparait comme indispensable à la réalisation de ce protocole.

Réduction

Un grand nombre d'expérimentations sera réalisé sur des cellules ou des mitochondries isolées. Cette approche permet, en contrôlant un grand nombre de paramètres et ainsi en réduisant la variablité d'une expérience à l'autre, de limiter le nombre d'animaux utilisés. De plus, la taille du coeur du rat permet de collecter une grande quantité de matériel biologique et permettra, à partir d'un même coeur de réaliser diffrentes évaluations (biochimie, immuno-précipitation, protéomique).

Raffinement

Les animaux sont stabulés une semaine après leur arrivée, avant toute procédure, afin de s’acclimater à leurs conditions d’hébergement. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les rats sont hébergés en cages de 3 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum et un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont visités quotidiennement par un animalier formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents point limites. Ainsi, en se basant sur cette grille, un score sera attributé à chaque animal afin d'évaluer son état de bien être ou de souffrance. Les résultats de cette observation permettront, en se basant sur un arbre décisionnel, d'opter, si necessaire, soit pour une stratégie d'analgésie soit pour la mise de la mort de l'animal.

Choix des espèces

Le rat est un modèle de choix car la physiologie cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme. Le modèle rongeur a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in vivo. L’utilisation des même tissus (coeur) ex vivo puis pour des analyses biochimiques permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours du protocole expérimental. Les animaux seront utilisés à un stade jeune adulte (rats de 12-15 semaines) afin de pouvoir travailler sur un système cardiovasculaire mature et sans facteurs de complications

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection intraveineuse d'un vecteur de thérapie génique, des prélèvements sanguins répétés, et selon les groupes une pompe implantée chirurgicalement sous la peau ou des injections d'anticorps trois fois par semaine pendant quatre semaines. Le porteur indique vouloir moduler la réponse immunitaire dirigée contre le vecteur, afin d'améliorer les traitements de thérapie génique. Il affirme que le rat Sprague-Dawley est le seul petit modèle reproduisant cette réponse et que le modèle animal reste "incontournable".

Objectifs

La thérapie génique consiste à introduire un gène thérapeutique dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés (AAV) constituent des outils de choix. Une seule injection de ces vecteurs permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Néanmoins, malgré de récents succès, un des facteurs majeurs pouvant limiter l’efficacité du transfert de gène in vivo est la réponse immunitaire dirigée contre ce vecteur. Cette réponse immune délétère s'explique, en partie, par le fait que les humains sont naturellement infectés au cours de leur vie par des virus AAV. L’initiation ou non de cette réponse immune cellulaire semble être dépendante de nombreux facteurs (voie d'administration, dose injectée, tissu cible, transgène thérapeutique...) et son impact sur l’efficacité du transfert de gène reste à ce jour difficile à prédire. Nous avons récemment développé un modèle animal dans lequel nous observons une réponse immunitaire dirigée contre ce vecteur. Ce modèle semble reproduire la réponse immune observée chez l’humain. La génération de ce modèle animal ouvre un champ d’applications important pour aider au développement de médicaments de thérapie génique innovants plus efficaces et plus sûrs sur le plan immunologique pour prévenir un rejet du transfert de gène. Ainsi, fort de ces constats, nous proposons de tester, dans notre modèle de rats, 2 stratégies pour moduler la réponse immunitaire dirigée contre le vecteur et ainsi prévenir le rejet lié au transfert de gène. La première stratégie consistera à utiliser une molécule (l’interleukine 34 (IL-34)) pour favoriser l’émergence de cellules immunitaires (macrophages et lymphocytes T) régulatrices impliquées naturellement dans la modulation des réponses immunitaires. La seconde stratégie repose sur le constat que les cellules effectrices humaines expriment fortement un marqueur de surface (le CD45RC) à l’inverse des cellules aux propriétés régulatrices Un anticorps ciblant ce marqueur spécifique sera utilisé pour moduler l’action des cellules immunitaires effectrices. L’objectif scientifique de ce nouveau projet est de développer une stratégie pour moduler la réponse immune dirigée contre le vecteur de thérapie génique.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer une méthode pour prévenir la réponse immunitaire anti-vecteur et permettre ainsi d’améliorer les traitements de thérapie génique à l’aide d’AAVr.

Procédures

Les rats recevront une injection unique de solution saline ou d’un vecteur viral en Intraveineuse. La durée totale d’intervention est d’environ 5 à 10 mn. Des prélèvements sanguins sous anesthésie seront réalisés régulièrement pendant toute la durée du protocole soit 7 pour les suivis 1 mois et 10 pour les suivis 3 mois. Le temps d’intervention est d’environ 5 mn. Pour les animaux inclus dans la première stratégie d’immunomodulation, des pompes seront placées chirurgicalement sous la peau du dos des rats permettant de diffuser un immunomodulateur sur plusieurs jours. Le temps d’anesthésie, de préparation du champ opératoire et de la chirurgie est d’environ 30 mn. La recharge s’effectuera tous les 15 jours à travers la peau et s’effectue en moins de deux minutes sous anesthésie. Pour les animaux inclus dans la deuxième stratégie d’immunomodulation, les anticorps seront injectés en intrapéritonéale 3 fois par semaine pendant 4 semaines. En cas de stress marqué, dû à la répétition des procédures, les animaux seront anesthésiés, le temps de réaliser l’injection soit environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Les animaux ressentiront une légère douleur au point du prélèvement sanguins et au point d’injection de l’intraveineuse et de l’intrapéritonéales dû à la pénétration de l’aiguille. La répétition des injections intrapéritonéales peut engendrer un stress pour les animaux. Les animaux ressentiront une douleur modérée dû à l’incision de la peau pour la mise en place de la pompe rechargeable.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post-mortem.

Remplacement

L’enjeu majeur des protocoles de thérapie géniques développés à l’aide d’AAV consiste à s’affranchir de la réponse immunitaire anti-vecteur observée chez l’humain. À ce jour, il n’est pas possible de reproduire in vitro un système immunitaire et encore moins de le combiner avec des cellules d’autres organes (également transduits par le vecteur de thérapie génique). Le modèle animal demeure donc incontournable. Pour ce protocole précis, nous avons choisi un modèle de rat Sprague-Dawley, car c’est le seul modèle de petit animal, qui développe une réponse immunitaire anti-AAV similaire à celle observée chez l’humain.

Réduction

Chez l’Homme, l’apparition d’une réponse immune dirigée contre le vecteur de thérapie génique ainsi que son intensité varient d’un individu à l’autre. Cette variabilité a également été observée dans une étude précédente réalisée au laboratoire où environ 60% des animaux injectés développent une réponse immunitaire. De manière à avoir des résultats statistiquement interprétables, le nombre d’animaux par groupe devra être porté à au moins 10 .

Raffinement

Le bien-être animal et le raffinement des procédures passera par de bonnes conditions d’hébergements, un suivi quotidien des animaux, l’instauration de points limites pertinents et précoces ainsi que la mise en place de mesures adaptées (anesthésie, analgésie etc.). En cas d’observation d’un mal être de la part de l’animal, un examen clinique sera réalisé à l’aide d’une grille de score afin d’évaluer le degré de souffrance de l’animal. Selon le score enregistré et l’arbre décisionnel, certaines actions seront mises en place comme l’utilisation d’analgésique, une surveillance accrue, ou une euthanasie.

Choix des espèces

Dans la majorité des études de thérapie génique ou d'immunologie, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. L'utilisation du rat est justifiée à la fois par la preuve de concept de modélisation de la réponse immune anti-AAV ainsi que par la possibilité de constituer des groupes suffisamment larges pour effectuer des analyses statistiques. De plus, des études fonctionnelles réalisées in vivo dans un contexte de transplantation d’organes chez le rat mettent en évidence les propriétés immunorégulatrices de l’anti-CD45RC et de l’IL34. Le but de cette étude est d’apporter une preuve de concept de l’effet de ces molécules sur la réponse immunitaire dirigée contre le vecteur dans un contexte de transfert de gène. Les rats seront injectés entre 6 et 10 semaines, à l’âge adulte afin d’avoir un système immunitaire mature.