Procédures modérées

512 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans la patte des injections d'agents pro-inflammatoires comme l'adjuvant complet de Freund ou la formaline, puis leur douleur est mesurée par l'observation des léchages, morsures et secouements pendant quatre-vingt-dix minutes, et par le test des filaments de von Frey. Le porteur décrit ces modèles de douleur comme des standards de la littérature et indique vouloir confirmer in vivo le rôle d'un gène repéré sur des neurones en culture. Les retombées annoncées, des traitements contre les douleurs mécaniques de l'arthrose ou de la polyarthrite, restent une perspective.

Objectifs

Notre projet a pour but d’identifier des acteurs moléculaires impliqués dans la sensibilité mécanique douloureuse afin de définir de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter les désordres liés à la perception exagérée des douleurs d’origine mécanique. Nous avons identifié des gènes candidats impliqués dans la transduction mécanique, i.e. la conversion des stimulations mécaniques en signaux biologiques, dans les neurones sensoriels dont font partie les neurones nociceptifs impliqués dans la douleur. Nous avons ensuite testé ces candidats in vitro et identifié un gène dont l'inhibition diminue significativement les réponses des neurones nociceptifs aux stimulations mécaniques. Nous voulons confirmer ces résultats in vivo en testant l’impact de ce gène sur la perception de la douleur par la réalisation de tests comportementaux. Ces tests seront réalisés en conditions inflammatoires (induites par injection d’adjuvent complet de Freund (CFA) ou de Formaline), qui sont des modèles de douleur établis dans la littérature scientifique, sur des souris génétiquement modifiées.

Bénéfices attendus

Cette étude pourrait être à l’origine du développement de traitement ciblant des types de douleurs mécaniques qui interviennent dans de multiples maladies et syndromes chroniques ou inflammatoires, telles que la polyarthrite rhumatoïde ou l’arthrose qui touche 10 millions de français.

Procédures

Les animaux recevront des injections d'agents proinflamatoires dans la patte ou dans la zone tibio-tarsale. Les animaux ayant reçu une injection dans la patte seront ensuite placés en box d’observation afin de mesurer la durée de comportements douloureux spontanés (léchage, morsure, secouements de la patte) sur une durée maximum de 90 minutes. Les animaux ayant reçu une injection dans la zone tibio-tarsale seront testés avec des fialments de von Frey aux jours 7, 10 et 21 post-injection afin de determiner leur sensibilité mécanique. Le test dure environ 15 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les modèles inflammatoires utilisés dans ce projet constituent les standards de ce type d'étude et sont très bien établis dans la littérature. Ils produisent des phénotypes de douleur légère ou modérée chez l'animal, ce qui est l'objectif du projet de tester l'implication du gène cible dans la douleur. Les procédures de test comportemental (box d'observation ou test de sensibilité mécanique) peuvent induire un stress limité chez l'animal, qui sera minimisé par les temps d'acclimatation.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés car ne pouvant plus servir dans de nouvelles procédures. Un certain nombre d'animaux seront utilisés pour le prélèvement des ganglions rachidiens (DRG) pour l'enregistrement électrophysiologique in vitro.

Remplacement

La sensibilité / douleur mécanique et thermique ne peuvent s'évaluer in fine que sur des animaux vivants. Ce travail sur l'animal vivant s'inscrit donc dans la continuité de nos expériences et des résultats que nous avons obtenus in vitro.

Réduction

Réduction du nombre d’animaux sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats. Le nombre d’animaux utilisés pour cette étude est paramétré afin de pouvoir effectuer des tests statistiques afin d’observer des différences significatives sur les paramètres étudiés. Lors de la réalisation des protocoles, le maximum d’informations sera récolté afin de restreindre le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Raffinement : le nombre de souris par cage respectera les directives européennes du 1er février 2013, sachant que le projet utilise de jeunes adultes entre 20 et 25g, nécessitant 70 cm2 par individus dans les cages, soit 5 animaux par cage de 374 cm2. Une définition précise des points limites et une surveillance adaptée des animaux permettra d’éviter la souffrance des animaux. Ils permettront de définir la nécessité d’un traitement symptomatique (analgésique, modification du protocole expérimental). Les expériences de comportement ont été choisies afin de limiter au maximum la contention de l’animal (animal libre de ses mouvements), et l’environnement des animaux sera enrichi avec des dômes en cartonainsi que des nids de papier kraft (sizzle pad).

Choix des espèces

Nous utilisons le modèle souris, du fait de l'existence de souris transgéniques dont le gène d'intérêt a été éteint (souris KO), et pour lequel les tests comportementaux évaluant la perception à la douleur d’origine mécanique et thermique sont établis et documentés dans la littérature scientifique. Nous pourrons ainsi déterminer l’effet spécifique de ces gènes dans la sensibilité mécanique et thermique dans des modèles de douleur. Les souris qui seront utilisées dans ce projet seront âgées de 6 à 8 semaines ce qui correspond à un stade jeune adulte. Les souris ont ainsi fini leur croissance et présentent une sensibilité mécanique et thermique assez stable entre 6 et 8 semaines.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises à un régime riche en graisse, elles reçoivent huit poudres de tomate différentes pendant douze semaines, avec prélèvements sanguins sur animal éveillé, tests de tolérance au glucose et à l'insuline, perçage des oreilles et isolements répétés. Le porteur décrit un objectif appliqué, améliorer les effets santé de la tomate en combinant choix de variétés, pratiques de culture et technologie alimentaire. Il affirme que l'étude d'une supplémentation alimentaire ne peut s'envisager que sur un modèle vivant.

Objectifs

La tomate est une des productions agricoles les plus importantes en termes de volume de production et de portée économique. Sa consommation, notamment sous forme de poudre de tomate, est associée à des effets bénéfiques pour la santé métabolique, mais son profil nutritionnel et sa teneur en micronutriments dépend du génotype et des conditions de production. L’objectif du projet est de mieux comprendre l’impact du génotype de tomate et du déficit d’irrigation sur la qualité nutritionnelle des poudres de fruit et les conséquences que cela va engendrer en terme de santé métabolique chez la souris. Pour ce faire, 4 génotypes de tomate ayant subit 2 niveaux d'irrigation et présentant des profils contrastés en phytomicronutriments seront lyophilisés (8 poudres différentes en tout) puis administrés à 180 souris C57Bl/6J (8 groupes de 9 souris mâles et 9 souris femelles supplémentés et 2 groupes de 18 souris contrôles) durant 12 semaines, dans le cadre d'un régime riche en graisse. Une prise de sang sera réalisée à 6 semaines, ainsi qu'un test de tolérance à l'insuline à la 9eme semaine et un test de tolérance au glucose ainsi qu'un test de perméabilité intestinale à la 10eme semaine. Les fèces seront également récoltés et le microbiote des animaux sera analysé.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux évaluer l’impact du génotype et des conditions de culture de poudre de tomate sur les effets sur la santé métabolique. Ce projet s’insère dans un projet plus large qui permettra in fine d’améliorer les effets santé de la tomate avec une combinaison innovante du choix de génotypes, de pratiques culturales et de technologie alimentaire.

Procédures

Des prélèvements de sang sur un animal vigile seront réalisés. Pour ce faire, les animaux seront mis sous contention durant environ 2 minutes. Un test de tolérance à l'insuline et un test oral de tolérance au glucose seront pratiqués. Le déroulé du test nécessite ensuite une mise en isolement des animaux de 2 heures afin de suivre l'évolution de leur glycémie. Un test de perméabilité intestinale sera réalisé. Lors de la procédure, 3 recueils de fèces nécessitant d’isoler temporairement (environ 30 minutes) l’animal seront effectués.

Impact sur les animaux

Stress social lié à l'isolement de l'animal de ses congénères. Douleurs possibles lors des interventions de prélèvements sanguins, de perçage des oreilles pour l'identification des animaux lors des injections d'insuline. Ces nuisances ou effets indésirables toutes temporaires et réversibles sont associés à des mesures de raffinement (enrichissement de la cage, manipulation régulière des animaux, soins apportés si nécessité).

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'intérêt seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques) et de démontrer les effets métaboliques de la supplémentation en poudre de tomate.

Remplacement

L’étude d’une supplémentation en poudre de tomate sur la santé métabolique ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Les souris C57Bl/6J sont un modèle largement utilisé et reconnu pour les études sur le métabolisme.

Réduction

Le nombre d'animaux (18 par groupe, soit 9 par sexe) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes de manière sexe-dépendante, notamment en ce qui concerne la prise de poids. Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé sur la base d’une étude similaire sexe-dépendante et déterminée avec la variation du poids (variable quantitative) comme résultat principal de l’étude.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 3, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en fonction des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arrêt.

Choix des espèces

Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.

82 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des rats porteurs de la mutation de la myopathie de Duchenne et des rats sains reçoivent une injection intraveineuse d'un vecteur de thérapie génique, puis des prélèvements sanguins mensuels et un prélèvement terminal, pour tester de nouveaux promoteurs censés cibler le traitement sur les muscles. Le porteur justifie le choix du rat en écartant la souris, au phénotype jugé trop peu marqué, et le chien, jugé trop lourd à manipuler. Les bénéfices annoncés pour les patients, des doses plus faibles et moins de toxicité, sont renvoyés au conditionnel.

Objectifs

La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique liée au chromosome X affectant environ 1 garçon sur 5000 à la naissance. Elle est due à des mutations dans le gène DMD qui code pour une protéine appelée Dystrophine. La Dystrophine est essentielle au fonctionnement et au maintien de l’intégrité de l'ensemble des muscles de l'organisme (y compris le coeur). L’absence de Dystrophine dans les muscles provoque leur dégénérescence progressive, une faiblesse musculaire, la perte de la marche avant 15 ans, l’apparition de déficiences respiratoire et cardiaque, et, finalement une mort prématurée. Aucun traitement n’est disponible à ce jour pour la DMD. La thérapie génique, qui vise à corriger ou remplacer le gène DMD est aujourd’hui une approche prometteuse pour le traitement de cette maladie. Pour réaliser un transfert de gène efficace, il est possibile d'utiliser des vecteurs viraux dérivés des Virus Adéno-Associés (AAV) produits en laboratoire dans des systèmes cellulaires. Ils assurent un transfert de gène thérapeutique sûr et efficace dans différents tissus/organes (oeil, muscle, foie ou cerveau). Les AAV sont des produits thérapeutiques performants mais des essais précliniques et cliniques ont montré des limites à leur utilisation, avec notamment la nécessité d'utiliser de fortes doses, et un transfert de gène dans certains tissus non ciblés (tissus non musculaires), avec un risque de toxicité associé. Une approche pour contrer cet effet secondaire indésirable des vecteurs AAV repose sur l'utilisation, dans ces vecteurs AAV de séquences d'ADN particulières (appelées promoteurs "tissus-spécifiques"), qui vont permettre de restreindre le traitement uniquement dans les tissus ciblés dans la pathologie à traiter, soit, dans le cadre de la Dystrophie Musculaire de Duchenne, dans les muscles squelettiques et le coeur. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité et la spécificité de nouveaux promoteurs "muscle-spécifiques" portés au sein de vecteurs AAV. Cette évaluation se fera chez le rat DMDmdx, modèle animal pertinent de la DMD, mais également chez le rat sain, afin d'évaluer les potentielles différences d'activité de ces promoteurs entre un tissu pathologique et un tissu sain.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra d'identifier un (ou plusieurs) promoteurs "muscle-spécifiques" et de rendre les traitements utilisant les vecteurs de thérapie génique de type AAV beaucoup plus sécuritaires et plus efficaces: plus sécuritaires via le ciblage du traitement uniquement dans des tissus ciblés (ici les muscles), et plus efficaces car permettant d'obtenir un effet théraputique à une plus faible dose de vecteur AAV que celles actuellement utilisées. Une réduction des doses à injecter permettra de réduire la toxicité associée à l'injection de ces fortes doses, et de réduire le coût du traitement. L'identification de tels promoteurs "muscle-spécifiques" aura une application directe pour le traitement des patients atteints de DMD à l'aide de vecteurs AAV. De plus, si ces promoteurs montrent la même efficacité dans les muscles sains et dans les muscles dystrophiques, il pourra alors être envisagé de les utiliser dans des vecteurs AAV thérapeutiques visant à traiter d'autres types de maladies musculaires.

Procédures

(i) Injection intraveineuse réalisée dans une veine caudale: geste réalisé une fois par animal sous anesthésie. Durée de l'intervention: maximum 10min. (ii) Prélèvements sanguins au niveau d'une veine jugulaire le jour de l'injection, puis une fois par mois jusqu'à la mise à mort de l'animal (2 prélèvements pour les animaux suivis 2 mois post-injection, et 4 prélèvements pour les animaux suivis 4 mois post-injection). Prélèvements effectués sous anesthésie, pour un volume correspondant à 7.5% maximum du volume sanguin circulant de l'animal. Durée de l'intervention: maximum 10min. (iii) Prélèvement sanguin terminal au niveau de la veine cave. Ce prélèvement précèdera la mise à mort des animaux.

Impact sur les animaux

(i) L'injection intraveineuse réalisée dans une veine caudale se fera sous anesthésie et ne provoquera donc pas de stress ou de douleur aux animaux. Les animaux seront surveillés après leur réveil par un examinateur. La récupération devrait être rapide. Par ailleurs, l’injection intraveineuse d’un vecteur viral chez le rongeur est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable. Il a été en effet documenté dans de nombreuses études que l’injection systémique d'un tel vecteur chez le rongeur est très bien tolérée. (ii) Prélèvements sanguins mensuels au niveau d'une veine jugulaire: les animaux pourraient être stressés par les anesthésies, mais celles-ci seront espacées d'au moins 4 semaines, et les animaux seront surveillés après leur réveil par un examinateur. La récupération devrait être rapide. (iii) Prélèvement sanguin terminal au niveau de la veine cave : pas de stress ou de douleur pour les animaux, puisque cet examen sera réalisé sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement précèdera la mise à mort des animaux.

Devenir

A l'issue de la procédure décrite dans ce projet, tous les animaux de cette étude seront euthanasiés afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses moléculaires et immunohistologiques nécessaires au projet. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l'animal.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents tissus: muscle squelettique, coeur, foie et autres tissus majeurs). Ce projet, qui vise à évaluer l'efficacité et la spécificité d'éléments géniques régulateurs, à la fois dans un contexte malade (DMD) et un contexte sain, et dans plusieurs tissus différents, ne peut donc être réalisée in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Il est basé sur notre expérience précédente de précédents projets sur le modèle de rats DMDmdx, lors desquels des résultats d'analyses moléculaires et immunohistologiques cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de cette taille. Pour les rats DMDmdx, nous nous laissons la possibilité d'inclure un animal supplémentaire par groupe (avec un maximum de 10 animaux DMDmdx supplémentaires sur l'ensemble de l'étude), en cas de sacrifice prématuré d'un animal du fait de l'évolution de la maladie chez ces animaux avec phénotype dommageable.

Raffinement

Le bien-être animal passera notamment par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu (mise à disposition de tunnels en cartons ou PVC, frisottis de papier, bûchettes de bois), un hébergement à deux animaux (par groupe expérimentaux), accès à l’eau et à l’alimentation à volonté. 2) un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative) 4) Afin d'améliorer la réactivité du personnel animalier, une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).

Choix des espèces

Il existe un modèle de rat possèdant un défaut génétique dans le gène codant pour la protéine Dystrophine, le rat DMDmdx. Dans ce modèle animal de la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD), l’expression de la dystrophine est nulle et le phénotype sévère. Les modèles animaux atteints de cette maladie les plus classiquement utilisés : souris déficientes en dystrophine (souris mdx) et chien Golden Retriver déficient en dystrophine (chien GRMD), présentent des limites pour les projets pré-cliniques : -La souris mdx ne reproduit que partiellement les lésions tissulaires avec un phénotype peu marqué. -Le chien GRMD présente des lésions tissulaires proches de celles des patients atteints de la Dystrophie Musculaire de Duchenne et un phénotype sévère, mais reste un modèle "gros animal" lourd à manipuler. Le rat DMDmdx est donc un modèle intermédiaire avec un bon reflet de la pathologie humaine, tout en présentant moins de limitations. Afin de comparer les résultats obtenus dans un contexte sain et un contexte dystrophique, des rats sains de type Sprague Dawley (même fond génétique que les rats DMDmdx) seront utilisés. Les animaux seront injectés à l'âge de 1 mois au niveau de la veine caudale. C'est un âge auquel les animaux sont considérés comme "juvéniles", et mimant donc le stade auquel des patients DMD pourraient être injectés lors d'un futur essai clinique (enfants ou jeunes adolescents, pré-pubères). Les animaux injectés seront ensuite suivis sur une durée de soit 2 mois, soit 4 mois après injection pour documenter l’efficacité du traitement à 2 temps différents. Ce planning nous garantira de pouvoir effectuer l’intégralité du protocole chez tous les animaux inclus, sans atteindre un âge critique où la dégradation de l'état de santé due à la maladie pourrait devenir sévère. En effet, cette myopathie est associée à une dégradation progressive de l’état général de l’animal. Cette dégradation devient sévère (troubles locomoteurs, douleurs à la manipulation) pour la plupart des animaux au delà de 8-9 mois.

70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par une alimentation à 60 % de lipides, elles reçoivent chaque jour pendant douze semaines un composé par voie orale, avec prélèvements sanguins après jeûne et hébergement individuel, pour le compte d'un laboratoire client préparant un médicament contre l'obésité. Le porteur indique que la perte de poids peut devenir une nuisance si elle est trop rapide, et prévoit une mise à mort pour prélever les organes. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier ces régulations métaboliques.

Objectifs

L'obésité dans le monde a plus que triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 1 milliard de personnes obèses aujourd'hui, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Dans ce contexte, notre client souhaite évaluer l'effet des nouveaux composés sur les symptômes liés à l'obésité chez les souris obèses (induites par une alimentation enrichie en graisses). Notre entreprise mènera, pour le compte de notre client, une étude in vivo visant à évaluer les effets des composés clients sur la prise alimentaire, le poids corporel et le métabolisme du glucose chez la souris obèse. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a montré que ces composés induisent une perte de poids corporel associée à une diminution de prise alimentaire. L’objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l’impact à plus long terme de ces composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris soumises à une alimentation enrichie en graisses (HFD; 60% de l'énergie fournie par les lipides). A termes, ces données seront incluses dans un dossier de demande d'autorisation d'essais cliniques dans le but d'obtenir une autorisation sur le marché d'une nouvelle classe de médicaments visant à traiter les troubles métaboliques.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de constituer un dossier de demande de premier essais cliniques chez l'humain dans le but d'obtenir une autorisation de mise sur le marché d'un composé thérapeutique luttant contre l'obésité et les troubles métaboliques associés.

Procédures

Les animaux seront pesés régulièrement et leur prise alimentaire mesurée. Ces mesures durent environ 2-3 minutes. Des prélèvements sanguins sont prévus après 4 heures de mise à jeun. Les prélèvements en eux même durent environ 3 minutes. Des mesures de composition corporelle non-invasives seront réalisées. Ces mesures sont rapides (

Impact sur les animaux

La nécessité de mesure individuelle de la prise alimentaire implique l'hébergement individuel des animaux. Etant donné leur phénotype attendu, les souris seront obèses. Toutefois, la perte de poids induite par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance si celle-ci s'avère trop rapide. D'autre part, des prélèvements sanguins avec mise à jeun préalable de 4h, les administrations quotidiennes per os pendant 12 semaines, les mesures de composition corporelles et le test de tolérance au glucose (avec une mise à jeun de 8h préalable) peuvent être source de nuisance pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issu de l'étude afin de collecter des organes d'intérêt. Des analyses biochimiques seront réalisées a posteriori sur ces derniers.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et la régulation glycémique dans les cas de troubles métaboliques. En effet, les paramètres physiologiques impactés impliquent une communication hormonale et nerveuse entre différents organes qui produit des effets au niveau de l'ensemble des cellules de l'organisme et il n'existe pas à l'heure actuelle de modèle non animal capable de reproduire ou de prédire l'impact d'un composé sur ces phénomènes de régulation.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, gain de poids corporel (en g et %), prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire (Gain de poids en g/Prise alimentaire cumulée en g), composition corporelle (mesures de la masse de tissu gras, de la masse de tissu maigre et de la masse de fuides non liés), test de tolérance au glucose (glycémie, insulinémie et aires sous la courbe), glycémie à jeun, insulinémie, HOMA-IR et HOMA-b (résistance à l'insuline et fonction des cellules b du pancréas) et les poids des différents organes. Dans le cadre des groupes expérimentaux obèses, le nombre d'animaux a été fixé à 12/groupe en prenan également en compte l'hétérogénéité du modèle, certains animaux présentant naturellement une résistance à l'induction de l'obésité. Concernant le groupe témoin du modèle d'obésité (Groupe 1, nourri avec la nourriture sandard et traité au véhicule), nous avons réduit le nombre à 10 animaux.

Raffinement

Le modèle animal utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles mais conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos et de matériels de nidification. Concernant les prélèvements sanguins, un anesthésique local sera appliquée sur la queue des souris 30 minutes avant. Avant les mesures de composition corporelle, les animaux seront préalablement habitués au système. Pour les mesures de glycémie, la mise à jeun préalable sera limitée à 4h afin de limiter l'inconfort. Concernant les traitements, ceux ci seront réalisés par des expérimentateurs rodés à geste expérimental en utilisant des canules souples pourvues d'embouts en silicone. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6J nourries avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris le plus classiquement utilisé et le mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge de jeune adulte adulte au début des traitements (7 semaines d'âge). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie, puis une seconde pour une mini-pompe délivrant de l'angiotensine, afin d'étudier le remodelage des artères sous hypertension et le rôle de gènes de la famille PI3K. Le porteur indique des douleurs modérées post-opératoires, minorées par des antalgiques, et une mise à mort pour prélèvement d'organes. Il présente la souris comme la "seule" espèce disposant des modèles génétiquement modifiés utiles et le recours à l'animal comme un "complément indispensable" des études in vitro.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont particulièrement incidentes chez les patients présentant des pathologies sous-jacentes telles que l'hypertension. Un des processus responsable de la grande majorité des accidents vasculaires est l'athérosclérose. L’athérosclérose va se développer dans différentes zones artérielles, obstruer le vaisseau et dans les étapes ultimes de la maladie provoquer des infarctus du myocarde ou des accidents vasculaires cérébraux. Afin de limiter ce risque, la technique d’angioplastie (pose de "stents") a alors été développée afin de rétablir la lumière du vaisseau. Elle consiste en la pose d’un stent actif, délivrant des substances médicamenteuses, dans le vaisseau endommagé. Cet acte chirurgical est associé à un traiement médicamenteux pour prevenir les rechutes en particulier chez les patients hypertendus. Cependant, des phénomènes de résistance à ces molécules ont été observés. Dans ce contexte, notre équipe se propose donc d'étudier le role des genes de la famille des PI3K dans le remodelage arteriel dans un contexte d'hypertension pour ameliorer ces traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence les cibles médicamenteuses pertinentes et efficaces pour lutter contre les complications cardiovasculaires régulièrement retrouvées chez les patients hypertendus.

Procédures

Les animaux seront soumis à une ou deux interventions chirugicales selon les cas. La première intervention chirurgicale pour implanter la puce de télémetrie dure environ 30min. 1 semaine apres la pose de la puce de la télémetrie, les animaux subiront une deuxième chirurgie de 15 min consistant à la pose en sous cutanné d'une mini-pompe.

Impact sur les animaux

Les deux procédures chirurgicales induisent la pose de 3 sites de sutures sur le thorax et 1 à l'arriere de la tête. Ces actes chirugicaux peuvent entrainer des douleurs modérées post-opératoires qui seront minorées par des antalgiques et les risques d'irritations et de demangeaisons seront minorés par utilisation d'antiseptique.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organe.

Remplacement

L'utilisation de ce modèle animal est un complément indispensable des études in vitro sur des lignées de cellules musculaires lisses que nous avons déjà réalisées au laboratoire. En effet, ces approches de culture cellulaire ne permettent pas d’étudier le remodelage artériel et de mesurer le bénéfice de nos cibles thérapeutiques dans un contexte physiopathologique intégrés prenant en compte l'ensemble des réponses cellulaires mise en jeu au sein d'une artère.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est réduit à son maximum en respectant les contraintes de publication, sans compromettre les objectifs du projet et pour permettre de bonne analyses statistiques. Le nombre de souris utilisé est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs et est donc précisé dans chaque procédure en fonction de la variabilité obtenue des protocoles expérimentaux mis en jeu. La télémetrie permet de diminuer le nombre d’animaux enrolés dans ce protocole en augmentant significativement le niveau de fiabilité et de reproductibilité des mesures de tension arterielle.

Raffinement

Quelle que soit la procédure utilisée, une observation des animaux en expérimentation est réalisée quotidiennement. L’état général de l’animal est évalué : prise de nourriture, toilette et mouvements habituels sont considérés comme des signes de bonne santé. La douleur est évaluée par les signes de prostration, de perte d’appétit ou de poids et de mouvements pénibles. L’environnement des animaux est enrichi (bandes de papier Sizzle-Nest pour la nidification, cube de bois pour usure des dents mais pas de tunnel ou d'igloo pour éviter à l'animal de se bloquer avec la pompe alzet), pour éviter l’angoisse et eventuellement faciliter l'acces à la nourriture et à l'eau en placant des croquettes humidifiées et de l'hydogel dans la cage. Si les points limites déterminés par le responsable de l'étude sont atteints, nous déterminerons avec la SBEA et le vétérinaire les soins ou l'action à appliquer pour réduire la souffrance animale.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris, seule espèce animale pour laquelle il existe des modèles animaux génétiquement modifiés pour nos cibles pharmacologiques. Les complications cardiovasculaires en condition d'hypertension font intervenir des mécanismes intégrés qui ne sont pas modélisables par des approches in vitro. L’expérimentation animale est donc une approche complémentaire aux études in vitro, permettant d’utiliser des modèles animaux susceptibles au développement des pathologies vasculaires. Enfin, plusieurs des cibles pharmacologiques potentielles seront validées en utilisant des modèles animaux génétiquement modifiés. Les souris seront utilisées à l'âge de 8 à 20 semaines, au stade jeune adulte car il est nécessaire que leurs systemes cardiovasculaire, immunitaire et métabolique soit entièrement developpé et mature.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire une ataxie cérébelleuse humaine, elles subissent un génotypage puis des tests comportementaux répétés, dont un passage dans un bassin de nage à 27 degrés, pour évaluer un composé pharmacologique avant et après l'apparition des symptômes. Le porteur indique une fatigue musculaire de courte durée et un stress liés aux tests, et suit les animaux sur plusieurs mois avant une mise à mort pour prélèvement de tissus. Il affirme que sa lignée avec délétion du gène est le "seul" modèle animal reproduisant la maladie.

Objectifs

Ce projet vise à étudier une ataxie cérébelleuse d’origine génétique qui se manifeste chez les patients par une ataxie cérébelleuse avec une évolution lente et progressive pouvant être associée à une intolérance à l’exercice, un retard mental faible à modéré, des crises d’épilepsie et des pseudo-épisodes vasculaires cérébraux. Le laboratoire a developpé un modèle de souris avec délétion totale du gène qui reproduit la pathologie humaine. Ainsi, l’objectif de ce projet est de tester sur ce modèle l’efficacité d’un composé pharmacologique dans deux approches pré- et post-symptomatiques.

Bénéfices attendus

Le bénéfice de ce projet est de mettre en place des essais pré-cliniques qui, s’ils s’avèrent concluants, déboucheront sur un transfert de ces essais vers la clinique dans le but de traiter les patients atteints de cette ataxie dégénérative.

Procédures

Ce projet comprend : - Une étape d’identification et génotypage des animaux qui aura lieu une fois entre l’âge de 2 et 3 semaines. - Une étape incluant des tests comportementaux sera réalisée sur les animaux vigiles. La durée de ces tests est comprise entre 30 secondes et 5 minutes.

Impact sur les animaux

Procédure avec degré de gravité modérée : Les animaux peuvent avoir une fatigue musculaire de courte période, seront mouillées après passage dans un bassin de nage à 27°C. Pourront avoir un stress lié aux tests comportementaux.

Devenir

Dans ce projet, les animaux qui seront etudiés à différents âges seront replacés dans leur cage entre chaque série de tests afin d’assurer l’étude longitudinale sur un même lot d’animaux. A la toute fin des études, les animaux seront mis à mort pour prelevement de tissus.

Remplacement

En parallèle de la création d’un modèle animal de la maladie, les alternatives non-animales (in vitro) ont été utilisées en première intention par notre équipe pour étudier les mécanismes pathologiques. Nous venons de démontrer l’efficacité du traitement proposé dans ce projet à l’aide d’une autre approche in vitro. Ces approches ne peuvent remplacer l’utilisation d’animaux et l’appréciation globale du bénéfice du traitement chez le modèle animal de la maladie car ce n'est que le reflet d'un seul type cellulaire, or la maladie impacte plusieurs organes (cervelet, muscles). La création du modèle animal et son étude in vivo permettra de définir les conditions optimales de transfert du traitement chez le malade. La souris avec délétion du gène que nous avons développé est le seul modèle animal reproduisant la maladie et permettant d’apprécier l’efficacité de traitements pharmacologiques.

Réduction

Toutes les procédures sont conçues pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, tout en tenant compte du nombre minimum nécessaire pour appliquer les tests statistiques adaptés. Les travaux de notre équipe et les données préliminaires nous permettent d’estimer le nombre de souris pour avoir une valeur statistique suffisante (10 souris par condition pour les différentes analyses). Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, autant que possible, nous effectuerons une étude sur un même lot d’animaux à différents âges et les mêmes animaux seront utilisés pour réaliser les différentes analyses.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans les conditions standard d’hébergement et l’environnement sera enrichi (igloo polycarbonate, rouleau de cellulose,...). Tout au long des procédures, un suivi régulier des animaux sera réalisé (une à deux fois par semaine). Il nous permettra de s’assurer du bon vieillissement des animaux au fil des mois. Ce suivi est basé sur la mise en place de points limites et méthodes de prise en charge d’éventuel stress et douleur spécifiques à notre projet. Certains prélèvements impliquent une mise à mort sous anesthésie générale et une fixation des tissus.

Choix des espèces

Avec 98% d’identité protéique avec l’Homme, la souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et la génétique sont bien connues. Les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d'utiliser des souris génétiquement modifiée est liée à l'absence de modèle mammifère naturel correspondant à la maladie humaine. Par ailleurs, nos données de l’étude du modèle murin avec délétion totale du gène montrent que ce modèle reproduit les caractéristiques pathologiques necessaires pour tester des solutions thérapeutiques. Les souris étudiées dans le cadre d’une administration pré-symtomatique de l’agent pharmacologique seront étudiées de l’âge de 1 mois à l’âge de 6 mois. Les souris étudiées dans le cadre d’une administration post-symtomatique de l’agent pharmacologique seront étudiées de l’âge de 4 mois à l’âge de 14 mois.

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans l'œil ou dans le cœur d'un vecteur viral, puis subissent jusqu'à six examens de la vue sous anesthésie répétée, dont fond d'œil, tests optocinétiques, tomographie et électrorétinogrammes, pour tester des thérapies géniques contre des dégénérescences de la rétine. Le porteur indique que les injections peuvent provoquer des décollements de rétine et des hémorragies oculaires, et que les anesthésies répétées exposent à l'hypothermie. Il affirme que l'étude du système visuel ne peut se faire que chez l'animal, faute de méthode de modélisation.

Objectifs

La perte de la vue représente un handicap majeur pour les personnes qui en sont atteintes. Afin que ces personnes puissent rester complètement autonomes, il apparaît essentiel de trouver des thérapeutiques efficaces pour ralentir l’évolution d’une perte visuelle ou de la restaurer chez les personnes l’ayant perdue. Notre objectif est de combattre les maladies dégénératives de la rétine en utilisant des thérapies géniques vectorisées par des virus adéno-associés (virus non pathogènes, non immunogènes et qui permettent un transfert efficace de gène dans les cellules). L’efficacité des différentes thérapies testées sera évaluée sur la structure anatomique de la rétine par tomographie à cohérence optique, sur l’acuité visuelle des animaux par des tests optocinétiques et sur la fonction rétinienne par des électrorétinogrammes, à différents points dans le temps, dans différents modèles de souris de dégénérescence rétinienne.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de mettre en avant la preuve de concept d’efficacité d’une ou plusieurs thérapies géniques dans des modèles de souris de rétinite pigmentaire. Le bénéfice attendu est à terme d’amener en clinique cette/ces thérapies géniques pour des maladies dégénératives de la rétine.

Procédures

- Injection intraoculaire : les animaux recevront une injection intraoculaire (une seule par œil) de la thérapeutique à évaluer. L’injection est rapide (5 à 10 minutes) et sera réalisée sous anesthésie générale. Les souris ne passeront qu’une seule fois par cette étape expérimentale. Les souris qui recevront une injection intraoculaire de la thérapeutique à tester ne recevront pas d’injection intracardiaque. - Injection intracardiaque : les animaux recevront une injection intracardiaque de la thérapeutique à évaluer. L’injection est très rapide (30 secondes) et sera réalisée sous anesthésie locale. Les souris ne passeront qu’une seule fois par cette étape expérimentale. Les souris qui recevront une injection intracardiaque de la thérapeutique à tester ne recevront pas d’injection intraoculaire. - Fond d’œil : suite à l’injection de la thérapeutique, le fond d’œil des animaux sera visualisé pour contrôler la qualité de l’injection réalisée. La procédure est rapide (5 minutes) et sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé 1 à 3 fois selon les conditions expérimentales. - Test optocinétique : ce test permet d’estimer la fonction visuelle in vivo. L’acquisition d’images dure environ 10 minutes par animal et sera réalisée sur animal vigile. Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé au maximum 6 fois par animal entre l’âge de 35 à 150 jours. - Tomographie à cohérence optique : ce test permet de visualiser la structure anatomique de la rétine (différentes couches de cellules). L’acquisition d’images dure environ 5-10 minutes par animal et sera réalisée sous anesthésie gazeuse Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé au maximum 6 fois par animal entre l’âge de 35 à 150 jours. - Electrorétinogramme : ce test permet d’évaluer la fonction de la rétine (capacité des cellules de la rétine à répondre à un stimulus lumineux). L’analyse dure environ 30 minutes par animal et sera réalisée sous anesthésie générale. Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé au maximum 6 fois par animal entre l’âge de 35 à 150 jours. - Euthanasie par des méthodes réglementaires en vue de prélèvements : en fin de procédure expérimentale, les souris seront euthanasiées pour collecter des échantillons pour des analyses microscopiques des tissus et des analyses biochimiques ultérieures.

Impact sur les animaux

Les injections sous-rétiniennes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires. Les injections intrapéritonéales, sous-cutanées et intracardiaques peuvent induire une douleur ponctuelle réversible. La majorité des gestes expérimentaux auxquels seront soumises les souris seront réalisés sous anesthésie induisant une répétition des anesthésies. L’anesthésie peut provoquer une hypothermie chez la souris qui est la première complication et cause de mortalité lors d’anesthésie de rongeurs. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme) et lors des tests confinés d’optocinétiques.

Devenir

Tous les animaux de l’étude (1440) seront euthanasiés à la fin des procédures afin de collecter des échantillons pour des analyses histologiques et biochimiques post-mortem

Remplacement

Nous étudions dans ce projet le fonctionnement du système visuel après un traitement thérapeutique à plusieurs niveaux. Ceci ne peut être étudié que chez l’animal puisque le fonctionnement du système visuel doit être intact. Il n'existe pas de méthodes alternatives par modélisation.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés (1440 souris) sera toujours limité au minimum nécessaire pour fournir des données biologiquement et statistiquement significatives. Les tests statistiques réalisés seront adaptés aux échantillons de petite taille afin de limiter le nombre d’animaux par groupe (12 souris par groupe). Ce nombre de 12 souris par groupe est basé sur des études antérieures du laboratoire utilisant des techniques similaires. Plusieurs tissus seront prélevés sur toutes les souris utilisées dans ce projet afin de collecter un maximum d’échantillons et d’éviter de relancer des expérimentations additionnelles.

Raffinement

- Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les utilisateurs et seront hébergés dans les conditions conformes à la réglementation. - Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (tunnel en carton, coton), alimentation et abreuvement à volonté. - Une anesthésie courte gazeuse, permettant un réveil rapide de l’animal, sera privilégiée quand les procédures le permettent. Les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale gazeuse pour les procédures courtes (injection intraoculaire, imagerie), et d’une anesthésie générale par injection d'anesthésiants pour les procédures plus longues (électrorétinogrammes). Une anesthésie locale de la cornée sera réalisée pour les injections intraoculaires et les électrorétinogrammes. Un gel hydratant sera utilisé pour protéger la surface cornéenne pendant les procédures. L’anesthésie pouvant provoquer une hypothermie, les souris seront placées sur un tapis chauffant durant toute la durée de l’anesthésie et en chambre thermostatée jusqu’à leur complet réveil. - Une nouvelle aiguille sera utilisée pour chaque animal pour limiter la douleur induite lors d’injections intraoculaires/intracardiaques/intrapéritonéales (dans la cavité abdominale)/sous-cutanées. - Application d'une pommade anti-inflammatoire et antibactérienne en post-injection intraoculaire et à la fin des électrorétinogrammes. - Un temps de repos minimal de 24h sera réalisé entre une anesthésie gazeuse et une anesthésiepar injection d'anesthésiants et de 7 jours entre deux anesthésies par injection d'anesthésiants. - Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme), les souris resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel (tunnel en carton et coton), ainsi que nourriture et eau à volonté. - Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. - Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque étape de la procédure expérimentale. - Les animaux provenant de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum.

Choix des espèces

Cette étude sera réalisée sur des modèles de souris car il existe différents modèles génétiques de rétinopathie proches du phénotype humain. Nous utiliserons plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées ayant des mutations différentes et une vitesse de dégénérescence rétinienne différente, pour modéliser la variabilité observée chez les patients. L’âge auquel les animaux entreront dans la procédure dépendra du phénotype et de la stratégie utilisée (selon si nous voulons injecter avant ou après que la dégénérescence rétinienne ait commencée). Les souris seront donc injectées soit au stade « nouveau-né » (entre 2 et 4 jours de vie, avant le développement définitif de la barrière hémato-rétinienne), soit à l’âge de 15 jours (avant que la dégénérescence des photorécepteurs ne soit trop avancée), soit à l’âge de 5 ou 8 semaines (lorsque la dégénérescence des photorécepteurs est quasiment complète).