Procédures modérées

322 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime appauvri en fibres et pro-inflammatoire, des gavages répétés et des prises de sang, et 40 % d'entre elles absorbent un produit induisant une inflammation intestinale pendant sept jours, cinq fois de suite. Le porteur indique attendre une perte de poids de 5 à 10 % et des diarrhées durant les phases inflammatoires, et héberge les souris seules pour éviter la coprophagie. Il justifie le recours à l'animal par l'impossibilité de modéliser in vitro la rupture de la symbiose entre l'hôte et son microbiote.

Objectifs

Chaque année, 41 millions de personnes décèdent des conséquences de maladies chroniques, également appelées maladies non transmissibles, dont maladies inflammatoires chroniques intestinales, obésité, diabète…, ce qui représente 71% des décès dans le monde. L’augmentation de l’incidence de ce type de maladie est entre autres associée à notre environnement (microbiote, régime alimentaire). Il apparait aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant le dépistage et le traitement des maladies chroniques. Ces dernières tendent à être de longue durée et résultent de l’association combinée de facteurs génétiques, physiologiques, comportementaux et environnementaux (Source : Organisation Mondiale de la Santé) dont l’environnement microbien. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant au sein des intestins des êtres vivants. Ces micro-organismes forment une association intime, durable et à bénéfice mutuel avec l’hôte que l’on qualifie de symbiose. Depuis plusieurs années, de nombreux travaux scientifiques ont décrit des déséquilibres au sein du microbiote intestinal de patients atteints de maladies chroniques. Récemment il a été montré que ce déséquilibre résulte d’une altération de la symbiose hôte-microbiote, elle-même caractérisée par une modification de la composition du microbiote couplée à la perturbation du statut immuno-physiologique de l’hôte qui conduit à la mise en place d’états « pré-pathologiques » et/ou pathologiques. Nos travaux suggèrent que ce déséquilibre résulte d’une rupture du dialogue microbiote-hôte due à des signaux inducteurs inflammatoires. Ce déséquilibre, récurrent dans différentes maladies chroniques, a été décrit chez l’animal et l’humain. Il se caractérise souvent par une diminution qualitative du microbiote. L’objectif de notre projet est d’étudier la mise en place d’une rupture de symbiose microbiote-hôte occasionnée par un stress inflammatoire chronique chez l’animal et d’évaluer les conséquences de cette rupture sur le vieillissement des animaux et leur descendance. Les résultats obtenus au cours de ce projet serviront de base pour la compréhension du mécanisme chez l’humain et permettront d’identifier des leviers permettant de retarder, prévenir et/ou traiter la rupture de la symbiose dans le cadre des maladies chroniques inflammatoires intestinales.

Bénéfices attendus

Les maladies chroniques sont une préoccupation majeure de santé publique et leur incidence est en constante augmentation. Diagnostiquées précocement au cours de la vie de l’individu, elles sont souvent de longue durée. Dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques intestinales, une perturbation du microbiote intestinal est souvent associée à une dérégulation de l’état de santé chez l’humain. Malgré la prise en charge thérapeutique des patients la persistance de cette perturbation conduit souvent à une succession de phases aigües de la maladie au cours de la vie de l’individu. Il apparait alors aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant leur dépistage et leur traitement. Notre projet amènera à une meilleure compréhension mécanistique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques intestinales et permettra d’anticiper les effets de cette rupture sur le vieillissement et la descendance.

Procédures

Les animaux recevront un régime appauvri en fibre et inducteur d’inflammation susceptible de moduler leur ingestion quotidienne et leur prise de poids de manière modérée. Tous les animaux adultes recevront une solution par gavage au minimum 4 fois et au maximum 8 fois durant la procédure. Le temps de gavage contention comprise est de 5 à 10 secondes maximum. Tous les animaux adultes auront au minimum 2 et au maximum 4 prises de sang à la queue de 40 µL. Le temps de collecte est de 2 à 3 minutes maximum. Tous les animaux adultes auront au minimum 1 et au maximum 2 prises de sang à la joue de 200 µL. Le temps de collecte contention comprise est de 30 seconde à 1 minute maximum. Les fèces de tous les animaux adultes seront collectées lors de l’émission naturelle de manière quotidienne ou hebdomadaire en fonction des différentes périodes établies dans les procédures. Les animaux seront placés dans un pot de collecte 5 min maximum. 40% des animaux adultes recevrons dans l’eau de boisson un produit induisant l’inflammation de l’intestin durant sept jours consécutifs répéter 5 fois avec une semaine de récupération entre chaque prise.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle, entrainant un stress modéré, afin d’éviter des contaminations croisées de microbiote par coprophagie. Il est attendu que les animaux réduisent de 5 à 10% leur prise de poids et soient sujets à des diarrhées pendant les phases inflammatoires aigues. Des prises de sang engendrant un léger stress de très courte durée seront réalisées et les animaux seront également gavés oralement avec des solutions permettant d’évaluer respectivement le temps de transit et la perméabilité intestinale. Ces protocoles constitueront un stress modéré notamment dû à la contention. Des signes de douleurs intestinales (diarrhée) sont attendus pendant les phases inflammatoires.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter le sang et les tissus pour analyses.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser in vitro ou in silico la dynamique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte. En effet, comprendre et caractériser l'évolution de la symbiose microbiote-hôte nécessite la mise en place d'intéractions bidirectionnelles complexes entre l'hôte et son microbiote. Ces intéractions sont difficilement controlables et pertinentes dans des modèles in vitro actuel de type microbiote/organoïde, notamment sur des temps longs tels que ceux décrient dans notre projet, ou nous ciblons particulièrement les périodes post stress et plus particulièrement la résilience ou non de la symbiose.

Réduction

D’après les études antérieures menées au laboratoire, nous estimons que 134 animaux pour le groupe contrôle et 188 animaux pour le groupe expérimental sont nécessaires afin de mettre en évidence des différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. Nous définissons un point limite sur l’apparence des animaux, leur comportement et leur prise de poids.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans notre étude seront des souris. Ce modèle est largement utilisé pour les recherches sur les maladies inflammatoires chroniques intestinales en raison de ses réponses reproductibles. Les animaux seront âgés de 6 semaines, ce qui nous permettra de débuter le traitement inducteur à 8 semaines. Ceci correspond à l’âge moyen auquel les modèles sont utilisés dans la grande majorité des laboratoires. Cet âge constitue donc un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos expériences précédentes. Il est également admis qu’à cet âge le microbiote de ces animaux est mature et stable d’un point de vue fonctionnel et compositionnel.

7 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées d'antigènes, parfois adjuvés, et subissent des prélèvements sanguins répétés jusqu'à quatre par jour, pour environ cinquante études d'immunisation par an. Le prélèvement final, mortel, récupère un volume important de sang. Le porteur affirme qu'une immunisation in vivo reste "nécessaire" dans certains cas et indique avoir réduit d'environ 20 % le nombre d'animaux par rapport au projet précédent.

Objectifs

L’objectif des protocoles d’immunisations sont utilisés à des fins scientifiques et médicales. Les applications pour leur utilisation peuvent être diverses comme par exemple : Fabrication de tests de diagnostic permettant la détection de maladies en médecine humaine, Préparation de médicaments pour usage en médecine humaine (médicaments biologiques), Applications diverses en recherche et développement.

Bénéfices attendus

Ces études d’immunisation sont utilisées à des fins scientifiques et médicales. Ces études sont bénéfiques pour les patients à court terme (e.g. fabrication de tests de diagnostic de type ELISA) et à moyen/long terme (eg. Phase de recherche et développement pour la mise à disposition de médicaments biologiques). Réalisation d’environ 50 études par an d’immunisation avec une moyenne de 30 animaux par étude.

Procédures

Tous les animaux rentrant dans une étude d’immunisation peuvent être soumis à des injections d’antigène et des prélèvements sanguins répétés. Concernant les injections, les volumes maximum sont de 0.5 mL / site (4 sites maximum) pour la voie sous-cutanée, 0.05mL/site (2 sites maximum) pour la voie intra-musculaire, 0.2mL pour la voie intraveineuse, 1mL pour la voie intra péritonéale. Une injection de dose solide est également possible (diamètre de la seringue maximal 1.4mm). - Temps minimum entre deux injections : 1 semaine sur des sites différents (sauf intraveineuse : 1 jour), à condition qu’aucune réaction anormale n’ait été observée sur l’animal. La durée d’injection est d’une dizaine de secondes à 5 minutes selon la voie. Le nombre d’injections dépend de la voie d’injection et du protocole du scientifique. Concernant les prélèvements (durée maximum 5 minutes), les animaux peuvent être soumis à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements par jour). Une pesée hebdomadaire d’une durée inférieure à 5 minutes est réalisée jusqu’à une fois par jour selon le protocole et l’état clinique de l’animal.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : Douleur, stress, perte de poids et inflammation localisée au site d’injection liés à des injections répétées d’antigènes (+/- adjuvés), Douleur, stress, perte de poids et saignements et/ou inflammations localisés aux sites de prélèvements liés aux prélèvements sanguins répétés, La contention de l’animal d’une manière générale qui peut amener à du stress chez l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Lors du prélevement final un volume significatif de sang est récupéré.

Remplacement

La production d’anticorps par méthode in-vitro exclusive comporte des avantages mais dans certains cas (exemples :besoin de concentration en anticorps élevée, glucosylation appropriée, affinité des anticorps spécifique…), une immunisation de type in-vivo reste encore nécessaire de nos jours. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Réduction

A travers les années d’expertises gagnées par l’établissement utilisateur, il n’est pas nécessaire de commander plus d’animaux que demandés par le scientifique pour réaliser le projet. Si une exception à cela devait avoir lieu, une revue par les membres de la SBEA serait nécessaire avant d’initier le projet. Avec l’expérience acquise, le nombre d’animaux prévu dans ce projet est diminué de l’ordre de 20% par rapport au projet précédant. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux, avec différents enrichissements dans leurs cages (e.g. tunnel, nidification…) . Elles sont observées chaque jour par du personnel formé et compétent et des points limites sont mis en place. Les techniciens animaliers sont encouragés à favoriser la manipulation sans stress des animaux (contention avec la technique de la cuillère ou utilisation de tunnels). Des signes cliniques spécifiques aux protocoles d’immunisation sont reconnus et appliqués comme points limites intermédiaires - entraînant une surveillance accrue avec mise en place de raffinements et traitements – et points limites terminaux - entraînant la mise à mort immédiate de l’animal. Avant les injections intra-veineuses les souris sont positionnées dans une enceinte chauffante à 38°C pendant 10 minutes pour faciliter l’injection intra-veineuse. En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la «Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisés que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique Également après prélèvement intermédiaire de sang supérieur à 250μL, une injection est effectuée en sous cutané pour réhydrater l’animal (minimum 40ml/kg). Un anesthésiant local est appliqué en amont de l’injection d’une dose solide (15/30 minutes avant l’injection).

Choix des espèces

La souris est une espèce adaptée pour les études d’immunisation étant donné la qualité du sérum produit et elle répond donc aux demandes des scientifiques. L’âge minimal des souris à J0 est de 8 semaines. A cet age, les souris ont un système immunitaire permettant la réalisation des études de type immunisation.

2 000 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'antigènes, parfois adjuvés, et subissent des prélèvements sanguins répétés jusqu'à quatre par jour, dans le cadre d'études d'immunisation destinées à produire des tests de diagnostic et des médicaments biologiques. Le prélèvement final, mortel, récupère un volume important de sang. Le porteur reconnaît que la production d'anticorps in vitro existe mais affirme qu'une immunisation in vivo reste "nécessaire" dans certains cas, notamment pour la qualité du sérum.

Objectifs

L’objectif des protocoles d’immunisations sont utilisés à des fins scientifiques et médicales. Les applications pour leur utilisation peuvent être diverses comme par exemple : Fabrication de tests de diagnostic permettant la détection de maladies en médecine humaine, Préparation de médicaments pour usage en médecine humaine (médicaments biologiques), Applications diverses en recherche et développement.

Bénéfices attendus

Ces études d’immunisation sont utilisées à des fins scientifiques et médicales. Ces études sont bénéfiques pour les patients à court terme (e.g. fabrication de tests de diagnostic de type ELISA) et à moyen/long terme (eg. Phase de recherche et développement pour la mise à disposition de médicaments biologiques). Réalisation d’environ 40 études par an d’immunisation avec une moyenne de 10 animaux par étude.

Procédures

Tous les animaux rentrant dans une étude d’immunisation peuvent être soumis à des injections d’antigène et des prélèvements sanguins répétés. Concernant les injections, les volumes maximum sont de 10mL / kg (4 sites maximum) pour la voie sous-cutanée, 0.5mL/site (2 sites maximum) pour la voie intra-musculaire. Une injection de dose solide est également possible (diamètre de la seringue maximal 1.4mm). Temps minimum entre deux injections : 1 jour, sur des sites différents à condition qu’aucune réaction anormale n’ait été observée sur l’animal. A noter qu’en routine, le temps entre deux injections est supérieur à 1 semaine La durée d’injection est d’une dizaine de secondes à 5 minutes selon la voie. Le nombre d’injections dépend de la voie d’injection et du protocole du scientifique. Concernant les prélèvements (durée maximale de 5 minutes), les animaux peuvent être soumis à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements par jour). Une pesée hebdomadaire d’une durée inférieure à 5 minutes est réalisée jusqu’à une fois par jour selon le protocole et l’état clinique de l’animal.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : Douleur, stress, perte de poids et inflammation localisée au site d’injection liés à des injections répétées d’antigènes (+/- adjuvés), Douleur, stress, perte de poids et saignements et/ou inflammations localisés aux sites de prélèvements liés aux prélèvements sanguins répétés, La contention de l’animal d’une manière générale qui peut amener à du stress chez l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Lors du prélevement final un volume significatif de sang est récupéré.

Remplacement

La production d’anticorps par méthode in-vitro exclusive comporte des avantages mais dans certains cas (exemples :besoin de concentration en anticorps élevée, glucosylation appropriée, affinité des anticorps spécifique…), une immunisation de type in-vivo reste encore nécessaire de nos jours. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Réduction

A travers les années d’expertises gagnées par l’établissement utilisateur, il n’est pas nécessaire de commander plus d’animaux que demandés par le scientifique pour réaliser le projet. Si une exception à cela devait avoir lieu, une revue par les membres de la SBEA serait nécessaire avant d’initier le projet. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Raffinement

Les cobayes sont hébergés en groupes sociaux, avec différents enrichissements dans leurs cages (e.g. tunnel, mousqueton…) . Ils sont observés chaque jour par du personnel formé et compétent et des points limites sont mis en place. Des signes cliniques spécifiques aux protocoles d’immunisation sont reconnus et appliqués comme points limites intermédiaires - entraînant une surveillance accrue avec mise en place de raffinements et traitements – et points limites terminaux - entraînant la mise à mort immédiate de l’animal. En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la «Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. En cas d’hémorragie inattendue lors d’un prélèvement sanguin, une réhydration via injection sous cutanée est effectuée (minimum 10ml/kg). Un anesthésiant local est appliqué en amont de l’injection d’une dose solide (15/30 minutes avant l’injection).

Choix des espèces

Le cobaye est une espèce adaptée pour les études d’immunisation étant donné la qualité du sérum produit et il répond donc aux demandes des scientifiques. Le poids minimal à J0 est de 250 grammes. A cet âge, les cobayes ont un système immunitaire mature permettant la réalisation des études de type immunisation.

970 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisés ensuite dans d'autres projets après avis vétérinaire. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie de 1h30 à 2h, parfois une seconde chirurgie pour une mini-pompe, puis reçoivent des candidats médicaments par diverses voies pendant plusieurs jours, avec des périodes d'isolement et de mise à jeun jusqu'à 20 heures. Le porteur décrit ces atteintes comme un stress modéré et transitoire. Il affirme qu'avant toute administration à l'homme l'animal constitue un "passage obligatoire" et qu'il n'existe pas de méthode de substitution pour évaluer les effets cardiovasculaires.

Objectifs

Chaque étude de ce projet consiste à évaluer les effets cardio-vasculaires de différents candidats médicaments chez le rat éveillé en utilisant un enregistrement automatique des paramètres cardio-vasculaires (télémétrie). Pour cela, des chirurgies sont prévues afin d'implanter de manière définitive un dispositif d'enregistrement. Les enregistrements se feront en cage de vie et sur des animaux libres de leur mouvements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Les procédures de ce projet nécessitent différents types d'interventions. Dans un premier temps, une chirurgie sous anesthésie générale sera pratiquée afin d'implanter un dispositif (émetteur de télémétrie) permettant l'enregistrement automatique des paramètres cardio-vasculaires (durée: 1h30-2h). Les animaux seront tenus afin de pouvoir leur administrer des produits anesthésiques et analgésiques (durée: environ 1-2minutes). Après la chirurgie d’implantation de l’émetteur de télémétrie, 10 à 15 jours de récupération, au minimum, sont prévus avec isolement des animaux pour optimiser la cicatrisation. Pour certains protocoles, une seconde chirurgie pourra être pratiquée après récupération de la première chirurgie (durée: 30-45min). Le but de cette seconde chirurgie est d’implanter une mini-pompe sous la peau pour perfuser le produit à tester de façon continue. Dans ce cas, les soins post-opératoires ne pourront pas être suspendus et leurs durées seront fonction du type de mini-pompe implantée (durée maximale: 1 semaine). Le candidat médicament ou du placebo seront administrés aux animaux par voie orale, intrapéritonéale, sous-cutanée (continue ou non), transdermique, intramusculaire ou intraveineuse (bolus ou perfusion ou continue) (durée 1-2minutes et non applicable pour les administrations continues via une mini-pompe). Ainsi, leur potentiel effet sur les paramètres cardiovasculaires pourra être évalué. Cette évaluation se fera chez un animal éveillé et libre de ses mouvements dans sa cage d'hébergement pendant plusieurs heures ou jours. Dès que possible, les animaux seront hébergés avec un animal compagnon afin de ne pas être isolé. Des prélèvements sanguins pourront être effectués durant les phases expérimentales sur animal vigile ou anesthésié (durée des prélèvements: moins de 3min). Pour certains protocoles, des animaux pourront être mis à jeun (durée maximale: 20 heures). En cas de mise à jeun, une période minimale d’une semaine sera respectée entre chaque expérience de télémétrie (à l'inverse de 24h sans mise à jeun).

Impact sur les animaux

Les contentions des animaux vigiles pour induire l'anesthésie et administrer le produit peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. La chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie et la potentielle chirurgie d'implantation d'une mini-pompe peuvent induire des douleurs post-chirurgicales qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie, analgésie et un protocole de soins post-opératoire. Post-chirurgie.s, les animaux pourront être isolés: 10/15 jours maximum post chirurgie d'implantation de l'émetteur de télémétrie et éventuellement, 1 semaine supplémentaire maximum post chirurgie d'implantation d'une mini-pompe. Cet isolement engendra un stress de durée moyenne et d'intensité modérée (désocialisation). Cependant en contrepartie, l'isolement permettra aussi d'accélérer la récupération post-chirurgicale. Finalement, les animaux pourront être mis à jeun avant l'administration du produit (et de façon exceptionnelle, avant les chirurgies). Cette période de jeun durera maximum 20h. La mise à jeun engendre un stress physiologique et psychologique d'intensité modérée mais de courtes durées.

Devenir

Réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire (sauf en cas de prélèvements d’organes / fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal).

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur la fonction cardiovasculaire. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’une des espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe (6 à 12) est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. L'utilisation de la télémétrie permet de faire des suivis sur de longues périodes. De plus, en général, les mêmes animaux sont utilisés pour les administrations des placebos et des produits (avec un temps de récupération entre les 2). Ainsi, la technique de télémétrie permet de diminuer le nombre d'animaux en ne multipliant pas les animaux pour l'étude de divers temps et groupes expérimentaux. Enfin, une réutilisation des animaux pour plusieurs études, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra aussi de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement est obtenu par : l'utilisation d'animaux libres de leurs mouvements pendant les enregistrements, la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, la validation du système de télémétrie et validation pharmacologique du modèle, le suivi des signes cliniques et des points limites, le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, des protocoles chirurgicaux avec une anesthésie et une analgésie adaptées et maitrisées, le suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux. L'ensemble des mesures décrites ci-dessus permet de réduire les contraintes potentielles pour l'animal à leur minimum.

Choix des espèces

Le rat est l'une des espèces de rongeurs les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur le système cardiovasculaire car il s'agit d'une espèce bien connue et décrite dans les premières étapes de l'évaluation des effets cardiovasculaires des candidats-médicaments. Des animaux adultes seront utilisés. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

342 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales à la patte, jusqu'à treize séances d'imagerie sous anesthésie et des injections répétées de molécules, pour tester des candidats médicaments contre l'ostéosarcome de l'enfant. Le porteur affirme que le développement tumoral ne génère pas de douleur apparente, tout en prévoyant une surveillance trois fois par semaine et des points limites précoces. Les retombées cliniques annoncées restent renvoyées à un futur transfert vers la clinique, l'objectif immédiat étant de valider l'effet antitumoral chez la souris.

Objectifs

Dans les cancers pédiatriques, l’ostéosarcome (OS) est un cancer rare qui touche 3.4 cas par million d’habitants/an. Ces tumeurs d’origine osseuse se développent dans diverses localisations comme au niveau des os long (tibia, fémur), épaule ou encore au niveau de la mâchoire. La survie à 5 ans des patients est d’environ 75% alors qu’elle est inférieure à 27% chez les patients dont la maladie s’est propagée à d’autres parties du corps (métastases). Malgré les avancées de la médecine personnalisée, il n’y a eu que de faibles progrès dans le traitement de cette maladie. De nouvelles molécules ciblant les cellules immunitaires ont été identifiées, dont leur rôle va être de rétablir le système immunitaire afin de combattre la tumeur. Il faut donc démontrer que ces molécules possèdent des caractéristiques de candidats médicaments antitumoraux et anti-métastatiques. Ceci permettrait d’améliorer la prise en charge médicale de l’ostéosarcome chez l’enfant, les adolescents et jeunes adultes. L’objectif de ce projet est de confirmer chez la souris l’efficacité antitumorale de ces molécules c’est-à-dire que le traitement induit une diminution du volume de ces tumeurs primaires et de l’étendue des métastases.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules candidats médicaments dans le traitement d’un type de cancers pédiatriques (ostéosarcome) en vue d’un transfert technologique vers la clinique.

Procédures

Analgésique pré implantation : 1x lors de la greffe au niveau de la patte gauche avant l'anesthésie. Anesthésie : 1x au moment de la greffe au niveau de la patte (Durée : 5 min maxi) 13x max (entre 5 et 13 selon la procédure) pour l'imagerie lumineuse (Durée : 8 min maxi par point d’acquisition soit 1x/semaine). Traitement : 2 jours/7 pendant 5 semaines maximum ou 3jours/7 injection des molécules pendant 3 semaines maximum. Évaluation de l’efficacité des composés et prise de greffe par imagerie lumineuse sous anesthésie (1x/semaine) et par mesure au pied à coulisse de l’épaisseur des pattes (2x/semaine) pendant 90 jours maximum (de 35 à 90 jours selon les procédures)

Impact sur les animaux

La toxicité des molécules a été évaluée précédemment et n’a pas montré de toxicité aux doses que nous allons utiliser. La greffe de cellules tumorales ne génère pas de douleur, de plus quand cela est compatible l'animal est anesthésié et reçoit un antalgique. Le développement tumoral ne génère pas de signes de douleur apparente, ni de problème de locomotion. Par conséquent, les procédures mises en place ne devraient pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l'état général des animaux. Toutefois les animaux sont surveillés 3x/semaine pour prévenir et détecter tout mal être animal. Lors du traitement pharmacologique, un cadran sera défini et les zones d'injection seront alternées (gauche-droite-haut-bas) pour le bien-être animal. Ce protocole d'administration a déjà été mis en œuvre et il n'a pas été observé de souffrance particulière. Le développement de métastases pourrait entrainer une difficulté respiratoire, des douleurs abdominales à la palpation (foie), un envahissement de plusieurs organes altérant leur fonction qui seront détectés par imagerie (1x/semaine).

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort.

Remplacement

Pour le remplacement, les traitements à évaluer ont déjà démontré des résultats prometteurs in vitro sur de nombreux tests comme des évaluations à partir de cellules de sang humain frais ou de tumeurs isolées de patients. Les modèles tumoraux chez la souris nous permettent de valider l’effet thérapeutique de nos traitements à l’échelle d’un organisme, ainsi que d’évaluer leur potentiel effet toxique avant d’envisager un essai clinique.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des études précédentes ont permis de sélectionner les composés d'intérêts et de déterminer les doses maximales tolérées. De plus, pour chaque modèle tumoral orthotopique, la progression de la tumeur sera suivie par imagerie par bioluminescence. Cette approche non invasive et quantitative nous permet de suivre la progression de la maladie et de décider de la mise à mort des souris avant même l’apparition de symptôme critique. D’après les données de la littérature, on estime que le taux de prise de greffe sera de 90%. Cette donnée a été prise en compte afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux permettant de s’assurer de la reproductibilité et de réaliser une analyse statistique des résultats. De plus, les procédures prévues dans ce projet sont séquentielles, ce qui permettra de réduire au maximum le nombre de souris impliquées dans le projet.

Raffinement

Nous avons généré une lignée cellulaire qui émet de la lumière afin de pouvoir suivre la progression tumorale et/ou la dissémination métastatique au cours du temps sur le même animal sans avoir recours à sa mise à mort dans un but de raffinement. Au cours de ce projet, les précautions seront prises pour stresser au minimum l’animal. Dès leur arrivée, les souris seront hébergées par groupe de 5 souris par cage. Une période d’acclimatation de 7 jours sera respectée avant l’entrée des animaux dans l’une des procédures présentées ci-après. L'administration d'analgésique/anesthésique, un suivi adapté des animaux et la définition précise des points limites précoces et prédictifs d'un mal être, permettent de limiter au maximum la souffrance animale. Post greffe au niveau de la patte, de la nourriture humidifiée sera ajoutée au fond de la cage au cas où les animaux présenteraient des difficultés à se déplacer. De plus, post-mortem différents organes seront prélevés pour des analyses complémentaires.

Choix des espèces

L’utilisation des souris a un âge un peu plus précoce, nous permettra d’avoir une meilleure reproduction du système immunitaire et des hormones retrouvés chez les patients pédiatriques. Nous avons déjà démontré qu’à des âges plus précoce la prise de greffe reste fiable et donne de résultats clairs afin d’analyser l’efficacité de nouveaux traitements. De plus l’utilisation de souris nous permettra de réellement étudier le rôle de notre protéine d’intérêt dans le développement tumoral. Nous avons également l’avantage de posséder des souris génétiquement modifiées rendant possible l’utilisation d’un anticorps humain permettant alors un rapprochement entre le pré-clinique et clinique plus robuste.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte, éveillées, des cellules tumorales puis quatre administrations d'un traitement directement dans la tumeur, avant prélèvement d'une quinzaine d'organes pour étudier la toxicité et le cheminement d'une thérapie anticancéreuse. Le porteur attend une gêne au déplacement liée à la tumeur et une perte de poids pouvant approcher vingt pour cent, et situe les bénéfices pour les patients à moyen terme et au conditionnel. Sur le remplacement, il indique recourir à des organoïdes et des modèles bio-imprimés, mais conclut que la toxicité ne peut être évaluée que dans un "organisme complet".

Objectifs

Les cellules dendritiques sont des cellules spécialisées dans la reconnaissance de tout ce qui n'appartient pas à notre organisme : le non-soi et sont capables de le présenter aux cellules du système immunitaire pour l'éliminer. Le porteur de projet a identifié une stratégie capable de transformer des cellules cancéreuses en ces cellules dendritiques. Elles sont alors capables de prévenir le système immunitaire, ce qui provoque une réponse immunitaire contre la tumeur dans le but de l'éliminer. De part cette capacité à réveiller et armer le système immunitaire contre une tumeur, ces cellules représentent un outil thérapeutique prometteur dans le traitement du cancer. Le but ici est de caractériser la toxicité de cette thérapie et de connaître son cheminement dans l'organisme une fois celui-ci injecté : les tissus ou organes par lesquelles il va passer avant d'être éliminé, tout cela chez la souris saines et chez la souris atteinte de cancer.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à moyen terme. Ce projet permettra de développer et de caractériser en phase préclinique une approche thérapeutique anticancéreuse très innovante, sur un large panel d’indications oncologiques. Cette approche thérapeutique permettra au mieux de guérir les patients atteints de cancer, sinon de ralentir la progression tumorale. La thérapie étudiée devra encore passer par une phase préclinique règlementaire avant une première administration chez l’Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis vigiles, une fois à une injection de cellules tumorales puis une à deux semaines après, selon le temps de pousse des tumeurs, à quatre injections de traitement à deux jours d'intervalle. Les groupes sains sans injection de cellules tumorales débutent le traitement en même temps que les groupes avec tumeurs. L'administration du traitement se fera en intratumoral pour les groupes avec tumeur et en sous-cutanée pour ceux sans tumeur. Les injections durent pour chaque souris quelques secondes.

Impact sur les animaux

1/Nuisances attendues : -Injection sous-cutanée de cellules : douleur à la piqûre et à l’injection ; durée de quelques secondes - Croissance d’une tumeur sur le flanc : gêne cutanée, gêne au déplacement ; durée maximum 25 jours. -injections en sous cutané ou en intratumoral : douleur de la piqûre ; 5 secondes. 2/Nuisances potentielles : -perte de poids de moins de 20% du poids maximal : 4 jours maximum -inflammation de la surface de la tumeur : douleur cutanée, démangeaisons ; maximum 48h - réaction au traitement : irritation, rougeur

Devenir

A différents temps au cours des études : 24 heures et 7 jours après la dernière injection de traitement pour les animaux avec tumeur et 24 heures, 7 jours et 30 jours après pour les animaux sans tumeur, 6 individus par groupes seront prélevés en terminal. A l'issu du dernier temps de prélèvement, ce sera la fin des études, tous les animaux auront été mis à mort. Lorsque les souris seront mises à mort, les organes et échantillons suivants seront prélevés : sang, urine, tumeur, foie, rate, poumons, reins, cerveau, cœur, gonades, glandes surrénales, moelle osseuse, moelle épinière, thymus et nœud lymphatique, pour de la quantification biochimique dans l'étude de biodistribution et pour de la quantification histologique pour l'étude de toxicologie.

Remplacement

Les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes lymphoïdes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). Certaines caractéristiques individuelles seront étudiées in vitro/ex vivo (modèles organoïdes, modèles bio-imprimés), la toxicité et la biodisponibilité ne peuvent être pleinement évalués que dans un organisme complet.

Réduction

Pour le modèle de cancer de la vessie, les études de toxicologie et de biodistribution seront faites sur le nombre minimal de souris nécessaires permettant de conclure de façon fiable statistiquement avec le test statistique approprié, à savoir 12 ou 18 souris par groupe thérapeutique, pour un total de 16 groupes. Parmi ces 16 groupes thérapeutiques, 8 seront testés sur un modèle tumoral très bien connu et représentatif d’un cancer à fort besoin thérapeutique et 8 autres sur des souris saines sans tumeur pour s'affranchir d'un effet induit par la tumeur. Dans notre expérience, les effectifs de 12 ou 18 souris par groupe permettent de caractériser avec les tests statistiques adéquats des différences significatives. Le modèle tumoral utilisé a été préalablement testé in vitro pour sa bonne réponse à la thérapie étudiée. Pour chaque groupe thérapeutique, différents organes et échantillons seront analysés post-mortem sur 6 souris indépendantes à deux ou trois temps différents pour connaître les effets et le cheminement du porduit au cours du temps : le site d’injection, foie, rate, poumons, reins, cerveau, cœur, gonades, glande surrénale, moelle épinière, nœud lymphatique, thymus, moelle osseuse, sang et urine).

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Toutes les précautions seront prises pour détecter et minimiser la souffrance, la douleur et le stress des animaux (observation quotidienne, pesée des animaux, traitement antalgique si besoin). Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. Des prélèvements en point final (tumeurs, organes et échantillons) seront réalisés pour pouvoir obtenir le maximum d’informations des animaux utilisés.

Choix des espèces

Nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent, et d’un modèle tumoral de souris. La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs de souris représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Par rapport aux rats, la souris permet également d’utiliser moins de composés pour obtenir une dose/poids. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime gras puis hébergées seules à thermoneutralité, elles reçoivent chaque jour pendant plus de six semaines un composé par gavage ou injection, avec pesées, prélèvements sanguins et test de tolérance à l'insuline, pour un laboratoire pharmaceutique client. Le porteur décrit l'isolement et les administrations quotidiennes comme des nuisances et affirme que le choix du modèle a été "validé avec le client". L'objectif déclaré est commercial, constituer un dossier d'autorisation puis mettre sur le marché un médicament contre l'obésité.

Objectifs

L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a montré qu'une série de composés en développement induit une perte de poids corporel associée à une diminution de la prise alimentaire chez des souris obèses. L'objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l'impact à plus long terme de ce composé sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris rendues obèses par un régime hyperlipidique (60% de l'énergie issue des graisses) pendant 10 semaines avant réception. Les traitements seront administrés par voie orale ou sous-cutanée pendant 5 semaines, pendant lesquelles les animaux seront soumis au même régime enrichi en graisses. Au cours du traitement, les paramètres suivants seront mesurés : poids corporel et prise alimentaire, composition corporelle, glycémie à jeun, tolérance à l'insuline. Par ailleurs, afin d'explorer l'implication éventuelle de la thermogenèse dans les effets du composé, les animaux seront hébergés à une température de thermoneutralité (29-32°C).

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de sécuriser le développement des composé tests, notamment dans le but de prioriser ceux ayant les effets les plus marqués. Ainsi, ls données obtenues permettront de constituer un dossier de demande d'autorisation pour la réalisation d'études cliniques. A terme, cela permettrait à la société cliente d'obtenir une AMM et de commercialiser un composé thérapeutique luttant contre l'obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis à : 1) un état d'obésité induit par l'aliment enrichi en graisses (Régime fournis pendant 12 semaines avant réception des animaux et 7 semaines après réception) - 2) un hébergement individuel sur toute la longueur de l'étude (Durée: 7 semaines après réception) - 3) une administration orale ou sous-cutanée quotidienne du traitement test, du véhicule ou du composé de référence à partir de D-11 et jusqu'à D35 (46 jours; durée de l'acte : environ 1-2 minutes) - 4) une pesée quotidienne de D-18 à D-1 (durée de l'acte : environ 1-2 minutes) - 5) une mise à jeun de 4h + un prélèvement sanguin à la queue à D-6 (durée de l'acte : environ 5 minutes)- 6) des mesures de prise alimentaire et de poids corporel trois fois par semaine à partir de D1 (soit un total de 15 mesures; durée de l'acte : environ 2-3 minutes) - 7) deux analyses de leur composition corporelle à D-6 et D29 (Durée de l'acte < 2 minutes) -8) un test oral de tolérance à l'insuline (ITT) à D29 [(Mise à jeun pendant 6h, Prélèvements sanguins (1 goutte) 0, 15, 30, 60 et 120min après administration du glucose; Durée de l'acte : 2,5 heures) . - 9) Une anesthésie générale et euthanasie à D35 (Durée de l'acte: environ 5 minutes) .

Impact sur les animaux

La nécessité de mesure individuelle de la prise alimentaire et les mesures en cages métaboliques prévues en cours d'étude imposent un hébergement individuel des animaux imposent un hébergement individuel des animaux constituant une nuisance. Afin d'explorer l'implication éventuelle de la thermogenèse dans les effets du composé, les animaux seront hébergés à une température de thermoneutralité (29-32°). Les animaux seront pesés régulièrement afin d'administrer le bon volume de véhicule ou de traitement. Etant donné leur phénotype attendu, les souris seront obèses. Toutefois, la perte de poids induite par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance. D'autre part, des prélèvements sanguins pour mesure de glycémie, un test de tolérance à l'insuline (avec une mise à jeun de 6h), et deux analyses de la composition corporelle par RMN sont prévus et pourront être source de stress ou de nuisance pour les animaux. Enfin, les gavages oraux et les administration sous-cutanées quotidiens à partir de D-11 et jusqu'à D35 (soit 46 jours) sont une source de nuisance. Il est à noter que les administrations (orales ou sous-cutanées) d'habituation effectuées entre D-11 et D1 s'avèrent nécessaires car sans cette précaution, ces procédures induiraient des modification du prise alimentaire et de poids corporel au début du traitement et seraient et donc seraient à même de fausser les résultats de l’étude.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Des prélèvements terminaux post mortem sont nécessaires pour une étude complète des effets des composés test.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les troubles métaboliques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt compte tenu des paramètres mesurés dans la présente étude mais également de l'hétérogénéité connue du modèle obèse. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, gain de poids corporel (en g et %), prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire (Gain de poids en g/Prise alimentaire cumulée en g), test de tolérance à l'insuline (glycémie et aire sous la courbe), glycémie à jeun, HOMA-IR et HOMA-b (résistance à l'insuline et fonction des cellules b du pancréas), HbA1c, triglycérides et le poids du tissu adipeux inguinal gauche et droit.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles du fait de la nécessité de mesurer précisement l'impact du composé sur leur prise alimentaire individuelle. Néanmoins, les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dômes en carton et de briquettes en bois. Par ailleurs, nous avons remarqué que la litière en cellulose permet non seulement une bonne absorbance mais également un enrichissement (nidification). Pour chaque prélèvement sanguin, de la lidocaïne en gel sera appliquée à l'extrémité de la queue 30 minutes avant prélèvement afin de prévenir la douleur pouvant résulter de ce geste. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. En cas de signe de souffrance de l'animal, un analgésique (buprénorphine) sera administré. Si aucune amélioration n'est constatée passé un certain délai, l'animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6J nourries avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris le plus classiquement utilisé et le mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (16 semaines à réception). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

4 200 larves de poissons zèbres vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'un régime gras puis exposées à des cocktails de perturbateurs endocriniens entre le cinquième et le onzième jour après la fécondation, elles servent à étudier la progression des maladies du foie gras, avec une atteinte hépatique et une nage altérée attendues. Le porteur présente la larve comme un modèle "alternatif" au rongeur qui limite l'usage de mammifères, tout en qualifiant l'expérimentation animale d'"indispensable". Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne reproduit les interactions entre organes nécessaires à l'étude.

Objectifs

Les maladies du foie gras sont devenues une priorité de santé publique car elles touchent plus de 20 % de la population générale et surtout les personnes obèses (>70% de personnes atteintes). Elles débutent avec la stéatose hépatique (foie gras), stade bénin, qui peut progresser vers la stéatohépatite, propice au développement des cirrhoses et cancers du foie. L’exposition aux perturbateurs endocriniens, seuls ou en mélange, notamment via l’alimentation, est reconnue comme un facteur pouvant participer au développement de ces maladies. Il apparait donc urgent de développer de nouveaux modèles permettant de mieux évaluer l’impact de ces molécules sur la santé et en particulier sur les maladies du foie gras. Etant donné la nature complexe de ces maladies qui dépendent des interactions étroites entre différents organes et types cellulaires, il est nécessaire d’avoir une approche utilisant des organismes entiers et donc uniquement retrouvée dans les modèles in vivo. Le premier objectif de ce projet est donc de poursuivre l’évaluation de la larve de poisson-zèbre comme modèle alternatif aux modèles rongeurs pour l’étude des effets cocktail des perturbateurs endocriniens sur les maladies du foie gras. En outre, l’un des mécanismes suspectés fait intervenir les vésicules extracellulaires comme un moyen de communication important entre les organes participant à la progression de ces maladies du foie. Ces vésicules représentent également de potentiels biomarqueurs d’exposition et/ou de progression de la maladie dans la mesure où elles sont facilement accessibles par prélèvement sanguin. Ainsi, un second objectif de ce projet est de caractériser la production des vésicules extracellulaires issues du foie suite à l’exposition à un cocktail de perturbateurs endocriniens.

Bénéfices attendus

Cette phase d'expérimentation in vivo devrait permettre de confirmer le potentiel de ce modèle de larve de poisson-zèbre en alternative au modèle murin classiquement utilisé. En parallèle, des travaux seront d’ailleurs conduits sur un modèle murin pour compléter ce projet (ces travaux sont intégrés à une autre saisine). En outre, ce projet permettra de vérifier nos hypothèses sur les vésicules extracellulaires et, en cas de confirmation, ouvriront la voie à des études plus avancées sur le rôle de ces vésicules dans les maladies du foie gras ou à leurs utilisations en tant que potentiels biomarqueurs.

Procédures

Alimentation avec un régime enrichi en graisse de 4 à 10 jours post-fertilisation des oeufs. Exposition à des cocktails de perturbateurs endocriniens (de 7 à 11 jours post-fertilisation des oeufs)

Impact sur les animaux

L'objectif de ce projet est d'étudier l'apparition et la progression de pathologies hépatiques. On s'attend donc à un impact sur la santé des poissons, cependant celui-ci devrait rester modéré et se traduire éventuellement par des modifications légères du comportement (nage altérée).

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin d'obtenir suffisamment d'échantillons biologiques pour réaliser les expériences envisagées et garantir au maximum l'obtention de résultats significatifs.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est indispensable à l’atteinte des objectifs du projet (3R : Remplacement), l’utilisation du modèle poisson-zèbre reste toutefois une alternative au modèle rongeur dans le contexte de l’étude du rôle des vésicules extracellulaires dans les effets délétères des NAFLD.Plus précisément, l’un des objectifs de ce projet est de déterminer si les vésicules extracellulaires produites par le foie peuvent servir de biomarqueurs d’exposition et/ou d’atteintes hépatiques dans le contexte d’exposition à des polluants environnementaux. Pour cela, il est nécessaire de reconnaitre spécifiquement les vésicules issues du foie au sein de toutes les vésicules produites par l’organisme et d’identifier les changements qualitatifs ou quantitatifs de cette population de vésicules qui pourraient corréler avec les niveaux d’exposition aux polluants ou avec les atteintes du foie. Ainsi, seule l’expérimentation sur un modèle in vivo peut permettre d’évaluer de manière intégrative la production de vésicules et le développement de ces maladies du foie (maladies qui dépendent en partie de la communication entre différents organes). A l’heure actuelle, il n’existe pas d’alternatives (in vitro, in silico ou ex vivo) permettant de reproduire l’ensemble des interactions entre organes liées à ces maladies du foie ni la grande variété de vésicules retrouvées dans un organisme entier.

Réduction

Les plans d’expérimentations ont été réalisés de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats significatifs et d’éviter les réplicats inutiles. Ainsi, nous avons prévu de réaliser des tests de comparaison de moyennes ANOVA avec un seuil de significativité à 5% (p

Raffinement

Les études seront conduites dans le respect des normes les plus strictes en matière de soins des animaux et d’évaluation de la souffrance animale. Les animaux seront maintenus dans des installations modernes et agréées pour assurer un confort maximal aux animaux. Tout le personnel impliqué dans le travail des animaux a suivi une formation conformément aux réglementations institutionnelles et aux lois nationales relatives à la protection des droits des animaux. En outre, les animaux seront attentivement suivis et l’atteinte éventuelle des points limites évalués selon des critères adaptés, gradés et précis entrainera l’arrêt des expérimentations.

Choix des espèces

Ce projet vise à évaluer l’impact des perturbateurs endocriniens en mélange sur l’apparition et la progression des maladies du foie gras. Le modèle de poisson- zèbre se positionne comme un modèle d’étude intermédiaire entre les modèles in vitro et les modèles murins et limite ainsi l’utilisation de ces modèles mammifères. L’objectif de ce projet est en partie de renforcer cette notion en particulier pour l’étude des perturbateurs endocriniens et des vésicules extracellulaires. Le modèle zebrafish possède, en effet, de nombreux atouts : une grande similitude avec l’Homme notamment concernant le foie et les maladies du foie gras (types cellulaires et métabolisme); une grande sensibilité dans la réponse aux agents hépatotoxiques et aux perturbateurs endocriniens ainsi que des avantages méthodologiques (transparence des larves permettant l’observation directe d’organes internes). Les animaux seront utilisés, après éclosion, au stade larvaire entre 5 et 11 jours post-fertilisation. En effet, à partir du 4ème jour, les larves présentent un foie fonctionnel et sont capables de se nourrir de l’alimentation apportée : 2 éléments essentiels à ce projet. D’autre part, de nombreuses études ont montré qu’à cet âge, les larves de poisson-zèbre pouvaient être utilisées comme modèle pour tester la toxicité d’agents chimiques au niveau du foie ou étudier le développement des maladies du foie gras (induite par l’alimentation notamment).

2 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie générale répétée, ils reçoivent quatre administrations intraveineuses d'un ARN interférent et subissent cinq prélèvements de sang, cinq ponctions de liquide céphalorachidien et cinq électromyogrammes, pour évaluer la tolérance d'un candidat-médicament contre la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Le porteur indique que les ponctions peuvent provoquer maux de tête, vomissements et signes neurologiques, et que les deux animaux sont euthanasiés pour analyses histologiques et de biodistribution. Il présente le recours au primate comme une exigence réglementaire de l'ANSM, une seconde espèce non rongeur étant "requise" après les études menées chez la souris.

Objectifs

Les maladies de Charcot-Marie-Tooth (CMT) sont un groupe de maladie des nerfs périphériques héréditaires consécutives à des mutations dans un large panel de gènes et conduisant à une atteinte majeures de la myéline (gaine isolante) des nerfs périphériques . Il n’existe actuellement pas de traitement pour ces pathologies. L’objectif ici est d’évaluer la faisabilité, l’efficacité et la tolérance d’une administration intraveineuse de petits ARN interférent siARN (cible confidentiel) pathologiques à doses croissantes chez le Primate non humain (PNH), qui en se liant à l’ARN chez l’hôte empêchent la production de la protéine et ainsi empêche la maladie. Le bien-être animal sera surveillé tout au long du projet avec mise en place de critères précis d’interruption.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet est d'obtenir toutes les données préclinique permettant ensuite de proposer un essai clinique chez l’Homme pour un nouveau traitement très peu invasif par de petites molécules d'ARN interférents administrée en intraveineux. Pour rappel, il n'existe à l’heure actuelle aucun traitement

Procédures

Dans ce projet, tous les gestes techniques sont réalisés sous anesthésie générale et analgésie , et une même anesthésie générale permet la réalisation de plusieurs gestes (prise de sang + prélèvements de Liquide céphalo rachidien (LCR) et Electromyogramme (EMG) selon les temps d’intérêt de l'étude). - 4 administration intraveineuse (durée 10min) - 5 prélevements de sang et 5 prélèvements de LCR durée 30min - 5 EMG durée 10min

Impact sur les animaux

Les animaux sont soumis à plusieurs prélèvements de sang et de Liquide céphalo rachidien (LCR) avec un risque de fuite de LCR (maux de tête, vomissements, signes neurologiques) et la formations possibles d’hématomes. Mais aussi plusieurs Electromyogramme (EMG) avec un risque de douleurs musculaires passagères et enfin un risque anesthésique (hypothermie, sécheresse oculaire, anomalies cardio-respiratoire.

Devenir

A la fin du projet, l'ensemble des animaux sera euthanasié pour permettre les études histologiques et de biodistribution afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique et la tolérance de l’approche.

Remplacement

Toutes les études sur des cellules en dehors dès organismes vivants (in vitro) possibles pour valider la cible thérapeutique ont été effectuées en amont de ce projet afin de valider l’utilisation de siARN comme cible thérapeutique dans la maladie de Charcot Marie Tooth. De plus la stratégie thérapeutique a été démontrée dans 2 modèles rongeurs de la pathologie. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude d’efficacité, de toxicité, etc sur un modèle non rongeur, le plus pertinent pour reproduire le modèle est le primate car le siARN cible la protéine humaine qui est quasi identique à celle du primate. Ces étapes sont réglementaires et requises par l’ANSM pour toute demande d’autorisation pour la réalisation d’étude clinique (chez l’homme).

Réduction

Il y a 2 animaux sur ce projet, correspondant au minimum requis pour une étude statistique permettant de repondre à l'objectif du projet qui est la validation de l’efficacité de l’approche et à l’évaluation de la toxicité. L'étude statistique concernera principalement l’étude histologique et sera réalisée par un anatomopathologiste certifié.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe. Un programme d’enrichissement est mis en place pour complexifier l’environnement et permettre l’expression de comportement propres à l’espèces (ex : fourragement). Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthésie, l'utilisation d’un analgésique pour les ponctions lombaires et les injections virales, pour éviter tout inconfort. Une observation journalière sera faite tout au long du projet. A la moindre anomalie détectée, un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si nécessaire. Si un animal ne présente pas d'amélioration suite à une prise en charge vétérinaire, il sera euthanasié (avec avis vétérinaire). Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, elles sont réalisées par du personnel formé et expérimenté́. Enfin, le nombre d'anesthésies est minimisé en regroupant les procédures (prise de sang (volume adapté à la taille des animaux et conforme aux recommandations en termes de Bien-être animal), ponction lombaire) au sein de la même anesthésie générale

Choix des espèces

Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle souris de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisée et ayant permis de confirmer la preuve de concept de la thérapie testée. Cependant pour une étude de toxicologie règlementaire, une deuxième espèce animale de grande taille est requise. Les organes du singe en particulier le cerveau, se rapprochent de ceux de l’Humain en terme de structure anatomique et connectivité fonctionnelle mais aussi le système nerveux périphérique. L’administration d’une telle thérapeutique dans un individu proche de l’humain permet de définir au mieux les paramètres (dose, diffusion) et d’étudier l’efficacité et la tolérance de l’approche. Les animaux utilisés sont des macaques adultes (2-6 ans) (2 à 10 Kg) ayant un système nerveux complètement développé et myélinisé.