Procédures modérées

568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe sous la peau des cellules de lymphome ou de cancer du côlon, laissées croître jusqu'à un volume de deux mille millimètres cubes, avec des prélèvements sanguins par la queue, pour identifier le mécanisme d'un vaccin antitumoral déjà commercialisé en médecine vétérinaire. Le porteur écrit qu'un anti-inflammatoire "introduirait des biais" en défaveur de l'étude et ne sera donc pas administré, et annonce une efficacité qui "devrait" reproduire celle observée chez le chien. Sur le remplacement, il indique avoir mené des travaux in vitro et ex vivo mais juge la vérification in vivo "primordiale".

Objectifs

Le lymphome B diffus à grandes cellules est le lymphome le plus fréquent. La prise en charge thérapeutique est basée sur une immunochimiothérapie couplant le rituximab à la polychimiothérapie. Pour le patient âgé, cette thérapie n’est pas toujours applicable en particulier en raison de comorbidités notamment cardiaque. Pour pallier ce problème et envisager des traitements pouvant stimuler le système immunitaire, nous avons développé une thérapeutique basée sur l’utilisation de protéines autologues actives sur le système immunitaire. La procédure de préparation de ce vaccin est basée sur la purification de protéines tumorales sur des particules de phosphate de calcium d’hydroxyapatite. Ces particules devront être réinjectés au patient pour une réactivation spécifique de son système immunitaire contre les cellules tumorales. Cette préparation vaccinale est utilisée depuis 2013 en médecine vétérinaire dans le modèle canin. Une étude récente a mis en évidence un doublement de la survie des chiens après traitement par le vaccin. Etant donné Les résultats spectaculaires ont, la mise en place d’un essai clinique est envisagée chez l’homme. Cependant les équipes cliniques requièrent une analyse mécanistique de l’efficacité vaccinale dans un modèle pré-clinique murin. Il est envisagé d’inclure dans le protocole clinique d’autres types de cancers qui font également face à des obstacles thérapeutiques, tel que le cancer colorectal dans le projet. Enfin nos données préliminaires sur la composition du vaccin indiquent la présence de différentes protéines de choc thermique. Il est donc pertinent d’étudier leurs effets dans l’efficacité du vaccin. Nos objectifs sont donc dans ce projet, (1) de mettre au point la préparation vaccinale à partir de tumeur de lymphome B murin et de côlon, (2) de mettre au point la condition de traitement la plus efficace dans le modèle murin, (3) d’identifier les cellules immunitaires anti-tumorale et les protéines de choc thermique impliquées. L’utilisation de ce modèle dans des souris possédant un système immunitaire fonctionnel (Balb/c) a montré, dans plusieurs études, une pertinence pour identifier les cellules contrôlant le développement du lymphome et du cancer du côlon.

Bénéfices attendus

La vaccination des animaux devrait permettre une réduction tumorale significative comme celle observée chez le chien. L’identification des mécanismes antitumoraux de la vaccination nous permettra de valider les prérequis nécessaires à la mise en place d’un essai clinique de Phase I/II dans le lymphome B et le cancer du côlon.

Procédures

Il s’agira de prélever une goutte de sang pour déterminer la composition sanguine de l’animal en réponses aux vaccins. Pour dilater la veine de la queue, les souris sont placées sous une lampe d’animalerie chauffante pendant 10 minutes. Elles sont ensuite glissées dans un tube de contention adapté aux souris et acheté chez un fournisseur spécialisé. Le placement des souris ne durera qu’une dizaine de secondes par souris. Le prélèvement de sang est ensuite effectué avec une aiguille (26 Gauge) ou une lame tranchante stérile. Cette opération durera en moyenne 10 secondes par souris. Cette méthode est recommandée pour des prélèvements répétés de moins de 0,1 mL de sang. Les animaux sont maintenus dans le tube de contention pendant toute la durée du prélèvement. Le volume prélevé est au maximum de 100 microlitres (2 à 3 gouttes). Après la prise de sang un point de compression sera réalisé afin d’éviter tout saignement à l’endroit de l’incision. Une prise de sang (100uL) à J-1 avant l’injection des cellules tumorales et le jour de la mise à mort à la fin de la procédure expérimentale seront réalisés. Total de 2 prises de sang par souris. Le nombre de souris concerné par ces prises de sang sera de 532. Les 36 autres souris qui seront employées à la génération des tumeurs nécessaires à la fabrication des vaccins ne seront pas concernées par ces prises de sang. Les injections de cellules tumorales A20 (2x106 cellules) et CT26 (5x105 cellules) seront réalisées en sous-cutanée à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille de 26 Gauge et concerneront les 568 souris du projet expérimentale. Un maximum de 100 µL de suspension cellulaire seront injectés. Chaque injection de cellules tumorales durera en moyenne une dizaine de seconde. Les injections de préparation vaccinale concerneront ¬532 souris à hauteur de 4 injections vaccinales par souris et seront réalisées à J5, J7, J9 et J14 en post-injection des cellules tumorales. Chaque vaccination durera en moyenne une dizaine de seconde. Au total, pour une souris, deux prises de sang auront lieu, (à J-1 avant injection des cellules tumorales et avant la mise à mort), 5 injections (1 de cellules tumorales A20 ou CT26 et 4 injections de solution vaccinale).

Impact sur les animaux

L’utilisation du vaccin chez le chien depuis 2013 n’a pas montré d’effets indésirables. L’injection des inhibiteurs d’HSP chez la souris n’a pas montré d’effets indésirables. L’injection du vaccin peut engendrer de la souffrance et du stress au souris, c’est pour cela que l’injection se fera sous anesthésie à l’isoflurane. Également, l’injection des cellules cancéreuses A20 et CT26 par voie sous-cutanée se fera sous anesthésie à l’isoflurane et la croissance tumorale ne dépassera jamais les 2000 mm2.

Devenir

L’analyse de la réponse des souris à la vaccination nécessite une étude approfondie des tumeurs et des cellules du système immunitaires. Le prélèvement de la tumeur ainsi que des organes lymphoïdes (rate et ganglions) contenant les cellules immunitaires nécessite la mise à mort des animaux.

Remplacement

Les résultats préliminaires obtenus à partir des nombreuses expériences in-vitro et ex-vivo ont été très encourageants et ont permis de réduire le nombre de souris au regard des différents axes restant à être investigués. Des marqueurs phénotypiques ont été découvert via ces expériences ex-vivo. Toutefois, ce modèle ne nous permet pas de tester notre hypothèse d’une stimulation de certaine populations anti-tumorales du système immunitaire. C’est la raison pour laquelle il est primordial de pouvoir vérifier ces résultats dans un modèle in-vivo. Ces expériences constituent des tests pré-cliniques et ont pour but d’observer l’immunogénicité de notre traitement dans un organisme vivant immuno-compétent. Ces expériences in-vivo sont donc nécessaires afin de mettre en valeur les aspects physiologique résultants de notre thérapie. Mais également de retrouver les marqueurs phénotypiques vérifiés par les expériences ex-vivo.

Réduction

Pour chacune des combinaisons thérapeutiques (vaccination préventive ou curative, effets des inhibiteurs de HSP, ou déplétion des HSP) réalisées lors de nos expérimentations in vivo, nous utiliserons des groupes de 7 souris maximum, ce qui correspond à la taille d’échantillon minimum nécessaires à nos tests statistiques et valable avec le test non paramétrique adapté aux petits échantillons (< à 10) de Mann-Whitney. De plus, nous étudierons plusieurs éléments sur un même groupe de souris dès que cela est possible (réduction) et nous réaliserons seulement les expériences les plus indispensables sur les modèles murins.

Raffinement

Dans le but de préserver le bien-être animal et pour anticiper l’arrivée des signes de souffrance liés à la maladie, nous suivrons l’évolution de la croissance tumorale en mesurant tous les 2 jours par un pied à coulisse le volume des tumeurs, puis tous les jours lorsque la tumeur atteindra un volume égal ou supérieur à 1500 mm3. Dans le but de réduire, supprimer/soulager la douleur/détresse pour l’ensemble de nos animaux (vaccinés ou non), ces derniers seront minutieusement observés lors de chaque intervention des expérimentateurs (injection, pesées). Les injections des cellules cancéreuses A20 et CT26 pourraient engendrer de la souffrance et du stress au souris, ainsi l’injection se fera sous anesthésie à l’isoflurane. La croissance tumorale sera monitorée et ne dépassera jamais les 2000 mm2. L’injection du vaccin par voie sous-cutanée sera réalisée sous anesthésie à l’isoflurane. Un suivi (réveil et post anesthésique) sera mis en place après injection des cellules tumorales en sous-cutané (s.c.), et des vaccins (s.c.), pour nous assurer que les souris retournent à une activité normale (confort, vivacité, état sanitaire). L’utilisation d’un anti-inflammatoire introduirait des biais en notre défaveur, car cela irait à l’encontre de l’intérêt de l’étude (l’immunisation via l’utilisation d’un biomédicament). Pour pallier à cela, les animaux seront quotidiennement suivis par l’expérimentateur et en cas de signes de souffrance un analgésique sera administré. Si la souffrance persiste, l’expérience sera stoppée. De plus, des mesures seront prises pour améliorer le bien-être des animaux. L’hébergement se fera en groupe pour favoriser la socialisation des animaux. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Un enrichissement structural du milieu sera également mis en place. Un contenant sera placé dans chaque cage permettant aux souris de se cacher et de développer leur répertoire comportemental (exploration, enfouissement…). Les animaux seront mis à mort par les personnes formées. Les souris seront mises à mort par dislocation cervicale après anesthésie générale à l’isoflurane. Après la mise à mort, la mort des animaux est constatée par l’absence des signes vitaux : respiration, battements cardiaque, absence des mouvements volontaires et des réflexes.

Choix des espèces

Les souris BALB/c seront utilisées afin de se rapprocher au maximum des conditions de développement tumorale en présence d’un système immunitaire compétent. Cette condition est nécessaire pour tester les effets d’une vaccination anti-tumorale sur le système immunitaire. La souris a pour intérêt d’avoir un système immunitaire proche de celui de l’Homme. Le modèle de lymphome B murin A20 et le modèle CT26 de cancer du côlon ont été montré comme pertinent comme modèles pré-cliniques or ces modèles se développent dans des souris BALB/c. Nous utiliserons des souris femelles et mâles de 8-14 semaines car elles sont considérées comme adulte. En effet, dans le cadre de notre étude, nous avons besoin que les animaux aient atteints l’âge adulte et, en ce qui concerne les modèles de souris immunocompétentes, soient dotées d’un système immunitaire fonctionnel.

3 332 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de vecteurs viraux par chirurgie intracérébrale sous anesthésie, puis passent une série de tests, exposition à des goûts et à des sons, exploration d'un labyrinthe et test de mémoire contextuelle conditionnée, avant euthanasie pour des analyses d'électrophysiologie et d'imagerie. Le porteur présente l'objectif comme fondamental, mieux comprendre le rôle de la plasticité présynaptique dans la formation des souvenirs, sans application annoncée à court terme. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico n'étudie la neurotransmission de synapses matures et que les souris transgéniques sont "nécessaires".

Objectifs

La capacité de garder en mémoire une expérience est essentielle pour la survie des organismes supérieurs. Cette capacité est assurée en partie par 2 structures cérébrales appelées néocortex et hippocampe. Ces structures sont composées de cellules appelées "neurones". Ces derniers sont connectés entre eux par des synapses, et sont capables de modifier leurs connexions en fonction des informations qu’ils reçoivent, autrement dit, ils sont capables de « plasticité synaptique ». L'objectif général du projet est de mieux comprendre le rôle de la plasticité présynaptique dans la formation et le stockage des informations des souvenirs dans ces 2 structures du cerveau. La formation de la mémoire et la mémorisation de nouvelles informations dans les circuits neuronaux du cortex dépend de la capacité des neurones et des synapses à modifier leurs propriétés. Nous allons utiliser comme modèle soit des souris contrôle, soit des souris génétiquement modifiées (souis n'exprimant pas des protéines présynaptiques). Nous utilisons des injections localisées de vecteurs viraux (outils permettant de délivrer un gène d'intérêt) pour visualiser les cellules impliquées dans la formation de la mémoire, ou pour réaliser des modifications génétiques, en supprimant par exemple les protéines impliquées dans la plasticité présynaptique. Nous effectuerons ensuite des expériences d'électrophysiologie (enregistrement de l'activité électrique des neurones) et d'imagerie cellulaire sur tranches de cerveau, combinées à des taches comportementales.

Bénéfices attendus

Nous espérons mieux comprendre comment les neurones du cerveau, en particulier dans nos 2 structures cérébrales d'intérêt, traite la formation et le stockage d'informations des souvenirs.

Procédures

Une injection de virus par chirurgie intra cérébrale: entre 30 et 60 min pour tous les animaux du projet. Tests sensoriels: - gustatifs: exposition à différents gouts pendant 2 Heures une fois par animal. - Exposition à des sons: 5 minutes une fois par animal Tests contextuels: - Exploration dans un labyrinthe: 1H une fois par animal. Tests comportementaux de mémoire contextuelle : une fois par animal pendant 5 minutes. Injcetion intrapéritonéale durant quelques secondes d'une molécule une fois par animal.

Impact sur les animaux

Ces animaux sont soumis à des procédures dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Des nuisances ou effets indésirables potentiels sont ceux associés à la chirurgie stéréotaxique (stess de l'anesthésie, perte de poids légère). Les tests comportementaux ne durent que quelques minutes et n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux. Le test de mémoire contextuelle conditionnée peut induire un léger stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en vue d'études électrophysiologiques ou d'imagerie.

Remplacement

La souris est une espèce de choix pour étudier le système nerveux central des vertébrés, qui fournit des informations largement transférables à l'homme. Ce projet vise à mieux comprendre en quoi la plasticité présynaptique au niveau des synapses contribue à l'encodage et la mémorisation d'informations sensorielles et contextuelles. Par conséquent, aucun des modèles in vitro ou in silico ne peut être utilisé ici. En effet, les modèles alternatifs ne permettent pas d’étudier la neurotransmission au niveau de synapses matures complètement développées. De plus, l’étude du rôle des différe,tes protéines nécessite d'utiliser des souris transgéniques.

Réduction

Le même animal sera utilisé pour différents protocoles d’électrophysiologie ou d’imagerie afin de récolter un maximum de données scientifiques pour chaque souris. Si cela est possible, le nombre d’animaux sera revu à la baisse en cours d’expérimentation. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet : logement sur des racks ventilés, dans des cages adaptées, enrichissement de l'environnement (tunnel et matériel de nidification) et points limites adaptés pour éliminer ou réduire toute douleur. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du néocortex et de l'hippocampe de la souris présentent de nombreuses similitudes avec ceux d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les protocoles utilisés seront effectuées sur des animaux âgés de 3 semaines à 6 mois. L'introduction des différents gènes d'intérêt doit se faire à l'âge jeune (3 semaines) et le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge jeune adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage.

Des injections de protéines avec adjuvant de Freund, complet la première fois puis incomplet, précèdent une exsanguination par ponction intracardiaque sous anesthésie pour les souris immunisées : 600 souris âgées de 6 semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet doit produire des anticorps polyclonaux contre des protéines de Plasmodium, le parasite du paludisme, et cribler des candidats vaccins à ARNm injectés dans le muscle. Le porteur prévient que les souris "peuvent montrer des signes cliniques et comportementaux de souffrance et ou d'angoisse". Celles dont le titre d'anticorps suffit sont mises à mort pour leur sérum, et les autres doivent l'être à la fin de chaque procédure, même si le porteur ajoute qu'elles "peuvent être réutilisées dans d'autre projets dans la mesure du possible".

Objectifs

Le paludisme est un problème de santé publique, majeur qui sévit dans plus de 100 pays et fait plus de 627 000 morts par an surtout chez les jeunes enfants. Chez les femmes enceintes, l’infection par Plasmodium peut causer leur mort et celle de leur enfant ainsi qu’un poids de naissance inférieur à la normale entraînant une mortalité très fréquente après la naissance. Depuis 2021, un vaccin est disponible sur le marché. La prise d’antipaludiques et l’utilisation de moustiquaires imprégnées augmentent la résistance du parasite aux antipaludiques. La maladie est causée par le parasite du genre Plasmodium, un protozoaire appartenant au phylum des Apicomplexes. Parmi les 5 espèces qui infectent l’Homme, deux sont les plus répandues : Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax. Le cycle de vie du parasite, entre un hôte mammifère et un moustique du genre Anopheles, est complexe. La partie la mieux connue de ce cycle est la phase érythrocytaire se déroulant chez le mammifère, durant laquelle les parasites se multiplient dans les érythrocytes de l’hôte. Notre laboratoire étudie les mécanismes d’invasion des globules rouges humains par Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax. Nous nous intéressons, en particulier, au stade sanguin du cycle du parasite. Nous étudions les mécanismes mis en jeu par le parasite pour s’attacher au globule rouge, y pénétrer et s’y développer. Cette phase érythrocytaire pour P. falciparum et P. knowlesi, peut être reproduite in vitro dans des systèmes de culture de globules rouges humains. Nous avons identifié plusieurs protéines d’intérêt exprimées par le parasite lors de son cycle de vie dans le globule rouge. Afin de les étudier, nous allons produire, chez la souris, des anticorps polyclonaux (AcP) dirigés contre ces protéines. Ces anticorps nous permettrons d’inhiber ces protéines à la surface du merozoïte (forme du parasite permettant d’infecter un nouveau globule rouge) ainsi que de déterminer la réponse immunitaire des candidats vaccins.

Bénéfices attendus

Notre compréhension du paludisme est limitée par des outils de recherche tels que les anticorps. Il existe en effet peu d’anticorps spécifiques contre les différentes espèces de Plasmodium disponibles. Ce projet a pour but de produire un outil qui sera indispensable dans la lutte contre cette maladie. Les anticorps sont essentiels pour faire progresser notre connaissance sur le fonctionnement du parasite. Nous pouvons étudier l’expression de ces molécules dans les différents stades du parasite en utilisant les techniques suivantes : ELISA, Western Blot, l’inhibition de la croissance parasitaire, les procédures d’immunoprécipitation, l’immunofluoromicroscopie. Avec des anticorps spécifiques nous sommes en mesure de mieux comprendre l’implication des protéines responsables de l’invasion chez P. falciparum, P. vivax et P. knowlesi. De plus, les infections de souris par des candidats vaccins permettront un criblage des préparations vaccinales.

Procédures

1) Une prise de sang (une minute). 2) Une injection (une minute). 3) L'exsanguination par ponction intra-cardiaque (5 minutes) à la fin de l’expérience, préalablement anesthésiées par injection par voie intrapéritonéale (une minute).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont liés à l’injection des protéines avec adjuvant et des candidats vaccins. Dans des très rares cas les souris peuvent mal supporter les protéines recombinantes et les candidats vaccins à ARNm. Elles peuvent montrer une réaction inflammatoire. Les souris recevront les protéines recombinantes en présence d’adjuvant Complet de Freund (CFA) pour la première injection et l'adjuvant Incomplète de Freund (IFA) pour les autres injections. L’utilisation de l’adjuvant CFA par voie sous-cutanée peut induire des effets indésirables. Les injections des candidats vaccins à ARNm se feront par la voie intra-musculaire sans adjuvant. Les souris peuvent montrer des signes cliniques et comportementaux de souffrance et ou d’angoisse.

Devenir

Toutes les souris ayant un titre d’anticorps satisfaisant seront mises à mort afin d’obtenir une quantité de sérum suffisant pour l’études des protéines d’invasion ou déterminer les candidats vaccins permettant la meilleure immunisation possible contre P. falciparum, P. vivax ou P. knowlesi. Toutes les souris n’ayant de titre d’anticorps satisfaisant lors de prélèvements intermédiaires seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car elles ont reçu au moins une injection de protéines recombinantes ou une dose de candidats vaccins à ARNm. Elles ne peuvent donc pas être réutilisés dans notre projet. Cependant, elles peuvent être réutilisées dans d’autre projets dans la mesure du possible.

Remplacement

L’alternative possible à l’emploi de sérums serait d’employer les sérums prélevés chez des personnes vivant en zone d’endémie, porteuses d’anticorps contre les antigènes d’intérêt et d’immuno-purifier les immunoglobulines spécifiques par affinité sur les antigènes recombinants. Les expériences d’autre groupes de recherche ont montré que les anticorps ainsi obtenus sont de faible affinité pour des protéines spécifiques, avec un titre très faible et ne fonctionnent pas pour les protéines intracellulaires qui ne sont pas exposée à la réponse immunitaire de l'hôte. Il existe aujourd'hui des alternatives non animales pour produire les anticorps telles que les anticorps recombinants et les aptamères (courts fragments d'ADN ou d'ARN qui peuvent se lier à des cibles telles que des protéines). Cependant, une bibliothèque de gènes d'anticorps de Plasmodium n'a pas encore été constituée, ce qui rend cette technique hors de portée pour le moment. Le recours à l’animal est nécessaire car ces anticorps ne peuvent être obtenus qu’après immunisation d’une espèce animale. Cependant, pour chaque protéine identifiée avec certitude dans l’invasion du globule rouge par P. falciparum, P. vivax ou P. knowlesi, nous ferons des hybridomes permettant d’obtenir des anticorps monoclonaux. Ce qui nous permettra de bénéficier d’une banque d’anticorps pour l’étude des mécanismes d’invasion du globule rouge par les Plasmodium.

Réduction

Le nombre de souris pour chaque expérimentation a été calculé au plus juste pour permettre un nombre minimum des animaux. Cette estimation a été réalisée en concertation avec un biostatisticien. Ainsi, nous avons choisi des groupes de 5 souris dont les sérums seront poolés afin d’avoir une quantité de sérums suffisante pour une étude approfondie et répétée.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse de nos souris, nous mettrons en œuvre un enrichissement de l’environnement avec par exemple des abris et des bâtons de coton pour la nidification. Si les souris montrent des signes de détresse ou de souffrance pendant les prélèvements nous pouvons utiliser une anesthésie gazeuse sous isoflurane. Une surveillance accrue pendant 3 jours suivant les injections et puis 2 fois par semaine entre les injections et les prélèvements ainsi que des soins post manipulation (injections et prélèvements) seront pratiqués.

Choix des espèces

Nous avons choisi de produire nos anticorps chez la souris car nous savons par des expériences antérieures que les protéines recombinantes de Plasmodium sont très immunogènes chez la souris. De plus il est indispensable de tester des candidats vaccins sur des souris avant de continuer leur développement. Les souris utilisées pour les immunisations seront âgées de 6 semaines, âge auquel on obtient une bonne réponse immune et une préhension correcte pour l’immunisation et le prélèvement sanguin.

90 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont inoculés avec des virus porcins vivants par voie nasale, trachéale, intramusculaire ou intradermique, sans anesthésie, puis subissent des ponctions sanguines hebdomadaires et d'éventuels rappels d'immunisation, avant d'être mis à mort trois à quatorze semaines plus tard pour prélever la totalité de leur sang. L'objectif est de produire des sérums de référence servant à détecter ces virus dans les élevages, le porteur invoquant leur caractère "indispensable" et une corpulence permettant de récupérer au moins deux litres de sang par animal. Sur le remplacement, il affirme en une phrase que ces sérums ne peuvent "pas être produits in vitro".

Objectifs

Afin de pouvoir assurer le diagnostic des maladies virales des porcs et des sangliers, il est nécessaire pour notre laboratoire de disposer d’outils de caractérisation des pathogènes recherchés. Plusieurs pathogènes font en effet l’objet d’une surveillance en élevage de suidés ou chez les sangliers sauvages. Les Laboratoires nationaux de référence ou Laboratoires experts ont pour mission de proposer des méthodes de détection virologique et sérologique fiables pour leurs activités de surveillance et de recherche. Un sérum contenant des anticorps dirigés contre un agent pathogène spécifique est indispensable pour détecter et caractériser ce pathogène dans divers échantillons biologiques ou pour servir de contrôle positif pour valider des tests. L’objectif du projet expérimental est de produire des sérums dits post-infectieux (SPI) ou hyperimmuns (SHI) vis à vis de souches de virus porcins. Pour cela, le virus sera inoculé à des porcs indemnes de ce pathogène particulier, en une fois ou à plusieurs reprises (1 ou 2 à 3 rappels d’immunisation). Dans le cas de virus très virulents pour le porc, les animaux pourront être préalablement vaccinés afin d’être protégés de l’infection, ou le virus pourra être inactivé. Ces porcs seront suivis sur le plan clinique et mis à mort 3 à 14 semaines plus tard pour récolter un volume important de sang nécessaire à l’obtention d’une quantité suffisante de réactifs de référence.

Bénéfices attendus

Le modèle porc nous permet de récupérer de grandes quantités de sérums avec un minimum d’animaux afin de disposer de matériaux de référence spécifiques à la maladie virale étudiée et à l’espèce animale concernée.

Procédures

Tous les actes prévus sur les animaux se feront sur animaux vigiles. Aucune anesthésie n’est prévue dans ce projet lors des différentes interventions du fait de leur rapidité (moins d’une minute) et de leur caractère peu invasif. Les inoculations et les ponctions sanguines seront effectués le plus rapidement possible. Dans la procédure 1, les 2 à 3 porcs de chaque lot seront inoculés avec du virus par la voie la plus appropriée (ex : intranasale, oronasale, intratrachéale, intramusculaire ou intradermique) et une ponction sanguine sera réalisée de façon hebdomadaire pendant les 3 semaines de l’étude expérimentale. Concernant la procédure 2, les 2 à 3 porcs de chaque lot seront inoculés avec du virus par la voie la plus appropriée (ex : intranasale, oronasale, intra-trachéale, intramusculaire ou intradermique) et 1 autre injection du virus sera réalisée 3 semaines après la première inoculation. Un second rappel d’immunisation pourra être programmé 2 semaines plus tard. Une ponction sanguine sera réalisée de façon hebdomadaire tout au long du projet. Il est possible de collecter 15 tubes de sang juste avant le 1er rappel d’immunisation pour obtenir un SPI en faible volume. Enfin, le protocole suivi dans la procédure 3 sera le même que dans la procédure 2 mais les animaux auront été préalablement vaccinés à 1 ou 2 reprises par la voie appropriée avant d’être inoculés avec du virus.

Impact sur les animaux

La vaccination et les inoculations des virus vivants par voie oro/nasale, intratrachéale, intramusculaire ou intradermique peuvent entrainer une hyperthermie transitoire (quelques jours). Les virus considérés plus pathogènes seront inactivés ou inoculés à des animaux préalablement vaccinés contre le virus en question. Pour les rappels d’immunisation par voie intramusculaire en présence d’adjuvant, un seul point d’injection est réalisé pour limiter les actes invasifs. L’adjuvant utilisé est également reconnu pour son innocuité. Aucune symptomatologie sévère n’est attendue lors de ces procédures.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour pouvoir collecter le volume sanguin total et récupérer le sérum riche en anticorps.

Remplacement

Production de réactifs sérologiques (sérums) de référence ne pouvant pas être produits in vitro.

Réduction

Chaque production de SPI/SHI vis-à-vis d’un virus implique 2 à 3 porcs de 4 à 12 semaines d’âge. Les réponses immunitaires pouvant légèrement varier d’un individu à l’autre, il est d’usage d’inoculer à minima 2 porcs pour chacun des virus de référence vis-à-vis desquels il est prévu de produire des SPI et/ou SHI. A raison de 3 porcs par virus inoculé et se basant sur une estimation d’un besoin annuel de deux nouveaux sérums vis-à-vis de trois virus représentatifs des maladies virales porcines pouvant infecter les porcs ou les sangliers en France et selon l’historique de production de ce type de réactif sur 17 années (2005-2022), 90 porcs devraient être utilisés sur les 5 années de validité du projet.

Raffinement

Les animaux seront logés dans des parcs par groupe de 2 ou 3. Ils auront accès à de l'eau à discrétion et ils seront alimentés à volonté. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et une plaque de couchage. Enfin, les porcs auront à leur disposition des matériaux manipulables (mordilles, boules en matière plastique, tourniquets et tubes à relever et à abaisser) qui seront renouvelés au cours de l’expérimentation. Un soin sera apporté au suivi clinique de chaque animal au quotidien. L’examen clinique comprendra une observation "visuelle" de l'état de santé général des animaux et un relevé de la température rectale de tous les porcs. De plus, l’évolution pondérale sera suivie par des pesées individuelles hebdomadaires, à partir de l'installation des animaux dans les animaleries jusqu’à l’autopsie. La consommation alimentaire au niveau de la case sera également connue chaque semaine. Si une altération de l’état de santé était notée, les animaux concernés seront mis à mort en cas d’atteinte des points limites décrits dans les procédures expérimentales (partie 4). Si un ou plusieurs rappels d’immunisation sont réalisés et que le virus est administré par voie intramusculaire en présence d’adjuvant, ce dernier sera choisi pour son innocuité. Pour limiter les actes, le suivi sérologique sera réalisé à partir de ponctions sanguines effectuées à une fréquence hebdomadaire, jusqu’à la fin de l’essai, cette cinétique étant suffisante pour évaluer le plateau de la production en anticorps.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible des virus porcins et est donc l’espèce choisie pour la récolte de sérums contenant les anticorps d’intérêt. Les animaux sont sevrés à 3 ou 4 semaines d’âge. Ils auront au minimum 4 semaines d’âge au moment de la première inoculation et au maximum 15 semaines lors du dernier rappel d’immunisation. A 4 semaines, le porc présente d’un point de vue physiologique un système immunitaire quasi-mature. A la fin de l’essai, sa corpulence permet de récupérer au moins 2 L de sang.

64 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'anticorps, par voie intraveineuse sous anesthésie ou trois injections intrapéritonéales par semaine pendant un mois, avec des prélèvements sanguins rétro-orbitaux hebdomadaires sous anesthésie jusqu'à cent jours, pour mesurer la durée d'action d'une immunothérapie anti-CD45RC avant un essai clinique. Le porteur indique que la biosécurité de l'anticorps a déjà été démontrée et qu'aucun effet indésirable n'a été observé, et précise que tous les rats sont euthanasiés pour analyser le sang, la rate, les ganglions et la moelle osseuse. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'ensemble des systèmes biologiques humains et conclut que le rat reste le "meilleur modèle".

Objectifs

L'immunothérapie ciblée constitue un espoir majeur dans le traitement de nombreuses pathologies dont les maladies inflammatoires, les maladies auto-immunes ou encore le rejet de greffe. Contrairement aux médicament immunosuppresseurs couramment utilisés, la thérapie par injection d'anticorps permet d'induire des effets immunomodulateurs spécifiques en agissant uniquement sur les populations cellulaires d'intérêt. Depuis plusieurs années, notre équipe de recherche a démontré l'efficacité de l'immunothérapie par injection d'anticorps dans le contrôle de l'inflammation dans des modèles de transplantation, de maladie du greffon contre l'hôte et de maladie auto-immune. Une nouvelle société pharmaceutique développe actuellement plusieurs versions de cet anticorps. Les résultats obtenus suite à la collaboration entre cette société et notre laboratoire de recherche permettent aujourd'hui d'envisager un essai clinique de phase I courant 2024. L'objectif de ce projet est donc d'étudier la pharmacodynamique (la durée de l'effet thérapeutique) de l'anticorps in vivo chez le rat en prévision de cet essai clinique.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est de définir à la fois la durée de l'effet d'une injection d'anticorps, et la durée de l'effet d'un cycle de traitment par injection répétées d'anticorps. Ces résultats ont pour objectif final d'orienter le protocole de traitement pour l'essai clinique chez l'Homme.

Procédures

Les animaux auront soit une seule injection d'anticorps en intraveineuse (sous anesthésie) soit un mois de traitement avec 3 injections intrapéritonéales par semaine. Dans les deux cas, un petit volume de sang sera prélevé en rétro-orbital sous anesthésie toutes les semaines à partir de la dernière injection et jusqu'à réapparition des cellules (maximum 100 jours après la dernière injection d'anticorps) pour controler l'efficacité à long terme du traitement.

Impact sur les animaux

La biosécurité de l'anticorps, selon la dose et les protocoles utilisés dans cette étude, a déjà été démontré. Aucune nuisance ou effet indésirable n'a été observé. Les injections intraveineuses ou intrapéritonéales ainsi que les prélèvements sanguins peuvent engendrer une douleur légère de courte durée.

Devenir

L'euthanasie au terme de la procédure ou à l'atteinte du point limite est nécessaire pour permettre l'analyse en parallèle des cellules présentes dans le sang et dans les tissus tels que la rate, les ganglions et la moelle osseuse.

Remplacement

Le développement de nouvelles thérapeutiques pour le traitement de maladies humaines nécessite une phase d'étude pré-clinique réalisée chez l'animal lorsqu'aucun modèle expérimental in vitro ne permet de le remplacer. Aujourd'hui il n'existe pas de modèle in vitro qui permette de reproduire l'ensemble des systèmes biologiques présents chez l'homme. Ainsi, l'injection d'anticorps chez le rat (anticorps démontré comme étant un bon susbtitut de l'anticorps humain) est le meilleur modèle pour étudier la durée de l'effet du traitement en prévision d'un essai clinique chez l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet a été détermineé de manière à pouvoir effectuer différents tests statistiques qui pourront permettre d'obtenir des résultats significatifs pour conclure sur l'efficacité ou non du traitement.

Raffinement

Avant même le début de la procédure les animaux seront entrainés à la contention de manière à ce que les injections de traitement puissent se dérouler sans créer de stress supplémentaire chez l'animal. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens et les symptômes seront évalués selon une grille critériée deux fois par semaine par les personnes responsables de la procédure. Les rats seront hébergés à plusieurs dans des cages dont la surface sera adaptée au nombre d'individu et disposeront en permanence d'enrichissement (rouleau en carton, batônnet de bois,...).

Choix des espèces

Nous avons déjà démontré l'intérêt des modèles de rats pour étudier les pathologies humaines et notamment pour étudier l'implication de certaines cellules dans leur développement. Ainsi, en plus d'avoir mis en évidence la pertinence de l'utilisation des modèles de rats, nous avons prouver que l'injection de notre anticorps n'induit pas d'effets indésirables ou nuisibles chez le rat adulte.

779 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des pompes osmotiques renouvelées deux fois, des injections dans la veine saphène, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline et des tests comportementaux dont le RNT ne précise pas la nature, pour tenter de faire produire un peptide de la reproduction par leurs cellules musculaires. Le porteur signale des douleurs, une perte de poids et une perte de mobilité liées aux pompes et aux injections, tous les animaux étant mis à mort pour prélèvement d'organes. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement n'est envisageable pour cette approche encore jamais testée.

Objectifs

La kisspeptine (Kp), produite dans le cerveau, est un puissant stimulateur de la sécrétion de gonadolibérine (GnRH) qui, à son tour, induit la libération de l’hormone lutéinisante (LH) dans la circulation sanguine chez les mammifères. A ce jour, de très nombreuses études ont évalué l’effet d’une injection aigüe de kisspeptine pour tenter de comprendre et de maitriser la reproduction de plusieurs mammifères (notamment la souris, l’Homme, mais aussi les animaux de rente pour lesquels le système reproducteur n’est pas actif tout au long de l’année). De ce fait, les mécanismes impliquant le contrôle de la sécrétion de LH et l'action de la Kp sont alors très bien connus et documentés. Cependant, une faiblesse majeure de la kisspeptine, utilisée en tant que telle pour maitriser la reproduction, est le délai d’action de la protéine qui est relativement vite dégradée. Des études ont alors tenté de mettre au point une forme modifiée de la kisspeptine afin de la rendre plus résistante aux processus de dégradation. A ce jour, aucune forme modifiée du peptide n’a cependant été assez performante pour être utilisée comme outils de maitrise de la reproduction. Le présent projet vise alors à adopter une approche totalement innovante à la lumière de ce qui est en cours de développement dans le domaine des biomédicaments : faire produire la kisspeptine directement par les cellules musculaires qui sont des cellules définitivement différenciées, qui ne se divisent pas, et sont capables de fortement exprimer une protéine puis de l'excréter dans le système circulatoire. Concrètement, l’idée est d’injecter dans le muscle un complexe ADN pour faire produire de la Kp qui sera excrété du muscle vers le système sanguin. Comme ils n’impliquent pas d’agents viraux, ces complexes sont plus faciles d’utilisation et n’ont pas d’effet inflammatoire. Nous souhaitons donc tester si l’injection de ces complexes dans le muscle peut être une technique efficace pour, à terme, faire produire de façon stable la Kp dans l’optique de stimuler ou inhiber la reproduction de l’organisme cible qui, dans ce projet, est la souris.

Bénéfices attendus

Le présent projet vise à mettre au point une méthode permettant de sécréter de la kisspeptine de façon continue par les cellules musculaires de l’organisme cible. Les bénéfices sont donc multiples 1) étudier l’effet d’une diffusion continue de kisspeptine sur la physiologie de l’organisme, 2) mettre au point une technique de production de peptides par les cellules musculaires et 3) développer un outil permettant de maitriser la reproduction.

Procédures

- Pose de mini pompes osmotiques sur 96 animaux : les mini pompes diffusent la solution qu'ils contiennent pendant 28 jours maximum, le protocole étant prévu pour 3 mois, les mini pompes seront remplacées 2 fois. - Test de tolérance au glucose (GTT) et à l'insuline (ITT) sur 56 animaux avec des prélèvements de sang. L'ITT sera toujours réalisé 1 semaine avant le GTT et ceux ci seront réalisés 3 fois avec 28 jours d'intervalle. - Frottis vaginaux réalisés sur 28 femelles sur une période de 8 jours tout les 28 jours. - Tests de comportements sur 80 animaux - Prises de sang sur 96 animaux tout les 28 jours. L'intervention sera réalisée 4 fois. - Injection d'un solution et 16 prélèvements de 4ul de sang de façon sériée, une seule fois au 84ème jour du protocole. - Mise à mort après anesthésie - Injection hydrodynamique d'un vecteur plasmidique via la veine saphène réalisé sur 637 animaux au total sur les deux procédure (630 + 7). Prises de sang tout les 10 jours pendant 3 mois, soit 9 fois. - Mise à mort après anesthésie - Electroporation ou injection hydrodynamique sur 14 animaux

Impact sur les animaux

Le peptide et ses effets sont très bien décrits chez les mammifères, et notamment chez les rongeurs. En termes de manipulation des animaux, les tests comportementaux, chirurgies, injections et prises de sang sont des manipulations maitrisées par le laboratoire et réalisées par du personnel expérimenté. Cependant, des effets secondaires peuvent être observés, notamment suite à la pose des mini pompes ou l'injection hydrodynamique : des douleurs, perte de poids et perte de mobilité peuvent apparaître mais sont anticipés par l'injection d'antidouleurs au moment des procédures. De plus un suivi journalier sera mis en place pour prévenir ce genre d'effets et pouvoir traiter les animaux en conséquence. L’objectif de ce projet est d’induire une production continue de kisspeptine par l’organisme, ce qui n’a encore jamais été testé jusqu’à présent.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d’organes pour des études post mortem

Remplacement

Une grande partie du travail de sélection des meilleurs vecteurs ADN a été réalisé en amont sur des modèles de cultures cellulaire, mais l'étude de l'effet de la Kp sur la fonction de reproduction et sur la physiologie globale de l’organisme nécessite un système complexe et vivant tel que le modèle murin afin d'avoir une compréhension complète des mécanismes mis en jeu, aucune méthode de remplacement n'est donc envisageable dans ce contexte.

Réduction

Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. A la lumière des études publiées dans le domaine et de notre expérience, il nous sera nécessaire de constituer des groupes de 7 animaux par traitement.

Raffinement

Les animaux impliqués dans cette étude sont élevés dans les conditions d'élevage classique dans des cages en présence d'enrichissement (de type carton pour la mise en place d'un nid, petite cabane en carton...). De plus, les animaux seront visités au moins une fois par jour avec contact direct ou non (sans réalisation de procédure), permettant l'habituation de l'animal à l’expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Aussi une attention toute particulière sera portée aux points limites. Un suivi journalier sera mis en place tout au long de la période d'expérimentation pour évaluer l'état de bien-être des animaux en s'assurant que les points limites ne soient pas atteints. Le comportement et l'apparence des souris sera suivi avec attention et les animaux seront pesés tous les jours pendant 3 jours après les prises de sangs puis tous les 2 jours jusqu'aux prochains prélèvements. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de l'euthanasie ou le soulagement de la douleur des animaux suivant le stade d'atteinte des points limites. Afin de de réduire le stress lié aux prélèvements de sang et permettre l'habituation des animaux à cette procédure, un morceau de cookie sera apporté aux animaux après chaque prélèvement sanguin. De plus, lors des chirurgies (implantation de mini pompes et injections hydrodynamique, des traitements anesthésiques et analgésiques seront apportés aux animaux pour réduire leur douleurs au maximum.

Choix des espèces

Les mécanismes d’action de la kisspeptine, de façon aigüe chez la souris sont très bien documentés au niveau de la physiologie de la reproduction. De plus les mécanismes sous-jacents sont bien décrits et conservés chez les mammifères. Cependant, l’effet de la kisspeptine sur le long terme sur la physiologie globale de l’organisme reste assez peu étudiée, or, ce peptide est de plus en plus présenté comme étant un outil prometteur pour la maitrise de la reproduction et le traitement de pathologies associées à la fertilité. La souris est alors un très bon modèle pour analyser les effets de composés sur la physiologie et le comportement tout en offrant la possibilité de réaliser des parallèles avec d’autres espèces qui permettront d’avoir un bon aperçu de l’effet de la kisspeptine sur le long terme. Enfin, ces études font suite à des manipulations in vitro et permettront de poursuivre avec des expérimentations sur les espèces de rente telles que les ovins et constituent alors un chainon essentiel au développement de notre approche de façon optimale et rigoureuse.

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues prédiabétiques par une alimentation grasse et sucrée, elles sont gavées chaque jour pendant cinq semaines, puis soumises à des tests de tolérance au glucose et aux lipides avec incision de la queue, pour comparer des bactéries probiotiques. Le porteur mentionne comme effets un gonflement de l'œsophage, une prostration possible et une infection au point d'incision, les souris étant anesthésiées puis mises à mort pour prélever leurs organes. Il justifie l'usage de la souris par l'impossibilité éthique de prélever ces organes chez l'humain.

Objectifs

Le diabète de type 2 est une maladie reconnue comme une priorité urgente et un enjeu majeur de santé publique. La mortalité et la morbidité associées à cette maladie entraînent des coûts exorbitants de santé dans le monde. A ce jour, malgré un arsenal thérapeutique important, le traitement est loin d'être optimal. Il apparaît urgent d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour optimiser le traitement des patients. Une nouvelle voie s’est ouverte depuis que des études ont montré que l’un des effets bénéfiques d’un médicament anti-diabétique très largement prescrit résulte de sa capacité à modifier les populations de bactéries présentes dans l’intestin. Actuellement, des souches de bactéries probiotiques sont développées pour améliorer l’état du métabolisme des patients diabétiques de type 2. Les probiotiques sont définis comme des microorganismes vivants qui, lorsqu’ils sont administrés en quantité suffisante, confèrent un bienfait pour la santé de l’hôte. Récemment, dans modèle de souris, une nouvelle souche de bactérie probiotique ciblant le diabète de type 2 a été identifiée. Ce projet vise à identifier le mécanisme d’action de cette nouvelle souche en la comparant avec des bactéries probiotiques déjà connues et qui ont des effets bénéfiques sur le diabète.

Bénéfices attendus

A court teme, ce projet permettra de comparer les effets d’une nouvelle bactérie probiotique avec des bactéries probiotiques déjà connues sur le métabolisme du glucose et des lipides afin identifier son mécanisme d’action. A plus long terme, les résultats de ce projet ouvriront la possibilité de valider l’effet anti-diabétique de la nouvelle bactérie vivante ou de préférence de la bactérie sous une forme inactivée pasteurisée (risque sanitaire réduit) chez des personnes diabétiques au cours d’un essai clinique. Ainsi, ce projet doit permettre de développer un nouveau traitement pour les patients avec un diabète de type 2, ce qui est particulièrement précieux face à des traitements médicaux existants qui ne sont pas optimaux.

Procédures

Toutes les souris éveillées seront gavées pendant 5 semaines (tous les jours, une fois par jour, 15 secondes au maximum par souris). A l’issue des 3 premières semaines de traitement à l’âge de 13 semaines, toutes les souris éveillées seront soumises à un test sanguin permettant de mesurer l’effet du traitement sur la capacité de leur organisme à utiliser le glucose injecté dans la cavité abdominale (une fois, 15 secondes). L’évolution du taux de sucre dans le sang après l’injection du glucose sera mesuré 5 fois dans une goutte de sang issue d’une légère inscision à la queue de l’animal (une seule incision, 5 secondes par prélèvement). A l’âge de 14 semaines, toutes les souris éveillées seront soumises à un test de charge en lipides donnés par gavage pour tester leur capacité à absorber les lipides (une fois, 15 seconde). L’évolution des taux de lipides dans le sang sera suivie 4 fois par un prélèvement d’une goutte de sang à la queue des souris (5 secondes par prélèvement). A l’âge de 15 semaines, toutes les souris seront anesthésiées par injection (une fois 15 secondes) pour effectuer un dernier prélèvement sanguin (20 secondes). Les souris anesthésiées seront mises à mort immédiatement après le prélèvement sanguin (2 secondes).

Impact sur les animaux

On pourrait observer après gavage du sang sur la canule, un gonflement de l’œsophage et/ou une prostration de la souris. Dans les jours qui suivent l’incision superficielle de la veine de la queue (une seule fois par test), une infection au point d’incision peut être observé. Il est important de noter qu’au cours des protocoles similaires précédemment réalisés, aucun comportement anormal qui dénote une souffrance ou une anxiété particulière chez les animaux n’a été observé.

Devenir

A l’issue du protocole, à l’âge de 15 semaines, tous les animaux seront anesthésiés avant une dernière prise de sang, puis les souris seront rapidement mises à mort pour récupérer les organes nécessaires aux analyses biologiques pour permettre l’identification du mécanisme d’action de la bactérie probiotique.

Remplacement

Comme l’effet attendu d’un anti-diabétique se fait par des modifications physiologiques coordonnées entre plusieurs organes (foie, intestin et tissus adipeux, entre autres) et qu’il n’est pas possible éthiquement de réaliser ces prélèvements dans chacun de ces organes chez l’Homme, ils seront réalisés chez la souris, un animal qui fonctionne physiologiquement de manière similaire à l’Homme pour les paramètres physiologiques analysés.

Réduction

Le nombre de 16 animaux par groupe a été déterminé par un calcul de puissance statistique et par l’expérience acquise dans des protocoles précédemment réalisés. Avec cet effectif de 16 souris par groupe, les données recueillies pourront être comparées entre le groupe contrôle et les groupes traîtés à l’aide de tests statistiques ce qui permetta de répondre aux questions initialement posées. Plusieurs bactéries seront testées en parallèle afin de ne consituter qu’une seule fois les groupes contrôles et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les souris seront surveillées tous les jours avec une attention particulière en période de gavâge pour vérifier l’apparition de troubles du comportement ou de stress. Il est important de noter qu’au cours des protocoles similaires précédemment réalisés, aucun comportement anormal qui dénote une souffrance ou une anxiété particulière chez les animaux n’a été observé. De plus, la personne qui va manipuler les souris lors du gavage est très expérimentée (si possible toujours la même), et réalisera un geste rapide et précis pour limiter la souffrance et l’angoisse des animaux.

Choix des espèces

Au sein de la communauté scientifique, les travaux effectués dans le domaine des bactéries probiotiques sont majoritairement réalisés chez la souris ce qui permet la comparaison des résultats obtenus par les différentes équipes. Comme la physiologie du métabolisme des sucres et des lipides chez la souris est proche de celle de l’Homme, les expériences seront réalisées chez cette espèce animale. La souris C57BL/6J est reconnue comme une souche de référence pour les études du métabolisme et tolère très bien la nourriture riche en gras et en sucres. De plus, les altérations du métabolisme glucidique et lipidique induites chez les souris par une nourriture riche en gras et en sucres sont très bien décrites et maîtrisées. L’intervention nutritionnelle débutera chez les souris âgées de 10 semaines car à cet âge, les souris sont adultes et présentent un microbiote intestinal mature. De plus, à l’âge de 10 semaines de vie, les souris sont métaboliquement prêtes à consommer une nourriture riche en gras et en sucres et à développer les altérations métaboliques voulues.

80 médakas vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les poissons sont manipulés, photographiés et pesés, puis soumis par couple à une montée rapide de température jusqu'à la perte d'équilibre, pour mesurer leur tolérance thermique dans un contexte de changement climatique. Le porteur reconnaît un stress lié aux manipulations et au stress thermique, les poissons étant mis à mort après deux semaines pour prélever leurs muscles et alimenter une banque de tissus. Il affirme que l'étude de l'écologie ne peut se faire ni sur cellules ni sur tissus isolés.

Objectifs

Les effets du changement climatique sur la faune et la flore sont déjà bien visibles. Un des grands défis en écologie est donc d’identifier les effets de ce changement sur la survie des espèces et la biodiversité. L'objectif de ce projet est d’examiner comment la température influence les réponses physiologiques du poisson médaka Oryzias latipes. Nous voulons utiliser des poissons élevés à deux températures afin de réaliser des mesures de tolérance thermique (résistance à des températures chaudes) pour déterminer si les poissons peuvent s’adapter à des températures plus élevées. Nous nous attendons à ce que les poissons élevés à des températures chaudes puissent tolérer des températures plus élevées que ceux élevés à des températures froides. L’objectif de ce projet est donc de tester cette hypothèse.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des connaissances essentielles à propos de l’adaptation des poissons à des températures plus chaudes.

Procédures

Les poissons seront soumis à des manipulations en laboratoire (transfert entre aquariums, mesures morphométriques et pesées). Les transferts durent environ 10 secondes et le poisson est immergé dans un bac de 2L. Pour les mesures morphométriques, nous prenons des photographies des poissons dans une boite de pétri avec un fond d’eau afin que les poissons restent immergés mais sans possibilité de nager. La prise de photo prend 30 secondes. Pour peser les poissons, chaque poisson est transféré individuellement dans un bac de 2L noir opaque. Le contenant et son contenu sont ensuite pesés à l'aide d'une balance de précision. Le poisson est ensuite retourné à l'élevage. Cette manipulation est rapide (1 minute par poisson) et le poisson reste immergé. Pendant l’expérience de tolérance thermique, les poissons subiront une augmentation rapide de la température et serons sortis du groupe pour être placés en couple. L’expérience durera 4h au maximum pendant lesquelles les poissons seront exposés (par couple) à une montée rapide de la température jusqu’à la perte de l’équilibre du poisson qui est utilisée comme indicateur du CTmax. Les poissons ne feront l’expérience qu’une seule fois.

Impact sur les animaux

Tout d’abord, les poissons subiront un léger stress lors des manipulations en laboratoire (transfert entre aquariums, photographie et pesées). Les poissons subiront un stress plus important lors des expériences de tolérance thermique en raison du stress thermique et de la sortie du groupe (isolement en couple). Néanmoins, ce type d’expérience est pratiqué sur les poissons depuis des décennies et n’entraîne pas de mortalité. Dans notre cas, l’expérience sera de courte durée (4 heures maximum) et les poissons ne feront l’expérience qu’une seule fois.

Devenir

Pour cette expérience, n=80 (40 mâles, 40 femelles) individus seront utilisés au total pour la mesure de tolérance thermique. Après deux semaines de récupération, ils seront ensuite mis à mort. Leurs muscles seront ensuite utilisés pour effectuer des mesures de respiration tissulaire. De plus, tous les individus seront stockés dans une banque de tissus pour des analyses ultérieures.

Remplacement

L'écologie a pour objet l'étude des populations et des écosystèmes. Il n'est donc pas possible de substituer des cellules ou des tissus à des individus pour de telles recherches. Le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à la problématique posée (règle des 3 R : Remplacement) étant donné qu’il s’agit d’étudier les réponses comportementales et physiologiques des poissons.

Réduction

Nous prévoyons d’utiliser un total de 80 poissons. Puisque les mâles et les femelles ont des physiologies différentes, il est nécessaire de tester les deux sexes (mâles et femelles). Notre choix pour ce nombre de poisson est justifié par des tests statistiques qui indiquent que l’on doit tester 80 poissons pour pouvoir détecter une différence entre les poissons élevés à des températures chaudes et ceux élevés à des températures froides et pour détecter d’éventuelles différences entre les lignées.

Raffinement

Pour les transferts entre aquarium, nous utilisons un bac de 2L avec un fond noir pour ne pas stresser les poissons. Les transferts sont rapides (10 secondes). Pour les photographies, nous prenons des photographies des poissons dans une boite avec un fond d’eau afin que les poissons restent immergés. La prise de photo prend 30 secondes et la lumière est tamisée pour réduire le stress au maximum. Pour peser les poissons, chaque poisson est transféré individuellement dans un bac de 2L noir opaque, contenant de l’eau de l’élevage (cette eau est changée à chaque poisson pour limiter le stress lié à la production d’hormones). Le poisson est ensuite transféré dans un petit contenant noir opaque contenant 100mL d’eau. Le contenant et son contenu sont ensuite pesés à l'aide d'une balance de précision. Le poisson est ensuite retourné à l'élevage. Cette manipulation est rapide (1 minute par poisson) et est effectuée sous lumière tamisée. Les mesures de tolérance thermique seront les plus courtes possible (4 heures maximum) et les poissons ne feront l’expérience qu’une seule fois. Les poissons pourront observer leurs congénères dans les aquariums voisins ce qui permettra de diminuer leur niveau de stress. Aucun personnel ne sera présent dans la pièce pendant les mesures (surveillance par caméra). Nous contrôlerons la température et l’oxygène pendant l’expérience et nous stopperons l’expérience si la montée en température n’est pas conforme au protocole (1°C par 10 minutes) ou si la concentration en oxygène est trop faible. Le lendemain de l’expérience de tolérance, les poissons sont transférés dans des aquariums à leur température d’élevage (bacs d’eau fraîche et oxygénée). Les poissons seront mis par couple mâle/femelle avec 6 couples par aquarium afin de limiter le stress lié à l’isolement. Si nous constatons que l’hébergement par couple pose un problème (ex : male agressif envers la femelle), nous ajouterons des poissons de l’élevage de taille plus petites ce qui nous permettra d’identifier nos poissons « tests » sans utiliser de marquage. Les poissons seront ainsi maintenus et nourris dans ces aquariums pendant deux semaines afin de s’assurer de leur bonne récupération. Nous évaluerons l’état sanitaire des poissons 30 minutes et 1 heure après la perte d‘équilibre, ainsi que le lendemain de l’expérience et ensuite après 3, 7, 10 et 14 jours.

Choix des espèces

Nous avons choisi le médaka car il vit naturellement dans les milieux peu profond et riches en nutriments, typiquement les rizières (d'où le nom du genre, Oryzias). Ces milieux sont très chauds en été et très froids en hiver. Ils sont donc naturellement très rustiques. Nous utiliserons des poissons adultes à l’optimum physiologique (âgés de 200 jours) correspondant à un standard concernant les mesures physiologiques puisque ces dernières peuvent différer selon l’âge des poissons.

5 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales de tamoxifène et de médicaments psychiatriques, puis passent jusqu'à trois tests comportementaux dont des mesures d'impulsivité et de locomotion, pour étudier l'action de deux composés sur les réseaux neuronaux de la dopamine. Le porteur classe la procédure en modérée en raison des injections et des tests et prévoit une grille de score, tous les animaux étant tués pour prélèvement de tissus. Il affirme que la souris est le "seul organisme modèle" permettant ce type d'étude grâce aux lignées transgéniques.

Objectifs

Les neurones du cerveau communiquent entre eux à l’aide de substances appelées neurotransmetteurs, dont la dopamine. De nombreuses maladies psychiatriques telles que la schizophrénie, les troubles attentionnels et la dépression sont associées à un déséquilibre important des quantités de dopamine libérées dans le cerveau. Les neurones se retrouvent alors suractivés et le comportement est modifié de façon pathologique. Des composés utilisés en clinique, tels que le pramipexole et l'aripiprazole, vont réguler la suractivation des neurones et ainsi neutraliser certains des symptômes. Cependant leur utilisation s’accompagne, à plus ou moins long terme, de complications dont des troubles de l’impulsivité motrice et cognitive qui se manifestent sous forme d'agressivité, impatience, recherche de sensations fortes. Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes d'action de ces deux médicaments sur les différents types de neurones du cerveau. Ceci constitue un aspect important pour développer des approches thérapeutiques efficaces pour traiter les troubles de l’impulsivités induites par ces deux médicaments. La réalisation de ce projet nécessite l'utilisation de souris non génétiquement modifiées ainsi que de différentes lignées de souris transgéniques permettant 1) l'identification cellulaire et moléculaire des populations neuronales activées dans le cerveau en réponse à la dopamine et de 2) déterminer le rôle fonctionnel de ces réseaux dans le contrôle des fonctions motrices, cognitives et des émotions.

Bénéfices attendus

Cette étude s'inscrit dans le cadre d'une meilleure compréhension de l'action dans le cerveau du pramipexole et de l'aripiprazole, deux composés prescrits dans de nombreuses maladies psychiatriques. Les résultats obtenus lors de la réalisation de ce projet permettront également de préciser certains des mécanismes neuronaux et moléculaires sous-tendant l'apparition d'effets secondaires indésirables tels que des troubles anxieux ou de l'impulsivité associés à ces traitements, et à terme de proposer des approches thérapeutiques innovantes.

Procédures

Les animaux recevront différents types d'injections par voie intra péritonéale : de tamoxifène, de composé pharmacologique (pramipexole ou aripiprazole) ou de solution saline (Nacl 0.9%). La durée de ces injections ne dépassant pas 1 minute par animal. Des tests comportementaux sont prévus dans la procédure. Les animaux ne seront jamais soumis à plus de 3 tests (2 tests uniques toujours suivi d’un nécessitant un conditionnement). Ces tests ont une durée comprise entre 10 et 30 min dans la majorité des cas, 45 min à 1h pour certains (impulsivité, locomotion). Chaque test sera répété qu'une fois, à l'exception du protocole d'impulsivité qui, incluant des phases d'habituation et d'apprentissage, prévoit des séances étalées sur plusieurs jours (maximum 3 semaines). Le cumul de ces tests ne dépassera pas les 4 semaines.

Impact sur les animaux

La procédure prévoit des injections intrapéritonéales ainsi que des tests comportementaux. Ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (perte de poids, dégradation de l'apparence physique). C'est pour cela que la procédure est classée modérée. Cependant nous mettrons en place une grille de scores dès l'apparition de ces signes cliniques (voir annexe). D'autre part, selon notre expérience le protocole prévu est très bien supporté par les animaux.

Devenir

A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.

Remplacement

La réalisation de notre projet repose sur l'utilisation de nombreuses lignées transgéniques nous permettant de travailler sur différentes populations de neurones. La souris est le seul organisme modèle permettant ce genre d'étude. L'utilisation d'animaux demeure donc la seule option à ce jour pour évaluer avec précision et pertinence certains des mécanismes neuronaux et moléculaires sous-tendant l'apparition d'effets secondaires indésirables tels que des troubles anxieux ou de l'impulsivité associés à la prise de pramipexole et d’aripiprazole.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé grâce à l'utilisation d'un logiciel statistique sur la base de publications précédentes et de l’expérience acquise au laboratoire depuis plus d’une vingtaine d’année, de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences. Dans le but d'une exploitation maximale des données obtenues, plusieurs régions cérébrales seront systématiquement analysées sur le même animal.

Raffinement

Des dispositions seront prises pour le raffinement des conditions d'élevage et d'expérimentation. Le maintien d'enrichissement de la naissance à l'expérimentation sera effectif dans toutes les cages: sciure, pellets de coton. Un enrichissement supplémentaire de type paille en carton ("sizzle"), igloo, ou maison en carton sera mis en place en cas d'isolement des souris pour les besoins des expériences. Un suivi régulier sera appliqué dès le débuts de nos expérimentations. Une grille de score avec des points limites sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques : dos vouté, poils ébouriffés, comportement anormal, stéréotypies.

Choix des espèces

Les souris fournissent des excellents modèles pour l'étude des réseaux neuronaux, au cœur de notre projet. En effet, nous disposons aujourd'hui de nombreux modèles murins transgéniques qui nous permettront d'atteindre les objectifs de notre étude, à savoir l’étude détaillée des réseaux neuronaux. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes d’un point de vue médical. Les animaux seront utilisés entre 3 et 8 mois ce qui permettra de travailler sur une système cérébral stable, mature, qui n'évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront plusieurs semaines.