Procédures modérées

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des greffes sous-cutanées de cellules tumorales prostatiques, une partie subit une ablation des testicules, puis des injections quotidiennes de deux médicaments pendant vingt-huit jours et des gavages, avant la mise à mort au point limite ou pour prélever tumeur et organes. Le porteur reconnaît que le gavage comporte un risque de perforation de l'œsophage et de détresse respiratoire, et que les tumeurs peuvent devenir douloureuses. Il décrit des travaux préalables in silico et in vitro mais affirme être "contraint" de recourir à la souris, aucun système in vitro ne reproduisant selon lui la récidive tumorale après castration.

Objectifs

Le cancer de la prostate est le cancer le plus diagnostiqué chez les hommes en France et le second en termes de mortalité par cancer. Pour les cancers de la prostate invasifs, la seule thérapeutique proposée est la castration chimique (déprivation en androgène) qui est efficace, dans un premier temps, mais dans 100% des cas la tumeur récidive en étant agressive (métastases). Dès lors, il n’existe aucun traitement efficace conduisant inéluctablement au décès du patient. Une équipe de recherche a identifié des cellules potentiellement initiatrices de cette récidive tumorale dans la prostate chez la souris. Dans un modèle de souris génétiquement modifié développant un cancer de la prostate résistant à la castration, la proportion de ces cellules est fortement augmentée. Ces cellules ont pu être isolées et caractérisées, ce qui a permis de déterminer deux cibles thérapeutiques théoriques exprimées par ces cellules. En utilisant deux drogues, chacune agissant sur une de ces cibles, nous montrons que ces drogues sont très efficaces pour tuer ces cellules et que leur effet est additif dans un modèle de culture en 3D, et ce en présence et en absence d’androgène. Ces cellules ont aussi été identifiées chez l’Homme. Sur une lignée cellulaire humaine de ce type de cellules issue d’une tumeur prostatique de patient, nous avons montrés la même efficacité de ces drogues. L’objectif de ce projet est d’évaluer/confirmer l’impact thérapeutique de ces deux composés chimiques, administrés seul ou en combinaison, sur le développement et la récidive tumorale chez la souris ayant reçue préalablement une greffe de ces cellules tumorales. La première partie du projet est réalisée à l’EU 110, sous un statut conventionnel obligeant à utiliser des isocages. Pour préserver ses animaux immunodéficients de tout pathogène. La suite des expériences sera réalisée dans une animalerie SOPF, EU0054 permettant une manipulation sécurisée plus simple des animaux mais aussi l’utilisation d’un système d’imagerie par bioluminescence, finalement localisé dans l’EU0054.

Bénéfices attendus

Pour améliorer la survie des patients développant des cancers de la prostate résistant à la castration, il est nécessaire d’identifier les cellules responsables de la récidive tumorale et de les cibler de façon thérapeutique. Les études préliminaires in silico et in vitro nous ont permis d’identifier une nouvelle population cellulaire possédant les propriétés requises à l’initiation de la récidive et en faisant donc une population cellulaire candidate. Des expériences in vitro, qui inhibent les capacités progénitrices et prolifératives de ces cellules nous ont permis de trouver deux protéines cibles. Ce projet permettrait de définir in vivo, chez la souris, si leurs inhibiteurs, administrés seuls ou en combinaison, sont capables d’inhiber le développement tumoral et/ou faire régresser une tumeur déjà établie dans un contexte naïf (présence d’androgènes) ou d’hormonothérapie (castration). Ces tests seront faits sur des tumeurs d’origine murine mais aussi humaine.

Procédures

Les interventions subies par les animaux seront : - 1- Des injections sous-cutanées de cellules tumorales primaires ou de lignées humaines. - 2- Des observations des tumeurs sous anesthésie gazeuse durant 30 min (isoflurane) après maximum trois mois de développement tumoral. - 3- Des chirurgies (ablations de testicules) de 15 min sous anesthésie gazeuse et sous analgésique (injection sous cutanée 30 min avant l’intervention puis à J+1 et à J+2 si nécessaire). - 4- Des traitements en injections (de moins d’une minute) intra péritonéal de drogues quotidiennement pendant 28 jours. - 5- Des traitements en gavage (de moins d’une minute) tous les quatre jours pendant 28 jours. Chaque animal subira une combinaison de ces interventions au cours des procédures : Pour la première partie, l’ensemble des souris (32), réparti en deux lots, sera soumis aux interventions 1 et 2. Pour les deux autres parties, les animaux seront soumis aux interventions 1 et 2 et les autres interventions dépendront ensuite des groupes : - le groupe A (96 souris) subira une chirurgie de castration (intervention 3) puis les animaux recevront des traitements comme suit : • 32 souris seront soumises à l’intervention 4 uniquement ; • 32 souris seront soumises à l’intervention 5 uniquement ; • 32 souris seront soumises aux interventions 4 et 5. - le groupe B (96 souris) recevront des traitements comme suit : • 32 souris seront soumises à l’intervention 4 uniquement ; • 32 souris seront soumises à l’intervention 5 uniquement ; • 32 souris seront soumises aux interventions 4 et 5.

Impact sur les animaux

Toutes les souris de la demande d’autorisation recevront par voie sous cutanée (bas du dos) deux injections (une à droite et une à gauche) mais toutes n’auront pas de développement de tumeur. S’il y a prise de greffe et formation de tumeur sous cutanée, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer une certaine douleur lorsqu’elles dépassent un certain volume. La tumeur peut induire une tension de la peau à l’origine de démangeaison et d’irritation. L’ablation des testicules (procédures 2 et 3) est un acte non douloureux car réalisé sous anesthésie et analgésie mais il peut occasionner une hypothermie, une déshydratation et l’asséchement des yeux. Suite à la chirurgie, les animaux peuvent souffrir et la plaie chirurgicale peut présenter des signes d’inflammation ou d’infection. Les anesthésies lors des chirurgies et des séances d’imageries sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections intra péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection.

Devenir

Chaque animal sera mis à mort : - soit parce qu’il atteint avant la fin un score supérieur ou égal à 3 de la grille d’évaluation indiquant une souffrance nécessitant sa mise à mort. - soit parce qu’il a dû être exclue (pas de prise de greffe tumorale). En revanche il ne sera pas mis à mort tout de suite si sa présence peut éviter l’isolement d’un individu encore en procédure. - soit parce qu’il est un animal d’intérêt ou contrôle pour lequel il est nécessaire à la fin de la durée de la procédure de prélever différents organes et la tumeur afin d’évaluer l’efficacité du traitement testé. Cet animal pourra appartenir soit à la branche des animaux témoins servant de référence, soit à une branche d’animaux traités.

Remplacement

Nous avons dans un premier temps mené l’étude par différentes approches pour aborder ces questions, incluant, des études de prédiction par analyse bio-informatiques de données transcriptomiques, des cultures cellulaires 2D et 3D in vitro, selon le principe de Remplacement. Pour remplir nos objectifs, nous sommes contraints d’utiliser des modèles murins, car aucun système in vitro et aucun modèle d’organismes plus simples ne permet de reproduire les différents stades du développement tumoral prostatique et de sa récidive post-castration.

Réduction

Selon le principe de Réduction, le nombre d'animaux utilisé est calculé de manière à obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. En supposant une efficacité de greffe de cellules tumorales de 50%, il faudrait alors doubler l’effectif car une greffe sur deux ne se développera pas. Cependant, nous avons prévu deux injections de cellules par animal soit 1 prise de greffe par animal, ce qui compense cette efficacité faible. Comme indiqué précédemment, si la prise de greffe se montre plus élevée que 50%, nous ajusterons le nombre d’animaux à la baisse pour les étapes suivantes. Au contraire, si un des types cellulaires testés ne génère pas de tumeur, les expériences se basant sur l’injection de ces cellules ne seront pas réalisées. En revanche, des animaux pourraient être écartés de l’étude, il est donc nécessaire de prévoir un effectif supérieur à celui calculé dans cette section. C’est pour cette raison que nous avons fixé un nombre final de 16 animaux par condition, tenant compte de tous ces paramètres.

Raffinement

Pour s’assurer du bien-être des souris durant la croissance des greffes tumorales, elles bénéficieront de coton, de maisonnettes, de tunnels et de bâtonnets de bois à ronger afin de les occuper et afin qu’elles puissent se construire un nid. Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie et lors des mesures de tumeur par la personne en charge du protocole afin de détecter tout signe de douleur. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et un analgésique sera administré en pré- et post-opératoire. A la suite de la chirurgie la souris sera réveillée au chaud et surveillée pendant les heures qui suivent et la bonne cicatrisation sera observée tous les jours durant la semaine qui suit l’opération par la personne en charge du protocole. Des points limites spécifiques à chaque étape ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort. Si, pour des raisons de protocole (mise à mort de certains congénères ayant atteint un point limite), une souris devait se retrouver seule dans une cage, l’enrichissement sera augmenté.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, les modèles animaux créent le lien indispensable entre les tests in vitro et les études cliniques. Le modèle ici utilisé est préféré aux autres modèles de souris car c’est le meilleur modèle connu pour éviter toute réaction immunitaire et rejet de greffe de cellules tumorales tout particulièrement pour les cellules humaines.

24 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une administration unique d'un mélange de perturbateurs endocriniens, phtalates et phénols, par voie orale ou intraveineuse, restent quarante-huit heures en cage à métabolisme, subissent trois prélèvements de sang de six millilitres, puis sont tuées pour récupérer leur sang chargé de métabolites. Cette étude toxicocinétique préliminaire vise à fixer les doses reproduisant chez la lapine l'exposition de femmes enceintes, le porteur la qualifiant d'"indispensable". Il affirme qu'aucune étude in vitro ne peut prédire le devenir de ces molécules dans un organisme.

Objectifs

La population générale, incluant les femmes enceintes, est exposée à de nombreux perturbateurs endocriniens, tels que les phtalates et les phénols synthétiques (PSP). Les objectifs du projet de recherche sont de déterminer si l’exposition maternelle à un mélange de PSP perturbe la fonction placentaire et affecte la santé de la descendance avec des réponses sexe-spécifiques. Pour cela, ce projet s’appuiera sur le modèle biomédical du lapin, pertinent en termes de placentation, de production d'hormones pendant la vie fœtale, de toxicité fœtale et d’effets métaboliques à long terme chez les descendants. Grâce à ce modèle, les effets de l'exposition maternelle, par ingestion, à un mélange de PSP, mimant l’exposition des mères de la cohorte SEPAGES (cohorte mère-enfant, dédiée à la surveillance de l'exposition aux PSP pendant la grossesse et de leurs effets sur la santé des enfants), seront évalués sur le développement et la croissance fœto-placentaire mais aussi sur la santé postnatale, en tenant compte du sexe des individus. Le mélange de PSP sera défini grâce aux données de la cohorte SEPAGES où des concentrations élevées de phénols, de phtalates et de leurs métabolites ont été détectées dans des échantillons issus de prélèvements répétés d'urine chez les femmes enceintes. Une étude est en cours pour définir, à partir de cette cohorte, les composés associés positivement ou négativement à une modification du poids placentaire, de l’efficacité placentaire et/ou du poids de naissance qui définiront le mélange d’exposition. L’objectif de l’étude préliminaire toxicocinétique qui fait l’objet de cette saisine est de déterminer les doses des PSP qui, administrées quotidiennement par voie orale, permettront de reproduire chez le lapin une exposition aux PSP, représentative de l’exposition de la femme enceinte, en termes de concentrations plasmatiques et urinaires.

Bénéfices attendus

Ce projet aboutira à une meilleure compréhension des effets d'un mélange de PSP sur la santé des mères et de leur progéniture via une exposition par voie orale. Ce projet contribuera à décrypter les mécanismes épigénétiques, et la façon dont ils peuvent induire des effets intergénérationnels comme des troubles cardio-vasculaires, métaboliques ou un dysfonctionnement gonadique. Les résultats obtenus aideront au suivi clinique des enfants SEPAGES après l'âge de 7 ans. De plus, ce projet va générer des informations relatives à la toxicité de l'exposition maternelle aux PSP et aux effets à long terme sur la descendance, ce qui représente un défi pour les autorités publiques telles que l'ANSES/EFSA, en termes de recommandations et d'évaluation des risques, pour les femmes enceintes et les nourrissons. L'étude toxicocinétique est indispensable pour déterminer le protocole d'administration des PSP qui permettra de reproduire chez la lapine l'exposition des femmes enceintes.

Procédures

Dans le cadre de la procédure 1, 24 lapines recevront une administration intraveineuse unique (N=12) ou une administration orale unique (N=12). Les lapines seront hébergées pendant 48h avant ou suivant l'administration dans une cage à métabolisme pour permettre le recueil de la totalité des urines produites à des intervalles de temps définis. Trois prélèvements de sang d'un volume de 6ml seront réalisés par lapine. La durée des administrations intraveineuses varie de 30 secondes à 2 minutes. La durée des prélèvements sanguins varie de 20 à 30 secondes.

Impact sur les animaux

Risques de stress liés à la manipulation pour l’exposition par voie orale ou à la contention pour les prélèvements de sang (durée : le temps de la contention) - Une douleur peut apparaître au point de prélèvement de sang en raison de l’utilisation d’une aiguille (durée : le temps du prélèvement). Une crème anesthésiante sera appliquée sur la zone de prélèvement pour réduire la douleur associée à la ponction.

Devenir

Les lapines seront mises à mort à l'issue de la procédure afin de collecter un volume important de sang contenant l'ensemble des métabolites des substances administrées, dont les métabolites actifs. Le plasma isolé sera ultérieurement utilisé in vitro pour exposer des cellules placentaires en culture et évaluer les effets de l'ensemble des métabolites sur la fonction placentaire.

Remplacement

Pour l’ensemble du projet, il n’est pas possible de s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants car le devenir d’une molécule dans un organisme (toxicocinétique) n’est pas prévisible par des études in vitro compte-tenu de la complexité des mécanismes mis en jeu (absorption, destruction par la flore intestinale, métabolisme par le foie, élimination par les reins, …).

Réduction

Une réduction très importante du nombre d’animaux sera permise par l’administration des PSP en mélange. En effet, l’administration simultanée de 10 PSP permettra d’évaluer sur les mêmes animaux le devenir des 10 PSP et de réduire d’un facteur 10 le nombre d’animaux. La méthode d'analyse utilisée ne s'appuie pas sur des tests statistiques mais sur des modélisations spécifiques qui permettront d'estimer avec précision quel est le devenir dans l'organisme des substances étudiées en optimisant le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

La méthode d'analyse des données qui sera mise en oeuvre permettra de réduire à trois le nombre de prélèvements par animal. En effet, contrairement aux méthodes classiques d'analyse qui nécessitent d'obtenir un grand nombre de données sur le même animal, cette approche permettra d'analyser simultanément toutes les données obtenues avec des animaux différents. Pour l’enrichissement, les cages contiennent une chaînette, des mobiles suspendus, une plateforme et des blocs de foin compressé à ronger. Pour le confort de l’animal, les cages disposent de repose-pattes. Les animaux sont en cage individuelle mais positionnées les unes à côté des autres afin que les animaux soient en contact visuel et olfactif. Les salles d’hébergement disposent de blocs de phéromones maternelles (secure rabbit), qui diminuent les sources de stress et apaisent des animaux -L'état de santé des animaux sera surveillé tous les jours (niveau d’activité, comportement, posture au repos, pelage, alimentation, mouvements à la sollicitation). Si un animal présentait une altération de ces critères, une évaluation de la douleur serait réalisée avec la grille dédiée à l’établissement d’un score. Selon le score, une analgésie serait mise en place. Si la douleur persistait, l’euthanasie pourrait être envisagée en concertation avec le vétérinaire. Avant la procédure, les lapines seront habituées à être placées dans une boîte de contention. Une crème anesthésiante sera appliquée sur la zone d'injection afin de limiter la douleur. Un produit sera utilisé sur la zone de prélèvement de sang pour induire la dilatation des vaisseaux sanguins et faciliter la cathétérisation. Les animaux seront habitués au contact avec les expérimentateurs et une surveillance accrue des lapins par ces mêmes expérimentateurs sera réalisée lors de l’hébergement des lapins dans les cages à métabolisme. Pendant la période d'acclimatation, les animaux seront également habitués à séjourner dans une cage à métabolisme afin de les entrainer à coopérer lors des manipulations. Pour cela, ils seront placés dans les cages métaboliques pendant une durée croissante, soit successivement 1h, 2h, 4h et 8h par jour. Le contact visuel et olfactif ainsi que l'enrichissement seront maintenus lors de l'hébegement dans les cages métaboliques.

Choix des espèces

L’espèce lapin a été choisie pour plusieurs raisons: i/ type de placentation plus proche de celle de l’humain que celle des rongeurs ii/ taille qui permet de réaliser un suivi de la gestation par échographie iv/ espèce pertinente pour étudier la toxicité sur le développement du fœtus et évaluer les effets à long terme v/ espèce plus appropriée à des fins de toxicocinétiques car, chez le lapin comme chez l'humain l'élimination urinaire prédomine pour les polluants organiques, contrairement à d'autres espèces, comme le rat et le chien, qui sont plutôt des excréteurs biliaires vi/ espèce pertinente car la production de stéroïdes gonadiques pendant la vie fœtale est similaire à celle de l’humain L'étude sera réalisé chez des lapines adultes car elle a pour objectif de définir les doses des composés mimant l’exposition des femmes en âge de procréer qui seront utilisées ultérieurement chez des lapines adultes pour évaluer les effets de cette exposition sur la santé néonatale.

6 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie de l'aine sous anesthésie d'environ une heure et demie, au cours de laquelle deux prothèses de renfort de paroi abdominale sont implantées pour comparaison, avant trois mois d'hébergement puis la mise à mort pour prélever les tissus. L'objet est une preuve de concept in vivo d'une nouvelle prothèse auto-fixante, dernière étape annoncée avant validation, le porteur reconnaissant n'avoir mené aucune approche statistique pour fixer l'effectif. Il affirme qu'il est "nécessaire" de tester le dispositif dans un organisme avec ses organes et ses fluides, impossible à reproduire in vitro.

Objectifs

Les Hernies De Paroi Abdominale (HDPA) sont dues à une déficience de la paroi ou un traumatisme pariétal ou un relâchement d’une cicatrice de laparotomie. Ce sont les pathologies les plus fréquentes de la paroi abdominale (PA). Le seul traitement efficace des HDPA est chirurgical et nécessite l’emploi de prothèses de renfort de paroi (Mesh). Beaucoup de prothèses existent mais il y a une grande disparité dans leur efficacité : taux variable de complications et/ou récidives en partie liées à l’approche opératoire et plus précisément à la méthode de fixation de la Mesh. Aucun consensus n'est établi sur la meilleure méthode de fixation ou de non-fixation. Il a été démontré que la fixation de la prothèse avec des agrafes induit des douleurs post-opératoires plus importantes par rapport à la non-fixation de la Mesh. L’utilisation de ces systèmes de fixations est traumatique et associée à des complications postopératoires précoces et tardives. Ces complications ont conduit les chirurgiens à envisager des méthodes alternatives de fixation atraumatiques de l’implant ( Un modèle innovant de prothèse a été développée et a fait l’objet d’une étude de caractérisation in vitro sur un banc d’essai. Les objectifs de ce projet sont : 1) évaluation du positionnement sans fixation atraumatique de la nouvelle prothèse sur la paroi abdominale 2) tolérance par la paroi abdominale de la présence permanente de la prothèse candidate 3) efficacité du système de fixation mécanique spontanée de cette prothèse comparée à une autre prothèse concurrente à 3 mois de l'implantation chez le porc. La preuve de concept in vivo de ce nouveau type de prothèse permettra d'améliorer la qualité des prothèses curatives et/ou préventives des HDPA.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette recherche permettront de répondre à deux critères : 1. la tolérance sur le plan clinique et biologique de la nouvelle prothèse auto-fixante ; 2. l’efficacité de l’attachement de cette prothèse au tissu abdominal mou suffisamment fort lui évitant une migration et/ou le rétrécissement.

Procédures

Les porcs subiront une chirurgie par voie coelioscopique au niveau de l'aine, sous anesthésie, qui devrait durer une heure à une heure et demi. Suite à cette chirurgie, ils seront transportés dans un élevage après 10 à 12 jours. Ils seront ensuite hébergés dans des conditions proches des élevages, sans contraintes particulières. Ensuite, ils seront pesés et palpés au niveau de la zone opérée régulièrement. Ces 2 actes sont de courte durée, pas plus de quelques minutes chacun.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut provoquer une douleur et une gêne mécanique au lieu d'intervention.

Devenir

Les animaux sont tous mis à mort pour réaliser des prélèvements de tissu et observer in situ le comportement de la prothèse.

Remplacement

L'objectif de cette étude est de vérifier l'efficacité et la sécurité de la nouvelle prothèse candidate auto-fixante in vivo. Cette prothèse a déjà fait l'objet d'une étude de caractérisation in vitro sur un banc d'essai et doit maintenant être validée in vivo. La preuve de concept de ce nouveau type de prothèse permettra de mettre au point des prothèses auto-fixantes de qualité et efficace dans le traitement des HDPA. Il est nécessaire de tester la prothèse dans un environnement avec les différents organes et les fluides corporels qui ne peuvent pas être reproduit en in vitro. Ce passage sur le modèle animal est la dernière étape de la preuve de concept.

Réduction

6 animaux répartis en 2 groupes de 3 seront utilisés. Ce nombre total a été déterminé pour avoir une représentation juste de la physiologie animale. Etant donné que c'est une preuve de concept, il n'y a pas besoin de plus de 3 animaux par groupe pour obtenir la réponse au questionnement (aucune approche statistique n'a été réalisée). Pour réduire le nombre d'animaux, des tests in vitro ont déjà été réalisés pour la caractérisation de la prothèse candidate. Dans un principe de réduction, il sera implanté sur un même animal les 2 prothèses à comparer pour chaque groupe. Il s'agit d'une preuve de concept, ce faible nombre d'animaux permettra d'obtenir les résultats suffisants pour cette étape du projet.

Raffinement

Après une phase d'acclimatation pour réduire leur stress, les porcs seront opérés par une équipe chirurgicale expérimentée, qui maîtrise les techniques utilisées dans les hôpitaux. Durant toute la chirurgie et en période post-opératoire, la douleur sera prévenue et traitée. L'anesthésie durant l'opration sera suivie, et assortie d'une couverture analgésique. Par la suite, ils seront transportés dans un établissement spécialisé dans les soins de longue durée. Durant tout l'hébergement les animaux seront maintenus en groupes sociaux harmonieux. Ils seront hébergés dans des enclos propres, équipés d'enrichissement, qui leur permet de fouisser, manipuler des objets et se coucher dans des litières sèches. Un suivi quotidien par des équipes spécialisées permettra de suivre tous les signes indésirables, les traiter et els prévenir. Nous privilégions les techniques de renforcement positif pour obtenir la coopération des porcs pendant les pesées, les changements de cage ou les manipulatinos.

Choix des espèces

Les nombreuses similitudes anatomo-physiologiques, qui rapprochent l’organisme du porc à celui de l’Homme, permettent d’obtenir une comparaison fiable des données obtenues et une meilleure compréhension des phénomènes physio-pathologiques étudiés. Le modèle porcin permet une transposition des techniques chirurgicales utilisées en pratique clinique courante chez l'Homme et de démontrer l’efficacité fonctionnelle de la candidat-prothèse de renfort à traiter les hernies abdominales. Les animaux utilisés seront des porcs "à l'engraissement", jeunes sevrés d'environ 30 à 35 kg au début du projet. Il est nécessaire d'attendre que l'animal soit sevré, pour qu’il soit bien protégé sur un plan immunologique et donc moins sujet à diverses pathologies néo-natales. A ce stade de leur croissance, les animaux peuvent plus facilement entrer dans un protocole tel que celui-ci.

1408 poulets de chair vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont élevés trente-six jours avec différents régimes, subissent une prise de sang à la jugulaire en fin d'étude, puis sont tués, une partie pour prélever le contenu intestinal, l'autre écartée de la chaîne alimentaire et destinée à nourrir des animaux non-humains de zoo. L'objet du projet est d'affiner la valeur nutritionnelle d'un additif, une muramidase déjà autorisée à la vente dans l'Union européenne depuis 2019, pour améliorer l'efficacité alimentaire et réduire les coûts des éleveurs. Le porteur affirme que l'efficacité de cet additif ne peut être évaluée qu'en utilisant l'espèce à laquelle il est destiné et juge la procédure "nécessaire".

Objectifs

L'objectif de ce projet est de réaliser des études pour évaluer une nouvelle solution nutritionnelle afin d'améliorer l'efficacité des aliments et d’optimiser les coûts d'alimentation. L'efficacité avec laquelle l'animal absorbe les nutriments de son alimentation est un facteur important à prendre en compte lorsque l'on tente d'optimiser l'utilisation des aliments. Les aviculteurs reconnaissent que l'optimisation de la fonction intestinale peut permettre une meilleure utilisation des nutriments et une meilleure efficacité alimentaire, car la digestion et l'absorption des composés alimentaires sont plus efficaces. La fonction gastro intestinale est influencée par de nombreux facteurs comme l’alimentation, le bien-être des animaux, ainsi que l’intégrité de la barrière gastro intestinale. Cependant, la division cellulaire bactérienne normale et la mort cellulaire naturelle libèrent des fragments de paroi cellulaire (débris cellulaires), dont l’accumulation dans l’intestin peut interférer avec la capacité du tractus gastro-intestinal à absorber les nutriments dans la circulation sanguine, réduisant la digestibilité des nutriments et altérant l'efficacité alimentaire. Une solution visant à améliorer la fonctionnalité intestinale est d’ajouter à la ration alimentaire une enzyme pour dégrader les débris cellulaires. L'enzyme par son action de dégradation contribue à l’amélioration de la fonctionnalité gastro-intestinale considérée comme un élément clé dans l’efficacité alimentaire, le bien-être animal et le développement durable . En effet, lorsque la fonction intestinale et la santé sont altérées, la digestion et l’absorption des nutriments sont affectées entrainant la compromission des performances de croissance. Une des stratégies d’optimisation de la ration alimentaire consiste aussi à déterminer pour toute enzyme ajoutée à l’aliment la quantité de nutriment (protéines) et d’énergie pouvant être libérée. La connaissance précise des valeurs nutritionnelles permet une formulation plus juste des régimes alimentaires supplémentés en enzyme contribuant ainsi à l’amélioration de la croissance des animaux.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de maximiser les valeurs nutritionnelles calculées spécifiquement pour une muramidase déjà autorisée à la vente pour les poulets de chair dans tous les pays de l’Union Européenne depuis 2019 ,et de générer des données spécifiques supplémentaires de performance de croissance, en termes d’indice de consommation, choisi comme critère de la réponse bénéfique de l’addition de l'enzyme. Ces données permettront aussi d'améliorer les rations alimentaires établies en Europe en prenant en compte l’efficacité de l'enzyme testée dans des aliments qui se différencient par leur densité nutritionnelle. Ce projet permettra aussi de répondre aux mieux aux difficultés rencontrées par les éleveurs de poulets de chairs en termes d’apports nutritifs de la ration alimentaire et de couts d’alimentation.

Procédures

Les animaux seront élevés avec différents régimes alimentaires répondant à leurs besoins nutritionnels pendant une durée de 36 jours. En fin d’étude, des prises de sang unitaires au niveau de la veine jugulaire seront réalisées sur un animal par cage. Pour chaque prise de sang, le temps de prélèvement ne dépassera pas 1 minute

Impact sur les animaux

Perte de poids, ralentissement de la croissance en cas de réduction de l'ingestion alimentaire Inconfort et le stress dus à la sortie des cages pour la pesée en groupe des animaux et la prise de sang

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale, une partie des animaux seront mis à mort pour le prélèvement d'échantillons biologiques (contenus intestinaux). L'autre partie des animaux seront mis à mort avant de rentrer dans la chaine alimentaire animale. Les animaux de cette procédure ayant été nourris avec un aliment supplementé par un additif ayant une autorisation de mise sur le marché seront utilisés à des fins spécifiques d'alimentation des animaux du zoo.

Remplacement

La procédure expérimentale est nécessaire et ne peut pas être remplacée par une autre stratégie n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants. L’additif alimentaire testé au cours de la procédure expérimentale est spécifiquement destinés aux volailles. Il entre dans la composition des aliments destinés aux volailles afin de répondre aux mieux aux difficultés rencontrées par les éleveurs de poulets de chairs en termes d’apports nutritifs de la ration alimentaire et de couts d’alimentation. L’efficacité de cet additif dans les conditions spécifiques du projet, ne peut être évaluée qu’en utilisant l’animal auquel il est destiné.

Réduction

Une approche statistique a permis d’évaluer la taille de l’échantillon nécessaire afin de montrer un effet attendu de 2,4 % d’amélioration de l’indice de consommation (FCR), paramètre de décision choisi dans ce projet pour montrer l’effet bénéfique de la supplémentation de l’additif. La taille de l’échantillon a été calculé sur la base de données d’études antérieures. Le calcul a montré que 11 cages de 16 poulets étaient nécessaires par lot pour détecter une différence significative de 2.4% entre les lots pour le FCR. De ce fait, deux études successives réalisées dans les mêmes conditions expérimentales (même salle) seront réalisées afin d'atteindre l'effectif de 11 cages de 16 aninaux (Etude 1 avec 6 cages par lot, Etude 2 avec 5 cages par lot).

Raffinement

L’inconfort et le stress dus à la sortie des cages pour la pesée en groupe des animaux sont réduits en réalisant les opérations de capture le plus silencieusement possible, par une manipulation délicate des animaux saisis au niveau du tarse juste au-dessus des doigts pour être transférés dans des contenants suffisamment grands pour éviter l’empilement et donc l’étouffement. L’inconfort et le stress dus à la sortie des cages pour les prises de sang sont réduits par une manipulation délicate des animaux , un prélèvement de faibles volumes de sang en fonction de la volémie et par l’application d’un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans le procédure interne « Geste technique sur animaux vivants : prises de sang » qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires. Seul un nombre limité d'animaux, soit un animal par cage subira le prélèvement sanguin. L'animal est isolé du groupe pas plus d'une minute. L’état de santé des animaux est suivi quotidiennement. Le raffinement des conditions d’hébergement consiste à étaler de la litière sous forme de copeaux ou de sciure afin d’assurer le confort des animaux par l’isolation thermique, l’absorption de l’humidité et la prévention des pathologies, de rajouter régulièrement de la litière au cours de l’étude pour maintenir une litière sèche. L’accès à l’eau est facilité par la mise en place de godets récupérateur d'eau en plus des pipettes et en adaptant régulièrement la hauteur des lignes d’eau en fonction de l’âge des animaux. L’accès à la nourriture est facilité en adaptant la hauteur des mangeoires en fonction de l’âge des animaux afin que le bord de la mangeoire se trouve au niveau de la poitrine de l’animal. Il consiste aussi à limiter les manipulations des animaux en les pesant uniquement à la mise en place, au changement d’aliment et en fin d’étude afin de déterminer la prise de poids et de suivre l’ingestion alimentaire. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte que l’enrichissement des cages (clochette), la densité des animaux par cage, ou encore les paramètres environnementaux (température et hygrométrie…) procurent le maximum de confort aux animaux, et restent supérieurs ou égaux à la législation en vigueur (Arrêté du 01/02/2013). Aucun animal ne reste isolé, en cage individuelle sans contact visuel ou tactile avec ses congénères, ceci afin de réduire au minimum l’angoisse et le stress des animaux.

Choix des espèces

L’additif alimentaire testé est destiné à être incorporé dans les aliments distribués aux volailles (poulet de chair) Poussins de 1 jour (poids moyen 40 g) : pour une mise en stabulation en cages au sol d’animaux de poids homogène et répondant à des conditions d’élevage commercial Les animaux sont utilisés au stade de démarrage afin de suivre les différentes étapes de croissance des poulets de chair (démarrage-croissance-finition)

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont hébergés seuls pendant huit à dix-sept jours, reçoivent des repas enrichis en tannins pour simuler une mauvaise assimilation des protéines, passent sept heures en cage métabolique, puis sont tués par ponction cardiaque sous anesthésie pour prélever le contenu de leur tube digestif. L'objectif est de mettre au point un test peu invasif qui pourrait ensuite être adapté à l'être humain, notamment aux enfants souffrant de malabsorption, le porteur renvoyant cette application au conditionnel. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe aucun modèle in vitro capable de reproduire une malabsorption protéique.

Objectifs

La capacité d’assimilation des protéines alimentaires par l’organisme est un des déterminants de la satisfaction du besoin protéique de l’être humain, notamment pour les populations vulnérables. Dans les pays en voie de développement, un apport protéique satisfaisant en quantité et en qualité n’est souvent pas assuré, ce qui entraîne des retards de croissance chez l’enfant. Les affections intestinales liées à l’environnement, dont les affections parasitaires, peuvent détériorer l’assimilation des protéines et donc aggraver l’insuffisance d’apports en protéines. L’objectif global du projet est d’évaluer l’efficacité de suppléments protéiques chez les enfants atteints de ces affections, et pour cela, il faut développer des tests peu ou pas invasifs pour rendre compte d’une amélioration de l’absorption intestinale. Pour cela, nous mettons en œuvre une étude sur rongeurs. Nous faisons varier la digestion des protéines grâce à l’ajout de tannins dans l’aliment. En effet, les tannins, présents dans des produits végétaux, perturbent la digestion des protéines, ce qui permet de mimer une malabsorption protéique. Par ailleurs, nous incorporons des traceurs de la protéine dans le repas, suivis dans l’air expiré et dans les urines. Grâce à ces données ainsi que les analyses effectuées sur les organes et le sang, nous testerons l’hypothèse qu’une baisse de la digestibilité des protéines induite par les tannins va se traduire par une baisse de l’apparition des traceurs dans le sang et l’urine. Si le test s’avère concluant, il pourra être développé chez l’humain, en comparant des individus sains ou atteints de pathologies qui détériorent l’assimilation des protéines.

Bénéfices attendus

Les données obtenues permettront d’évaluer si ce test est sensible à une perte de digestibilité des protéines. Si c’est le cas, il pourrait être adapté chez l’être humain pour révéler des situations de malabsorption protéique liée à des dysfonctions du tube gastrointestinal, dont la dysfonction entérique environnementale qui est susceptible d’altérer l’assimilation protéique.

Procédures

→ Les animaux seront hébergés en cage individuelle en permanence (pendant une durée de 8 à 17 jours selon le jour du test métabolique) . Ils auront un régime alimentaire standard et des petits repas test le matin, dans lequel des tannins sont incorporés (afin de diminuer la digestion des protéines de ce repas). Lors de l’exploration métabolique , ils seront placés dans une cage individuelle cylindrique pour mesurer les échanges respiratoires pendant 7 heures . Le jour de la mise à mort, les rats reçoivent 10 minutes avant le prélèvement sanguin, une injection intra péritonéale de xylazine (10mg/kg), puis ils sont anesthésiés par l’isoflurane (masque) et analgésiés localement par administration sous-cutanée au point d’incision (lidocaïne). Nous réalisons une ponction cardiaque pour prélever du sang. Les rats sont euthanasiés par injection intrapéritonéale d’Exagon (180mg/kg).

Impact sur les animaux

Il sera nécessaire d’héberger les animaux en cages individuelles car nous devons contrôler leur prise alimentaire et les habituer à l’ingestion d’un repas-test. Le jour du test, le rat sera placé dans une cage métabolique individuelle (une cage spécifique pour mesurer les échanges gazeux) différente de sa cage habituelle, ce qui peut générer un stress modéré. L’introduction des repas tests contenant des tannins peut perturber la motivation des rats à consommer leur repas. Bien que peu probable au regard de la dose administrée, les tannins pourraient provoquer des perturbations intestinales, type diarrhée.

Devenir

Les 48 rats seront euthanasiés afin de collecter les contenus des différents segments du tube digestif et mesurer la digestibilité des protéines.

Remplacement

A l’heure actuelle il n’existe pas de modèle in vitro permettant de mimer une malabsorption protéique qui pourrait être détectée dans les produits de dégradation finaux

Réduction

Les résultats pour chaque groupe d’animaux seront comparés entre eux en utilisant une analyse de la variance. A partir des données déjà publiées sur le sujet et dans des conditions expérimentales comparables, le nombre minimum d’animaux requis pour atteindre une puissance statistique suffisante est de 8 par groupe.

Raffinement

Afin de limiter l'impact de l'hébergement individuel, les cages sont en plexiglas transparent permettant le plus d’interactions visuelles entre les animaux et elles seront enrichies avec des tunnels en plexiglas opaque ainsi que des billes. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permettra de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Les animaux seront regroupés lors des pesées et des prises alimentaires pour faciliter leur interaction, dans des cages avec des tunnels suspendus. Si une perte de poids de plus de 20% par rapport au poids de la dernière pesée, sans cause apparente et sans récupération, des diarrhées sans cause apparente ou des difficultés à uriner ou une modification de l’aspect des urines sont détectées grâce au suivi rapproché de chaque animal, il sera sorti du protocole expérimental et euthanasié si son état de santé ne s’améliore pas rapidement. A certaines étapes de la procédure, un traitement peut être envisagé (anti-inflammatoires gastro-intestinaux, etc., en conformité avec la posologie et voie d’administration indiquée par le référent vétérinaire). L e jour de la mise à mort, les rats reçoivent une injection intra péritonéale 10 minutes avant le prélèvement sanguin, puis une analgésie est pratiquée sous la peau au point d’incision. Nous réalisons une ponction cardiaque pour prélever du sang. Les rats sont euthanasiés par injection intrapéritonéale d’un produit léthal.

Choix des espèces

Le régime alimentaire et le système digestif du rat présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. De plus, le rat est une espèce de référence pour les études nutritionnelles quel que soit le stade de développement, ici le jeune rat post-pubère.

750 animaux, 500 souris et 250 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sur chaque animal, des apprenants s'exercent à la contention, aux injections sous-cutanée, intraveineuse et intrapéritonéale, aux prélèvements de sang et au gavage, non pour produire des connaissances mais pour former de futurs expérimentateurs. Le porteur reconnaît que l'inexpérience des apprenants est une source de stress et que la voie intrapéritonéale peut provoquer une perforation intestinale. Il présente cette formation comme un moyen de diffuser des gestes précis au service du bien-être des animaux non-humains, alors qu'elle se solde par leur mise à mort.

Objectifs

Les formations spécifiques pour les personnes appliquant/concevant des procédures expérimentales sont encadrées par l’arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. Cet arrêté défini le programme de base et ce dernier doit comporter une partie : Procédure faiblement invasive : théorie et pratique. Ce projet décrit cette partie pratique.

Bénéfices attendus

Cette formation a pour objectif de former les futurs expérimentateurs. Dans cette formation leur sont enseigné les gestes précis, permettant de réduire au maximum le stress de l’animal. Par la formation aux bons gestes, cette formation participe au bien-être animal et permet la diffusion de gestes techniques précis et contrôlés.

Procédures

Durée des TP 4h, durée effective de manipulation 3h - la préhension / contention ( 10 min max) - une injection sous cutanée ( 2 minutes maximum) - une injection intraveineuse ( 10 min maximum)- une injection intrapéritonéale ( 2 minutes) - un prélèvement de sang submandibulaire ( 2 minutes) - une administration per-os (5 minutes)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur ses animaux peuvent être un stress généré par l’inexpérience des apprenants. Cette hésitation peut être source de stress pour l’animal. Le stress généré n’est cependant que transitoire et de courte durée. Par ailleurs les injections et les prélèvements peuvent entrainer une douleur notamment lors de l’effraction cutanée. La voie intrapéritonéale peut entrainer éventuellement dans de très rare cas des lésions digestives (perforation de l’intestin) dangereuses et douloureuses . Le gavage per-os peut également entrainer un inconfort pour l’animal et un risque de fausse route s’il n’est pas réalisé correctement. Le prélèvement submandibulaire peut entrainer éventuellement un risque d’hémorragie s’il n’est pas réalisé correctement

Devenir

Ils ne peuvent être réutilisés donc ils sont mis à mort

Remplacement

L’objectif de cette séance est d’une part de montrer aux stagiaires les bonnes pratiques en terme de contention et de prélèvements, puis de vérifier qu’ils mettent correctement en œuvre ces pratiques. Il est important pour cela, qu’ils soient confrontés à des animaux vivants, tout comme dans les futures procédures expérimentales qu’ils appliqueront.

Réduction

Le nombre d’animaux est choisi pour être réduit au minimum tout en gardant la possibilité à chaque apprenant de pouvoir effectuer les différents gestes techniques. Diminuer ce nombre ne ferait qu’augmenter les nuisances pour chaque animal, ainsi que le stress rendant les contentions plus difficiles et les apprentissages plus complexes.

Raffinement

Les manipulations se font sous le contrôle du/des responsables de groupe qui veille à l’exécution du bon geste pour le bien-être animal. La préhension des souris en évitant la prise par la queue sera enseignée (utilisation de tunnels et main en coupe). Avant chaque manipulation d'animal, les points limites seront vérifiés. Si un animal a atteind un point limite la procédure, il ne sera pas manipulé.

Choix des espèces

La souris reste le modèle le plus utilisé en recherche (60% des utilisations d’animaux), le rat, bien que moins utilisé (environ 10%) reste néanmoins très utilisé notamment dans le cadre des neurosciences, discipline très représentée au sein des chercheurs du CNRS. Les souris seront utilisées à 7 semaines de manière à n’être pas trop grosses afin de pouvoir entrer facilement dans la boite de contention pour l’IV. Les rats d’un poids de 250g et les souris de 7 semaines sont aussi utilisés à cet âge de manière à ne pas rendre trop compliquée la préhension et la contention pour les apprenants ayants de petites mains.

330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection sous-rétinienne de nanoparticules puis subit des examens d'imagerie et un électrorétinogramme sous anesthésie, un test comportemental optocinétique sur animal vigile et une craniotomie terminale, avant d'être tué pour prélever les yeux. Le porteur indique que l'injection peut provoquer inflammation, décollement ou déchirure de la rétine et opacité de la cornée. Il présente les nanoparticules comme une piste de restauration visuelle pour les rétinites pigmentaires, les bénéfices pour les personnes restant à valider.

Objectifs

La rétinite pigmentaire désigne un ensemble de pathologies progressives et héréditaires de la rétine qui mène à une cécité incurable et qui atteint plus d'un million de personnes à travers le monde. Elle résulte de la mutation dans un gène spécifique des photorécepteurs à bâtonnets, la rhodopsine, qui provoque la perte de ces neurones. Cette disparition provoque par la suite la dégénérescence progressive et secondaire des photorécepteurs à cônes. Récemment, il a été montré chez un modèle de rat aveugle qu'il est possible de réactiver la rétine dégénérée par des implants constitués de nanoparticules. Les nanoparticules peuvent être délivrées dans l’œil par des injections et s’ancrer aux membranes des neurones cibles de la rétine pour convertir les stimuli lumineux en une stimulation électrique. Ainsi les photorécepteurs endommagés sont rendus à nouveau sensibles à la lumière grâce à ces nanoparticules. Cependant, il reste à comprendre quel champ de vision et quelle acuité visuelle sont réellement retrouvés. Cette étape est essentielle pour évaluer le bénéfice qui pourrait être apporté par ce type de thérapie chez des patients. Il est aussi important d’étudier la distribution et l’évolution de ces nanoparticules dans l’œil après injection et de s’assurer de leur biocompatibilité par l’absence de réactions inflammatoires. L'objectif de ce projet est d'évaluer ces paramètres (biocompatibilité, distribution, acuité visuelle) chez un modèle murin de rétinite pigmentaire. La validation fonctionnelle sera réalisée par des tests comportementaux (test optomoteurs), l’enregistrement de l’activité électrique de l’œil in vivo (electrorétinogramme) et par l'enregistrement de l’activité cérébrale des animaux en expérimentation terminale, soit par une technique d'imagerie fonctionnelle ultrasonore non invasive, soit par une méthode électrophysiologique (potentiels visuels évoqués) au niveau du cortex visuel.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous cherchons à réactiver la vision au niveau de la rétine et à étudier si la thérapie choisie permet une transmission de l’information visuelle au cerveau. L’approche retenue pour notre étude est l’injection sous-rétinienne de nanoparticules. Il s’agit de remplacer les photorécepteurs absents par un système de stimulation électrique des neurones rétiniens restants. La finalité de l’étude est de valider un nouveau modèle d’implant basé sur des nanoparticules, plus performant et répondant au critère de biocompatibilité. Ces avancées biomédicales permettront de développer de nouvelles méthodes d'interfaçage des stimuli optiques avec le système nerveux pour le traitement des pathologies dans lesquelles la dégénérescence neuronale a induit une perte de fonction spécifique et irréversible. Le modèle murin présente un fort intérêt pour cette étude car l’architecture oculaire est très proche de celle de l’œil humain et le modèle de dégénérescence est similaire à celui rencontré dans les rétinites pigmentaires

Procédures

Procédures chirugicales (2): - Injection sous-rétinienne (1 fois par animal), sous anesthésie générale (gazeuse), 10 min; - Craniotomie + Enregistrement des potentiels évoqués visuels et Imagerie ultrasonore , (1 fois par animal, expérimentation terminale) sous anesthésie générale (fixe), 60 min; / Examens sous anesthésie générale:- Examen d’imagerie (2 à 6 fois par animal) sous anesthésie générale (gazeuse), 10 min; - ERG (1 fois par animal) sous anesthésie générale (fixe), 30 min;/ Test comportemental optocinétique (2 à 4 fois par animal) sur animal vigile, 15 min.

Impact sur les animaux

Les possibilités de nuisance sont essentiellement liées à : -Une mauvaise réaction à l’anesthésie (gazeuse ou fixe). -à l’injection : une éventuelle inflammation due aux nanoparticules (d’où l’étude) des problèmes de dégradation de l’œil : décollement de rétine, rétine déchirée, d’atteinte oculaire (inflammation, d’opacité cornéenne, paupières mi-closes, yeux gonflés etc.).

Devenir

L’euthanasie est requise pour permettre le prélèvement des yeux des souris, qui seront ensuite étudiés par des analyses histologiques. Tous les animaux des procédures seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Remplacement

Dans ce projet, l’évaluation des réactions inflammatoires (biocompatibilité des nanoparticules) et la restauration de la vision au niveau de la rétine ainsi que la transmission de l’information visuelle au cerveau ne peuvent pas être réalisées par des expérimentations ex vivo. L’acuité visuelle ne peut être évaluée que par des tests comportementaux chez l’animal in vivo. Les mécanismes physiologiques (dépolarisations corticales) et variations de flux sanguin au niveau du cortex visuel, ne peuvent être observés que sur un cerveau en fonctionnement. L’utilisation de l’animal est donc indispensable.

Réduction

Basé sur l’expertise du laboratoire et sur des projets proches, le nombre d’animaux (330) a été estimé pour obtenir un nombre minimum de résultats significatifs tenant compte des éventuelles pertes dues à une mauvaise injection, une mauvaise réaction à l’anesthésie, ou par atteinte des points limites durant les procédures expérimentales. La rédaction d’un protocole précis ainsi que la bonne maîtrise des outils de chirurgie et d’imagerie par les expérimentateurs correspondants permet de minimiser les pertes inutiles. Une analyse de puissance statistique a été faite et le nombre d’animaux utilisé par protocole expérimental a été estimé en vue d’atteindre un compromis entre une puissance élevée et un nombre d’animaux raisonnable. Des tests statistiques seront effectués (test t de Student, analyse de variance...) et permettront de minimiser le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux en provenance de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum. Les animaux sont hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (cotons + tunnel en carton + bâton en bois) alimentation et abreuvement à volonté. Les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. L’atmosphère est contrôlée pour les conditions d’hébergement (température et hygrométrie stable). Les animaux bénéficieront si nécessaire d’une anesthésie gazeuse par inhalation ou d’une anesthésie fixe par injection intrapéritonéale. Des analgésiques seront administrés, pour que l’animal sous anesthésie ou en post-opératoire, ne ressente aucune douleur pendant les procédures expérimentales. Une observation régulière des animaux sera effectuées et suite aux procédures chirurgicales, une signalétique spécifique permettra une surveillance quotidienne adaptée des animaux. La structure de bien-être animal (SBEA) a mis en place des étiquettes indiquant "Suivi post-opératoire" qui sont à apposer sur le porte-étiquette de la cage juste après une intervention chirurgicale. Cela permet à la zootechnie lors de leur tour bien-être animal deux fois par jour d'avoir l'indication rapide que les animaux ont été opéré et ainsi ouvrir la cage et procéder à la vérification. L'expérimentateur qui vient faire son suivi post-opératoire est en charge de retirer cette dernière quand l'animal a complètement récupérer de l’opération. Tous signes d’inconfort ou de détresse sera pris en compte tels que l'apparence et la position anormale : poil ébouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, couché sur le côté; comportements anormaux : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit, changement des périodes de sommeil, réduction de la mobilité. Les points limites sont: État de choc, léthargie, inconscience, immobilité. Difficultés respiratoires. Toutefois, les critères absolus ne devraient pas être mis en évidence aux vues des procédures utilisées et de notre expérience sur ce modèle.

Choix des espèces

Le modèle murin présente une architecture de l’œil très proche de celui humain, une organisation de la rétine similaire. De plus l’existence d’un modèle génétique de rétinite pigmentaire proche du phénotype humain, avec une dégénérescence rapide (aveugle à 60 jours convient parfaitement à notre étude. Au contraire, le modèle de rat aveugle que nous utilisons pour d’autres études dégénère moins vite (environ 9 mois) entraînant des conditions d’hébergement plus compliquées. Les souris seront âgées de 6 semaines à leur entrée dans l’animalerie et respecteront 5 jours d’acclimatation minimum. La première procédure expérimentale sera l’injection à l’âge de 8 semaines. C’est à cet âge que la rétinite pigmentaire des animaux sera suffisamment avancée (animal considéré aveugle) pour nos études sur les nanoparticules.

4080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit un régime obésogène, des mises à jeun, un hébergement individuel de 48 heures, des gavages et des prélèvements de sang répétés à la queue, avant d'être tué pour prélever tissus et organes. Le porteur classe ces actes de léger à modéré tout en reconnaissant que le régime peut gêner les déplacements et que l'isolement génère du stress. Il présente le projet comme une meilleure compréhension des maladies métaboliques liées au vieillissement et à l'obésité, les perspectives médicales restant à venir.

Objectifs

L’inflexibilité métabolique, commune à l'obésité et au vieillissement, est associée à la progression du diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires représentant la première cause de mortalité dans le monde. Ces pathologies résulteraient d’un défaut de gestion des lipides par le tissu adipeux mais les mécanismes impliqués sont encore mal compris. Les travaux de la littérature soutiennent l'hypothèse selon laquelle les cellules endothéliales vasculaires des tissus adipeux jouent un rôle central via leur capacité de gestion des flux lipidiques en fonction de l'état énergétique et que l’altération de cette fonction serait un événement précoce de l’altération de l’homéostasie lipidique systémique. Nous étudierons la contribution de signalisations cellulaires propres aux cellules vasculaires. Notre objectif est d’identifier des mécanismes propres aux cellules endothéliales vasculaires du tissu adipeux et d’évaluer l’impact de la modulation de leur phénotype sur l’expansion, la fonctionnalité du tissu adipeux et sur la progression des pathologies associées au vieillissement naturel et accéléré par l’obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux définir la contribution des altérations du système vasculaire dans la genèse des maladies métaboliques et cardiovasculaires associées au vieillissement naturel et accéléré par l’obésité et ce, en tenant compte du sexe. En particulier la complétion de ces travaux ouvrira de nouvelles perspectives médicales personnalisées pour diagnostiquer et traiter les individus à risque de développer un diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires associées.

Procédures

Les animaux seront soumis à des interventions de classes légère à modérée. -Prélèvements d’une goutte de sang à la veine caudale : maximum 1 fois 8 prélèvements espacés de 15 à 30 minutes (2 secondes par prélèvement) -Prélèvement de sang à la veine caudale par capillaire : maximum 4 fois sur 24 heures (15-30 secondes par prélèvement) -Gavage : maximum 1 fois par animal (10 secondes) -Mise à jeun : maximum 1 fois pour 12 heures effective (phase active) -Hébergement individuel : maximum 1 fois pendant 48 heures

Impact sur les animaux

Les expérimentations réalisées dans ce projet sont peu invasives indolores (pesée, régime riche en lipides, jeûne) ou de classe légère et modérée (test de tolérance au glucose, gavage, placement en environnement nouveau et seul pendant 48h pour la calorimétrie par exemple, mesure de la composition corporelle). Elles peuvent être associées aux nuisances suivantes : - Régime obésogène peut induire une prise de poids pouvant gêner les déplacements - Hébergement individuel de 48h peut générer du stress - L’analyse de la composition corporelle peut générer un stress pendant le maintien immobile dans la cage de lecture (90 secondes) - Gavage peut générer du stress et inconfort durant la procédure (quelques secondes) - Prélèvement à la veine caudale peut générer du stress et une douleur légère - Mise à jeun peut entrainer du stress

Devenir

Les procédures d’études phénotypiques et métaboliques (Calorimétrie indirecte, Composition corporelle, Tolérance au glucose) sont des mesures faites sur l’animal au cours de la procédure de régime obésogène. Les animaux seront alors remis dans leur cage d’origine et seront soit euthanasiés à la fin du temps de régime défini afin de prélever les tissus et organes pour les analyses histologiques et cellulaire des tissus, soit étudiés lors des procédures terminales d’adaptation au jeûne/réalimentation ou challenge lipidique aigue. Au terme de ces procédures tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les tissus et fluides pour des études multi-omiques permettant de répondre aux questions scientifiques énoncées.

Remplacement

L’utilisation du modèle murin nous permettra d’identifier et de quantifier les changements progressifs et dynamiques impactant le système vasculaire qui surviennent avec le régime alimentaire, la prise de poids et le vieillissement. Les prélèvements humains représentent un point fixe de l’état individuel et ne permettent pas de contrôler l’historique de perte et/ou gain de poids. Aucun système de culture cellulaire n’a pu reproduire les variations circadiennes des apports en lipides qu’auront à subir les cellules endothéliales chez des souris alternant des phases d’apport nutritif et de repos. Notre objectif est d’identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires mis en place avant l’apparition des désordres métaboliques et cardiovasculaires.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux pour cette étude, nous avons réalisé une veille bibliographique, tenu compte de nos expériences passées et conçu les expériences afin d’obtenir un pouvoir statistique suffisant avec un nombre minimum d’individus. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, plusieurs procédures expérimentales de classe légère puis modérée seront réalisées sur les mêmes groupes d’animaux dès lors que les animaux auront recouvré un bien-être général et dans la mesure où les procédures ne peuvent pas interférer entre elles.

Raffinement

Lors de leur arrivée en zone expérimentale les souris sont placées en salle d’acclimatation et y resteront pendant 1 semaine en présence de ouate pour réduire le stress qui pourrait être causé par le transport. Dès leur arrivée, les animaux sont pris en charge par le personnel de la zootechnie compétent qui vérifiera leur état et bien-être. Les animaux issus de différentes cages de transport ne sont jamais mélangés dans les cages d’hébergement. Critères d'arrêt par rapport à la souffrance : dans le cas où l’animal ne répond plus à des besoins physiologiques énoncés ci-dessous, l’arrêt de l’expérimentation sera préconisé par l’expérimentateur ou toute personne en charge du suivi des animaux. Les animaux sont observés quotidiennement par les zootechniciens et par les expérimentateurs du projet. Ce suivi aura pour but de détecter de la douleur, d’évaluer la capacité de s'alimenter, de boire, de se déplacer. Dans le cas où l’animal ne répondrait plus à ses besoins physiologiques, il sera anesthésié puis, après perte de conscience, l’animal sera euthanasié par dislocation cervicale. Observation quotidienne pendant la durée de la procédure. Dans nos connaissances actuelles, les procédures ne doivent pas modifier le comportement général des animaux ni altérer leur bien-être, même si les animaux sont gardés jusqu’à un âge avancé.

Choix des espèces

La souris de fond C57BL6/J est un modèle reconnu dans l’étude du métabolisme et de l’obésité. Nourrie en alimentation riche en gras, elle développe des anomalies similaires à celles associées au syndrome métabolique chez l’Homme. Animaux âgés de 8 semaines et 12 mois en début de protocole. Nous souhaitons utiliser des animaux à maturité et nous affranchir de la phase exponentielle de croissance. L’utilisation de 2 tranches d’âge (8 semaines et 12 mois + 1, 4, 12 semaines) nous permettra d’évaluer si l’adaptation vasculaire peut avoir des effets variables en fonction de l’âge.