Procédures modérées

1 255 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après implantation chirurgicale d'électrodes dans le cerveau, chaque rat reçoit des stimulations électriques répétées pendant plusieurs semaines pour provoquer des crises d'épilepsie partielles évoluant vers des crises généralisées, avec redressement et perte d'équilibre, afin de tester des molécules antiépileptiques. Le porteur indique qu'un état épileptique permanent peut apparaître dans de rares cas et que les rats opérés sont hébergés seuls, et signale l'existence de méthodes sur tranches cérébrales sans les présenter comme suffisantes. Il justifie la mise à mort de tous les animaux par les crises répétées qu'ils ont subies, qui ne permettent pas de garantir leur maintien en vie.

Objectifs

Le projet consiste à tester l'efficacité de substances pharmacologiques en développement préclinique pour lutter contre les épilepsies de type partielle, c'est-à-dire qui sont localisées dans une région spécifique du cerveau. Les épilepsies partielles sont à l'origine de décharges électriques anormales dans une région cérébrale spécifique et de symptômes qui peuvent se traduire par des contractions involontaires des membres supérieurs ou inférieurs, des hallucinations, des troubles du langage ou encore des troubles du rythme cardiaque et respiratoire. De plus, ce type d'épilepsie altère la qualité de vie des patients avec une perte progressive de contact avec l'extérieur et une perturbation de la mémoire. Dans certains cas, les épilepsies partielles peuvent progresser vers des épilepsies généralisées, avec l'apparition de symptômes convulsifs plus intenses et conduire à la mort. Il existe des traitements médicamenteux qui permettent de traiter une partie des patients. Néanmoins, environ 30 % des patients épileptiques ne répondent pas aux traitements médicamenteux et sont dits "pharmaco-résistants". Dans ce projet, un modèle murin de crises épileptiques partielles évoluant vers des crises généralisées sera utilisé afin d'évaluer l'efficacité de nouvelles substances pharmacologiques en développement.

Bénéfices attendus

Le modèle de kindling est recommandé pour identifier et tester l’efficacité de nouveaux médicaments avant leur mise sur le marché. La recherche de nouveaux traitements est indispensable pour améliorer les conditions de vie ainsi que l’espérance de vie des patients épileptiques. A l'heure actuelle, les traitements antiépileptiques existants sont uniquement symptomatiques. Néanmoins, 10 à 30% des patients interrompent leur traitement initial en raison des effets secondaires indésirables ou les traitements sont inefficaces (résistance aux traitements). En plus du développement de nouveaux antiépileptiques, un des enjeux majeurs de la recherche sur l’épilepsie est de découvrir des traitements prophylactiques contre cette pathologie, c’est-à-dire des traitements ayant un effet antiépileptogène. Il n’en existe aucun à ce jour alors qu'il est possible d’identifier les personnes présentant un risque de développer une épilepsie.

Procédures

Le projet consiste à opérer l'animal pour placer des électrodes dans une structure cérébrale spécifique ainsi qu'à à la surface du cerveau. L'implant va permettre de stimuler l'animal dans une structure cérébrale spécifique pour le sensibiliser à l'induction de crises partielles. La phase de sensibilisation correspond à une période de 2 à 3 semaines, 1 à 2 stimulations de 2 secondes par jour ,5 jours par semaine. Dans certains cas, une phase de stabilisation à la stimulation est ajoutée et correspond à une série de 3 à 20 stimulations de 1 seconde, une fois par jour, 5 jours par semaine sur 2 semaines. Lors de la phase de test, l'électroencéphalogramme est enregistré sur 10 à 20 minutes avec une seule stimulation de 2 secondes ou une série de stimulation (entre 3 et 20) de 1 seconde sur 2 ou 3 jours consécutifs lors d'un traitement aigu. Dans le cadre d'un traitement chronique, 3 ou 4 enregistrements peuvent être réalisés sur une semaine (1 enregistrement par jour). Des prélèvements sanguins terminaux ou d'organes peuvent également être envisagés pour compléter les données in vivo par des données biochimiques ou histologiques. Concernant l'administration des candidats traitements, les administrations par bolus rapide (voies orale, intraveineuse, sous-cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire) durent quelques secondes; l'administration par perfusion lente (intraveineuse) peut durer de quelques minutes à plusieurs heures en fonction des spécificités du candidat traitement. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat traitement. Un traitement peut également être injecté par voie intracranienne, au moment de l'implantation des électrodes.

Impact sur les animaux

Le protocole décrit dans ce projet conduit à l'apparition d'une crise partielle (clignement des yeux, mastication, mouvements des vibrisses ou de tête, mouvements involontaires des pattes avant) qui est suivie d'une crise généralisée (redressement de l'animal et perte d'équilibre) suite à une stimulation éléctrique de faible intensité, puis ce dernier récupère très rapidement. Dans de rares cas, un état épileptique permanent peut apparaitre. L'animal sera euthanasié s'il ne récupère pas rapidement après une stimulation. Les animaux sont hébergés seuls pendant toute la durée de la procédure, dès lors que les animaux sont opérés afin de protéger l'implant de leurs congénères. Néanmoins, les animaux peuvent se voir, se sentir et s'entendre lorsqu'ils sont hébergés en animalerie conventionnelle. Pour les animaux ayant reçu un OGM, ils sont isolés pendant une semaine dans des cages ventilées où les animaux peuvent se voir. Ils sont ensuite replacés en animalerie conventionnelle.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque étude. Des crises épileptiques ont été induites de manière répétée chez les animaux soumis à une procédure de kindling, leur maintien en vie dans de bonnes conditions ne peut pas être garantie (même s’il n’est pas attendu de crises épileptiques spontanées chez ces animaux)

Remplacement

Il existe des techniques alternatives in silico ou ex-vivo permettant d'évaluer les traitements sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales afin de sélectionner les meilleurs candidats médicaments et donc de limiter le nombre d'animaux utilisés. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux et l'activité cérébrale.

Réduction

Les animaux peuvent être utilisés pour l'évaluation de 2 candidats médicaments (2 études) sur plusieurs semaines (maximum 10 semaines), une fois sensibilisés et stabilisés, le cas échéant. Ceci permet de limiter le nombre d'animaux pour une même étude (différentes doses ou traitements comparables) ou pour deux études (deuxs candidats médicaments). Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé par une approche statistique. Une analyse de puissance réalisée sur les paramètres mesurés dans le test du kindling avec stimulation constante indique qu'un minimum de 10-12 rats est nécessaire par groupe.

Raffinement

Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Lors de la procédure chirurgicale, une analgésie est assurée par l’administration de Carprofene à 5 mg/kg ou équivalent avant le début de la chirurgie et pendant les 48 heures après l'opération. De la lidocaïne est également appliquée sur le crâne de l'animal pour limiter la douleur. Enfin, un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement de l'oeil. Une attention particulière sera portée sur la récupération des animaux à la suite de la chirurgie. Ces derniers seront pesés 24 et 48 heures suite à la chirurgie. L’implant sera désinfecté, le cas échéant et une antibiothérapie sera réalisée en cas de suspicion d’infection. L’administration d’huile naturelle peut être préconisée dans le cas d’un ralentissement du transit intestinal. Au cours du test, l'enregistrement de l'électroencéphalogramme permet de compléter l'analyse comportementale et raffiner le modèle. L'ajout d'une phase pour déterminer le seuil de stimulation pour induire une crise partielle et une crise généralisée permet de réduire le seuil de stimulation pour chaque animal testé, et par conséquent, limiter la douleur chez ce dernier. Le seuil de stimulation minimum pour une crise partielle correspond à l'apparition d'une crise de quelques secondes sur l'électroencéphalogramme, en présence ou non de symptômes comportementaux mesurés d'après l'échelle de Racine. Des points limites stricts ont été définis pour chaque procédure. Notamment, dans de rares cas, un état épileptique peut apparaître. L’animal sera euthanasié s’il ne récupère pas dans les 10 minutes suite à la stimulation électrique. Les animaux isolés sont hébergés dans un environnement enrichi avec du matériel à ronger. Les cages sont transparentes afin que chaque animal puisse voir ses congénères. Il est envisagé de placer un animal compagnon dans chaque cage, une fois que les plaies autour de l'implant seront bien cicatrisées afin d'améliorer le bien-être des animaux dans ces procédures. Un essai sera réalisé pour évaluer la faisabilité et sera généralisé si l’implant n’est pas endommagé.

Choix des espèces

Le modèle du kindling par stimulation électrique d'une structure cérébrale est utilisé principalement chez le rat, en raison de la taille de l'animal (implantation chirurgicale d'électrodes de stimulation et d'électrodes pour enregistrer l'électroencéphalogramme). Les rats sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique. La procédure décrite dans ce projet peut être utilisée de façon longitudinale sur des rongeurs sevrés jusqu'à l'âge adulte.

6 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'injection de vecteurs dans le cerveau d'environ trois heures, puis six prélèvements de sang, six ponctions de liquide céphalorachidien et trois IRM sous anesthésie, pour tester une thérapie génique de la maladie de Parkinson déjà évaluée chez la souris. Le porteur indique que les ponctions peuvent provoquer fuites de liquide, maux de tête, vomissements et hématomes, et que le modèle ne produit pas de symptômes parkinsoniens visibles. Il présente le recours au primate comme une étape réglementaire exigée avant l'essai clinique, et euthanasie les six animaux pour les analyses histologiques.

Objectifs

La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative conduisant à une atteinte majeure de la qualité de vie chez les patients, consécutive à une perte des neurones dopaminergiques d’une partie du cerveau. De nos jours, les patients parkinsoniens sont majoritairement sous traitements médicamenteux de L-Dopa, efficaces pour une durée dépendante de chaque patient, mais qui ne permet qu’un effet transitoire et évoluant ensuite vers une paralysie progressive et une perte importante de qualité de vie. L’enjeu majeur est donc de trouver un traitement pour ces patients permettant de ralentir voire de corriger les symptômes de la pathologie. Grace à la thérapie génique, nous injectons dans le cerveau un vecteur-médicament qui va entrainer la surexpression de l’enzyme impliquée dans la transformation du cholestérol dans le cerveau, pour tenter de corriger la perte neuronale responsable des symptômes parkinsoniens. Nous avons déjà démontré l’efficacité de notre approche thérapeutique dans 3 modèles murins de la maladie de parkinson Les objectifs du projet sont d’évaluer la faisabilité, l’efficacité et la tolérance d’une administration intracérébrale de ce vecteur-médicament chez le primate non humain (PNH) pour permettre ensuite de réaliser ce traitement chez l’Homme. Le bien-être animal sera surveillé tout au long du projet avec la mise en place de critères précis d’interruption.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet est de proposer un essai clinique pour un nouveau traitement de thérapie génique (nouveau médicament-vecteur d’intérêt) pour des patients atteints de maladie de Parkinson

Procédures

- Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie : injection intracérébrale de vecteurs (durée environ 3h) - 6 prélèvements sanguins, 6 prélèvements de Liquide céphalo rachidien (LCR) (sang + LCR maximum 30min), sous anesthésie générale et analgésie. - 3 examens par Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 2h), sous anesthésie générale Dans ce projet, une même anesthésie générale permet la réalisation de plusieurs gestes (prise de sang + prélèvements de Liquide céphalo rachidien et/ou IRM selon les temps d’intérêt de l'étude). Enfin l'euthanasie en fin de protocole est réalisé par une méthode réglementaire

Impact sur les animaux

Une chirurgie sous anesthésie générale avec un risque anesthésique et infectieux Plusieurs prélèvements de sang et de LCR avec un risque de fuite de LCR (maux de tête, vomissements, signes neurologiques ) et la formation possibles d’hématomes Le modèle de parkinson, n’a pas de symptômes physiques attendus suite à l’administration intracérébrale de ces vecteurs d’intérêts. Le stress lié à l'anesthésie en cage de l'animal.

Devenir

A la fin du projet, l'ensemble des animaux sera euthanasié pour permettre les études histologiques et de biodistribution afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique et la tolérance de l’approche.

Remplacement

Toutes les études in vitro (en dehors de l’animal) possibles pour valider la cible thérapeutique ont été effectuées avant ce projet afin de valider l’utilisation de ce médicament-vecteur comme nouvelle cible thérapeutique dans la maladie de Parkinson. Ensuite la stratégie thérapeutique et la fonctionnalité de nos vecteurs ont été réalisées chez la souris en amont de ce projet. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude de son efficacité et de sa toxicité, sur un modèle animal de plus grosse taille, le plus pertinent pour reproduire le modèle de la maladie de Parkinson est le PNH. Ces étapes sont réglementaires et requises par l’Agence nationale de la sécurité des médicaments (ANSM) pour toute demande d’autorisation d’étude clinique (chez l’Homme).

Réduction

Il y a 6 animaux au total sur ce projet, ce qui correspondant au minimum requis pour la validation de l’efficacité de l’approche thérapeutique. L'étude statistique concernera principalement l’étude histologique et sera réalisée par un anatomopathologiste certifié.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe. Un programme d’enrichissement est mis en place pour complexifier l’environnement et permettre l’expression de comportement propres à l’espèces (ex : fourragement). Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthésie, l'utilisation d’un analgésique pour les ponctions lombaires et la chirurgie d’injection virale, pour éviter tout inconfort. Une observation journalière sera faite tout au long du projet poru le suivi des points limites ainsi que le respect des mesures de raffinement. A la moindre anomalie détectée, un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si nécessaire.

Choix des espèces

Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle murin de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisée et ayant permis de confirmer la preuve de concept de la thérapie. Cependant pour une étude de toxicologie règlementaire, une deuxième espèce animale de grande taille est requise. Les organes du primate en particulier le cerveau, se rapprochent le plus du cerveau Humain en termes de structure anatomique et connectivité fonctionnelle. L’administration du vecteur dans un cerveau proche du cerveau humain permet de définir au mieux les paramètres du protocole clinique (chez l’homme). L'injection de vecteurs adéno-associé chez le primate est le seul moyen d'évaluer au mieux la faisabilité, l'efficacité et la tolérance d'une telle approche thérapeutique réalisée préalablement chez les rongeurs. Les animaux utilisés sont des macaques adultes (1-15 ans) (2 à 10 Kg) ayant un cerveau complètement développé́ compte tenu des patients ciblés par notre approche

1 320 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées de cellules immunitaires humaines qui attaquent leurs propres tissus, elles perdent du poids et se dégradent cliniquement, puis reçoivent trois fois par semaine des anticorps à tester, pour évaluer une nouvelle thérapie contre les maladies auto-immunes et inflammatoires. Le porteur précise que toutes les souris sont euthanasiées à l'atteinte des points limites, y compris celles où un effet bénéfique pourrait apparaître, faute de pouvoir les réutiliser. Il présente ce modèle de souris humanisée comme un moyen d'éviter le recours au primate.

Objectifs

Les maladies auto-immunes et les maladies inflammatoires n’ayants pas de traitements satisfaisants aujourd’hui, la recherche de nouvelles thérapies est nécessaire. Ce projet s’inscrit dans ce but afin de tester une nouvelle cible thérapeutique et d’en comprendre les mécanismes. La plupart des maladies auto-immunes sont traitées avec des traitements qui bloquent de façon non spécifique le développement de la maladie et induisent des effets secondaires. Parfois, certains patients sont traités avec des molécules qui induisent la mort cellulaire d’un type cellulaire à l’origine de la pathologie mais cela entraine le plus souvent des effets indésirables. Notre objectif est de développer une nouvelle thérapie qui pourrait éliminer les cellules impliquées dans la chronicité de l’inflammation mais cela de manière spécifique en gardant un système immunitaire compétent pour se défendre contre de nouveaux pathogènes.

Bénéfices attendus

L’objectif est de développer une nouvelle thérapie qui ciblerait une population cellulaire à l’origine de la pathologie afin de la bloquer ou de l’éliminer dans les maladies inflammatoires ou les maladies auto-immunes. Il est important de noter qu’actuellement la plupart des traitements utilisés ne sont pas spécifiques et ils réduisent la capacité des patients à se défendre contre de nouveaux pathogènes. La technologie que nous développant a pour objectif d’être plus spécifique et plus efficace. En étant plus spécifique, on réduit la probabilité d’avoir des effets indésirables et en étant plus efficace on donne la capacité aux patients de se défendre contre de nouvelles infections. Chez l’animal nous espérons pouvoir observer un blocage, une élimination ou une réduction des cellules pathogéniques à l’origine de la maladie. Si ces études in vivo sont bénéfiques pour l’animal nous envisageons de pouvoir débuter un essai clinique chez l’Homme afin de traiter les patients ayant des maladies auto-immunes ou inflammatoires et de leur proposer une nouvelle stratégie thérapeutique spécifique et plus sûre. Les nouvelles thérapies passent par le modèle animal avant d’envisager de tester la molécule dans un essai clinique.

Procédures

L'injection des cellules sera réalisée une seule fois et dure quelques secondes. Les traitements administrés aux animaux durent quelques secondes et seront réalisés 3 fois par semaine durant plusieurs semaines. Des prélèvements sanguins seront réalisés une fois par semaine durant plusieurs semaines et durent quelques secondes. Les traitements administrés aux animaux (3X semaine) ainsi que les prélèvements sanguins (1X semaine) seront variables en nombre de semaines (ils pourront aller de 1 à 12 semaines) mais pas en durée (toujours quelques secondes) et dépendra de chaque groupe de souris et du succès du traitement.

Impact sur les animaux

Ce modèle d’injection de cellules humaines de type T/B provoque une prise de greffe des cellules humaines chez la souris à cause de la réactivité des cellules effectrices humaines dirigées contre le tissu de la souris. Il va s’en suivre une perte de poids associée à un score clinique important qui pourrait induire chez la souris une modification du comportement. Le comportement et le poids des souris peuvent être impactés et pour palier à cela, un suivi 3 fois par semaine et 2/jours lors des pics sera réalisé.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés une fois les points limites atteints. En effet, l'injection des cellules humaines chez la souris va entrainer une prise de greffe des cellules de façon importante et cela va entrainer une perte de poids, un changement dans le comportemant chez la souris. Cela va se produire dans les groupes contrôles et dans les groupes dont les molécules n'ont pas d'effets bénéfiques. Dans les groupes ou un effet bénéfique pourrait être observé, les souris seront quand même sacrifiées car cela n'est pas possible d'utiliser les mêmes souris pour un second protocole car l'âge de la souris ne sera plus adéquat pour favoriser la prise de greffe des cellules humaines et car il risque d'y avoir des cellules résiduelles de la première manipe qui pourrait alterer l'interprétation d'une future manipe.

Remplacement

Les nouvelles thérapies passent par le modèle animal avant d’envisager de tester la molécule dans un essai clinique. Vu la complexité du système immunitaire et des différences entre espèces, il est nécessaire d’étudier l’impact d’une molécule sur son action ainsi que ses effets thérapeutiques sur un modèle proche de l’Homme. Pour cette première nécessité le primate est souvent utilisé, ici, nous avons la possibilité d’éviter l’utilisation de primate, donc nous étudierons ces paramètres chez la souris humanisée. Avant l’utilisation chez l’animal, nous sélectionnerons préalablement nos molécules par différents tests in vitro notamment d’affinité et d’avidité pour les récepteurs mais aussi d’efficacité sur des cellules humaines. Cela nous permettra de réduire le nombre d’animaux.

Réduction

Les tests statistiques qui seront réalisés seront des tests qui permettront de comparer chaque groupe en fonction du groupe contrôle. Il pourra également être réalisé des tests pour comparer tous les groupes les uns avec les autres ou tous les groupes en fonction du groupe contrôle. Nous avons réduit chaque groupe au minimum de 5 souris, cela est nécessaire à l’obtention d’une différence statistique. Le nombre d’animaux sera réduit autant que possible. En effet les différents axes définis plus haut permettent de réduire l’utilisation de l’animal lorsqu’un axe ne démontre pas d’efficacité thérapeutique.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Des brindilles de papier sont placées dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher. Si un animal se retrouve dominant et attaque ses congénères, il sera isolé dans une cage individuelle avec un dôme. Les animaux auront une phase d’acclimatation de 5 jours et ne seront pas manipulés afin de limiter leur stress. En amont de l’expérience le protocole sera entièrement planifié afin d’éviter du stress à l’animal et les points limites seront définis afin d’anticiper toute souffrance. Les animaux montrant des signes de douleurs lors de l’expérience recevront des molécules permettant d'atténuer cette souffrance. Lorsque les points limites seront atteints, les animaux seront mis à mort par dislocation des cervicales après anesthésie. Les animaux ne seront pas maintenus au-delà des délais décrits pour chaque modèle, limitant leur utilisation si cela n’est pas nécessaire.

Choix des espèces

Des formats d’anticorps permettant d’induire la cytotoxicité des cellules de la lignée B ou le blocage des lignée T ont été validées in vitro. Les animaux sont indispensables à cette étape d’évaluation thérapeutique du traitement car ils permettent de tester in vivo l’efficacité ou la non-efficacité de (des) format(s), ainsi que les effets secondaires possiblement liés avant de le tester en clinique chez l’Homme si celui (ceux)-ci est (sont) efficace (s). De plus, dans ce projet, le modèle utilisé repose sur ce qui est utilisé en modèles précliniques de développement d’anticorps chez l’homme. Nous travaillerons avec la souris (NSG/NXG) qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Il est nécessaire de travailler avec cette souche car elle est immunodéficiente en compartiment T, B et NK de souris ce qui permet une meilleure prise de greffe des cellules humaines T et des cellules de la lignée B. En outre, les anticorps développés ne peuvent pas être utilisés chez la souris immunocompétente car le format de l’anticorps ne permet pas de reconnaitre les antigènes de la souris, donc une autre souche n’aurait pas pu être utilisée. En outre, avant de passer aux travaux généralement réalisés chez le primate, il est impératif de valider au préalable l’efficacité de cette thérapie chez la souris humanisée afin de réduire au maximum le nombre de format d’anticorps, la dose ainsi que la voie d’injection qui pourrait être testés chez le primate. Les souris seront utilisées autour de 4 à 10 semaines car les souris ont une meilleure prise de greffe des cellules humaines à cet âge ainsi qu’un risque moins élevé de mortalité à la suite de l’irradiation.

108 souris mdx, modèle de la myopathie de Duchenne, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de vecteurs de thérapie génique, puis plusieurs prélèvements sanguins sous anesthésie jusqu'à un prélèvement terminal à huit semaines, pour comparer quinze constructions et sélectionner les plus efficaces. Le porteur affirme que l'injection de ces vecteurs est bien tolérée chez le rongeur et ne provoque aucun effet indésirable. Il présente cette étude pilote comme un moyen de réduire le nombre d'animaux d'une seconde étude à venir, affirme qu'aucune méthode ne remplace l'essai in vivo, et euthanasie toutes les souris pour prélever leurs tissus.

Objectifs

La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique liée au chromosome X affectant environ 1 garçon sur 5000 à la naissance. Elle est due à des mutations dans le gène DMD qui code pour une protéine appelée Dystrophine. La Dystrophine est essentielle au fonctionnement et au maintien de l’intégrité de l'ensemble des muscles de l'organisme (y compris le coeur). L’absence de Dystrophine dans les muscles provoque leur dégénérescence progressive, une faiblesse musculaire, la perte de la marche avant 15 ans, l’apparition de déficiences respiratoire et cardiaque, et, finalement une mort prématurée. Aucun traitement n’est disponible à ce jour pour la DMD. La thérapie génique, qui vise à corriger ou remplacer le gène DMD est aujourd’hui une approche prometteuse pour le traitement de cette maladie. Pour réaliser un transfert de gène efficace, il est possible d'utiliser des vecteurs viraux dérivés des Virus Adéno-Associés (AAV). Ils assurent un transfert de gène thérapeutique sûr et efficace dans différents tissus/organes, notamment le muscle et le cœur. Le gène de la dystrophine étant trop grand pour être inséré dans un vecteur AAV, des transgènes miniaturisés de la Dystrophine ont été générés. Ils permettent une récupération partielle de la fonction musculaire dans les modèles animaux de la DMD. Cependant, un rejet immunitaire contre ces produits thérapeutiques est parfois observé, avec une perte de l’effet thérapeutique. L’objectif du présent projet est d’évaluer de nouveaux produits de thérapie génique, qui pourraient permettre de combler le déficit en Dystrophine, tout en évitant ce rejet immunitaire. Ces nouveaux produits pouvant être plus ou moins stables ou plus ou moins fonctionnels dans les cellules musculaires, nous en testerons plusieurs, afin d'évaluer leur efficacité après injection intraveineuse chez la souris mdx, modèle murin de la DMD.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats obtenus dans cette étude pilote nous permettront de sélectionner les nouveaux produits de thérapie génique les plus efficaces (en termes d’efficacité du transfert de gène dans différents muscles, de niveau d'expression du produit thérapeutique, et de l’efficacité à corriger la pathologie musculaire des souris mdx au niveau histologique), afin d'ensuite évaluer la ou les meilleures (entre 1 et 3 maximum) pour leur efficacité thérapeutique et leur immunogénicité dans un autre modèle animal de la DMD, présentant un phénotype DMD marqué, et cela avec un nombre d'animaux plus important par groupe expérimental afin d'assurer la robustesse de ces évaluations phénotypiques. Cette seconde étude fera l'objet d'une autre demande d’autorisation de projet. A long terme, les bénéfices attendus de ce projet pilote sont de développer un candidat présentant un fort potentiel thérapeutique pour le traitement de la DMD par thérapie génique AAV. En cas de succès, le produit sera évalué dans une étude de toxicologie réglementaire, afin de pouvoir ensuite prétendre à réaliser un essai clinique chez des patients DMD.

Procédures

(i) Injection intraveineuse réalisée dans une veine caudale: geste réalisé une fois par animal sous contention, sans anesthésie, mais sous analgésie afin de limiter le stress de l'animal. Durée de l'intervention: maximum 5 min. (ii) Prélèvements sanguins au niveau d'une veine mandibulaire le jour de l'injection, puis à 2 semaines et 4 semaines post-injection (3 prélèvements par animal). Prélèvements effectués sous anesthésie, pour un volume correspondant à 10% maximum du volume sanguin circulant de l'animal. (iii) Prélèvement sanguin terminal au niveau de la veine cave, à 8 semaines post-injection. Ce prélèvement précèdera la mise à mort des animaux.

Impact sur les animaux

(i) Injection intraveineuse: l'injection intraveineuse réalisée dans la veine caudale se fera sous contention et pourra provoquer un stress léger le temps de l'injection (maximum 5 min), et une petite douleur au niveau du site de ponction. Par ailleurs, l’injection intraveineuse d’un vecteur AAV chez le rongeur est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable. Il a été en effet documenté dans de nombreuses études que l’injection systémique d'un tel vecteur chez le rongeur est très bien tolérée. (ii) Prélèvements sanguins au niveau d'une veine mandibulaire: les animaux pourraient être stressés par les anesthésies, mais celles-ci seront donc espacées d'au moins 2 semaines, et les animaux seront surveillés après leur réveil par un examinateur. La récupération devrait être rapide. (iii) Prélèvement sanguin terminal au niveau de la veine cave : pas de stress ou de douleur pour l’animal, puisque cet examen sera réalisée sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement précèdera la mise à mort des animaux.

Devenir

A l'issue de la procédure décrite dans ce projet, tous les animaux de cette étude seront euthanasiés afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses moléculaires et histologiques nécessaires au projet. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l'animal.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier et sur le long terme (plusieurs semaines après injection). L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents tissus: muscle squelettique, coeur, foie et autres tissus majeurs) et sur un tissu pathologique dans toute sa complexité (différents types de lésions). Ce projet, qui vise à évaluer le niveau d'expression et l'efficacité de nouveaux produits thérapeutiques pour notamment réduire les lésions musculaires liées à la pathologie DMD, ne peut donc être réalisé in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est basé sur notre expérience précédente de protocoles de thérapie génique lors desquels nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles dans des groupes de cette taille, pour les analyses de tolérabilité et d'expression qui seront réalisées ici. Cela semble être un nombre minimal qui permette d’assurer la robustesse des résultats sans qu’il soit excessif en terme d’animaux à inclure. D'autre part, par l'identification des constructions les plus efficaces, cette étude pilote permettra de réduire le nombre total d'animaux qui seront à inclure dans l'étude qui suivra et qui visera à évaluer l'efficacité thérapeutique des meilleurs de ces nouveaux produits de thérapie génique dans un autre modèle animal de la DMD, présentant un phénotype plus marqué. En effet, tester d'emblée l'efficacité thérapeutique de l'ensemble des 15 constructions différentes dans cet autre modèle animal aurait demandé l'inclusion d'un nombre très important d'animaux, supérieur au nombre qui sera inclus au total via ces 2 études.

Raffinement

Le bien-être animal passera notamment par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu (cages équipées de mezzanine et mise à disposition d’éléments d'enrichissement comme des carrés de coton, des tunnels en carton, des sizzle dry (papier) et des morceaux de bois) 2) un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative). 4) Afin d'améliorer la réactivité du personnel animalier, une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).

Choix des espèces

L'objectif de cette étude requiert l'utilisation d'un modèle animal de la DMD, dans lequel l'expression de Dystrophine est absente, et cela afin de pouvoir évaluer l'efficacité de nouveaux produits de thérapie génique. Il existe 3 modèles animaux majeurs de la DMD: la souris mdx, le rat DMD et le chien GRMD. La souris mdx présente des lésions musculaires typiques de la DMD, mais assez peu de symptômes de la maladie. Cette dernière limitation n'aura pas d'impact sur les objectifs de cette étude, puisqu'aucune évaluation phénotypique ne sera réalisée dans cette étude pilote. L'intérêt du modèle de la souris mdx pour cette étude repose par contre sur la facile disponibilité des animaux, ainsi que sur leur petite taille, réduisant les quantités de vecteurs nécessaires pour les injections (les vecteurs étant injectés en dose/kg d'animal). Les animaux seront injectés à l'âge adulte, entre 10 et 12 semaines d'âge. Avant l'âge de 8 à 10 semaines, la souris mdx présente des phénomènes de régénération musculaire qui peuvent avoir un impact négatif sur l'efficacité du transfert de gène à l'aide vecteurs viraux AAV. Les souris devront donc être âgées à minimum de cet âge. L'évolution de la pathologie chez les souris mdx étant ensuite lente, nous nous donnons une fourchette de 3 semaines d'âge de différence pour les animaux à inclure (mini 10 semaines, maxi 12 semaines), afin de simplifier la gestion de l'inclusion des animaux dans l'étude, qui sera adaptée selon la disponibilité des animaux chez l'éleveur, sans que cela n'ait d'impact sur les résultats de l'étude.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est maintenue isolée en cages métaboliques sur des grilles pendant plusieurs jours, avec de l'eau acidifiée et des prélèvements sanguins pratiqués au coin de l'œil, une autre reçoit des injections quotidiennes puis des régimes déséquilibrés en ions, pour étudier une protéine rénale mutée dans une maladie rare, l'acidose tubulaire distale. Le porteur reconnaît que les prélèvements oculaires peuvent léser l'œil, que l'isolement et la contention en cage métabolique stressent les souris et que les régimes provoquent une aversion alimentaire et une perte de poids. Il affirme que la culture de cellules rénales ne peut fournir un système intégré équivalent, juge le recours aux souris "indispensable" et les met toutes à mort pour prélever leurs reins.

Objectifs

Le rein contrôle la composition en ions et en eau de l'organisme. Cette fonction est rendue possible grâce à des cellules qui forment de longs segments en forme de tubes dans le rein. Il existe plusieurs types de cellules tubulaires qui ont chacune des fonctions particulières. Certaines cellules appelées cellules intercalaires sécrètent des acides dans l’urine en formation. Ces dernières sont importantes lorsque l’organisme est surchargé en acide comme dans plusieurs situations : diabète, régime riche en protéines, troubles du métabolisme. Le nombre des cellules du canal collecteur varient en fonction des apports en ions. Cette augmentation a un rôle important puisque son défaut entraine une perturbation de la régulation de l’état acido-basique pour autant sa régulation n’est pas bien comprise. Ce projet propose d’étudier le rôle d’une protéine située sur la surface des cellules intercalaires. Elle est mutée chez des patients atteints d’une maladie rare : l’acidose tubulaire distale qui peut conduire jusqu’à de sévères atteintes rénales et un trouble de la composition en ions du sang. Le gène muté chez les patients sera invalidé chez la souris permettant d’avoir un modèle d’étude pour cette maladie rare. Le projet aura aussi pour objectif de déterminer l’importance de protéines membranaires pour la sécrétion acide par le rein et le comportement des cellules intercalaires. Il n’existe pas de modèle alternatif de cellules intercalaires en culture au laboratoire qui reproduisent l’ensemble des cellules tubulaires du canal collecteur. Ce projet nécessite l’utilisation de souris dont la composition cellulaire rénale est proche de l’homme. Nous mesurerons la fonction du rein chez ces souris ainsi que le contenu en ions du sang de ces animaux. La composition cellulaire des reins de ces souris sera également explorée.

Bénéfices attendus

Les régulations de la sécrétion acide et du nombre de cellules permettant cette sécrétion sont mal connues. Pourtant, elles jouent un rôle fondamental dans le maintien bien équilibré d’un organisme pour son contenu en eau et en ions, pour le maintien du pH sanguin et une pression artérielle constante. Ce projet permettra de mieux connaitre certains mécanismes du rein qui sont modifiés lors de maladies comme l’hypertension ou de troubles métaboliques comme le diabète. Plus spécifiquement, il permettra d’établir un lien formel entre des mutations observés chez des patients et l’acidose tubulaire distale. Il permettra également de développer un nouveau modèle de maladie rare rénale.

Procédures

Pour étudier la fonction rénale et la sécrétion acide, 80 souris seront installées individuellement dans des cages spéciales (cages à métabolisme) sur 2 périodes de 7 jours consécutifs permettant de récolter leurs urines. L’eau de boisson des souris sera acidifiée pendant 17 jours permettant de solliciter les cellules intercalaires rénales. Trois prélèvements sanguins avant et après le traitement acide pour chacune de ces 80 souris permettront de mesurer les concentrations en ions du sang. Ces prélèvements durent environ 10 secondes sont réalisés sous anesthésie locale. Un autre lot de 112 souris exprimant une molécule fluorescente qui doit être induite par une molécule chimique injectée aux animaux quotidiennement pendant 5 jours. Une fois la molécule fluorescent induite, les souris subiront différents traitements dans la nourriture ou la boisson pendant 3 à 15 jours perturbant certains équilibres ioniques de l’organisme.

Impact sur les animaux

Des prélèvements sanguins sont nécessaires et seront réalisés au coin de l’œil ce qui peut être entrainer un risque de lésion ou d’inflammation dans la zone autour de l’œil et entrainer une douleur. Certaines souris seront maintenues en cages métaboliques ce qui peut provoquer un inconfort car elles sont maintenues sur une grille pendant plusieurs jours. La cage métabolique étant transparente, les souris ne sont pas à l’abri de la lumière ce qui peut provoquer un stress car cette espèce évite la lumière directe. De plus, l’hébergement dans ces cages se fait de manière individuelle en isolant chacune des souris ce qui peut provoquer un stress car leurs contacts sociaux sont diminués. Dans la cage à métabolisme, l’administration d’un traitement acide dans l’eau de boisson entraine une modification transitoire du pH sanguin qui pourrait provoquer un inconfort à l’animal. Une molécule est injectée à certaines souris et cela implique que les souris soient contraintes pour effectuer l’injection. L’injection induit un stress et une douleur au point d’injection. Une modification des apports en ions dans la nourriture lors des procédures expérimentales sera effectuée. Elle peut provoquer une aversion transitoire pour la nourriture et entrainer une perte de poids chez les souris.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour récupérer les tissus (reins) et d’en analyser le contenu en cellules et de quantifier l’abondance de plusieurs transporteurs ioniques.

Remplacement

Les modèles de cellules rénales en culture ne permettent pas d’obtenir les informations souhaitées ; ce projet nécessite un systèmes intégré multi-cellulaire reproduisant fidèlement le canal collecteur. Ce modèle n’existe pas à l’heure actuelle. Le recours aux modèles animaux s’avère donc indispensable. De plus, nous avons besoin dans ce projet de deux souches de souris génétiquement modifiée. Une première souche permettra d’étudier l’inactivation d’un gène retrouvé chez des patients atteints d’une maladie rare. Une deuxième souche permettra de suivre le devenir de cellules rénales en y exprimant une molécule fluorescente. Ces expériences ne sont pas envisageables dans un modèle plus simple tel que la culture de cellules.

Réduction

Dans toutes les procédures, le nombre d’animaux par lot a été défini a minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables. Pour les mesures du contenu sanguin en ions, les protocoles ont été élaborés pour réduire au minimum le volume de sang prélevé et ainsi faire trois mesures sur les mêmes animaux à 2 semaines d’intervalle entre chaque mesure. Cela permet de réduire le nombre total de souris d’une procédure. L’administration du traitement acide dans l’eau de boisson et l’utilisation des cages à métabolisme pour mesurer la fonction rénale ont été déjà validées par plusieurs publications permettant d’anticiper parfaitement le nombre souris minimum nécessaire au projet. Le nombre de souris a également été calculé pour détecter des différents significatives entre les différents mesures histologiques et biochimiques faites sur les reins prélevés après mises à mort des animaux. En évitant d’avoir un groupe contrôle pour chaque groupe de traitement, nous avons également put réduire le nombre de souris à utiliser.

Raffinement

Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée entre l’arrivée des souris dans l’animalerie et le début des expérimentations sur celles-ci. Les animaux bénéficieront tous d’une surveillance rapprochée (au moins trois fois par semaine). En cas de perte de poids importante, un aliment hydraté sera proposé aux souris Pour la mesure des concentrations ioniques dans le sang, le prélèvement sanguin (90µl) sera fait sur souris vigiles avec un collyre anesthésiant et sera confié à une personne qualifiée et expérimentée pour ce type de prélèvement. Le prélèvement sera de 90µl et correspond à un faible volume par rapport au volume de sang total d’une souris. Le protocole d’utilisation des cages à métabolisme comporte un suivi quotidien des animaux avec une mesure du poids, de quantité de nourriture ingérée et du volume d’eau bue tous les jours. Avant les mesures, une période d’habituation à la cage est réalisée. En plus, une habituation à la nourriture en poudre est réalisée. Un enrichissement (cylindre en plastique opaque) est également proposé permettant à l’animal de se mettre dans un endroit à l’abri de la lumière. Le séjour dans les cages à métabolisme a été réduit au minimum.

Choix des espèces

La souris représente un modèle de choix car elle présente une organisation du rein très semblable au rein humain. Nous savons également que la protéine participant à la sécrétion acide dans le rein et qui sera étudié dans ce projet est présente dans les mêmes cellules chez l’homme et la souris. L’organisation des cellules rénales est également identique chez l’homme et la souris. Les souris utilisées dans ce protocole seront des souris adultes car le projet porte sur l’étude de la fonction rénale d’un organisme adulte.

308 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont exposées à un manque d'oxygène huit heures par jour pendant deux à seize semaines pour reproduire l'apnée du sommeil, 84 d'entre elles subissant en plus une chirurgie d'ablation du tissu graisseux, et l'ensemble un test de tolérance à l'insuline avec jeûne et prélèvements sanguins répétés. Le porteur indique que l'hypoxie provoque une accélération de la respiration, une perte de poids et un stress, et que la chirurgie entraîne une douleur au réveil traitée par analgésique. Il affirme que la culture cellulaire ne peut remplacer un "organe entier" ni permettre l'analyse des facteurs circulants entre tissu graisseux et cœur, et prévoit la mise à mort de toutes les souris pour prélever leurs organes.

Objectifs

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) est une des pathologies chroniques les plus répandues touchant près d'un milliard de personnes dans le monde, et ayant des conséquences cardiovasculaires et métaboliques très délétères. Le SAOS correspond à des épisodes répétitifs d’apnées pendant le sommeil, résultant en une diminution cyclique du niveau d’oxygène dans le sang, appelée hypoxie. Cette hypoxie est responsable de lésions multi-organes, contribuant aux complications cardiaques et métaboliques. Afin de proposer une meilleure prise en charge des patients atteint de SAOS et de limiter ses complications, nos travaux de recherche visent à mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors de l’hypoxie. Les objectifs de ce projet sont de comprendre précisément le lien entre les atteintes du tissu graisseux induites par l’hypoxie et la dysfonction cardiaque associée. Nous faisons l’hypothèse que l’hypoxie pourrait affecter de façon précoce le tissu graisseux, qui libérerait alors des facteurs néfastes dans la circulation sanguine et participerait ainsi aux altérations cardiaques. Afin de répondre à nos hypothèses, nous envisageons d’utiliser différents modèles de rongeurs (souris génétiquement modifiées) exposés à l’hypoxie, chez lesquels nous réaliserons des chirurgies visant à retirer le tissu graisseux, ou des traitements médicamenteux visant spécifiquement le tissu graisseux. Ce projet nécessitera l’utilisation de 308 souris.

Bénéfices attendus

Le syndrome d’apnée obstructives du sommeil est un problème de santé publique en raison des complications cardiovasculaires associées, principalement dues au manque d’oxygène transitoire sur le long terme (nommé hypoxie). Il existe de nombreuses interconnections entre le tissu graisseux et le coeur. En particulier, le vieillissement du tissus graisseux, via la libération dans le sang de différents médiateurs, contribue au développement de la fibrose cardiaque, mécanisme qui contribue à diminuer la fonction normale du coeur. L’hypoxie induit de profondes altérations du tissus graisseux, ainsi que du coeur, mais l’interaction entre ces deux organes dans ce contexte est méconnue. Ainsi, nous proposons de démontrer que l’hypoxie induit un vieillissement plus rapide du tissus graisseux, responsable des complications cardiaques. Le but ultime de ce projet est de démontrer que cibler de façon spécifique le vieillissement du tissus graisseux est bénéfique pour limiter les atteintes cardiaques induites par l’hypoxie et d’identifier des marqueurs biologiques circulants spécifiques.

Procédures

Une partie des animaux sera soumis à une chirurgie unique visant à supprimer une grande partie du tissu graisseux. Cette procédure dure environ 15 minutes et sera réalisée sous anesthésie et les animaux seront traités contre la douleur avant la chirurgie et à leur réveil. Cette procédure concerne 84 souris. Tous les animaux (308 souris) sont soumis à un manque d’oxygène (hypoxie) ou non à l’air ambiant, pendant 2 ou 16 semaines. Cette exposition dure chaque jour et 8h/j. Des prélèvements sanguins seront réalisés afin d'évaluer le taux de sucre dans le sang des animaux dans les différents groupes, ainsi que leur sensibilité à l'insuline. Pour ce faire, ce test de tolérance à l’insuline consiste à injecter de l’insuline chez l’animal éveillé et à suivre l’évolution du taux de sucre dans le sang pendant 90 minutes. Les animaux sont mis à jeun 6 heures avant le test, et une 1 goutte de sang est prélevée à la queue à 0, 15, 30, 45, 60, 75 et 90 minutes après l’injection. Cette procédure concerne tous les animaux du projet. La procédure d’imagerie échographique est réalisée sous anesthésie et sur tapis chauffant, avant le début de l’exposition à l’hypoxie et 3 jours avant la fin du protocole. Chaque échographie dure environ 15 minutes par souris et concerne le groupe 2a, soit 84 souris. Le traitement médicamenteux est réalisé uniquement sur le groupe 2c (56 souris). Il consiste à administrer le traitement par gavage, 3 jours consécutifs toutes les 2 semaines pendant 2 à 16 semaines d’exposition.

Impact sur les animaux

L’hébergement des souris dans l’animalerie entraine une exposition à une nuisance sonore dû au fonctionnement de la machine permettant la mise en place de l’hypoxie. De plus l’animalerie est susceptible d’accueillir des rats et des souris simultanément. Cette présence peut induire un stress chez les souris. L’exposition à l’hypoxie induit une accélération de la respiration, une légère perte de poids, un stress et une diminution de l’activité lors des premiers jours, puis la souris s’adapte rapidement et ces signes disparaissent. La chirurgie de suppression du tissu adipeux peut induire au réveil une douleur, qui est traitée par administration d’analgésique et qui nécessite un suivi particulier des animaux dans les jours qui suivent. Le test de tolérance à l’insuline chez l’animal éveillé nécessite une injection d’insuline, suivie de plusieurs prélèvements sanguins à la queue (1 goutte de sang répété 6 fois) ce qui peut induire un stress à l’animal. Le traitement est administré 1 fois/j, sur 3 jours consécutifs toutes les 2 semaines, par gavage, tout au long de l’exposition à l’hypoxie. Pour limiter le stress des animaux, les gavages sont réalisés par une personne maitrisant cette technique. Un transport d’animaux est nécessaire pour réaliser les échographies, ce qui peut stresser les animaux. Pour limiter le stress, les animaux sont amenés en amont dans la pièce d’échographie pour qu’ils s’habituent à l’environnement et sont anesthésiés pour l’échographie.

Devenir

A l'issue de toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort et les différents organes d’intérêt seront prélevés pour analyses ultérieures.

Remplacement

Le présent projet est basé sur l’hypothèse d’une communication inter-organes (tissu adipeux-cœur), à la fois en réponse à l’hypoxie, mais également lors du processus de vieillissement. Le remplacement partiel des animaux peut être atteint en utilisant des approches de cultures cellulaires, mais cette alternative ne permet pas de répondre aux objectifs spécifiques du projet. 1) Un dispositif de manque d’oxygène appliqué aux cellules permet d’étudier les réponses spécifiques de différents types cellulaires (adipocytes, fibroblastes cardiaques, cardiomyocytes). Ce dispositif permet d’isoler un type cellulaire précis et de déterminer les réponses spécifiques à l’hypoxie. Des co-cultures sont également envisageables, mais ne peuvent en aucun cas remplacer la complexité d’un organe « entier » dans lequel coexiste une grande variété de cellules. Enfin, un des objectifs majeurs de notre projet est d’identifier des facteurs circulants, qui seraient sécrétés par le tissu adipeux, relargués dans la circulation sanguine, et impacteraient ensuite le cœur. L’utilisation de modèle animal est donc la seule alternative permettant une analyse systémique, multi-organes, ainsi que le recueil de plasma et l’analyse de facteurs circulants. 2) Il est également très difficile d’étudier les effets du vieillissement sur des modèles in vitro. Dans ce projet, nous utiliserons des souris jeunes ainsi que des souris adultes, et déterminerons si la cinétique des effets de l’hypoxie (durée de 2 à 16 semaines) est différente selon l’âge (hypothèse d’effets synergiques du vieillissement et de l’hypoxie), à la fois sur le remodelage et le vieillissement du tissu adipeux, mais également sur le remodelage cardiaque. De plus, nous utiliserons une approche chirurgicale de suppression du tissu adipeux, qui nous permettra d’établir la preuve de concept d’une communication inter-organe en réponse à l’hypoxie, dans un organisme entier.

Réduction

Le calcul de nos effectifs est réalisé de manière à utiliser le moins d'animaux possible sans altérer la puissance et la fiabilité de nos tests statistiques. Nous utiliserons un logiciel statistique (GraphPad Prism) pour réaliser des tests adaptés aux paramètres à évaluer. Les tests statistiques utilisés seront des t-test ou des ANOVA à deux voies suivis de tests post-hoc. Une valeur P

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes, dans un environnement enrichi (sauf pendant l’exposition à l’hypoxie ou à la normoxie) et leur bien-être sera vérifié quotidiennement. Les animaux s'adaptent rapidement à l'exposition à l'hypoxie. Les mesures d'échographies cardiaques et la lipectomie (suppression du tissus graisseux) seront réalisées sur animaux anesthésiés. Pour la lipectomie, les animaux recevront un traitement analgésique avant et après la chirurgie. Globalement et tout au long des différentes procédures du présent projet, les animaux seront surveillés quotidiennement, pesés au moins une fois par semaine, pour veiller à leur bien-être, à leur état de santé et à l’atteinte des points limites ; les critères d’arrêt et la décision d’exclure un animal d’une procédure sera prise par le responsable du projet.

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être appliquées à l’homme, notamment dans le cadre d’études sur l’organisme entier. Ceci permet ainsi de comprendre les mécanismes qui se produisent dans l’organisme des souris avant d’entreprendre des études chez l’humain. Les souris font également naître un nombre important de souriceaux par portée ce qui n’est pas le cas de tous les mammifères. Cela nous permet donc d’avoir un grand nombre d’animaux du même lot. Enfin, la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparabilité des études scientifiques. En effet, c’est le modèle de référence dans les publications. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (3 à 12 mois) afin de ne pas utiliser des souris trop jeunes, encore en pleine croissance, et qui pourrait être résistantes aux phénomènes de vieillissement. Les souris à phénotype dommageable développent spontanément des cellules tumorales (lymphomes et sarcomes) à partir de l'âge de 4 à 6 mois mais ces souris seront utilisées et mises à mort avant le développement spontané de ces tumeurs.

204 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises à un régime gras puis gavées neuf fois d'un mélange de six perturbateurs endocriniens, une dioxine, deux plastifiants, deux pesticides et un isolant électrique, elles doivent confirmer chez la souris des effets d'abord observés sur des larves de poisson-zèbre. Le porteur qualifie la maladie du foie gras d'indolore et ne décrit comme atteinte que l'inconfort du gavage. Il présente ce travail comme une étape vers le remplacement de la souris par la larve de poisson, tout en jugeant "indispensable" le recours aux souris pour valider ce modèle, et les met toutes à mort pour prélever leurs organes.

Objectifs

La maladie du foie gras (i.e. NAFLD: non-alcoholic fatty liver disease) est devenue une priorité de santé publique à cause de sa prévalence grandissante (20% de la population générale et plus 70% des personnes obèses). Elle débutent avec la stéatose hépatique (foie gras), stade bénin, qui peut progresser vers la stéatohépatite, propice au développement des cirrhoses et cancers du foie. Bien que les causes/mécanismes de cette progression pathologique restent à clarifier, l’exposition aux perturbateurs endocriniens seuls ou mélange, est suspectée. Il apparait donc urgent de développer de nouveaux modèles permettant de mieux évaluer l’impact des perturbateurs endocriniens sur la santé, en particulier sur la maladie du foie gras. Etant donné la nature complexe de cette maladie qui dépend des interactions étroites entre différents organes et types cellulaires, il est indispensable d’avoir une approche intégrative uniquement retrouvée dans les modèles in vivo. Ainsi, nous avons mis en place une stratégie en deux temps : d’abord un criblage de l’impact sur le foie de l’exposition chronique à des mélanges de perturbateurs endocriniens dans notre modèle de larve de poisson-zèbre obèse suivi de la confirmation de ces effets dans un modèle murin pertinent. L’objectif de ce projet est donc la réalisation de la 2éme phase de confirmation des effets observés chez la larve de poisson zèbre de mélanges de perturbateurs endocriniens sur le developpement de la la maladie du foie gras chez la souris.

Bénéfices attendus

Le caractère novateur de ce projet repose sur le choix du modèle pour répondre aux enjeux de la recherche sur les perturbateurs endocriniens, notamment dans des populations dites à risque. En effet, ce modèle, qui possède de nombreux atouts, est relativement proche de l’humain, notamment en ce qui concerne le développement de la maladie du foie gras. En outre, l’emploi de ce modèle, en accord avec la règle des 3R, peut être une alternative ou un prérequis à l’emploi des modèles in vivo de mammifères classiquement utilisés. Ainsi, cette étude de faisabilité a pour but de proposer un nouveau modèle in vivo visant à mieux caractériser les effets des perturbateurs endocriniens en mélange sur la maladie du foie gras et ainsi de répondre aux préoccupations concernant leurs potentiels effets cocktails. Pour cela, 6 perturbateurs endocriniens ont été choisis car la population y est couramment exposée et pour garantir les chances de démontrer un effet cocktail (une dioxine issue de rejets d’industrie ou d’incinération, deux plastifiants, deux pesticides, un isolant électrique). En effet, ces molécules sont reconnues pour leurs implications dans la maladie du foie gras et ont des modes d’actions variés, ce qui pourrait ainsi potentialiser leurs effets lors de mélange. Enfin, le choix du modèle s’est porté sur la larve de poisson-zèbre, dont la sensibilité aux perturbateurs endocriniens a été démontrée et pour lequel nous avons déjà mis en place un modèle développant une stéatose rapidement, et qui nous a permis de mettre en évidence qu’un mélange à faible dose de molécules toxiques pour le foie aggrave la maladie du foie gras. Le premier volet de ce projet sur le modèle de larve de poisson-zèbre a été en partie réalisé et a fait l’objet de saisines spécifiques. Les résultats ont permis de déterminer la composition de de différents mélanges pour lesquels on a observé une aggravation de la maladie du foie gras pour des concentrations où chaque molécule en exposition unique n’avait que peu ou pas d’effet, ce qui indique un effet cocktail de ces molécules.

Procédures

Les animaux seront soumis à un gavage pour maitriser l'exposition aux perturbateurs endocrniens à rasion d'un traitement par semaine 9 fois (entre la 3eme semaine de régime riche en graisse et la 12eme semaine).

Impact sur les animaux

Le gavage induit un inconfort des animaux, reste que la NAFLD est une pathologie indolore.

Devenir

tous les animaux sont mis à mort afin de recolter les organes pour permettre l'etude scientifique.

Remplacement

Le développement des pathologies du foie comme la stéatose et la stéatohépatite dépendent étroitement de la communication entre les organes (foie, tissu adipeux et pancréas notamment) mais aussi de la communication entre les différents types cellulaires qui constitue le foie. De plus, l’altération des systèmes de communications hormonaux est le mécanisme d’action définissant l’action des perturbateurs endocriniens. Seuls les modèles in vivo présentent toutes ces interactions. Le développement d’un nouveau modèle animal pour étudier la stéatohépatite qui peut être mis en œuvre sur des temps plus court et plus éthique a été proposé par l’équipe. Il utilise les larves de poisson zèbre et a montré des premiers résultats très encourageants qui doivent être confirmés sur le modèle murin de référence pour les études de toxicologie pour valider la pertinence de ce modèle de poisson zèbre et permettre la substitution de l’utilisation des souris par ces larves de poissons.

Réduction

Les plans d’expérimentations ont été réalisés de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats statistiquement significatifs et d’éviter les réplicats inutiles. Enfin le projet vise à confirmer chez la souris la validite de résultats obtenus dans un autre modele

Raffinement

les études seront conduites dans des installations modernes et agréées pour assurer un confort maximal aux animaux, une attention journalière à l’état des animaux sera mise en œuvre, et un grand nombre de mesures sur les échantillons prélevés sont envisagées pour récolter un maximum d’informations. Les souris seront traitées dans une pièce isolée de leurs congénères sur un temps court ne permettant pas le développement de douleur.

Choix des espèces

Ce projet vise à évaluer l’utilisation du modèle de poisson-zèbre pour étudier l’impact de cocktail de perturbateurs endocriniens sur la transition de la stéatose en un état pathologique, la stéatohépatite et à valider le caractère prédictif du modèle de poisson-zèbre en le comparant à un modèle murin classiquement utilisé pour l’étude des NAFLD. Il est donc indispensable d’utiliser des souris pour remplir les objectifs du projet. Adulte, pour étudier une pathologie qui affecte surtout des adultes. Animaux âgées de 8 à 12 semaines, d’environ 20g

308 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont exposées à un manque d'oxygène huit heures par jour pendant deux à seize semaines pour reproduire l'apnée du sommeil, 84 d'entre elles subissant en plus une chirurgie d'ablation du tissu graisseux, et l'ensemble un test de tolérance à l'insuline avec jeûne et prélèvements sanguins répétés. Le porteur indique que l'hypoxie provoque une accélération de la respiration, une perte de poids et un stress, et que la chirurgie entraîne une douleur au réveil traitée par analgésique. Il affirme que la culture cellulaire ne peut remplacer un "organe entier" ni permettre l'analyse des facteurs circulants entre tissu graisseux et cœur, et prévoit la mise à mort de toutes les souris pour prélever leurs organes.

Objectifs

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) est une des pathologies chroniques les plus répandues touchant près d'un milliard de personnes dans le monde, et ayant des conséquences cardiovasculaires et métaboliques très délétères. Le SAOS correspond à des épisodes répétitifs d’apnées pendant le sommeil, résultant en une diminution cyclique du niveau d’oxygène dans le sang, appelée hypoxie. Cette hypoxie est responsable de lésions multi-organes, contribuant aux complications cardiaques et métaboliques. Afin de proposer une meilleure prise en charge des patients atteint de SAOS et de limiter ses complications, nos travaux de recherche visent à mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors de l’hypoxie. Les objectifs de ce projet sont de comprendre précisément le lien entre les atteintes du tissu graisseux induites par l’hypoxie et la dysfonction cardiaque associée. Nous faisons l’hypothèse que l’hypoxie pourrait affecter de façon précoce le tissu graisseux, qui libérerait alors des facteurs néfastes dans la circulation sanguine et participerait ainsi aux altérations cardiaques. Afin de répondre à nos hypothèses, nous envisageons d’utiliser différents modèles de rongeurs (souris génétiquement modifiées) exposés à l’hypoxie, chez lesquels nous réaliserons des chirurgies visant à retirer le tissu graisseux, ou des traitements médicamenteux visant spécifiquement le tissu graisseux. Ce projet nécessitera l’utilisation de 308 souris.

Bénéfices attendus

Le syndrome d’apnée obstructives du sommeil est un problème de santé publique en raison des complications cardiovasculaires associées, principalement dues au manque d’oxygène transitoire sur le long terme (nommé hypoxie). Il existe de nombreuses interconnections entre le tissu graisseux et le coeur. En particulier, le vieillissement du tissu graisseux, via la libération dans le sang de différents médiateurs, contribue au développement de la fibrose cardiaque, mécanisme qui contribue à diminuer la fonction normale du coeur. L’hypoxie induit de profondes altérations du tissu graisseux, ainsi que du coeur, mais l’interaction entre ces deux organes dans ce contexte est méconnue. Ainsi, nous proposons de démontrer que l’hypoxie induit un vieillissement plus rapide du tissu graisseux, responsable des complications cardiaques. Le but ultime de ce projet est de démontrer que cibler de façon spécifique le vieillissement du tissu graisseux est bénéfique pour limiter les atteintes cardiaques induites par l’hypoxie et d’identifier des marqueurs biologiques circulants spécifiques.

Procédures

Une partie des animaux sera soumis à une chirurgie unique visant à supprimer une grande partie du tissu graisseux. Cette procédure dure environ 15 minutes et sera réalisée sous anesthésie et les animaux seront traités contre la douleur avant la chirurgie et à leur réveil. Cette procédure concerne 84 souris. Tous les animaux (308 souris) sont soumis à un manque d’oxygène (hypoxie) ou non à l’air ambiant, pendant 2 ou 16 semaines. Cette exposition dure chaque jour et 8h/j. Des prélèvements sanguins seront réalisés afin d'évaluer le taux de sucre dans le sang des animaux dans les différents groupes, ainsi que leur sensibilité à l'insuline. Pour ce faire, ce test de tolérance à l’insuline consiste à injecter de l’insuline chez l’animal éveillé et à suivre l’évolution du taux de sucre dans le sang pendant 90 minutes. Les animaux sont mis à jeun 6 heures avant le test, et une 1 goutte de sang est prélevée à la queue à 0, 15, 30, 45, 60, 75 et 90 minutes après l’injection. Cette procédure concerne tous les animaux du projet. La procédure d’imagerie échographique est réalisée sous anesthésie et sur tapis chauffant, avant le début de l’exposition à l’hypoxie et 3 jours avant la fin du protocole. Chaque échographie dure environ 15 minutes par souris et concerne le groupe 2a, soit 84 souris. Le traitement médicamenteux est réalisé uniquement sur le groupe 2c (56 souris). Il consiste à administrer le traitement par gavage, 3 jours consécutifs toutes les 2 semaines pendant 2 à 16 semaines d’exposition.

Impact sur les animaux

L’hébergement des souris dans l’animalerie entraine une exposition à une nuisance sonore dû au fonctionnement de la machine permettant la mise en place de l’hypoxie. De plus l’animalerie est susceptible d’accueillir des rats et des souris simultanément. Cette présence peut induire un stress chez les souris. L’exposition à l’hypoxie induit une accélération de la respiration, une légère perte de poids, un stress et une diminution de l’activité lors des premiers jours, puis la souris s’adapte rapidement et ces signes disparaissent. La chirurgie de suppression du tissu adipeux peut induire au réveil une douleur, qui est traitée par administration d’analgésique et qui nécessite un suivi particulier des animaux dans les jours qui suivent. Le test de tolérance à l’insuline chez l’animal éveillé nécessite une injection d’insuline, suivie de plusieurs prélèvements sanguins à la queue (1 goutte de sang répété 6 fois) ce qui peut induire un stress à l’animal. Le traitement est administré 1 fois/j, sur 3 jours consécutifs toutes les 2 semaines, par gavage, tout au long de l’exposition à l’hypoxie. Pour limiter le stress des animaux, les gavages sont réalisés par une personne maitrisant cette technique. Un transport d’animaux est nécessaire pour réaliser les échographies, ce qui peut stresser les animaux. Pour limiter le stress, les animaux sont amenés en amont dans la pièce d’échographie pour qu’ils s’habituent à l’environnement et sont anesthésiés pour l’échographie.

Devenir

A l'issue de toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort et les différents organes d’intérêt seront prélevés pour analyses ultérieures.

Remplacement

Le présent projet est basé sur l’hypothèse d’une communication inter-organes (tissu adipeux-cœur), à la fois en réponse à l’hypoxie, mais également lors du processus de vieillissement. Le remplacement partiel des animaux peut être atteint en utilisant des approches de cultures cellulaires, mais cette alternative ne permet pas de répondre aux objectifs spécifiques du projet. 1) Un dispositif de manque d’oxygène appliqué aux cellules permet d’étudier les réponses spécifiques de différents types cellulaires (adipocytes, fibroblastes cardiaques, cardiomyocytes). Ce dispositif permet d’isoler un type cellulaire précis et de déterminer les réponses spécifiques à l’hypoxie. Des co-cultures sont également envisageables, mais ne peuvent en aucun cas remplacer la complexité d’un organe « entier » dans lequel coexiste une grande variété de cellules. Enfin, un des objectifs majeurs de notre projet est d’identifier des facteurs circulants, qui seraient sécrétés par le tissu adipeux, relargués dans la circulation sanguine, et impacteraient ensuite le cœur. L’utilisation de modèle animal est donc la seule alternative permettant une analyse systémique, multi-organes, ainsi que le recueil de plasma et l’analyse de facteurs circulants. 2) Il est également très difficile d’étudier les effets du vieillissement sur des modèles in vitro. Dans ce projet, nous utiliserons des souris jeunes ainsi que des souris adultes, et déterminerons si la cinétique des effets de l’hypoxie (durée de 2 à 16 semaines) est différente selon l’âge (hypothèse d’effets synergiques du vieillissement et de l’hypoxie), à la fois sur le remodelage et le vieillissement du tissu adipeux, mais également sur le remodelage cardiaque. De plus, nous utiliserons une approche chirurgicale de suppression du tissu adipeux, qui nous permettra d’établir la preuve de concept d’une communication inter-organe en réponse à l’hypoxie, dans un organisme entier.

Réduction

Le calcul de nos effectifs est réalisé de manière à utiliser le moins d'animaux possible sans altérer la puissance et la fiabilité de nos tests statistiques. Nous utiliserons un logiciel statistique (GraphPad Prism) pour réaliser des tests adaptés aux paramètres à évaluer. Les tests statistiques utilisés seront des t-test ou des ANOVA à deux voies suivis de tests post-hoc. Une valeur P

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes, dans un environnement enrichi (sauf pendant l’exposition à l’hypoxie ou à la normoxie) et leur bien-être sera vérifié quotidiennement. Les animaux s'adaptent rapidement à l'exposition à l'hypoxie intermittente. Les mesures d'échographies cardiaques et la lipectomie (suppression du tissus graisseux) seront réalisées sur animaux anesthésiés. Pour la lipectomie, les animaux recevront un traitement analgésique avant et après la chirurgie. Globalement et tout au long des différentes procédures du présent projet, les animaux seront surveillés quotidiennement, pesés au moins une fois par semaine, pour veiller à leur bien-être, à leur état de santé et à l’atteinte des points limites ; les critères d’arrêt et la décision d’exclure un animal d’une procédure sera prise par le responsable du projet.

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être appliquées à l’homme, notamment dans le cadre d’études sur l’organisme entier. Ceci permet ainsi de comprendre les mécanismes qui se produisent dans l’organisme des souris avant d’entreprendre des études chez l’humain. Les souris font également naître un nombre important de souriceaux par portée ce qui n’est pas le cas de tous les mammifères. Cela nous permet donc d’avoir un grand nombre d’animaux du même lot. Enfin, la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparabilité des études scientifiques. En effet, c’est le modèle de référence dans les publications. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (3 à 12 mois) afin de ne pas utiliser des souris trop jeunes, encore en pleine croissance, et qui pourrait être résistantes aux phénomènes de vieillissement. Les souris à phénotype dommageable développent spontanément des cellules tumorales (lymphomes et sarcomes) à partir de l'âge de 4 à 6 mois mais ces souris seront utilisées et mises à mort avant le développement spontané de ces tumeurs.

30 porcelets mini-porcs Yucatan vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Séparés de leur mère à deux jours puis isolés en cage individuelle pendant dix-neuf jours, ils reçoivent par un distributeur automatique un lait infantile enrichi ou non en métabolites du lait maternel, pour améliorer les préparations pour nourrissons. Le porteur reconnaît que la séparation maternelle et l'isolement peuvent être une source de stress, tout en affirmant que les porcelets ne montrent aucun stress au-delà des douze premières heures. Il justifie le recours au porcelet par sa proximité physiologique avec le nouveau-né humain, et prévoit la mise à mort de tous les animaux pour prélever tissus digestifs et cérébraux.

Objectifs

Ce projet a pour enjeu l’amélioration des propriétés fonctionnelles des préparations pour nourrissons (PPN) afin de mimer les effets bénéfiques du lait maternel (LM) et de garantir un développement adéquat du nouveau-né. En effet, il reste à ce jour des différences entre le LM et les PPN, notamment concernant les composés bioactifs retrouvés dans le LM peu ou pas présents dans les PPN. Ainsi, ce projet s’intéresse aux métabolites du LM, afin d'évaluer leurs effets sur le développement du nourrisson, particulièrement au niveau des régions digestives et cérébrales. Plus spécifiquement, nous nous intéressons à des métabolites capables d’être produits par des bactéries et dont l’origine au sein du LM peut être bactérienne, issus de la circulation plasmatique maternelle ou produits in situ au sein du LM par la flore résidente. En effet, l’un des objectifs de ce projet est de pouvoir incorporer ces métabolites dans les PPN par procédés fermentaires. Ainsi, 4 groupes de métabolites ont été sélectionnés : acides gras à chaîne courte, polyamines, dérivés du tryptophane et acides organiques. Ces métabolites ont été préalablement testés in vitro sur des modèles cellulaires d'épithélium intestinal et cérébral afin de sélectionner ceux présentant des intérêts fonctionnels et développementaux. Les métabolites sélectionnés seront ainsi étudiés in vivo dans le modèle mini-porcs Yucatan en les incorporant dans des PPN fournies de façon continue des 2 aux 21 jours des porcelets. Nous disposerons de trois groupes de porcelets, un groupe témoin qui recevra une PPN sans métabolites et deux groupes expérimentaux qui recevront des PPN supplémentées en métabolites, à des concentrations proches du LM, par deux procédés distincts ; une supplémentation par des métabolites achetés dans le commerce et une supplémentation en métabolites apportés par fermentation d'une matrice laitière via des souches de bactéries lactiques et propioniques. Ainsi, nous pourrons évaluer l'impact des métabolites sur le développement physiologique intestinal et cérébral du mini-porc et valider que la fermentation d'une fraction laitière est un procédé fiable pour les apporter.

Bénéfices attendus

L’enjeu de ce projet est d’améliorer la fonctionnalité des PPN en s’intéressant aux métabolites du LM pour mimer au mieux les effets bénéfiques de ce dernier sur la santé et le développement du nourrisson. La sélection des métabolites présentant des intérêts fonctionnels et développementaux est en cours de finalisation et se basera sur les résultats obtenus à partir de modèles in vitro d'épithélium intestinal et de neurones cérébraux. Les métabolites d'intérêts appartiennent aux 4 groupes suivant : acides gras à chaîne courte, polyamines, dérivés du tryptophane et acides organiques. Les métabolites sélectionnés seront incorporés aux PPN à des concentrations proches de celles du LM. L’expérimentation sur porcelet, présentant des caractéristiques physiologiques proches du nouveau-né humain, permettra d’évaluer l'impact de l'apport de ces métabolites par voie orale au cours de la période post-natale précoce au sein d'un système plus complexe et intégré que les modèles cellulaires in vitro et permettant également de prendre en compte la présence du microbiote intestinal et les effets que les métabolites peuvent avoir sur ce dernier. Ce projet contribuera à enrichir les connaissances concernant les métabolites retrouvés au sein du LM en vue d’améliorer la composition des PPN et de se rapprocher des propriétés fonctionnelles du LM. Il permettra également de valider que l'incorporation des métabolites par fermentation bactérienne d’une matrice laitière est un procédé pertinent.

Procédures

Les porcelets seront isolés en cage individuelle durant toute la durée du protocole expérimental, de l'âge de 2 jours à l'âge de 21 jours. Chaque cage individuelle est équipée d'un distributeur automatique de lait par lequel chaque porcelet recevra l'un des trois traitements alimentaires du projet de façon contrôlée et adaptée. Les traitements alimentaires fournis sont les suivant : une PPN témoin sans métabolites et deux PPN enrichies en métabolites, l'une par ajout d'une fraction fermentée de matrice laitière et l'autre par ajout direct des métabolites via des produits achetés dans le commerce. Aucun prélèvement biologique, ni intervention chirugicale ne sera réalisé sur les animaux vivants durant la période d’expérimentation. Les paramètres mesurés concerneront la consommation alimentaire et la croissance des porcelets. Tous les animaux concernés par la procédure (n = 30) seront euthanasiés à la fin de l’expérience pour réaliser des prélèvements post-mortem de tissus et contenus digestifs et de zones cérébrales.

Impact sur les animaux

Les métabolites testés sont naturellement présents dans le LM, les concentrations testées sont proches des concentrations retrouvées dans celui-ci et ne présentent pas de danger pour les porcelets. De plus, ces métabolites ont été testés in vitro à différentes concentrations pour identifier leurs propriétés bénéfiques sur l'épithélium intestinal et le système nerveux central. Enfin, la plupart de ces métabolites ont été étudiés sur différents modèles cellulaires et animaux sans effets toxiques notables dans le cadre de problématiques de recherches différentes. Cependant, l'utilisation de PPN "porcinisées" peut entrainer un effet indésirable sur l’appétit des animaux et possiblement provoquer une perte de poids. Néanmoins, la PPN qui sera distribuée aux animaux dans ce projet est identique à la PPN porcinisée utilisée dans un précédent projet qui s'est déroulé de septembre à novembre 2022 et qui n’a engendré aucun problème d’alimentation, ni de trouble digestif chez les porcelets. La séparation brutale de la mère et l’isolement relatif en cage individuelle pendant une période de 19 jours pourraient constituer une source de stress pour les porcelets. Cependant, les porcelets ne subissent pas de stress répétés (une séparation unique et définitive de la mère), ils seront hébergés dans une salle contenant 5 cages permettant des contacts olfactifs et sonores avec leurs congénères et leur environnement sera enrichi avec des jouets, sources d’interaction avec le milieu environnant.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par la procédure décrite (n = 30) et ils seront tous euthanasiés à la fin de l’expérience. L'euthanasie des animaux est nécessaire pour récupérer les tissus et contenus intestinaux ainsi que les tissus cérébraux qui seront analysés par des approches de biologie moléculaire, d'histologie et ex vivo, afin de répondre à notre question scientifique.

Remplacement

Le projet s’intéressant à l’impact de l’alimentation sur les fonctions physiologiques et développementales du nourrisson, l’utilisation d’un modèle animal vivant reste indispensable pour une évaluation globale et intégrée de l’effet des métabolites étudiés et de prendre en compte le rôle du microbiote intestinal, qui sont impossible à reproduire dans leurs complexité dans des modèles in vitro. Le porcelet a été choisi pour sa proximité physiologique avec le nourrisson.

Réduction

L’étape in vitro permet de réduire le nombre de métabolites d’intérêt à fournir aux porcelets, métabolites retrouvés au sein du LM et ne présentant pas d’effets négatifs dans les tests effectués (pas de cytotoxicité, pas de perte d’intégrité de l’épithélium, pas d’activité pro-inflammatoire aigüe). Ils seront additionnés à une PPN reconstituée et distribuée sous forme d’alimentation liquide aux porcelets. L’impact des PPN enrichies en métabolites par apport direct ou par fermentation d'une fraction de PPN ou d'une autre matrice laitière à des concentrations proches de celles du LM sera ainsi étudié. Une PPN ne contenant pas de métabolites sera considérée comme la PPN de référence. Un effectif de 10 porcelets par types de PPN soit 30 porcelets au total a été calculé par un test de puissance sur des paramètres étudiés dans d'autres contextes sur ce même modèle, en lien avec des réponses physiologiques. Les données seront analysées statistiquement par des tests ad hoc (analyse de variance multifactorielle) prenant en compte les facteurs traitement alimentaire, sexe, portée et répétition.

Raffinement

Les métabolites testés sont naturellement présents dans le LM, les concentrations testées sont proches des concentrations retrouvées dans celui-ci et ne présentent pas de danger pour les porcelets. Cependant, l'utilisation de PPN "porcinisée" peut entrainer un effet indésirable sur l’appétit des animaux et possiblement provoquer une perte de poids. Néanmoins, la PPN qui sera distribuée aux animaux dans ce projet est identique à la PPN porcinisée utilisée dans un précédent projet qui s'est déroulé de septembre à novembre 2022 et qui n’a engendré aucun problème d’alimentation, ni de trouble digestif chez le porcelet Yucatan. Néanmoins, le poids des animaux sera surveillé pour s'assurer qu'ils n'accusent aucune perte de poids. Les porcelets seront inclus dans le protocole à 2 jours d’âge. La séparation brutale de la mère et l’isolement relatif en cage individuelle pendant une période de 19 jours pourraient constituer une source de stress pour les porcelets. Cependant, les porcelets ne subissent pas de stress répétés (une séparation unique et définitive de la mère), ils seront hébergés dans une salle contenant 5 cages permettant des contacts olfactifs et sonores avec leurs congénères, leur environnement sera enrichi avec des jouets, sources d’interaction avec le milieu environnant, et leur alimentation répond à leurs besoins nutritionnels. L’ensemble de ces éléments, associé à des interactions régulières avec les animaliers, induit un comportement des porcelets qui ne traduit aucun état de stress au-delà des 12 premières heures post-séparation maternelle. De plus, au cours des 12 premières heures qui suivent leur séparation de la mère, les animaliers sont en permanence présents dans les salles.

Choix des espèces

Le mini-porc Yucatan est un modèle animal proche de l’Homme, plus que ne peuvent l'être les rongeurs sur de nombreux aspects tels que la taille, l'anatomie du cerveau avec la présence de circonvolutions cérébrales notamment, l’anatomie de tube digestif, la physiologie digestive, le système immunitaire et le microbiote. S’intéressant à l’alimentation infantile, il est à noter que la dynamique de croissance et de développement des organes digestifs et du cerveau chez le porc nouveau-né est très proche de celle décrite chez le nouveau-né humain. De plus, il s’agit d’un animal omnivore monogastrique, ce qui en fait un modèle très utilisé pour les recherches en nutrition humaine. Enfin, sa taille et sa maturité à la naissance sont compatibles avec un allaitement avec des PPN dès les premiers jours de vie. S’intéressant à l’alimentation infantile, les porcelets inclus dans le protocole seront des nouveau-nés de 2 jours d’âge. Ils seront suivis pendant les trois premières semaines de vie avec une alimentation lactée.