Procédures modérées

26 520 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent par plusieurs voies des molécules fournies par des clients, dont le porteur indique ignorer la nature et les effets secondaires, avec pour certaines l'implantation chirurgicale d'une pompe et des prélèvements sanguins terminaux. Ce nombre découle du test en série de nombreuses molécules et doses, à raison de dix animaux par groupe, pour retarder l'accouchement prématuré. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne peut mimer un accouchement, et prévoit la mise à mort de toutes les mères pour prélever le sang fœtal et récupérer les fœtus in utero.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de candidats médicaments pour retarder la mise-bas de femelles gestantes (modèle physiologique).

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patiente accouchant prématurément.

Procédures

Les animaux recevront des administrations de composés à tester. Les voies d’administration sont dépendantes du protocole expérimental mais des administrations per os, intrapéritonéales, sous-cutanées, intraveineuses et intramusculaires pourront être réalisées. Les animaux pourront avoir une implantation de pompe type Alzet sous anesthésie. Ils pourront également avoir des prélèvements sanguins terminaux ou en cours d’expérimentation (étude de pharmacocinétique) sur animal éveillé ou sous anesthésie selon la voie de prélèvement utilisée.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux provoqués par les composés. Cependant, les animaux seront mis en cage individuelle et seront traités plusieurs fois par jour ce qui pourrait engendrer du stress d’autant plus que les animaux sont des femelles gestantes. De plus, les animaux pourront subir une chirurgie pour l’implantation d’une pompe osmotique, ce qui pourrait provoquer une hypothermie et du stress à l’animal.

Devenir

A l’issue de la procédure 1, les animaux seront euthanasiés car du sang fœtal et de la mère sera prélevé. A l’issue de la procédure 2, tous les animaux seront euthanasiés car les fœtus devront être récupérés in utero après sacrifice de la mère et des organes pourront être ensuite prélevés (cornes utérines).

Remplacement

Actuellement, aucune méthode in vitro, ex vivo ou in silico ne permet de mimer un accouchement dans son ensemble et d’évaluer des effets sur les fœtus (malformation, avortement in utero..). Le temps de gestation étant dépendante de facteurs hormonaux, du nombre de fœtus par femelle, du bien-être de cette dernière et de son niveau de stress, aucune technique cellulaire ou autre ne permet de remplacer l’animal, c’est pourquoi le recours à l’expérimentation animale est nécessaire pour comprendre et traiter cette pathologie.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à ce projet sera de 26520 animaux en raison de 10 animaux par groupe, le nombre de groupe étant fonction du nombre de molécules et/ou doses à tester. De par notre expérience sur ce modèle, 10 animaux par groupe est le nombre minimum nécessaire pour observer des différences statistiquement significatives entre les groupes. Les souris livrées qui ne seront pas gestantes (environ 10-15% d’imprécision pour déterminer les femelles gestantes) seront utilisées pour des apprentissages de gestes techniques ou autre. Ces animaux ne seront pas sacrifiés sans avoir été utilisés

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un suivi quotidien de leur état sera réalisé par du personnel qualifié. Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant de réaliser les expérimentations sous caméra afin de suivre un même animal sur quelques jours. Nous apporterons une attention particulière au bien-être des animaux avec une surveillance accrue (au moins 2 fois par jour), une manipulation en douceur par du personnel qualifié du fait que les femelles soient gestantes, une attention particulière à ce que les animaux soient au calme (pièce spécifique pour ces études), un suivi post-opératoire (observation du réveil, animaux sur plaque chauffante thermorégulée pendant la chirurgie pour éviter une hypothermie). Une attention particulière sera réalisée si un animal présentait des difficultés pour boire, se nourrir (ajout de croquettes humides dans la cage), se déplacer ou des signes de souffrance tels que vocalisation, prostration (euthanasie de l’animal si atteinte des points limites). Un enrichissement (type carré de coton, igloo) sera apporté lors du sevrage des petits.

Choix des espèces

L’utilisation de rongeurs pour étudier l’effet de molécules pour retarder les accouchements prématurés est bien décrite dans la littérature et est très souvent utilisée du fait du faible nombre de jour de gestation et d’un nombre important de fœtus lors de la mise bas pour évaluer les effets secondaires possibles des composés à tester. Classiquement nous réalisons cette étude sur des souris mais des demandes clients sur le rat nous ont été demandées donc nous préférons faire une demande d’autorisation chez la souris et le rat, sachant que la technique reste identique. Nous avons besoin de femelles gestantes donc les animaux devront être matures sexuellement, par conséquent âgés d’au moins 8 semaines. Les petits seront observés de leur naissance jusqu’à leur sevrage au bout de 3-4 semaines (soit des animaux de 0 à 28 jours).

700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le SRAS-CoV-2 par voie nasale sous anesthésie, reçoivent des injections répétées et des prélèvements sanguins rétro-orbitaux, pour étudier les atteintes cérébrales de la Covid et tester des traitements. Le porteur indique que l'infection peut entraîner une perte de poids allant jusqu'à 20 % et se révéler mortelle en sept jours, avec atteinte du système nerveux central et chute des capacités motrices et respiratoires, les souris M83 développant en plus une paralysie spontanée. Il affirme que l'étude de la physiopathologie ne peut se faire sans inoculer le virus à l'animal vivant, et justifie la mise à mort de toutes les souris par la gestion du risque lié à un agent pathogène de groupe III.

Objectifs

L’émergence de variants de SRAS2 requiert de nouvelles données scientifiques. Des patients continuent à présenter certains symptômes, parfois des mois après leur guérison, et d’autres en développent de nouveaux. Ces symptômes sont regroupés sous le nom de COVID- long. Des signes neurologiques sont observés chez les patients atteints de Covid et pourraient accélérer des pathologies cérébrales à long terme. Par ailleurs, le rôle de la réponse immunitaire innée est questionné dans l’établissement des symptômes de la Covid à court et long terme. Enfin, les mucines, composant du mucus, pourraient avoir un rôle clé dans la diffusion du SRAS2 au sein de la cavité nasale puis vers le tissu pulmonaire. Ce projet a pour objectifs (1) l’étude de la physiopathologie cérébrale des infections à SRAS2, (2) une meilleure compréhension du rôle de la réponse interféron induite par le virus (3) l'exploration du rôle des protéines composant le mucus (mucines) dans l'infection de l'épithélium respiratoire par le SRAS2 et (4) l'évaluation de traitements permettant de diminuer la pathologie cérébrale et l'inflammation à SRAS2. Pour répondre à ces questions, nous utiliserons une souris transgénique qui développe une neuropathologie rappelant la maladie humaine, un modèle de souris qui présente une immunité altérée, et un modèle de souris déficiente pour l'expression de mucines.

Bénéfices attendus

L’étude chez le rongeur des infections à SRAS-CoV-2 et des stratégies de contrôle est déterminante pour l’élaboration de stratégie de lutte contre la COVID-19 et les variants émergents de SRAS-CoV-2. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt, d’urgence ou de priorité nationale du gouvernement et des organismes publics de recherche. Ce projet va permettre d’évaluer le risque de survenue de troubles de type maladie de Parkinson suite à une infection SRAS-CoV-2, de mieux explorer le rôle de la réponse immune innée dans les infections SRAS-CoV-2 ainsi que de tester des pistes de traitement et de caractériser le rôle des protéines du mucus (mucines) dans l’infection SRAS-CoV-2.

Procédures

Les inoculations par voie nasale sont réalisées sous anesthésie générale. Les administrations par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale ou intramusculaire sont réalisées sur l’animal vigile. Les prélèvements sanguins seront réalisés au sinus rétro orbital sous anesthésie générale et collyre anesthésique. La durée de chacune des interventions décrites est inférieure à 1 minute.

Impact sur les animaux

Selon les données déjà disponibles de la littérature, il a été observé une chute de poids n’excédant pas 20% du poids initial que ce soit suite à une infection avec une souche adaptée à la souris ou un variant du SRAS-CoV-2. Les souris M83 développent spontanément des symptômes. Pour les souris M83, elles seront gardées jusqu’à un âge maximum de 8 mois, sachant que les premiers signes de paralysie spontanés n'apparaissent pas avant l'âge de 8 mois chez ces animaux. Selon la dose administrée et la souche virale considérée l’infection peut s’avérer létale chez la souris transgénique hACE2 à 7 jours post-infection avec une perte de poids et une infection du système nerveux central conduisant à une chute de l’activité motrice et des capacités respiratoires.

Devenir

La mise à mort des animaux est requise au regard de la gestion du risque d’exposition de l’agent pathogène de groupe III utilisé dans cette procédure

Remplacement

L’étude de la physiopathologie de l’infection ne peut être menée sans avoir recours à l’administration de l’agent pathogène à l’animal vivant. De plus nos projets s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur des évolutions sur le long terme (2 mois) qui ne peuvent être mimés in vitro. En revanche, les stratégies thérapeutiques seront validées préalablement sur des modèles d’infection utilisant des lignées cellulaires appropriées. L’effet du traitement antiviral sur la multiplication du SRAS-CoV-2 sera ainsi entériné par des analyses in vitro. Les essais thérapeutiques seront ensuite réalisés chez l’animal dans les meilleures conditions possibles afin d’évaluer l'innocuité et l’efficacité du traitement.

Réduction

Dans le but de suivre le principe des 3R et de réduire l’utilisation excessive d’animaux, le nombre d’animaux par groupe a été calculé sur la base de notre expérience acquise précédemment et des données bibliographiques (publications scientifiques). Dans notre expérience, des groupes de 6 animaux permettent d’atteindre une significativité statistique. La comparaison des traitements ou entre lignée de souris s’établit à l’aide de tests non paramétriques avec un niveau de confiance de 95%. Les différences entre les groupes seront considérées comme significatives si la valeur P est inférieure à 0,05%. Pour respecter la règle des 3R, les animaux seront utilisés pour plusieurs expériences (études histologiques et moléculaires).

Raffinement

Pour minimiser le stress induit aux animaux, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane avant inoculation intra-nasale du virus. L’endormissement complet sera contrôlé par pincement ferme de la queue. L’anesthésie à l’isoflurane est rapide et permet d’assurer un réveil rapide en minimisant l’hypothermie. Notre expérience du modèle souris a été également mise à profit pour aborder la question du raffinement : enrichissement et habituation de l’animal à la manipulation. La bonne connaissance du modèle infectieux sur lequel repose ce projet permet de limiter les souffrances ressenties par les animaux au cours des procédures expérimentales. Les souris seront hébergées par 6 dans des portoirs ventilés, avec à leur disposition du matériel de nidification (coton), des tunnels et des maisonnettes en carton ainsi que des bûchettes de bois à ronger.

Choix des espèces

La souris exprimant le récepteur murin ACE2 est sensible à l’infection par les souches adaptée à la souris et certains variants du SRAS-CoV-2. Elle présente l’avantage de pouvoir envisager l’emploi de souris génétiquement modifiée pour un gène d’intérêt (surexpression ou suppression) nécessaire à l’exploration des mécanismes biologiques impliqués dans la susceptibilité ou la défense de l’hôte vis-à-vis de l’infection virale. Les modèles de souris transgéniques exprimant le récepteur humain ACE2 au SRAS-CoV-2 permettent le développement clinique et virologique des infections à l’ensemble des souches circulantes et variants de SRAS-CoV-2. Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris de moins de 6 mois au moment de l’infection. Cette tranche d'âge permettra de disposer de lots homogènes des différentes colonies de souris transgéniques. L'âge maximal de 6 mois permet également d'éviter l'apparition de signes sévères associés à l'infection.

331 animaux non-humains vont être utilisés, 200 souris et 125 rats tués à l'issue pour prélèvement d'organes, et six macaques à longue queue réaffectés à d'autres projets d'imagerie. Ils reçoivent par voie nasale et intraveineuse un candidat médicament contre un déficit congénital en créatine, les macaques subissant en plus une immobilisation en cadre stéréotaxique pour une IRM de trois heures et demie sous anesthésie. Le porteur reconnaît des douleurs au point d'injection, une perte de poids et une toxicité possible par voie nasale, et situe l'application chez l'humain et les essais cliniques à venir. Il affirme que les tests d'innocuité "ne peuvent être faits que chez l'animal" et les juge "plus que nécessaires".

Objectifs

Le contexte du projet est le développement d’un candidat médicament pour le traitement du déficit congéntial en créatine, maladie pour laquelle il n’y a à ce jour aucun traitement. L’objectif de ce projet est de: (i) - développer une méthodologie IRM pour évaluer la biodistribution et l’efficacité thérapeutique d’un candidat médicament après son administration in vivo par la voie nasale. -(ii) tester et valider le traitement et la méthode d’imagerie par IRM du deutérium chez le primate sur un IRM. -(iii) valider l’innocuité du candidat médicament et de deux autres molécules chez le rat.

Bénéfices attendus

La démonstration de la présence de créatine chez le primate après une administration intranasale du DCE (Dodecyl Creatine Ester) marqué au déteurium permet d’envisager cette voie d’administration chez l’homme. De même l’évaluation de l’innocuité du traitement DCE chez le rat permet d’envisager les études de toxicologie réglementaire et à terme des études cliniques de phase I ou phase de tolérance chez le volontaire sain et une phase clinique d’efficacité pharmacologique du candidat médicament DCE.

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration pendant quelques minutes du candidat médicament DCE par voie nasale et intraveineuse. La durée de traitement est de 30 jours chez le primate et la souris pour le transporteur de la créatine. Cette durée de l’intervention est de quelques minutes et le de traitement est réduite à 15 jours chez le rat. Pour les études chez la souris et le rat, à la fin de chaque traitement les animaux seront mis à mort.. Une seule imagerie sera effectuée chez le macque sous anesthésie d’une durée de 3h30..

Impact sur les animaux

Douleur au site d’injection, stress lié à la durée du traitement, perte de poids, effets indésirables liés à l’inoculation et toxicité voie nasale

Devenir

Les souris et les rats seront euthanasiés à la fin de chaque expérimentation pour des prélèvements d’organes. Les primates seront affectés à d’autres projets d’imagerie avec l’accord du vétérinaire.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes permettant d’évaluer le passage cérébral de candidats par voie nasale en utilisant l’imagerie IRM. De plus, les tests d’innocuité du traitement DCE ne peuvent être faites que chez l’animal. Ces tests sont plus que nécessaires pour valider le mode d’administration du médicament qui sera administré chez le patient et garantir la non toxicité du médicament qui sera administré plus tard chez l’homme.

Réduction

Les procédures d’imagerie utilisées sont non-invasives. Ceci permet des mesures longitudinales, réduisant le nombre total d’animaux. Le nombre total de séances sera limité à 7, avec un minimum de 7 jours séparant les séances. Le nombre de souris (n=20/groupe) a été établi selon notre expérience de la sensibilité des mesures IRM pour détecter un effet sur de faibles concentrations de créatine. Le nombre de primates (n=6) est standard dans la littérature pour mettre en évidence un biomarqueur en mesurant une moyenne et un écart-type pertinent. Le nombre de rats par groupe (n=5) pour l’évaluation de l’innocuité du traitement par voie nasale est le nombre minimal utilisé pour l’évaluation des effets toxicologiques de candidats médicaments. Celui de 25 rats par ester de créatine (3 molécules) pour l’étude vie la voie iv est aussi un nombre minimum pour 5 groupes d’animaux.

Raffinement

L’hébergement animal est en accord avec l’annexe III de la directive 2010/63/EU : environnement enrichi selon nos procédures standards, hébergement en groupe social dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h, eau/nourriture ad libitum. Les animaux seront examinés quotidiennement par les techniciens animaliers, sous la supervision permanente du vétérinaire clinicien, également en charge du bien-être animal. La douleur liée à la fixation en cadre stéréotaxique pendant l’imagerie sera minimisée par l’application locale de xylocaïne (gel 2%) dans les oreilles. La douleur liée à la fixation en cadre stéréotaxique pendant l’imagerie sera minimisée par l’application locale de xylocaïne (gel 2%) dans les oreilles. Un suivi des paramètres physiologiques est assuré durant les anesthésies afin d’adapter les mesures compensatrices (soutien thermique, perfusion, anesthésique). Pour l’administration du traitement en spray ou en solution dans les narines, les animaux seront soit habitués à la contention vigile (souris), soit soumis à une anesthésie courte (primates, ~15 min). Des données préliminaires montrent qu’il n’y a pas de signe de gêne chez le rongeur suite à l’application quotidienne du produit

Choix des espèces

La maladie d’intérêt est une maladie grave avec des conséquences cognitives importantes chez l’enfant. Seul un modèle transgénique rongeur déficitaire en transporteur de la créatine existe à l’heure actuelle pour évaluer la distribution cérébrale et l’effet thérapeutique de l’apport en créatine exogène. La transposition de l’étude rongeur chez le primate permet de s’assurer et de valider le passage cérébral par voie nasale du candidat médicament l’ester dodécylique de créatine et donc de valider la stratégie thérapeutique qui sera utilisée chez l’homme, étant donné la similitude anatomique de la muqueuse nasale entre le primate non humain et l’homme. De plus, le modèle macaque permettra à terme d'intégrer des méthodes d'évaluation fonctionnelles, de comportement et de signes cliniques, qui peuvent être directement extrapolées à l'homme dans une démarche translationnelle. Le rat est l’animal utilisée dans l’évaluation des effets toxicologiques de candidats médicaments. Ce sera ensuite une des 2 espèces utilisées dans les études réglementaires. Les animaux adultes seront utilisés car le développement cérébral est achevé à ce stade. La maturation du cerveau peut avoir un impact sur la quantité totale de créatine

180 animaux non-humains, 90 souris et 90 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisés d'une séance à l'autre plutôt que tués, avec une adoption parfois envisagée. Chaque animal sert de support à des étudiants qui s'exercent à la préhension, à la contention et à des injections sous-cutanées, jusqu'à douze piqûres réparties sur six séances. Il ne s'agit pas de produire des connaissances mais de valider une formation réglementaire à l'expérimentation animale, le porteur soulignant qu'elle "confère un avantage décisif" aux diplômés sur le marché de l'emploi. Il indique que sur quatre séances une seule recourt à des animaux vivants, les autres utilisant vidéos, mannequins en silicone et cadavres.

Objectifs

L’objectif est de couvrir la partie pratique relative à l’obtention d’une formation spécifique en expérimentation animale, qui permettra à nos étudiants d’obtenir des compétences professionnelles dans le domaine. Dans le cadre d’une Unité d’Enseignement optionnelle, nos étudiants peuvent suivre une formation spécifique destinée aux personnes appliquant les procédures expérimentales aux animaux. Ce type de formation réglementaire à l’expérimentation animale doit permettre l’acquisition de compétences théoriques et pratiques permettant la manipulation d’animaux dans le respect de leur bien-être. Conformément à l’agrément de cette formation par le Ministère de l'Agriculture, il s’agira d’enseigner aux étudiants de bonnes pratiques pour la réalisation des méthodes de préhension, de contention et d’injections chez le rat et la souris de laboratoire. Tous ces actes sont de sévérité modérée pour l’animal. Les travaux pratiques que nous souhaitons réaliser permettent une familiarisation progressive des étudiants avec l’animal de laboratoire. Ils seront réalisés en effectif réduit, sous la tutelle d’enseignants et de techniciens expérimentés portant une grande attention au bien-être de l’animal. Des enseignements plus théoriques d’éthique, de réglementation, de physiologie nociceptive, de bien-être animal, de points limites, d’anesthésie et d’analgésie viennent compléter ces connaissances afin que les étudiants soient en mesure d’adapter leur pratique au comportement de l’animal qu’ils manipulent. Le choix des rongeurs s’explique par l’utilisation majoritaire de ces modèles animaux en expérimentation. Les travaux pratiques se dérouleront en 4 séances, dont 1 seule requière l’utilisation d’animaux vivants, les 3 autres séances se font par des méthodes alternatives. Cette formation est optionnelle dans le cursus des étudiants, seuls des étudiants volontaires seront amenés à manipuler des animaux. Nous formerons jusqu’à 96 étudiants par an, nous aurons recours à l’utilisation maximale de 90 rats et 90 souris soit 180 animaux pour ces travaux pratiques sur 5 années de formation. Ces chiffres correspondent à l’utilisation d’un animal de chaque espèce par étudiant et à un animal surnuméraire prévu pour la démonstration par l’encadrant. Les animaux utilisés seront tous des animaux de réforme. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, après évaluation pour chaque animal de la gravité réelle et sur avis vétérinaire, les animaux seront proposés à l’adoption.

Bénéfices attendus

Les objectifs pédagogiques des séances de travaux pratiques sont : - la familiarisation des étudiants avec les animaux, sensibilisation au respect du bien-être animal - l’acquisition des compétences techniques de préhension, contention et injection sous-cutanée sur animal vigile - l’apprentissage des règles d’hygiène et sécurité propres à la pratique de l’expérimentation animale - la connaissance du matériel nécessaire aux injections, préparation de ce matériel, notions d’asepsie - une mise en situation dans des conditions réelles de l’expérimentation animale De plus, l'obtention du diplôme de licence ou master incluant la certification à l'expérimentation animale confère un avantage décisif aux diplômés en recherche d'emploi sur des postes de R&D

Procédures

Chaque animal sera manipulé pour la préhension, la contention et une injection sous-cutanée à chaque séance. La durée de la séance de TP a une durée totale de 4h comprenant : - le temps d’équipement des étudiants (surchausse, blouse, etc), - la familiarisation avec la pièce de manipulation (odeur, température), - les explications et les démonstrations fournies par les encadrants, - la réalisation des gestes (durée contention / injection SC : max 1 min) - la validation des gestes (évaluation pratique de la formation réalisée à l’aide d’une grille). Un même lot d’animaux sera utilisé une fois par semaine pour ces TP, avec un minimum de 5 jours de récupération entre 2 séances. De plus, nous veillerons à alterner les sites d’injection droite et gauche pour limiter la douleur des animaux. Au total, les TP étant étalés sur 6 semaines, un lot d’animaux sera injecté 12 fois maximum en SC, à raison de 2 injections sous-cutanée par séance

Impact sur les animaux

Douleur momentanée due à l’introduction de l’aiguille lors de l’injection sous-cutanée. Inconfort des animaux selon les difficultés d’apprentissage des étudiants et stress dû au nombre d’étudiants dans la pièce. Ces éventuelles nuisances sont compensées par une surveillance des animaux dans les heures et jours qui suivent le protocole. Les actes pratiqués ici sont d’un degré de sévérité modérée, à moins d’un accident de contention trop forte ou de piqûre dans un organe conduisant à sa lésion accidentelle. Notre expérience nous indique cependant que ceci peut parfois se produire chez un étudiant malhabile et stressé, il nous faudra donc rester très vigilant. L’enseignant veillera au bien-être immédiat de l’animal si de tels accidents survenaient. De plus, le nombre d’injections sur chaque animal sera limité à 2 par séance et chaque séance de TP sera espacée de la suivante avec un intervalle minimum de 5 jours. Afin de réduire les nuisances possibles, chaque animal sera utilisé au maximum pour 6 séances. En parallèle, une grille d’évaluation du bien-être des animaux sera employée.

Devenir

Les animaux pourront être réutilisés après avis vétérinaire. Une adoption pourra être alternativement envisagée par le biais associatif

Remplacement

Le recours à l’animal vivant n’est prévu que pour la séance 4. Pour les 3 autres séances, des méthodes alternatives ont été retenues. La séance 1 est basée sur l’utilisation de vidéos illustrant des tests comportementaux. La séance 2 est prévue sur des rats Koken, mannequin grandeur nature en silicone. La séance 3 utilisera des cadavres d’animaux et des vidéos.

Réduction

Cette formation est proposée seulement en option et a effectif maximum de 96 étudiants, alors que le contingent total est compris entre 450 et 550 étudiants inscrits en troisième année de licence et en Master 1ère année. Cependant, afin de restreindre les effectifs animaux employés, et les actes pratiqués étant de sévérité modérée, ces animaux ne seront pas euthanasiés mais seront réutilisés pour d’autres travaux pratiques se déroulant au sein de notre établissement, ou dans le cadre de projets autorisés, ce qui va dans le sens d’une réduction du nombre d’animaux manipulés. De plus, nous réaliserons une utilisation en continu de 2 lots d’animaux de chaque espèce, chaque animal sera utilisé 6 fois avec un intervalle de 5 jours minimum entre chaque séance.

Raffinement

Les pratiques expérimentales proposées sont de gravité modérée et des points limites ont été définis afin d’éviter toute souffrance de l’animal. Un retour d’expérience sera dressé pour répertorier les réussites et les difficultés des apprenants, ainsi qu’une liste des incidents/événements liés aux animaux.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les animaux les plus utilisés en expérimentation. La souris et le rat sont les animaux modèles les mieux caractérisés dans des domaines variés (physiologie, neurophysiologie, pharmacologie et toxicologie, etc.). Adultes de plus de 6 semaines, plus faciles à manipuler que de jeunes animaux

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intradermiques et intraveineuses sous anesthésie, des sensibilisations à la gliadine, puis un test d'anaphylaxie passive consistant à injecter de l'histamine dans l'oreille pour en mesurer le gonflement, avant une mise à mort par ponction cardiaque au trente-cinquième jour. L'objectif est de préciser le rôle de la protéine PCSK9 dans l'allergie et d'élargir une piste thérapeutique, retombée que le porteur situe au conditionnel. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne permet d'évaluer ce traitement et que seul un modèle murin allergique le permet.

Objectifs

PCSK9 (Pro Protein Convertase Subtilisine/Kexine de type 9) appartient à la famille des proprotéines convertases et est sécrétée par les hépatocytes dans le sang. Elle est un régulateur naturel du récepteur au LDL en l’envoyant à la dégradation lysosomale. Depuis une dizaine d’années, différentes études se sont intéressées au rôle inflammatoire de cette protéine. L’allergie étant une maladie inflammatoire chronique, nous souhaitons étudier le rôle de PCSK9 dans le cadre de l’allergie. Par une précédente étude, nous sommes en train de caractériser l’effet de PCSK9 dans l’allergie alimentaire. Ayant pu déterminer son rôle sur certaines cellules immunitaires liées à cette pathologie, notamment les mastocytes, nous souhaitons poursuivre cette approche par une expérimentation qui ne peut s’effectuer que chez la souris : le test d’anaphylaxie passive. Ce test consiste en l’injection auriculaire d’un médiateur inflammatoire (l’histamine) et d’en mesurer les conséquences chez la souris par la mesure d’un changement anatomique de l’oreille (gonflement et hypervascularisation).

Bénéfices attendus

Actuellement, aucun traitement ne permet soigner la cause de l’allergie, de plus, les effets secondaires liés aux corticoïdes sont notables et la désensibilisation n’est pas efficace chez tous les patients. PCSK9 devient une cible de plus en plus privilégiée dans le cadre de maladies inflammatoires, de plus, notre première étude sur le traitement anti-PCSK9 soigne les symptômes de l’allergie alimentaire chez la souris. Cette étude permettrait de comprendre le mécanisme par lequel PCSK9 agit sur le mastocyte et ainsi, élargir la thérapeutique de l’anti-PCSK9.

Procédures

Les animaux seront soumis des injections intradermiques et intraveineuses sous anesthésie à l’isoflurane et à des sensibilisations à la gliadine par voie intrapéritonéale. Pour finir, un prélèvement du sang terminal sera effectué par ponction intracardiaque après anesthésie sous isoflurane.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont une perte de poids. Une observation régulière des souris sera effectuée, les souris serons également pesées 3 fois par semaine.

Devenir

A la fin du protocole d'allergie au jour 35 post sensibilisation, toutes le souris seront mises à mort pour analyses.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle cellulaire permettant d’évaluer le bénéfice du traitement anti-PCSK9 dans le cadre de l’allergie. Seul un modèle murin allergique nous permettra de mesurer l’amélioration des symptômes via ce traitement et comprendre les effets de PCSK9 dans la physiopathologie de l’allergie. Les principes de raffinement et de remplacement contribuent à réduire le nombre d’animaux utilisés tout au long du protocole. Le projet étudiera l’allergie respiratoire dans des modèles déjà établis dans le laboratoire.

Réduction

Le modèle animal utilise a été soigneusement conçu et évalué pour permettre de réduire au maximum le nombre d’animaux du fait de la connaissance et la précision des paramètres observés selon la règle des 3R. Le projet étudiera l'allergie dans des modèles déjà établis dans le laboratoire. Un test non paramétrique et non apparié de type Student test, Mann-Whitney ou une analyse de la variance par un test de Bonferroni sera realisé. Une p-value inferieur a 0.05 sera considérée comme significative.

Raffinement

Le projet étudiera l’allergie dans des modèles déjà établis dans le laboratoire. Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Une observation journalière des souris sera effectuée, les souris serons également pesées 3 fois par semaine. Ainsi, les souris seront hébergées 5 par cage ventilée maximum. Elles auront accès à l’eau et à la nourriture de manière illimitée et suivront un cycle de lumière et d’obscurité de 12h. Des frisottis seront placées dans les cages. Les souris seront anesthésiées à l’isoflurane au moment de l’anaphylaxie passive.

Choix des espèces

Au cours de cette étude seront utilisées des souris de souche C57/Bl6 et Balb/c. Ces souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire et du métabolisme lipidique du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. Des analyses métaboliques seront réalisées. L’utilisation de souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages ainsi qu'à de nombreux outils de biochimie (ELISA, dosage colorimétrique...). Souris C57/B6 et Balb/c femelles âgées de 5 semaines au début du protocole ce qui correspond à des souris sevrées donc adultes ayant un système immunitaire mature ou quasi-mature.

864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie intracérébrale sous anesthésie pour injecter une toxine détruisant les neurones à dopamine et reproduire la maladie de Parkinson, plusieurs séries de tests moteurs dont le détail n'est pas précisé, une mesure de conduction nerveuse sous quatre heures d'anesthésie, puis la mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur reconnaît un ralentissement de la locomotion et des difficultés de motricité fine liés à la dégénérescence induite. Il admet que des cultures cellulaires suffisent pour certaines questions mais affirme que seule l'étude de l'"animal entier" permet d'évaluer l'effet de la L-DOPA sur la motricité.

Objectifs

La maladie de Parkinson se caractérise par une destruction progressive des neurones produisant de la dopamine (neurotransmetteur essentiel) dans la substance noire du cerveau, intervenant dans le contrôle de la motricité et des mouvements volontaires. L’absence de dopamine va provoquer l’apparition de symptômes moteurs comme les tremblements de repos, la rigidité musculaire et le ralentissement des mouvements. Pour l’heure, le seul traitement efficace est la prise quotidienne du précurseur de la dopamine, la L-DOPA. En effet, les neurones de la substance noire produisent la dopamine à partir de la L-DOPA ; le conversion de la L-DOPA en dopamine nécessite l'activation d'un enzyme appelé AADC. Dans ce projet des souris génétiquement modifiées qui ont ou non l'enzyme AADC actif seront soumises ou non à l'administration intracérébrale d'une toxine qui provoque la dégénérescence des neurones de la substance noire. La motricité des souris sera évaluée ; la conduction nerveuse et différents paramètres cellulaires et moléculaires seront aussi étudiés au niveau du cerveau. A travers ces expériences, l'objectif du projet est donc d'identifier quels sont les effets propres de la L-DOPA (situation où l'AADC n'est pas actif) chez les animaux normaux et dans la situation pathologique mimant la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d'étudier les propriétés de neurotransmission de la L-DOPA. Ainsi, les résultats permettront d'étayer les connaissances fondamentales sur l'importance de la L-DOPA seule dans le fonctionnement de structures cérébrales interconnectées spécifiques impliquées dans la planification et l’exécution des mouvements. Le projet apportera des connaissances également sur la contribution de la L-DOPA en condition pathologique dans un modèle animal de maladie de Parkinson. A long terme, les résultats de cette étude devraient contribuer à redéfinir et améliorer les traitements symptomatiques de la maladie de Parkinson

Procédures

En fonction des animaux, l'étude dure 10, 16 ou 22 semaines. Le nombre d'intervention listé est donné pour la durée de l'étude. 1) En fonction de la durée de l'étude, les animaux vigiles subiront 2, 3 ou 4 séries de 5 tests comportementaux permettant d'évaluer la motricité. Une série de 5 tests comportementaux se réalise sur 2 semaines ; chaque test comportemental est séparé du suivant par 2 jours. Chaque test comportemental dure au maximum 1h. 2) En fonction de la durée de l'étude, les animaux vigiles seront pesés 11, 17 ou 23 fois ; chaque pesée dure au maximum 1 minute. La pesée permet de suivre l'état de l'animal et prévoir la quantité d'antalgique et d'anesthésique à injecter. 3) En fonction des paramètres étudiés, les animaux vigiles subiront 1 ou 2 injections d'antalgiques et/ou d'anesthésiques. Chaque pesée dure au maximum 1 minute. 4) Les animaux seront tous anesthésiés deux fois. Les animaux anesthésiés subiront 1 chirurgie intracérébrale (anesthésie gazeuse) d'une durée d'1h30 nécessaire à l'inactivation de la L-DOPA et à l'induction de la dégénérescence des neurones de la substance noire. Certains animaux subiront une seconde anesthésie gazeuse d'une durée de 4h pendant laquelle la conduction nerveuse intracérébrale est mesurée. Tous les animaux seront anesthésiés avec une dose létale d'anesthésie fixe double dose et d'antagique à la fin du projet.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut induire une légère perte de poids transitoire et un stress notamment au réveil. L'induction de la dégénérescence neuronale permettant de modéliser la maladie de Parkinson va induire un léger ralentissement de la courbe de croissance des animaux ainsi qu'un ralentissement global de l'activité locomotrice et des difficultés dans la motricité fine.

Devenir

Tous les animaux de la procédure seront mis à mort en fin de procédure, afin de prélever les cerveaux pour les étudier.

Remplacement

Certaines recherches sur la maladie de Parkinson peuvent être effectuées à l'aide de modélisation basée sur des cultures cellulaires (in vitro) dans le cadre d'études sur les causes de la mort neuronale observée dans la maladie de Parkinson. En revanche, cette approche n'est pas adaptée lorsque l'on s'intéresse aux modifications comportementales qui nécessitent l'intégrité des réseaux neuronaux. Seules des études sur animal entier permettent d'étudier l'effet de la L-DOPA sur la motricité

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé a été calculé avec un test statistique approprié afin d'obtenir des résultats fiables malgré la variabilité interindividuelle. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques.

Raffinement

Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet (actes réalisés par du personnel expérimenté, médicamentation définie avec le vétérinaire référent et les tests comportementaux basés sur le comportement spontané des animaux, ne nécessitant pas d’intervention directe de l’expérimentateur). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale (gazeuse, facilement modulable et permettant un réveil rapide) avec un contrôle des paramètres vitaux (température, fréquence respiratoire, fréquence cardiaque), additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgique. Le traitement antalgique sera poursuivi au lendemain de la chirurgie voire 48h post-opératoire si l'état de l'animal le nécessite. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et à agir rapidement pour interrompre la souffrance. Les animaux sont hébergés quatre par cage, avec eau et nourriture ad libitum. L’hébergement en animalerie est réalisé en portoir ventilé, dans des pièces à température et hygrométrie régulées et contrôlées selon les normes en vigueur. Un enrichissement adapté à l'espèce est disposé dans les cages d'hébergement. Les animaux sont manipulés a minima de façon hebdomadaire. Une phase d'habituation aux expérimentateurs est prévue en amont de l'étude. Le binôme d'expérimentateurs reste le même tout au long de l'étude.

Choix des espèces

Ce projet nécessite l'utilisation de souris pour plusieurs raisons : la similitude des réseaux neuronaux entre ce modèle et l'humain ainsi que des altérations motrices similaires mais aussi, le modèle est largement décrit dans la littérature, les tests de motricité sont maitrisés chez la souris, et la modification génétique d'intérêt pour cette étude est réalisée sur des souris. Les animaux utilisés seront des animaux mâles et femelles adultes (8 semaines au début des tests comportementaux réalisés avant la chirurgie) de façon à se rapprocher du stade de développement de la maladie de Parkinson.

780 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des rates gestantes sont nourries d'un régime très pauvre en protéines, soumises à des frottis vaginaux quotidiens et à une injection intraveineuse, puis tuées par ponction cardiaque avant le terme pour prélever les fœtus et étudier le développement de leur hypothalamus. Le porteur présente son travail comme éclairant les risques de régimes "végétariens ou végétaliens" mal suivis pendant la grossesse, et reconnaît sacrifier les mères en gestation pour éviter le cannibalisme à la naissance. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne reproduit la gestation et le développement cérébral et juge le recours aux animaux "indispensable".

Objectifs

L'objectif du projet est d'étudier l'impact d'une restriction protéique sévère sur le développement fœtal de l’hypothalamus, une structure cérébrale qui joue un rôle clé dans la régulation de l’équilibre nécessaire entre apports et dépense énergétiques, indispensable au maintien d’un poids stable pendant toute la vie d’un être humain. Ce projet se situe dans le contexte de l’étude des origines précoces des maladies de l’adulte, ou DOHAD (Developmental Origins of Health and Adult Diseases) qui est au cœur des préoccupations de notre laboratoire. L’alimentation pendant la grossesse, en agissant sur les étapes précoces du développement fœtal, pourrait influencer de façon durable le fonctionnement cérébral et métabolique de l’organisme. La carence en protéines est une réalité pour de nombreux pays en voie de développement. Dans les pays industrialisés, sous l’influence des recommandations préconisées à juste titre dans les programmes alimentaires, la consommation de viande est en baisse. Cependant la végétalisation importante ou totale de l’alimentation comme lors des régimes végétariens/végétaliens ne permet pas toujours de couvrir les besoins en acides aminés essentiels qui augmentent pendant la grossesse (passant de 50 à 65 g/j). Les protéines végétales sont pauvres en lysine, thréonine et acides aminés soufrés et sont moins bien assimilées par l’organisme. Il est donc important d’évaluer les conséquences d’une carence en protéines pendant la grossesse et de comprendre comment la malnutrition pendant la vie fœtale contribue à la santé et à la maladie plus tard dans la vie. Les recommandations actuelles pour les femmes enceintes concernent essentiellement l’acide folique, le fer et éventuellement d’autres micronutriments, mais très peu voire pas du tout les macronutriments et en particulier les protéines. En utilisant le rat comme modèle, nous visons à déterminer quels processus cellulaires et moléculaires sont affectés par un régime pauvre en protéines, et si les conséquences sont irréversibles ou pas. L'objectif au niveau clinique est de fournir des données fondamentales sur les risques pour le développement du fœtus associés à certains régimes populaires lorsqu'ils sont poursuivis tout au long de la grossesse sans un suivi soutien nutritionnel professionnel. Nous voulons acquérir des données pertinentes sur les stades qui sont importants pour le développement normal du cerveau et sur les conséquences possibles pour le développement de l'enfant.

Bénéfices attendus

Nous connaissons déjà les effets d'un régime maternel restreint en protéines à 8% sur le développement de l’hypothalamus ; ils sont multiples mais légers. En utilisant un régime plus restreint à 4%, le but est d’induire des effets plus marqués au niveau cellulaire et moléculaire afin de mieux distinguer et comprendre les effets précis sur les étapes clés du développement, y compris la maturation des différents types de neurones hypothalamiques : Quel type de cellule est le plus vulnérable ? Comment sont-elles connectées les unes aux autres (i.e. le connectome). En outre, nous identifierons la fenêtre temporelle spécifique pendant laquelle la restriction protéique est néfaste pour le développement de l'hypothalamus. Grâce à une analyse au niveau de la cellule unique, une liste complète de gènes impliqués dans la malformation des réseaux neuronaux sera générée et nous aidera à identifier les cibles clés responsables des effets indésirables. Cet ensemble de résultats nous permettra de comprendre exactement comment et quand les noyaux hypothalamiques se forment, et comment cela entraîne des effets persistants avec un régime faible en protéines. À long terme, l'impact est multiple. Notre recherche fournira des données sur les risques pour le développement du fœtus associés à certains régimes populaires pauvres en protéines (c'est-à-dire végétariens ou végétaliens) lorsqu'ils sont poursuivis tout au long de la grossesse sans soutien nutritionnel rigoureux de la part d'un diététicien, et sur les conséquences possibles pour la santé et les maladies ultérieures. Nos résultats serviront à contribuer à l'établissement d'un cadre diététique qui puisse aider les gynécologues, les diététiciens et les femmes pendant la grossesse. Cela contribuera également à réduire les coûts économiques liés aux naissances prématurées, aux retards de développement et aux soins postnatals prolongés en raison de la restriction de croissance intra-utérine.

Procédures

Les femelles seront soumises à des prélèvements de cellules vaginales exfoliées tous les jours pendant 4 à 7 jours afin de déterminer la période de fécondité et le lendemain de l'accouplement. Ces prélèvements sont indolores, ne durent que quelques secondes et sont pratiqués sur les animaux vigiles. Certaines seront soumises à une injection intraveineuse dans la veine de la queue (5 à 10 secondes environ) au 14ème jour de gestation. Cette injection sera réalisée sous anesthésie générale. Avant la mise à mort, les femelles gestantes anesthésiées seront soumises à un prélèvement intracardiaque de sang (environ 10 secondes).

Impact sur les animaux

Nous avons fait le choix de nourrir les femelles avec un régime modérément carencé en protéines (8%) pendant la période préconceptuelle afin d’éviter une altération de la fécondité. Le régime carencé à 4% de protéines, administré pendant la gestation, ne devrait pas provoquer d’inconfort ou de souffrance. Nous avons déjà dans le laboratoire l’expérience de ce type de régime pendant la gestation. Ce régime apporte la même quantité d’énergie que le régime contrôle afin d’éviter des apports énergétiques insuffisants aux femelles gestantes, la carence en protéine étant compensés par une augmentation de la teneur en hydrates de carbone (essentiellement amidon, un peu de sucre). Nous avons montré précédemment que la quantité d’énergie ingérée par les femelles gestantes recevant un régime à 4% de protéines était similaire à celles recevant un régime contrôle. La carence en protéines a pour effet de réduire la croissance fœtale, les poids des fœtus et des placentas étaient réduits de 26% et 35% respectivement, mais étonnament, la taille des portées était légèrement supérieure. Par ailleurs, aucun effet négatif majeur, de type mort pendant la gestation, fausse couche ou malformation fœtale n’a été observé. Le fait de sacrifier les femelles pendant la gestation permet d’éviter des effets possibles comme le cannibalisme au moment de la naissance qui peut survenir en cas de dénutrition maternelle. Par ailleurs, les sacrifices pratiqués au plus tard à G17 surviennent en amont de la phase majeure de croissance fœtale qui a lieu les 3/4 derniers jours de la gestation.

Devenir

Aucun animal ne sera maintenu en vie à la fin du projet, les femelles seront commandées au fur et à mesure et le nombre prévu sera éventuellement réduit si tous les prélèvement requis ont pu être obtenus avant. S’il n’est pas possible d’obtenir une gestation dans le délai voulu pour certaines femelles, elles seront sacrifiées ou proposées pour d’autres protocoles. Cependant, cette éventualité est très limitée du fait des régimes expérimentaux avec lesquels les femelles auront été nourries.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est indispensable pour créer les conditions physiologiques caractéristiques de situation physiologiques complexes telles que la gestation et le développement cérébral. A ce jour, aucun modèle ex-vivo ou in-vitro ne permet de reproduire l’ensemble des interactions métaboliques, cellulaires et moléculaires. Cependant, ce modèle animal servira aussi à l’obtention de modèles cellulaires (cellules souches neurales prélevées sur les fœtus) qui permettront de tester des caractéristiques de certains types cellulaires et de développer à terme des modèles cellulaires qui permettraient par exemple de tester l’influence de certaines molécules ou nutriments sur le métabolisme cellulaire in vitro.

Réduction

Un calcul statistique d'effectifs nous permet d'établir qu’un nombre de 20 fœtus (10 mâles + 10 femelles) provenant de 10 mères différentes est nécessaire pour chaque analyse à chacun des 2 stades, ce qui fait un total de 20 femelles par régime. Nous prévoyons 10 femelles de plus par régime (soit 30 femelles) pour pallier aux éventuels problèmes de type gestation non détectée, nombre insuffisant de petits, etc. Ce nombre pourra être réduit dès que le nombre de fœtus prélevés par groupe sera atteint. Pour chaque portée, nous prélèverons un minimum de 12 fœtus (idéalement 6 males et 6 femelles) par portée afin d’avoir un nombre suffisant de fœtus des 2 sexes pour chaque analyse.

Raffinement

L’environnement des femelles avant et pendant la gestation sera enrichi (tunnel, bâton à ronger, frisottis). Les procédures envisagées sont classées « modérées » du fait de la teneur faible en protéines du régime 4% auquel seront soumises la moitié des femelles gestantes. Les animaux seront suivis par un personnel animalier compétent et observés quotidiennement pour détecter d’éventuels signes de souffrance. Leur prise alimentaire et leur prise de poids pendant la gestation seront mesurées 3 fois par semaine afin de détecter une éventuelle sous-alimentation ou perte de poids anormale. Les points limites définis conduiront, s’ils sont observés, à la mise à mort des animaux le cas échéant.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce utilisée dans notre laboratoire et bien d’autres depuis de nombreuses années pour les protocoles expérimentaux visant à étudier l’influence de la nutrition en période périnatale sur le développement fœtal et postnatal. Nous avons déjà obtenu de nombreux résultats sur cette espèce, qui est appropriée, par sa taille, aux études anatomiques, cellulaires et moléculaires que nous pratiquons. Le projet porte sur l’influence de la nutrition maternelle en période préconceptuelle et gestation sur le neurodéveloppement fœtal. Les animaux commandés au fournisseur seront des femelles vierges de 8 semaines et des mâles reproducteurs. Les analyses porteront sur des organes prélevés post mortem sur des rates gestantes, et des fœtus à différents stades de la gestation. Aucune analyse n’est prévue dans ce projet dans la période post-gestation.