Procédures modérées

60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection dans la moelle épinière sous anesthésie et développe une hypersensibilité douloureuse de la face, l'allodynie, avant d'être anesthésié en profondeur et tué pour prélever ses tissus nerveux, dans une étude sur la migraine. Le porteur teste un triptan et un antagoniste du CGRP et prévoit la mise à mort des animaux perdant plus de 15 % de leur poids. Il juge le développement de nouvelles molécules "indispensable" et affirme qu'"aucune méthode alternative" ne peut remplacer ce protocole.

Objectifs

La migraine est une pathologie qui a un fort impact sur la santé publique (12-15% de la population touchée). Les traitements proposés ont une efficacité limitée, surtout au stade chronique de la maladie. Le développement et l'évaluation des effets antalgiques de nouvelles molécules est indispensable pour l’amélioration des thérapeutiques. Une des signatures comportementales de la migraine est l’hypersensibilité à la douleur mécanique cutanée appelée allodynie qui représente en plus de la douleur spontanée un symptôme très handicapant pour les malades.

Bénéfices attendus

A moyen terme, ce projet a pour but de mettre en évidence l'implication des astrocytes dans la chronicisation de la migraine et l'installation de l'allodynie mécanique. Si nous arrivons à identifier de nouveaux acteurs ainsi que leurs rôles, cela nous permettra de mieux comprendre ces pathologies. A plus long terme, ces études peuvent aider à développer de nouveaux traitements pour soulager les patients.

Procédures

Chaque animal aura une une injection intramédullaire (sous anesthésie gazeuse, 1fois 20 min), une injection intra péritonéale (vigile 1 fois 30s) et une perfusion (sous ananesthésie profonde 1fois 30min). Elles seront réalisées par du personnel formé et compétent, sous la responsabilité des membres de la Structure du Bien Etre Animal.

Impact sur les animaux

Les résultats obtenus des travaux du laboratoire ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mise à part le développement d'une allodynie faciale. La douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » et les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer ses gestes habituels.

Devenir

A la fin des procédures d'études comportementales, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort: pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une analyse immunohistochimique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après l'injection virale et pour tester les différents traitements curatifs.

Réduction

Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir 10 animauxmaximal par groupe: habituation, injections virale et systémique,comportement, stimulation et perfusion. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. D’abord, un test de significativité sera réalisé afin de déterminer si les données suivent une distribution normale, puis un test d’égalité des variances avant de confronter les valeurs avec un test paramétrique. Dans le cas où le test de normalité soit significatif ou les variances ne puissent pas être considérées égales, nous allons donc utiliser des tests non paramétriques.

Raffinement

Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. L’anesthésie adéquate des animaux est confirmée par l’absence de réflexe de retrait de la patte en réponse à un pincement de la patte postérieure. De plus, lors d’injection intra médullaire, le suivi post-opératoire, avec un examen minutieux de la zone d’injection, est poursuivi dans les jours suivants. L'état général de l'animal est surveillé tous les jours avec contrôle du poids. Si un amaigrissement de plus de 15% du poids total, mesuré au début de l’expérimentation, est constaté ou s’il apparaît un comportement défini dans la liste de points limites, alors les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souche de rat Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Nous utiliserons des animaux entre 3 à 8 semaines, pour comparer avec les données du laboratoire.

314 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un vecteur viral sous anesthésie, cinq prélèvements de sang et cinq séries de tests comportementaux entre un et douze mois, pour évaluer une thérapie génique contre une maladie neuromusculaire mortelle chez l'humain. Le porteur mentionne des tests moteurs et sensoriels sans en préciser la nature. Il affirme qu'il est "essentiel" de prouver l'efficacité de l'approche chez la souris, présentée comme ayant "98 % d'identité protéique" avec l'humain.

Objectifs

Ce projet concerne le développement d’une thérapie génique pouvant constituer un traitement curatif pour une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle, il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène, et cela entraine des troubles moteurs et sensoriels chez les patients dès l’enfance. La thérapie génique consiste donc à compenser le gène défectueux en important une copie du gène fonctionnelle dans l’organisme grâce à un vecteur viral. Précédemment, nous avons développé un modèle animal (souris) qui reproduit pour la première fois les troubles moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients. Nous avons élaboré une méthodologie avec ce modèle pour développer notre thérapie. Notre premier objectif est d’optimiser les conditions de notre protocole (choix du meilleur promoteur, doses à utiliser) en analysant les effets sur le comportement et l’organisme de nos souris (prélèvements sanguins, analyses moléculaires). Ensuite, notre deuxième objectif est d’évaluer les bénéfices de ce protocole thérapie génique grâce à un essai pré-clinique dans notre modèle sur une durée de 12 mois. Nous évaluerons ces bénéfices en évaluant le comportement et l’effet sur l’organisme de ces souris.

Bénéfices attendus

La validation de notre protocole et l’évaluation des bénéfices de notre thérapie génique chez la souris constituerait un premier pas vers une thérapie adaptable à l’Homme dans le cadre d’une maladie génétique. De plus, lors des analyses sanguines, nous aimerions pouvoir mettre en évidences des marqueurs sanguins de cette maladie. Ces marqueurs pourraient être utilisés également dans le cadre du diagnostic d’autres maladies neurodégénératives.

Procédures

Les souris recevront le vecteur viral (durée : 5mn) sous anesthésie générale. Les souris auront 5 prélèvements sanguins (durée : 5mn). Les souris réaliseront 5 fois la série de tests comportementaux (5 tests comportementaux, durée : entre 30s et 15mn) entre 1 mois et 12 mois. Ces tests permettront d’évaluer les capacités motrices et sensorielles des animaux permettant de rendre compte de l’efficacité de l’approche thérapeutique.

Impact sur les animaux

L’administration du vecteur viral, les prises de sang pourront induire un stress faible chez les animaux. Les tests comportementaux pourront induire un stress variable chez les animaux allant de faible à modérer. Aucun autre effet indésirable n’est attendu à l’issu de ces éléments.

Devenir

Ce projet compte 2 procédures. La première permettra de valider le protocole de thérapie génique sur les souris par des analyses comportementales et tissulaires, nécessitant leur mise à mort afin d’étudier le phénotype tissulaire (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses). La deuxième permettra d’évaluer les bénéfices de la thérapie au niveau comportemental et tissulaire nécessitant la mise à mort des souris (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses.

Remplacement

Le projet a pour but de valider un premier essai pré-clinique de thérapie génique pour une maladie neuromusculaire fatale et incurable chez l’Homme. Les modèles in vitro (cellules immortelles et neurones en culture) ont permis de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire/cellulaire de cette approche. Elle nécessite à présenter être validée dans un organisme modèle de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez la souris.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire au maximum le nombre d’animaux par condition expérimentale tout en conservant un nombre suffisant de souris par lot pour pouvoir analyses nos résultats de façon statistique et ne pas avoir besoin de reconduire ce type de projet.

Raffinement

Le phénotype de notre modèle murin ne diffère pas du modèle sauvage durant le temps de l’expérimentation (12 mois maximum) permettant un hébergement en cage collective pour respecter leurs besoins sociaux. L’administration du vecteur viral est réalisée sous anesthésie générale avec un réveil post-anesthésie dans une cage chauffée, du gel ophtalmique est appliqué post-injection et mise en place d’une analgésie si besoin. Les prises de sang sont effectuées sous anesthésie générale avec réveil post-anesthésie dans une cage chauffée et mise en place d’une analgésie si besoin. L’organisation des tests comportementaux seront précédés d’une phase d’entrainement et une période de récupération d’au moins une demi-journée voir 2 jours entiers est prévue afin de limiter au maximum le stress des animaux. Chaque animal sera surveillé de façon individuelle et de façon quotidienne. A chaque étape du projet, des points limites ont été établis pour soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Avec 98% d’identité protéique avec l’Homme, la souris constitue un modèle idéal pour reproduire les pathologies humaines afin de les étudier dans un contexte physiologique mais également de pouvoir tester et valider des approches thérapeutiques. L’étude réalisée sur notre modèle a montré qu’il reproduit pour la première fois les symptômes moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients, justifiant son utilisation valider notre approche de thérapie génique. Notre projet utilisera le stade juvénile (1 mois) et le stade adulte (2 à 12 mois). Notre modèle murin présente des défauts moteurs et sensoriels à partir de 3 mois ; il est donc nécessaire de débuter la stratégie à un stade précoce. La validation du protocole et l’évaluation des bénéfices au niveau comportemental et histologique doivent être évaluées au stade adulte pour évaluer les effets de la thérapie à moyen- et long-terme.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie du crâne avec pose d'un cathéter et ouverture de la boîte crânienne sous anesthésie pendant soixante-dix minutes, puis une IRM sous anesthésie, pour provoquer un accident vasculaire cérébral et étudier l'effet d'un thrombolytique sur l'inflammation. Le porteur n'annonce que de simples "pistes" thérapeutiques comme retombée. Sa rubrique de réduction avance deux nombres différents, 120 souris puis 60, sans lever la contradiction.

Objectifs

Cette étude vise à comprendre l'implication de l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) dans les processus inflammatoires qui surviennent lors d'un accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique, et notamment sur l'infiltration des neutrophiles du compartiment vasculaire vers le tissu cérébral. Des études précédentes montrent que l'utilisation de rtPA (Actilyse) pour induire une reperfusion du tissu cérébral peut moduler en parralèle l'infiltration des neutrophiles dans le tissu cérébrale. La contribution du rtPA dans ces mécanismes inflammatoires reste à déterminer. L'objectif de notre projet est de comprendre les effets du rtPA sur l'inflammation cérébrale à la suite d'un AVC ischémique. Afin de représenter les différentes situations qui se produisent en clinique, nous étudierons les effets de la thrombolyse par rtPA sur deux modèles murins d'AVC ischémique : un modèle thromembolique où l'injection i.v. de rtPA permet la reperfusion du tissu cérébrale et un modèle thrombotique où l'injection de rtPA est inefficace sur la reperfusion. De plus nous allons étudier l'impact de la thrombolyse par le rtPA sur la réponse inflammatoire dans le contexte d'une thrombolyse précose et tardive afin de mimer les differents contextes possibles en clinique.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d'apporter de nouvelles connaissances l'impact du rtPA sur l'inflammation cérébrale et ainsi nous permettra de proposer de nouvelles pistes pour de potentielles stratégies thérapeutiques en combinaison de la thrombolyse par rtPA.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie permettant une pose de cathéter caudal et l'accès à l'artère cérébrale moyenne par craniotomie sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 70 minutes par animal. Les animaux seront également soumis à des acquisitions par imagerie par résonnance magnétique (IRM) à 24h après l’induction de l’AVC, sous anesthésie générale pour une durée totale de 34 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Afin de limiter toutes douleur occasionnée par la chirurgie, nous utiliserons un analgesique lors du protocol chirurgical. Lors de projets précédents utilisant des procédures identiques ou similaires, nous n’avons pas observés de signe de douleur ni souffrance des animaux à la suite de la chirurgie. Les mesures pour réduire au maximum toute forme d’inconfort et de souffrance sont le suivi strict et rapproché des animaux, l’hébergement en petits groupes sociaux stables (n = 5) avec un enrichissement minimum (un rouleau cartonné + une feuille de papier essuie-tout), et la manipulation uniquement par des personnels expérimentés. Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales d’hébergement, dans un environnement stabilisé en température (21°), hygrométrie (55%), luminosité (100 lux), et durée du cycle de lumière (12h/12h).

Devenir

Tous les animaux utilisés au cours de ce projet (120 animaux) seront mis à mort. Les tissus récupérés seront necessaires pour les futures analyses immunohistochimiques et en biologie moléculaire.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation et l’ischémie cérébrale. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 120 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, et l’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettant de mesurer les lésions cérébrale et l’inflammation cérébrale permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux total : 60) a été évalué via un test d’analyse de puissance (α=0.05 ; β=0.8).

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est l’espèce de référence comme d’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la thrombolyse, la neuroprotection et la réponse inflammatoire suite à un AVC ischémique. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour notre étude.

128 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mâles subissent une neurochirurgie qui installe un modèle de la maladie de Parkinson, des injections quotidiennes pendant quarante-six jours et huit injections d'un composé provoquant "malaise gastrique et dégoût" pour conditionner une aversion sexuelle, avant d'être tués pour analyse du cerveau. Les femelles subissent l'ablation des ovaires et la pose d'un implant hormonal, puis seront réutilisées dans des formations à l'expérimentation animale. Le porteur décrit des tests d'activité motrice et sexuelle et affirme qu'"il n'existe pas de méthodes alternatives" pour évaluer un comportement impulsif.

Objectifs

Les traitements symptomatiques de la maladie de Parkinson sont associés à plusieurs complications motrices et non motrices. Les troubles du contrôle des impulsions sont les effets secondaires neuropsychiatriques les plus courants, affectant plus de 20 % des patients, principalement sous traitement médicamenteux. Les troubles du contrôle des impulsions sont des addictions comportementales telles que l'hypersexualité, l'alimentation compulsive, les achats compulsifs ou le jeu pathologique qui entraînent de graves conséquences familiales, des coûts sociaux, économiques et juridiques qui affectent un grand nombre de patients dans le monde entier. L'hypersexualité est l'un des troubles du contrôle des impulsions les plus fréquents développés par les patients. Ce projet est basé sur l’hypothèse selon laquelle les troubles du contrôle des impulsions sont associés à des signatures moléculaires spécifiques qui peuvent être récupérées sous la forme de biomarqueurs dans le sang. Nous supposons en particulier que des profils spécifiques de certains marqueurs cellulaires permettront de distinguer des animaux parkinsoniens atteints de troubles de l'hypersexualité, troubles que l'on peut reproduire facilement expérimentalement chez le rat mâle.

Bénéfices attendus

Le projet vise à fournir une compréhension de la physiopathologie des troubles du comportement impulsif par le développement d’un modèle préclinique innovant, permettant l'identification des mécanismes moléculaires et des biomarqueurs grâce à des méthodes de dépistage spécifiques. Ce projet conduira à une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à la réponse pharmacologique et aux effets secondaires de la maladie de Parkinson et permettra l'identification de biomarqueurs spécifiques aux troubles du comportement impulsif qui devraient aider, à plus long terme, à identifier des sous-groupes critiques de patients.

Procédures

Les animaux mâles subissent une neurochirurgie, pour induire le modèle animal de la maladie de Parkinson, d'une durée de 45 minutes, anesthésie incluse. Ils subissent 3 prélèvement sanguins n’excédant pas 1 mL, chacune espacés de plus de 6 semaines, n’excédant pas plus de 10 minutes, anesthésie incluse. Ils subissent des injections quotidiennes (pendant 46 jours) dans la cavité abdominale d’un antiparkinsonien sur animal vigile, chacune n’excédant pas 10 secondes. Enfin, ils subissent 8 injections (chacune n’excédant pas 10 secondes sur animal vigile) dans l'abdomen (une tous les deux jours) d’un composé qui provoque malaise gastrique et dégoût pendant environ une heures. Les rats males seront soumis à 3 reprises à un test d’activité motrice s’établissant sur 4 sessions (2 par jour sur 2 jours consécutifs) d’évaluation de leurs capacités à avancer leurs pattes antérieures. Chaque session dure moins de 5 minutes. Les animaux femelles subissent une chirurgie abdominale et une chirurgie sous cutanée, les deux étant consécutives et l’ensemble n’excédant pas 40 minutes, anesthésie incluse. Elles subissent par la suite 12 injections sous-cutanées d’un composé qui favorisent les processus de la grossesse, espacées chacune d’au moins 48h. Mâles et femelles, seront soumis à 12 sessions comportementales permettant d’évaluer l’activité sexuelle des mâles et n’excédant pas une heure chacune.

Impact sur les animaux

Une souffrance légère liée à la répétition des injections est à envisager ainsi que les risques de formation d’un hématome, que ce soit chez les femelles comme chez les mâles. De plus les injections qui provoque chez lesmâles malaise gastrique et dégoût sont également susceptibles d’induire un état d’angoisse modérée de par l’induction de la situation conflictuelle dans lequel elles placent l’animal. Lors de la neurochirurgie (rats mâles) et de la chirurgie abdominale (rats femelles) et d’implantation des implants d’estradiol (rats femelles), les nuisances ou effets indésirables modérés pourront concerner la douleur associée aux points d’incision et aux points de contention au niveau des oreilles, et des douleurs post-opératoires. En post-chirurgical, il n’est pas à craindre de souffrance plus que modérée au cours du processus neurodégénératif progressif induit par un virus codant pour une toxine avant 9 semaines d’incubation, les animaux restant tout à fait capable de s’hydrater et de se nourrir. La littérature rapporte des déficits moteurs pouvant s’aggraver au-delà de 9 semaines, date à laquelle seront initiées les injections quotidiennes d'une substance qui bloquent l’apparition de ces déficits. Pour les animaux traités avec le diluant des points limites seront définis pour que les déficits moteurs n’induisent pas de souffrance. Enfin, une souffrance légère pourra être liée aux échantillonnages sanguins réalisés par ponction de la veine de la queue à 3 reprises, pouvant induire chez l’animal stress et hémorragie.

Devenir

Les animaux mâles seront mis à mort pour effectuer des analyses des tissus cérébraux. Les femelles seront réutilisées dans le cadre de formations à l’expérimentation animale ou autre formation d’enseignement, en concertation avec le vétérinaire référent.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, qui permettront l’évaluation d’un comportement impulsif. De plus, notre approche méthodologique nous permet d’avoir accès à l’activité de différentes structures dans un réseau complexe au sein du cerveau. Les activités transcriptionnelles (activités concernant le passage de l'information contenue dans les cellules sous forme d'ADN en ARN) des neurones au sein des différentes structures cérébrales étudiées sont influencées aussi bien par les structures auxquelles ils appartiennent que par les interactions entre ces différentes structures et ne peuvent être modélisées ni par des approche ex-vivo, ni des approches mathématiques.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe afin de ne pas compromettre la validité́ des expériences. Ce nombre a été estimé à l'aide d'une d'approche statistique. Pour une question d’organisation et de gestion des expérimentations, l’ensemble des animaux sera traité au cours de deux sessions distinctes pour n’avoir à suivre simultanément qu'un nombre restreint de mâles et de femelles. Ainsi, à l’issue de la première session, si les résultats sont suffisants pour mettre en évidence des différences significative des différents paramètres étudiés, il ne sera pas nécessaire de faire appel à une seconde session.

Raffinement

Les animaux sont hébergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils sont manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations, afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux manipulations et aux contentions. Les prélèvements sanguins sont réalisés sur les rats mâles endormis puis maintenus sous anesthésie gazeuse permettant un recueil de sang par une des veines latérales de la queue avec des aiguille- fines. Chaque recueil se fait en un point différent du précédent pour limiter les risques lésionnels. Les neurochirurgies chez les rats mâles sont réalisées sous anesthésie générale, les yeux sont protégés de la dessication et les points de contentions et d’incisions sont préalablement analgésiés. La température est maintenue constante. En post-opératoire les animaux sont placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Les douleurs post-opératoires sont prévenues par injection d’un antalgique. A leur réveil, les animaux sont retournés dans leur cage avec leurs congénères. Le retrait des ovaires chez les femelles se fait sous anesthésie générale et sous analgésie (température maintenue constante et yeux également protégés de la dessication). Puis, après fermeture des incisions chirurgicales, afin de ne pas avoir à réendormir les animaux, ceux-ci reçoivent un implant hormonal sous-cutané placé au niveau du cou par une incision restreinte de 1 cm de long. Après fermeture des incisions chirurgicales, en post-opératoire, les animaux sont placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil puis remis avec leurs congénères et reçoivent 24h après une nouvelle injection d’antalgique. Les injections répétées - chez les mâles comme chez les femelles - sont réalisées avec des seringues microfines avec changement de seringue entre animaux et changement des points d’entrée des aiguilles pour atténuer les risques de douleur et de formation d’hématomes. Le projet implique la mise en place d’un état pathologique chez le rongeur avec de la chirurgie de classe modérée n’affectant que très progressivement l’autonomie des rats à s’hydrater et se nourrir et donc une faible perte de poids. L’avantage de ce modèle par injection virale est que ces déficits moteurs bilatéraux restent modérés tout au long du protocole. Le suivi quotidien et les pesées bihebdomadaires des animaux permettent de veiller à ce que les animaux ne souffrent pas et de mettre en place des stratégies de soin et des points limites adaptés.

Choix des espèces

Le rat est une espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau dee certaines structures cérébrales sur lesquelles portent cette étude, tant du point de vue anatomique que physiologique. Les registres comportementaux explorés (motricité, sexualité) sont facilement appréhendables dans cette espèce. De plus le type de construction virale utilisé dans ce projet permettant d'induire progressivement des stades précoces de la maladie de Parkinson chez le rat est également bien caractérisé dans cette espèce et les troubles du contrôle de l’impulsivité semblent s’y exprimer de façon plus prépondérante que dans d’autres types de modèles lésionnels. Les animaux utilisés sont des animaux adultes de 8 semaines. Ce stade de développement est justifié, s’agissant d’étude portant sur le comportement sexuel des animaux, par la nécessité d’avoir des animaux présentant un développement des phases précoces de la maladie de Parkinson et ayant atteint leur pleine maturité sexuelle.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection dans le sinus veineux situé derrière l'œil sous anesthésie, puis subit jusqu'à neuf prélèvements de sang par la joue sur deux à trois semaines, pour comparer des anticorps produits à partir de microalgues à des anticorps classiques. Le porteur présente l'enjeu comme économique, réduire le coût de production des anticorps, et annonce le bénéfice pour les patients à terme. Il affirme qu'après vérification in vitro il était "nécessaire" d'étudier ces anticorps dans un organisme au système immunitaire mature.

Objectifs

L’industrie pharmaceutique mise de plus en plus sur les anticorps thérapeutiques pour satisfaire les besoins de santé, encore nombreux. Cependant, l’industrie française a pris du retard dans ce domaine. Malgré une consommation importante de médicaments par la population française, seuls trois anticorps thérapeutiques sont produits en France (omalizumab, canakinumab, sécukinumab). Avec la prévalence croissante des maladies chroniques comme les cancers, les maladies autoimmunes et infectieuses telles que la COVID-19, le besoin en médicaments de type anticorps s’accroit considérablement. Ces médicaments sont actuellement produits en utilisant des cellules de mammifères comme usines cellulaires. Le coût de production de ces anticorps est très élevé. En conséquence, il devient indispensable de développer des systèmes alternatifs de production d’anticorps qui permettent de décroître leurs coûts de production et ainsi de les rendre plus accessibles. Récemment, les microalgues ont été utilisées avec succès pour produire des anticorps fonctionnels dirigés contre des virus comme le virus de l’Hépatite B ou le virus de Marburg. Nous produisons actuellement des bio-similaires d’anticorps anti-cancéreux. L'objectif du projet est donc de comparer la pharmacocinétique de ces anticorps produits à partir de microalgues par rapport aux anticorps génériques.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude, si ils valident le système alternatif de production d'Ac à partir de microalgues va permettre de diminuer considérablement leur coût de production et ainsi les rendre plus accessibles.

Procédures

Chaque souris recevra à J0 une injection intraveineuse unique via le sinus rétro-orbitale de 5 mg/kg d’anticorps dans un volume total de 200µl de PBS. Cette injection sera pratiquée sous anesthésie générale. Chaque souris aura des prélèvements sanguins, un total de 9 sur 2 à 3 semaines. Prélèvements de sang via les veines submandibulaires. L’ensemble des prélèvements sera effectué sous anesthésie générale à l’isoflurane 2.5% après une induction à l’isoflurane 5% dans l’air. Le volume de chaque prélèvement sera de 50µl récupéré dans des capillaires calibrés. Après chaque ponction une pommade antiseptique cicatrisante sera appliquée (Biseptine Cica gel).

Impact sur les animaux

Les gestes expérimentaux sur les animaux se limitent à une injection intraveineuse et des prélèvements sanguins qui ne devraient pas induire de nuisances ou effets indésirables particuliers compte tenu des mesures préventives prises et des précautions apportées à leur mise en oeuvre.

Devenir

Tous les animaux de l'étude seront mis à mort.

Remplacement

Les anticorps sont actuellement produits en utilisant des cellules de mammifères comme usines cellulaires. Récemment, les microalgues ont été utilisées avec succès pour produire des anticorps fonctionnels, malgré une structure protéique identique certaines modifications post-traductionnelles peuvent intervenir et par conséquent modifier l'affinité des parties constantes pour les différents récepteurs aux FcGamma ou son immunogénicité. Après vérification in-vitro de ces différentes interactions anticorps récepteurs il était nécessaire d’étudier leur comportement dans un organisme vivant avec un système immunitaire mature et fonctionnel.

Réduction

Au-delà de l’utilisation du nombre minimum d’animaux pour obtenir une modélisation correcte de la pharmacocinétique de chaque anticorps, cette étude à terme permettra de remplacer les milieux de culture riches en sérum de veaux foetal par de l’eau de mer pour la production de ces anticorps. Le problème éthique majeur du sérum de veau foetal vient du fait qu’il provient du sang de foetus de vache, prélevé au moment de l'abattage de vaches gestantes. Le foetus est retiré du ventre de sa mère, et la totalité de son sang est prélevé par ponction cardiaque, le plus souvent sans anesthésie afin de garantir la qualité de l’échantillon. Ce nouveau mode de production permettra donc à court et à long terme moins d’utilisation de sérum de veaux foetal et donc d’animaux donneurs.

Raffinement

L’injection intraveineuse ainsi que les différents prélèvements seront pratiqués sous anesthésie générale à l’isoflurane. Afin de limiter le nombre de prélèvement sur chaque souris tout en garantissant un suivi sérologique optimal pour l’étude pharmacocinétique, les 16 souris seront divisées en 4 groupe de 4. De cette façon le nombre de prélèvements par individu sera divisé par 4, de plus les prélèvements seront alternés coté droit et gauche de la mandibule. L’innocuité de ces anticorps devant être totale, des points limites extrêmement précoces basés sur le mouse grimace scale et le poids seront appliqués :

Choix des espèces

La souris est un très bon modèle qui permet d'évaluer après modélisation le profil pharmacocinétique d'un anticorps monoclonal. La demi vie d'un anticorps et sa bio distribution au sein des différents tissus d'un organisme vivant sont dûs à un récepteur aux Fc des immunoglobulines G, le FcRn. Chez la souris il est totalement fonctionnel pour les IgG humaines ce qui permet d'évaluer la demi vie et la courbe de distribution par dosage cinétique des concentrations résiduelles dans le sang (volume périphérique) d'un anticorps choisi. Ces anticorps sont actuellement produits en utilisant des cellules de mammifères comme usines cellulaires. Récemment, les microalgues ont été utilisées avec succès pour produire des anticorps fonctionnels, malgré une structure protéique identique certaines modifications post-traductionnelles peuvent intervenir et par conséquent modifier l'affinité des parties constantes pour les différents récepteurs aux FcGamma. Cette étude chez la souris permettra donc d'évaluer ces modifications potentielles. Les souris seront utilisées à l’âge de 7 semaines pour que leur système immunitaire soit mature. Elles arriveront dans notre animalerie à l’âge de 6 semaines et seront acclimatées pendant 7 jours période nécessaire au développement d'un microbiote dépendant de notre animalerie.

6 098 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses sous la peau, des injections dans le ventre, des médicaments par gavage et des prélèvements de sang, pour tester huit inhibiteurs de la protéine eIF4A censés lever la résistance des mélanomes et cancers du poumon aux thérapies ciblées. Le porteur situe l'essai clinique et le bénéfice pour les patients dans un temps ultérieur, l'objectif immédiat restant de mesurer l'effet des composés sur la tumeur. Il affirme qu'aucun modèle in vitro n'est assez robuste et que le recours à un modèle animal "comparable au corps humain" est "indispensable".

Objectifs

Le mélanome est la première cause de décès par cancer des jeunes adultes. Les thérapies ciblées actuelles augmentent la durée de vie des patients porteurs d’une mutation sur le gène BRAF mais n’empêchent pas l’apparition d’un phénomène de résistance au traitement dans la grande majorité des cas. Nos récentes études ont montré que l’inhibition de la protéine eIF4A impliquée dans la traduction de l’ARN en protéine entraine une levée de cette résistance in-vitro. Ces découvertes encourageantes ont initié l’étude de l’utilisation d’inhibiteurs de la protéine eIF4A en combinaison avec les thérapies ciblées usuelles. Actuellement plusieurs dizaines de candidats sont en cours de caractérisation in-vitro afin de sélectionner les 8 inhibiteurs les plus prometteurs qu’il est indispensable de tester in vivo. L’objectif de ce projet est de démontrer l'efficacité in vivo de 8 inhibiteurs eIF4A, dans différents modèles de mélanome et de cancer du poumon qui est également très répandu. Ces modèles ont été choisis parce qu’ils modélisent plusieurs types de thérapies ciblées usuellement utilisées en cancérologie et qu’ils présentent différents degrés de sensibilité à celles-ci nous permettant ainsi de mimer différentes situations cliniques. Les souris recevront une greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses, permettant d’obtenir un modèle rapide et reproductible, avec une mesure de la croissance tumorale directe et des métastases rares.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle aucun inhibiteur eIF4A n’a reçu d’Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) pour le traitement des mélanomes et du cancer du poumon. Cela serait une avancée considérable dans la prise en charge des patients avec le recul du risque de rechute qui est malheureusement prévisible dans la plus grande majorité des cas. Les expériences in-vitro réalisées sur ces inhibiteurs présentent des conclusions très prometteuses lors de la combinaison avec une thérapie ciblée sur le phénomène de résistance. L’objectif par la suite sera de mettre en place un essai clinique dès qu’un inhibiteur eIF4A aura fait ses preuves dans le modèle animal afin de permettre aux patients d’en bénéficier dès que possible.

Procédures

Greffes de tumeurs en sous-cutanée sous anesthésie générale (durée 15 minutes). Injections en intrapéritonéale (durée 10 minutes). Administration de médicaments par gavage (durée 1 minute). Prélèvements de sang sous anesthésie générale, durée 2 minutes.

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés à la présence de tumeurs unique sur le flanc en sous-cutanée.

Devenir

Mise à mort pour prélèvements post-mortems d'organes et de tissus aux fins d'analyses.

Remplacement

Il n'existe, à ce jour, pas de modèle in vitro modélisant suffisamment robuste pour tester ces synergies ni les interactions entre tumeur et système immunitaire. La variété et la complexité des cancers, ainsi que leur incidence élevée, rendent l’utilisation de modèles animaux cruciale pour comprendre comment le cancer se développe et pour améliorer les stratégies préventives, de diagnostiques et thérapeutiques. L'utilisation de modèles animaux comparables par de nombreux aspects au corps humain est donc indispensable pour l'évaluation des nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Des études préliminaires sur cultures cellulaires ont permis d’affiner les tests d’optimisation et de cibler les analyses à effectuer et ainsi réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats statistiques significatifs. Ainsi, le nombre d’animaux a été défini pour utiliser l’effectif minimal d’animaux possible. Des études antérieures conduites dans les mêmes modèles d'étude et avec des cibles thérapeutiques différentes ont montré que 10 animaux par groupe sont nécessaires et suffisants pour obtenir des effets significatifs sur la croissance tumorale par rapport à des souris contrôle non traitées (procédures 3 et 4). De plus, les résultats de la procédure 3 nous permettront de réduire le nombre d'inhibiteurs à tester aux 5 les plus efficaces dans les modèles immunodéficients. La procédure 1 étant une étape préliminaire pour vérifier l’absence de toxicité in vivo, 3 animaux par groupe seront suffisants. La procédure 2 étant une étape d’optimisation, elle nécessitera également un nombre réduit de souris à savoir 3 animaux par groupe pour déterminer la dose et l’intervalle optimaux. Le nombre d'animaux indiqué est un nombre maximal qui pourra être réduit si le nombre de composés à tester diminue pour des raisons de toxicité ou autre raison.

Raffinement

Les animaux seront surveillés tous les jours lors des procédures qui sont raffinées par l’établissement de points limites précoces, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. De plus, des médications appropriées (anesthésiques et analgésiques) seront utilisées lors des greffes pour réduire la douleur et le stress de l’animal. La présence de souffrance sera recherchée en utilisant les critères habituels (état général, sous-alimentation, état du pelage, prostration). Les souris seront également surveillées quotidiennement afin de déceler le plus rapidement possible l’apparition de points limites précoces. Trois fois par semaine, les animaux seront pesés et les tumeurs mesurées.

Choix des espèces

Le génome de la souris a été séquencé et de nombreux outils ont été développés pour étudier ce modèle. De plus, on observe une croissance tumorale rapide chez ce modèle et son poids permet d’utiliser des doses de produits moins importantes. La souris est donc le modèle de choix pour l'étude des cancers. Le projet nécessite des souris adultes (5-8 semaines) sans plus de contraintes sur l’âge. Ceci se justifie par l’âge de la population humaine touchée par le mélanome et le cancer du poumon et ciblée par les éventuels traitements.

980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un régime gras et sucré, une chirurgie du cerveau sous anesthésie, des injections sous-cutanées, dans le ventre et directement dans le cerveau, des prélèvements sanguins sur animal éveillé et des jeûnes de 6 à 16 heures, pour étudier le rôle d'un récepteur dans la régulation du poids. Le porteur renvoie au long terme les retombées annoncées, de nouveaux traitements contre l'obésité et le diabète. Il affirme qu'il est "nécessaire" d'étudier un "organisme vivant intègre" que ni les cultures cellulaires ni aucun modèle informatique ne pourraient remplacer.

Objectifs

Le système endocannabinoïde représente une cible thérapeutique potentielle pour combattre l’obésité et le diabète de par sa capacité à réguler la balance énergétique et le métabolisme glucidique. Le récepteur aux cannabinoïdes CB1, qui fait partie de ce système, est présent dans plusieurs organes impliqués dans le métabolisme énergétique et glucidique. Il est notamment présent dans certains neurones du cerveau et dans certaines cellules pancréatiques. Ce récepteur a différentes localisations subcellulaires (à la surface ou à l'intérieur de la cellule). Ces cellules sont aussi très sensibles aux changements d’alimentation et participent activement à la régulation du métabolisme pour maintenir à terme un poids et une glycémie stable. Une étude récente suggère un rôle d'un sous-type de récepteur CB1 dans la modulation de la fonction des neurones et des cellules pancréatiques. Notre objectif général est de comprendre le rôle de ce récepteur CB1 dans la balance énergétique et le métabolisme glucidique. Nous combinerons des approches pharmacologiques, comportementales, métaboliques, moléculaires et neuro-anatomiques.

Bénéfices attendus

Nous espérons obtenir des informations sur comment l'organisme répond à la surcharge calorique, ainsi que de trouver de potentielles cibles thérapeutiques. Les bénéfices attendus à long-terme sont de permettre l'élaboration de nouveaux traitements pour l’obésité et le diabète.

Procédures

- Changement de régime alimentaire : le nouveau régime est plus gras et plus sucré. Il est palatable pour les animaux mais induit une obésité à long-terme. La consommation de ce régime durera entre une et 12 semaines. - Tests métaboliques avec prélèvements sanguins sur animaux vigiles : le suivi de la glycémie implique que les animaux soient non anesthésiés. - Chirurgie stéréotaxique (= cérébrale) et vasculaire, sous anesthésie générale, avec protocole d'analgésie post-chirurgicale. - Injections sous-cutanées, intra-péritonéales et intra-cérébro-ventriculaires : cela nécessite de prendre les animaux en contention pendant quelques secondes. - Jeune de 6h ou 16h

Impact sur les animaux

1. Stress induit par l’isolement en cage individuelle : ceci ne sera réalisé uniquement lorsque la prise alimentaire individuelle est nécessaire. 2. Stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle. Ce test nécessite de placer l’animal dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. 3. Prise de poids consécutive au régime gras HFD. La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser 200% du poids initial. 4. Perte de poids consécutive au jeun (6h ou 16h). La perte de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser -10 à 15% du poids mesuré le jour précédent. 5. Perte de poids/appétit post-opératoire. La peau du scalp et le périoste devant être incisés, une douleur post-opératoire est attendue. La perte de poids ne devrait pas durer plus de 3 jours (basée sur nos études antérieures).

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour faire des analyses moléculaires.

Remplacement

Le but de notre activité de recherche est de comprendre les bases biologiques de la régulation de la balance énergétique et les mécanismes physiopathologiques menant à l’obésité. Lors d’un déséquilibre énergétique, plusieurs structures cérébrales entrent en jeu et communiquent, non seulement entre elles, mais aussi avec les organes périphériques. Il est donc nécessaire d’étudier un organisme vivant intègre, qui ne peut être remplacé par des techniques in vitro. Toutefois, nous réaliserons des tests pharmacologiques in vitro sur îlots pancréatiques en culture, ce qui limitera le nombre d’animaux. Cependant, le niveau de complexité dans une telle étude est si important qu’aucun modèle informatique n’existe à l’heure actuelle pour remplacer l’animal, d’autant que de nombreux mécanismes biologiques contrôlant la balance énergétique restent inconnus. Enfin, les modèles génétiques dont nous avons besoin pour tester notre hypothèse sont largement développés chez la souris.

Réduction

Nous avons utilisé un test de puissance pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement (le calcul est détaillé en 3.4.10). Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil à résonnance magnétique nucléaire, qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux avec l’aide d’un test t de Student (2 groupes) ou par analyse de variance (ANOVA) à 2 facteurs, suivie si nécessaire d’un test post-hoc de Tukey (plus de 2 groupes). Dans le cas des mesures répétées (évaluation de la prise alimentaire, du poids corporel dans le temps), des ANOVAs à mesures répétées suivies des tests post-hoc adéquats seront utilisés

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 3 ou 7 semaines et seront habitués pendant 1 semaine. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux en réponse à l’expérimentateur. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite parfois la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier, un tunnel en carton pour se cacher et de bâtonnets en bois pour ronger. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Notre étude nécessite une chirurgie stéréotaxique, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès l’induction, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis : ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

Le comportement alimentaire, la balance énergétique et les métabolismes glucidique et lipidique sont depuis longtemps évalués chez la souris, qui représente donc une espèce adéquate pour ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités sont développés chez la souris. De nombreux modèles génétiquement modifiés existent et permettent l’étude de mécanismes moléculaires précis. De plus, la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. Enfin, la forte proximité du génome murin et humain fait de la souris un bon modèle prédictif lors d’études d’inactivation de gènes. Toutes les souris arriveront dans notre animalerie expérimentale à l’âge de 3 semaines. Les procédures expérimentales débuteront après au minimum 1 semaine d’habituation. Etant donné l’impact significatif de l’âge sur le métabolisme énergétique et glucidique, ces expériences seront réalisées sur des souris jeunes (4 semaines) ou plus âgées (24 semaines).

84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit une fibrose et des tumeurs du foie par injections répétées de deux produits chimiques, le DEN dès l'âge de quinze jours et le tétrachlorure de carbone deux fois par semaine pendant dix-huit semaines, avant d'administrer des inhibiteurs de l'inflammation seuls ou combinés à un anticancéreux. Le porteur affirme que l'évolution du cancer reste silencieuse et sans effet indésirable notable pour les souris, et qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer cette étude jugée trop complexe. Toutes les souris sont tuées pour prélever le sang et le foie.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer le potentiel thérapeutique de molécules dans le cancer du foie. Pour cela, nous induirons chez la souris une fibrose et des tumeurs dans le foie pour reproduire la maladie humaine en leur administrant deux produits chimiques, le N-nitrosodiéthylamine (DEN, administré aux souris âgées de 15 jours), et le tétrachlorure de carbone (CCl4, administré aux souris 2 fois par semaine à partir de l’âge de 8 semaines pendant 18 semaines). A partir de la semaine 15 et pendant 4 semaines, les souris seront traitées avec deux molécules capables de soit diminuer les effets (antagoniste IL-1b) ou la production (un inhibiteur de l'inflammasomme NLRP3) d’une molécule de l’inflammation (IL-1b) pour étudier si elles sont capables de réduire le cancer du foie. Ces molécules ont donné des résultats prometteurs dans des modèles cellulaires au laboratoire. Elles seront administrées seule ou en combinaison avec le Sorafenib qui est médicament administré chez les patients atteints de cancer du foie à un stade tardif.

Bénéfices attendus

Les études proposées dans ce projet permettront de déterminer si des molécules permettant de diminuer les effets ou la production d’une molécule de l’inflammation (IL-1b) ont la capacité de réduire la progression du cancer du foie.

Procédures

Les souris seront soumises à : une injection d’un génotoxique ou son diluant en injection intrapéritonéale 15 jours après la naissance pour induire le développement de tumeurs ; deux injections par semaine d’une molécule favorisant le développement de la fibrose hépatique ou son diluant en injection intrapéritonéale à partir de l'âge de 8 semaines pour une durée de 18 semaines ; une administration de molécules ciblant une voie de l’inflammation ou leurs diluants en injection intrapéritonéale 2 fois par semaine les 4 dernières semaines (elles seront combinés pour réduire la fréquence des injections) ; une administration d’un traitement antitumoral ou son diluant en injection intrapéritonéale cinq fois par semaine. Les injections intrapéritonéales ont une durée de 15 secondes par souris. Au moment du sacrifice, il sera réalisé un prélèvement de sang à la veine cave inférieure.

Impact sur les animaux

Ce modèle favorise le développement de tumeurs hépatiques (induites par le DEN) sur un foie avec une fibrose (induite par le CCl4) ce qui permet de se rapprocher de la physiopathologie du carcinome hépatocellulaire chez l’homme car la cirrhose représente un stade de la maladie qui précède l'apparition d'un cancer du foie. A ce stade, l'évolution du cancer est silencieuse (comme chez l'homme), les souris n'ont pas d'effets indésirables notables.

Devenir

Les animaix seront euthanasiés à la fin des procédures afin de faire un prélèvement de sang et du foie.

Remplacement

Les méthodes alternatives consisteraient à réaliser des études in vitro. Cependant, celles-ci ne permettraient pas de répondre à la question posée. En effet, ce projet vise à étudier l'effet de deux molécules pharmacologiques ciblant la réponse inflammatoire seul ou en combinaison avec une molécule pharmacologique ciblant les cellules tumorales. Les effets des molécules ciblant la réponse inflammatoire vont avoir des répercussions sur de nombreux types cellulaires immunitaires et tumorales. Il n’est donc pas possible de trouver un modèle in vitro permettant de remplacer une telle étude dans laquelle la réponse physiopathologique étudiée est très complexe car elle met en jeu plusieurs types cellulaires (cellules tumorales et plusieurs types de cellules immunitaires). Nous avons recours à des animaux car il n’y a pas de méthodes alternatives.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats.

Raffinement

Nous effectuerons un suivi quotidien des souris tout au long du protocole en observant leur comportement et les indices pouvant suggérer une douleur. Si nous observons une douleur chez un animal, cela entraînerait son euthanasie anticipée. Par ailleurs, les animaux sont hébergés en présence de papier kraft et de carrées de coton pour faire le nid, ainsi que des maisonnettes et des dômes en cellulose.

Choix des espèces

La souris est le modèle couramment utilisé pour étudier les effets de molécules pharmacologiques dans la progression du carcinome hépatocellulaire. Par ailleurs, ce modèle permettant le développement de tumeurs hépatiques sur un foie avec une fibrose, et qui permet de se rapprocher de la physiopathologie du carcinome hépatocellulaire chez l’homme a été développé en 2014 chez la souris et est bien caractérisé dans cette espèce (Uehara T et al.Curr Protoc Pharmacol 2014). Le N-nitrosodiéthylamine (DEN) est un produit chimique qui induit des cancers du foie s’il est administré chez le souriceau de 15 jours car à ce stade les cellules hépatiques sont en forte prolifération ce qui rend plus facile l’induction d’un cancer du foie.

245 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisées ensuite ou tuées puis conservées pour des dissections d'enseignement. Déjà issues d'expérimentations classées "légères", elles sont manipulées par des étudiants qui les saisissent, les pèsent, les contiennent et leur injectent de l'eau physiologique, puis en deuxième année de l'éthanol jusqu'à 1,8 g/kg pour observer un effet comportemental. Le porteur revendique la "nécessité" d'une première expérience pratique sur animal vigile, non remplaçable selon lui par de la simulation, pour des étudiants qui se destinent à l'expérimentation animale. Il indique qu'aucun animal n'est commandé pour ce projet et que des données d'archives peuvent suppléer un effectif réduit.

Objectifs

Ce projet se justifie par la nécessité pour les étudiants engagés en formation à l'IUT (Institut Universitaire de Technologie) d'avoir une première expérience pratique avec des modèles animaux habituellement utilisés à des fins scientifiques. Ces étudiants se destinant à des métiers de type technicien voire d'ingénieur de laboratoire, un nombre significatif d'entre eux sera concerné par l'expérimentation animale. Bien que leur formation contienne des enseignements théoriques sur les réglementations, l'intérêt et les contraintes des protocoles animaux, il est nécessaire de leur proposer après ces premiers enseignements théoriques, une première approche concrète pratique avec des animaux vigiles comme les rongeurs (souris et/ou rats) qui sont très fréquemment utilisés en biologie-médecine. Parmi tous les étudiants inscrits notamment en 1ère année (6 groupes de TP de 14 étudiants au maximum), seuls ceux qui choisissent le parcours Biologie Médicale et Biotechnologie (BMB, soit 4 groupes de TP de 14 étudiants maximum) seront concernés par ce projet. Les autres étudiants de la même promotion suivent un parcours "Diététique". L'objectif principal de ce projet est de proposer la réalisation de protocoles simples de préhension, pesée, contention courte, injection intrapéritonéale, tests comportementaux d'observation, prise de données, en binômes sous accompagnement/surveillance d'un enseignant titulaire du Diplôme Universitaire d'expérimentation niveau concepteur. Afin de respecter au mieux l'éthique animale, il est proposé de n'utiliser dans le projet que des animaux souris ou rats provenant de précédentes expérimentations classées "légères", et de n'utiliser qu'un nombre limité d'animaux. D'ailleurs, les nombres qui sont indiqués dans ce projet sont des nombres "idéaux et maximums" calculés avec le nombre d'étudiants théoriques par groupe. Mais puisque nous considérons des animaux de réutilisation, nous prévoyons de réaliser les séances d'enseignement même avec un nombre réduit d'animaux. Dans ce cas uniquement des démonstrations avec les quelques animaux disponibles seront réalisés et des données chiffrées d'archives serviront aux étudiants. Aucun animal ne sera commandé de façon spécifique pour ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet expérimental constitue un apprentissage par la pratique pour les étudiants de leurs cours théoriques en matière d'expérimentation animale utilisés à des fins scientifiques. Il leur permettra aussi un premier contact avec des rongeurs fréquemment utilisés dans les laboratoires de recherche dans lesquels les étudiants diplômés pourront postuler. De plus, ce projet propose une continuité scientifique avec théorisation de l'expérimentation en amont (hypothèse de travail), manipulation des animaux, prise de données expérimentales par rapport à une hypothèse de travail, traitement des données recueillies, analyse statistique (non rigoureuse vu la diversité des animaux, mais "à titre d'exemple") et conclusion par rapport à l'hypothèse initiale. De cette façon, les étudiants ainsi initiés via ce projet seront opérationnels plus rapidement dans les postes adéquats et cela permettra de sécuriser leur utilisation future d’animaux au cours de leur futurs postes professionnels.

Procédures

Lors de la procédure proposé en 1ème année, les animaux seront manipulés selon deux phases. La première dure environ 5 minutes (souvent moins) pour la préhension (contrôlé par un titulaire du DU niveau 1), la pesée sur balance électronique, puis la contension et injection d'eau physiologique. La deuxième phase dure également 5 minutes lorsque chaque animal est déposé dans le disositif et est laissé libre de ses mouvements (observation comportementale). Entre les deux phases, les animaux sont remis dans leur boîte d'élevage, et après la deuxième procédure, ils y retournent pour être surveillés (points limites). Lors de la procédure proposé en 2ème année, les mêmes types et phases de maniulations qu'en 1ère années seront réalisées et avec les mêmes temps. Cette fois ci, l'injection sera de l'éthanol dilué dans le l'eau physiologique, et une dose modérée sera choisie selon la littérature scientifique (au maximum 1,8g/kg). Ceci pour (1) tout de même générer un effet comportemental notable mais ne pas générer trop d'inconfort aux animaux (trop grande ébriété ou effet toxique par exemple) et permettre une élimination relativement rapide (2 à 3 heures).

Impact sur les animaux

Très peu d'effets sont attendus car ce projet se veut minimaliste en terme de manipulation sur les animaux. Les seuls effets qui pourraient être notables sont une élévation du stress des animaux manipulés par les étudiants et l'inconfort ponctuel au moment de l'injection intra-péritonéale. Cependant, les moments de manipulation seront brefs (quelques dizaines de secondes à chaque fois, voire une à deux minutes au maximum). Lors de la procédure proposée en 2ème année avec injection d'éthanol, une dose modérée sera choisie selon la littérature scientifique et au maximum 1,8g/kg. Ceci pour (1) tout de même générer un effet comportemental notable mais ne pas générer trop d'inconfort aux animaux (trop grande ébriété ou effet hépatotoxique par exemple) et permettre une élimination relativement rapide (2 à 3 heures).

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront soit proposés pour une réutilisation dans un autre projet, soit mis à mort pour fin de projet et cryo-conservés pour être utilisés en enseignement de physiologie (dissection)

Remplacement

Le programme national du BUT exige un enseignement pratique minimal portant sur la manipulation concrète d'animaux vigiles, qu’il n'est donc pas possible de remplacer par de la simulation pour l’apprentissage, par les étudiants ayant un projet professionnel orienté vers recherche biomédicale, des gestes techniques de base sur les animaux. A noter tout de même que dans le même module d'enseignement que le présent projet, les étudiants auront vu précédemment toutes les notions théoriques correspondant à l'expérimentation animale parmi lesquels la présentation de la réglementation, initiation à la genèse de projets scientifiques, le traitement de données expérimentales, etc...

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux, ce projet réutilisera des animaux issus de précédentes expérimentations légères réalisées dans les animaleries fournisseurs du site universitaire, et disponibles au moment des créneaux d'enseignement. De plus, les créneaux d’enseignement seront planifiés pour permettre, selon l'effectif d'étudiants (56 en 1ère année et en 2ème année) de n'utiliser que 49 animaux au maximum par année d'enseignement, car seules des manipulations légères étant prévues, les mêmes animaux pourront être réutilisés 3 à 4 fois dans la même semaine d'enseignement.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les animaleries partenaires selon les conditions standards au sein d'animaleries conventionnées. Un enrichissement avec des buchettes, maisonnettes cartonnées ou papier absorbant sera proposé aux animaux et une surveillance quotidienne des animaux sera réalisée. Leur transport sur le site d’enseignement (sur une centaine de mètres) sera assuré en sacs isothermes et charriot dédié. Les animaux seront maintenus dans leur cage d'élevage tout au long de leur prise en charge (une semaine maximum, correspondant à un TP par rpomotion d'étudiants). Pendant les procédures mais également après celles-ci, les points limites seront surveillés. Les signes principaux seront, les changements brusques de comportement, les vocalises, l'accélération exagérée du rythme respiratoire, le freezing éventuel qui correspond à une raideur immobilisatrice brutale en réponse à un stress aigu. Le poids des animaux étant un paramètre mesuré par les étudiants, il servira également de référence pendant la semaine de TP; une perte de poids de 10% sur 3 jours sera considérée comme limite.

Choix des espèces

Souris ou rats sont les espèces les plus utilisées en biologie/médecine dans les projets scientifiques et la plupart des étudiants concernés ici seront amenés à postuler pour participer à ce type de projets (stage, métiers) animaux adultes mâles ou femelles âgés de 2 à 12 mois selon les disponibilités en animalerie partenaire.