Procédures modérées

1 785 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur de prostate sous la peau puis des injections répétées pendant quatre à six semaines, pour tester des nanoformulations à base de carbone ciblant le métabolisme des cellules cancéreuses. Le porteur indique que la greffe peut provoquer une douleur au site d'incision, une infection et une inflammation, et que toutes les souris sont mises à mort pour collecter des tissus. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement "pertinente" n'existe et qualifie la xénogreffe d'"indispensable", les retombées cliniques étant renvoyées au potentiel.

Objectifs

Le cancer de la prostate (CaP) représente 1 276 000 nouveaux cas et 360 000 décès dans le monde par an (57 000 cas, 9 000 décès en France). Il est dépisté par mesure du PSA (Antigène Spécifique de la Prostate) et toucher rectal. Aux stades localisés, des traitements curatifs existent : la chirurgie, la radiothérapie et la Curiethérapie, et des ultrasons. Au stade métastatique, l’hormonothérapie est le traitement de 1ère ligne, avec cependant une problématique de taille, l’échappement hormonal, qui fait que le cancer reprend son développement. Il s’agit d’un cancer complexe et hétérogène pour un même patient et entre les patients, et impliquant de multiples processus moléculaires permettant aux cellules tumorales d’échapper à la mort, rendant les traitements difficiles. Pour améliorer la survie des patients de nouvelles avancées sont nécessaires, tant pour le diagnostic que pour le traitement de la maladie. Dans ce projet ciblé sur le cancer de la prostate, nous allons développer des molécules chimiques innovantes qui permettent de combiner de la chimiothérapie et de la thérapie génique qui permet d’éteindre un gène d’intérêt important pour le développement tumoral.

Bénéfices attendus

Notre projet va optimiser au niveau préclinique l’utilisation de nanoformulations à base de carbone pour un double ciblage cellulaire du métabolisme. Les retombées de notre projet ont des implications potentielles très importantes pour la clinique. Nos résultats permettront ainsi d’ouvrir de nouvelles perspectives pour le traitement du cancer de la prostate. Du fait que les patients deviennent résistants aux thérapies anti-tumorales classiques dans ce cancer, il y a un besoin urgent de découvrir, de développer et valoriser de nouvelles alternatives thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des patients aux stades avancés de la maladie. Récemment, de nouvelles opportunités ont émanées de laboratoires de recherche travaillant sur des composés ciblant le métabolisme cellulaire et l’apport en oxygène des cellules tumorales. Nos résultats antérieurs supportent largement notre hypothèse et valident le rationnel de ce projet. Ainsi, nous pourrons apporter de nouveaux outils pour cibler le métabolisme des cellules cancéreuses grâce à ces propriétés uniques des nanoformulations à base de carbone.

Procédures

Les animaux recevront un implant tumoral sous-cutané au cours d’une intervention chirurgicale sous anesthésie générale. La chirurgie durera 5 minutes. Le volume tumoral sera suivi par mesure hebdomadaire à l’aide d’un pied à coulisse électronique. Ils recevront des injections sous anesthésie générale répétées sur 4 à 6 semaines, à raison de 2 injections par semaine durant environ 15 secondes.

Impact sur les animaux

Comme il s’agit de greffer des petits morceaux de tissus tumoraux, il est possible qu’il y ait une douleur au site d’incision, et une infection au point de suture. Une inflammation au site d’injection est aussi possible.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin des expérimentations afin de collecter un maximum de tissus afin de procéder à des analyses complémentaires et soulager les douleurs éventuelles.

Remplacement

Le cancer de la prostate, comme beaucoup de cancer, se caractérise par une grande variabilité cytogénétique entre les individus et hétérogénéité au sein même de la tumeur. La réalisation d'études précliniques fiables nécessite l'utilisation de modèles reproduisant fidèlement ces caractéristiques des tumeurs humaines. Or, les modèles d'étude se basant sur les lignées cancéreuses clonales ne reflètent pas l'hétérogénéité de la tumeur in situ. De même, pour les systèmes de culture 3D en cours de développement qui ne permettent pas encore d’obtenir des résultats projetables à l’homme. Par conséquent, aucune méthode de remplacement pertinente n'existe à ce jour. Il est donc indispensable d’utiliser le modèle de xénogreffe de tumeur de patients, seul capable de reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine.

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux utilisés pour les différentes étapes du projet, notamment en réduisant le nombre de réimplantation lors de la stabilisation des modèles de xénogreffe et en réalisant des études pilotes pour valider les voies d’administration des traitements. Le nombre d’animaux a été calculé statistiquement (calcul de puissance) afin d’être réduit à son minimum tout en permettant d’atteindre les objectifs du projet. Dès que les objectifs seront atteints, ou en absence d’effet des traitements, aucun animal supplémentaire ne sera inclus permettant de réduire encore les effectifs.

Raffinement

Le raffinement sera assuré par un enrichissement des cages pour le confort des animaux (des bâtons à ronger pour limiter les querelles ; des carrés de coton pour une nidification ; des igloos, permettant le jeu et le repos). Les souris seront nourries et hébergées en groupe ; elles ne seront séparées qu'en cas de comportement agressif avec induction de plaies. Nous diminuerons la douleur et l'angoisse liées à la xénogreffe en opérant sous anesthésie générale, avec une anesthésie locale au site d’implantation, et en appliquant une analgésie péri- et post-opératoire. Les animaux seront maintenus au chaud sur un tapis chauffant pendant la phase de réveil, phase pendant laquelle les animaux seront surveillés en continu. De plus, nous avons établi des points limite qui mettront fin à l’expérimentation en cas de souffrance et d’inconfort des animaux.

Choix des espèces

Les pathologies cancéreuses en général se caractérisent par une grande variabilité cytogénétique (variation de l’ADN des cellules tumorales) entre les individus et sont généralement hétérogènes au sein même de la tumeur. Or, jusqu'à présent, les modèles d'étude en oncologie se basent sur les lignées cancéreuses clonales qui ne reflètent pas l'hétérogénéité de la tumeur in situ. Par ailleurs, les modèles expérimentaux in vitro ne prennent pas en compte le rôle du microenvironnement dans le développement tumoral. Ainsi, malgré le développement de cultures 3D dont la mise en place reste difficile, les modèles animaux s'avèrent donc indispensables pour la recherche translationnelle en oncologie. Le modèle expérimental décrit dans ce projet nécessite l'utilisation d'animaux immuno-déprimés pour permettre la greffe d'un tissu étranger. Les greffes seront réalisées sur des souris jeunes âgées de 5 à 6 semaines afin d’avoir un système immunitaire encore très peu mature, permettant d’assurer une prise de greffe optimale.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont sensibilisées de façon répétée par injection, gavage et voie nasale pour développer un asthme allergique aux acariens et une allergie alimentaire au blé, puis reçoivent des acides gras à chaînes courtes par nébulisation. Le porteur indique que le déclenchement de l'allergie provoque une chute de la température corporelle et une gêne respiratoire, et que les souris sont mises à mort pour prélever poumons, rate, ganglions et intestins. Il affirme qu'il est "impossible" de reproduire le système immunitaire in vitro ou in silico, les bénéfices préventifs et thérapeutiques annoncés restant à évaluer.

Objectifs

Des études épidémiologiques ont établi des relations entre le mode de vie /environnement et l’incidence des maladies allergiques. Des données récentes ont montré́ l’association entre la survenue des allergies et la sévérité des symptômes avec des modifications de microbiote. Il est aujourd’hui clairement établi que le microbiote intestinal, contribue au développement du système immunitaire en étant impliqué dans des fonctions digestives, métaboliques et neurologiques. Le déséquilibre de l’écosystème microbien appelé́ « Dysbiose », est associé à des altérations des réponses immunitaires et au développement de maladies et en particulier des allergies ou de l'asthme. Cette dysbiose entraine non seulement un changement dans les espèces bactériennes présentes mais surtout une dérégulation de la production d’acides gras à chaines courtes (AGCC) par le microbiote. Des études ont mis en évidence qu’une concentration élevée en AGCC comme par exemple le propionate ou le butyrate était associée à une protection contre le développement des allergies et de l’asthme. Nous avons montré une diminution des niveaux d’AGCC en lien avec une aggravation des symptômes de l’asthme. De plus, l’augmentation de ce taux d’AGCC est associé à un blocage de la différentiation deslymphocytes B en régulateurs contrôlant la réponse immunitaire durant l'allergie in vitro. L'objectif de ce projet est d’étudier le rôle des AGCC comme moyen de prévention et de thérapies dans un modèle d’asthme allergique aux acariens chez la souris et dans un modèle d'allergie alimentaire au blé.

Bénéfices attendus

Les travaux réalisés antérieurement au laboratoire ont démontré un rôle majeur des AGCC dans la réponse immune et en particulier la réponse lymphocytaire B. Par ailleurs, cette réponse régule en grande partie la réponse allergique. Dans ce contexte, les bénéfices attendus de ce projet préclinique sont d’évaluer l’intérêt préventif et thérapeutique des acides gras a chaines courtes (AGCC) dans l’allergie alimentaire et l’asthme.

Procédures

Sensibilisation par voie intrapéritonéale tous les 7 jours pendant 3 semaines puis un gavage, pour l’induction de l’allergie alimentaire. ce geste dur moins d'une minute. Anesthésie gazeuse tous les 7 jours pour l’induction de l’allergie respiratoire pendant 6 semaines. Ce geste dure quelques miniutes (2 à 5 minutes). Sensibilisation sous anesthésie gazeuse percutanée à l’oreille tous les 7 jours pendant 4 semaines. Ce geste dure quelques miniutes (2 à 5 minutes). Sensibilisation nasale sous anesthésie gazeuse tous les 7 jours pendant 2 semaines. Ce geste dure quelques miniutes (2 à 5 minutes). Nébullisation des AGCC dans une chambre de plethysmographe (Chambre hermétique permettant de mesurer les variations d’air a l’intérieur et d’apprécier la respiration de la souris). Ce geste dur de 30 secondes a une minute.

Impact sur les animaux

Lors du déclenchement de l’allergie alimentaire (challenge) par gavage oral, une baisse de température corporelle d'environ 30 à 45 minutes des animaux est généralement observée. Lors du déclenchement de l’allergie respiratoire (challenge) par dépôt intra-nasal, certaines souris peuvent ressentir une gêne respiratoire suite au deuxième dépôt intra nasal d'une durée de quelques minutes (>10).

Devenir

Mise à mort des animaux afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude physiologique, immunologique et la sévérité des allergies incluant poumons, rate, ganglions, femurs, intestins.

Remplacement

Impossible de prendre des mesures de remplacement. Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire in vitro ou in silico. Notamment pour mesurer l'impact de traitement comme la nébulisation de propionate sur la fonction respiratoire, l'inflammation pulmonaire ou encore la réponse humorale. Nos travaux préliminaires ont montré une action du propionate sur la différenciation des lymphocytes B qui doivent etre confirmé et étendu in vivo.

Réduction

Nombre d’animaux réduis au minimum pour être statistiquement relevant c’est-à-dire au moins 10 individus par groupes pour faire des analyses statistiques. Ce nombre à été determiné grâce aux études précedentes et aux tests de la variance.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place lors des procédures expérimentales d'analgésie et d'anesthésie permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront herbergé dans les cages ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées à 5 par cage selon les groupes dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Les souris seront sacrifiées si trois signes cliniques notables ou un signe clinique sévère sont observés.

Choix des espèces

Au cours de cette étude seront utilisées des souris femelles de souche Balb/C. Ces souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. De plus nous avons débuté nos modèles sur ces femelles Balb/c. Il n’existe aujourd’hui pas de méthodes alternatives pour analyser efficacement et dans son ensemble la réaction allergique. De plus, l’allergie est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux peuvent adéquatement reproduire. Les femelles auront entre 6 et 10 semaines de vie, stade auquel le système immunitaire est complètement mature.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées puis greffées par injection, pour étudier le rôle d'une hormone du fer dans la maladie du greffon contre l'hôte, complication fréquente des greffes de moelle. Le porteur indique que la maladie provoque une perte de poids, une alopécie et une desquamation de la peau, et que les souris sont mises à mort pour prélever peau, intestin et foie. Il affirme qu'il est impossible de reproduire le système immunitaire in vitro et conclut que l'expérimentation animale est un "élément clé" du projet, les retombées thérapeutiques restant formulées au conditionnel.

Objectifs

La greffe de moelle est un traitement majeur de nombreux cancers du sang. Dans certaines formes de leucémies aiguës notamment, il s’agit du seul traitement permettant potentiellement d’obtenir la guérison. L’efficacité de la greffe de moelle est limitée par les complications de ce traitement. En effet, dans près de 50% des cas, la greffe de moelle se complique d’une réaction immunitaire appelée maladie du greffon contre l’hôte. La maladie du greffon contre l’hôte est caractérisée par une toxicité de certains organes : principalement la peau, le tractus gastro-intestinal et le foie. Cette complication est parfois gravissime puisqu’elle entraîne le décès du patient dans environ 15% des cas. Il s’agit de la principale cause de décès après greffe de moelle. De manière intéressante, il a été montré que la surcharge en fer chez les patients exacerbait la maladie du greffon contre l’hôte, suggérant un rôle du fer dans la pathogenèse. L’hormone clé de régulation du fer est principalement secrétée par le foie mais peut être exprimée localement dans la peau et intestin et joue un rôle majeur dans le recrutement de cellules immunitaires. Des données montrent l’expression de cette hormone dans la peau et l’intestin de patients souffrant de la maladie du greffon contre l’hôte. Le projet visera à comprendre le rôle de cette hormone et du fer dans le développement de cette maladie.

Bénéfices attendus

Dans la peau et l’intestin, l’hormone du fer pourrait avoir un rôle inflammatoire en induisant d’une part la surcharge en fer dans les cellules de ce tissu et d’autre part en activant les cellules immunitaires. Ce projet pourrait avoir des retombées en recherche fondamentale (meilleure connaissance des processus de la GVH) mais également en recherche appliquée en proposant de cibler l’hepcidine ou le fer en thérapeutique dans cette pathologie.

Procédures

Sur animaux vigiles : - Les souris seront irradiées pendant 3 minutes 30 (quelques secondes de contention pour les placer dans les boites d’irradiation). - 3 heures après irradiation: les souris subiront une injection intraveineuse caudale (100 ul ; temps de contention de 20 secondes). - 14 jours post-greffe : prélèvement sanguin de 50 ul via la veine mandibulaire par simple contention (20 secondes) à l’aide d’une lancette. - 1 mois post-greffe : Injection sous-cutanée (100 ul Buprénorphine à 0,1mg/kg) avec une aiguille de 26G 1⁄2 (temps de la réalisation impliquant la contention: 20 secondes). 30 minutes après, sur animaux anesthésiés à l’isoflurane (1 minute par souris) à 4% avec un mélange d’air, 500ul de sang sera prélevé par voie rétro-orbitale à l'aide de capillaires héparinés (Hirschmann TM).

Impact sur les animaux

L’irradiation (sans transplantation) provoque (aux cinétiques étudiées) une rougeur de la peau. La maladie du greffon contre l'hôte va induire une perte de poids, une alopécie et une desquamation de la peau (formation « d’écailles »).

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélever la peau, l’intestin et le foie ainsi que le sang afin de mesurer différents paramètres biologiques.

Remplacement

Des tests in vitro sur des cellules de la peau ont été effectués en amont pour déterminer le rôle de l’hormone du fer dans l’inflammation. Nous avons en parallèle accés à des biopsies de patients atteints de la maladie du greffon contre l'hôte. Les modèles animaux sont utilisés ici dans le but d'obtenir un modèle pathologique proche de celui développé chez l’homme. Au cours de la « maladie du greffon contre l’hôte » de nombreuses cellules immunitaires sont impliquées et leurs interactions ont un rôle fondamental dans le développement de la maladie. De plus, cette réaction du greffon congre l'hôte est caractérisée par le déclenchement de symptômes, uniquement observables in vivo. Il est donc impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire uniquement par des études in vitro. Ainsi l'expérimentation animale est un élément clé de ce projet.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. L'étude statistique permet de calculer au plus juste le nombre d'animaux à utiliser.

Raffinement

La durée et la dose de traitements utilisées seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les souris sont mises sous antibiotique pour éviter tout risque d’infection. Des analgésiques et anesthétiques seront utilisés pour le prélèvement sanguin et en cas de mal être. Les animaux sont en groupes sociaux et disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés.

Choix des espèces

Les réactions observées au cours de la « maladie du greffon contre l’hôte » chez la souris sont les mêmes que celles observées chez l'homme. Des souris adultes de de 8 à 12 semaines seront utilisées, car à cet âge, le système immunitaire est mature ce qui est indispensable à l’étude de la « maladie du greffon contre l’hôte ».

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées d'un anticorps, des injections rétro-orbitaires sous anesthésie, subissent pour certaines une néphrectomie ou la pose de pastilles induisant une hypertension, et passent en cage métabolique, avant d'être tuées pour analyser les reins. Le porteur décrit une douleur minime aux injections intrapéritonéales et les conséquences physiologiques de l'insuffisance rénale et de l'hypertension induites. Il affirme que les analyses in vitro et in silico ne conviennent pas à l'étude des maladies glomérulaires, testée ici avant un éventuel usage chez l'humain.

Objectifs

Les glomérulopathies sont un groupe de maladies touchant le glomérule. Le glomérule fait partie du rein et est à la base de la filtration du sang et de la production de l'urine. Les glomérulopathies conduisent donc rapidement à l'insuffisance rénale. Un type de cellule du glomérule, les cellules épithéliales pariétales (CEP), joue un rôle majeur dans ces glomérulopathies. En effet, l'activation des CEP est à l'origine des lésions du glomérule qu'on retrouve dans les glomérulopathies. Nous avons à disposition un anticorps bloquant l’activation de ces CEP. Nous voulons tester cet anticorps dans des modèles murins de glomérulopathies afin d’évaluer sa capacité à prévenir l’apparition de l’insuffisance rénale avant une éventuelle utilisation comme médicament chez l'humain.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra mettre en évidence l'efficacité d'un nouveau traitement dans deux types de glomérulopathies qui sont deux causes majeures d'insuffisance rénale terminale. Il permettra également de mieux appréhender les mécanismes physiopathologiques de ces glomérulopathies et notamment le rôle des CEP dans celles-ci.

Procédures

104 souris de la procédure "efficacité de l'anticorps anti-claudin 1 humaine dans un modèle de glomérulonéphrite proliférative extra-capillaire, le modèle NTS" subiront une injection de l'anticorps d'interêt ou de son contrôle en intra périntonéale deux fois par semaine pendant 2 ou 3 semaines en fonction de la procédure, ces injections seront effectués sur animaux vigiles. Ces injections intra péritonéales durent une minute. Ces 104 mêmes souris subiront trois injections en rétro-orbitaire de NTS 3 jours de suite aprés anésthésie à l'isoflurane, cette injection dure 30 secondes. Ces souris seront également mises en cages metaboliques une fois par semaine pour une durée maximale de 14 heures et enfin subiront un prélévement de sang en intracardiaque sous anésthesie générale gazeuse à l'isoflurane et sédation à la buprénorphine, qui dure 2 minutes. Ces 104 souris de la P1 subiront une mise à mort par dislocation cervicale après anesthésie à l'isofurane. Pour ces 104 souris, cela fait au total 5 différents types d'intervention. 58 souris de la procédure "efficacité de l'anticorps anti claudin 1 humaine dans un modèle d'HSF, le modèle DOCA salt" subiront une uni-néphrectomie et la mise en place de pellet doca salt sous anesthésie générale gazeuse à l'isoflurane et sédation à la buprénorphine, cette intervention dure 25 minutes. Ces 58 souris subiront une injection de l'anticorps anticlaudin 1 humaine ou de son isotype en intra périntonéale deux fois par semaine pendant 58 jours, ces injections seront effectués sur animaux vigiles. Ces injections intra péritonéales durent une minute. Ces mêmes 58 souris seront mises en cages metaboliques une fois par semaine pour une durée maximale de 14 heures pendant 6 semaines et subiront un prélévement de sang en intracardiaque sous anésthesie générale gazeuse à l'isoflurane et sédation à la buprénorphine. Ce prélèvement dure deux minutes. Enfin, ces 58 souris subiront une mise à mort par dislocation cervicale après anesthésie à l'isofurane. Pour ces 58 souris, cela fait au total 5 différents types d'intervention.

Impact sur les animaux

Les souris subiront le stress d'être isolées pendant le passage en cage métabolique. Elles subiront une douleur minine lors des injections intra péritonéales. Lors des procédures plus invasives comme les injections rétro orbitaires, la néphrectomie ou la mise en place des pellets DOCA, elles seront anesthésiées à l'isoflurane et analgésiées. Enfin, elles subiront les conséquences physiologiques de l'insuffisance rénale et de l'hypertension artérielle induites par les modèles expérimentaux

Devenir

Etant donné que les reins de ses animaux seront analysés, les animaux de ce projet seront mis à mort.

Remplacement

le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas relevantes en ce qui concerne l'étude des maladies glomérulaires car il existe beaucoup de paramètres physiologiques qui entrent en jeu. Des tests in vitro ont été réalisés afin de sélectionner les clones d'anticorps, ces tests ont permis de mettre en évidence leur spécificité et leur efficacité d'anticorps bloquant.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d'animaux requis afin de permettre une analyse statistiquement pertinente des résultats en prenant compte de la variabilité inter et intra expérience. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait avec un risque alpha de 5%, une puissance de 95%, une moyenne du groupe contrôle de 12, une moyenne pertinamment différente attendue de 8 dans le groupe traité, une déviation standard de 4 et un ajustement de 10%; ce qui donnait 26 animaux par groupe requis. 3 animaux de plus sont prévus pour pallier les risques du modèle expérimental (mortalité liée à la chirurgie odans le modèle DOCA salt).

Raffinement

Afin de réduire l'angoisse et la souffrance des animaux des mesures seront prises: 1)Une surveillance des animaux, quotidienne par les zootechniciens et bi-hebdomadaire par l'expérimentateur, sera réalisée. Une grille de score d'évaluation de la douleur a été établie permettant d'évaluer la souffrance des animaux et de déterminer des points limites. 2) La procédure terminale sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse + buprénorphine . 3)Les procédures invasives tel que les injections retro-orbitaires seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse et les souris recevront un traitement analgésiques qui sera renouvelé et poursuivie si les animaux présentent des signes de souffrance. 4)Les souris seront hébergées en groupe et l’enrichissement de leur environnement sera à base de coton déchiquetable, préservant ainsi une activité et un exercice naturel. 5) une double litière sera mise en place pour pallier à la production excessive d'urine par les souris du modèle DOCA salt, et les cages seront changées 3 fois par semaine.

Choix des espèces

Les mécanismes des maladies du rein sont similaires chez l'homme et la souris et ce sont dans les maladies du rein qu'il existe un interet à bloquer l'activation des cellules appelées CEP et donc à utiliser l'anticorps anti claudin 1. Les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 2 à 6 mois car il faut des adultes au système immunitaire mature (>2 mois) et suffisamment jeunes pour ne pas observer des maladies du rein liées au vieillissement.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit deux plaies cutanées sur le dos sous anesthésie, une infection par le staphylocoque doré pour une partie d'entre elles, puis des applications d'amibes répétées, avec des anesthésies cinq jours sur sept pendant quinze jours, avant d'être tué pour des biopsies. Le porteur décrit une possible démangeaison à la cicatrisation et un léger stress lié aux anesthésies répétées. Il affirme qu'un modèle in vitro a déjà montré l'activité antibactérienne mais ne rend pas compte de l'effet thérapeutique réel sur l'infection.

Objectifs

En réponse à la propagation préocupante du phénomène d’antibiorésistance, l’OMS a érigé une liste d’espèces bactériennes multirésistantes aux antibiotiques pour lesquelles il est primordial de développer de nouveaux composés antibactériens ou thérapies alternatives à l’usage de ces derniers. Les bactéries antibiorésistantes, et notamment Staphyloccus aureus pour la plus importante, sont à l’origine d’un nombre croissant d’infections nosocomiales et de divers types (respiratoires, urinaires, cutanées, etc). En 2019, 200 000 décès liés à des infections cutanées causées par des souches bactériennes antibiorésistantes ont été recensés de par le monde. De telles souches sont également responsables d’infections chez l’animal et représentent une véritable menace pour le traitement des infections en médecine vétérinaire. Une des alternatives aux antibiotiques actuellement à l’étude est la phagothérapie, utilisant des virus, les phages, capables de lyser spécifiquement certaines bactéries cibles. Bien que cette approche soit prometteuse, notamment pour le traitement de plaies infectées, il n’est pas à exclure que les bactéries puissent échapper à l’action des phages (systèmes de défense anti-phages, mutations). De plus, le spectre d’activité des phages est très réduit, souvent spécifique d’une seule souche bactérienne, limitant ainsi leur usage en première intention. Récemment, il a été démontré que des cellules environnementales naturellement prédatrices de bactéries, les amibes libres, sont capables d’éliminer efficacement des souches bactériennes antibiorésistantes et responsables d’infections nosocomiales. Ces résultats ont suggéré le fait que les amibes possèdent un spectre de prédation large et qu’elles pourraient être utilisées afin de contrôler les populations de bactéries antibiorésistantes se développant au niveau de sites infectieux, comme certaines plaies cutanées ou brûlures. Lors de précédents tests réalisés sur modèle murin, il a été démontré que l’application répétée d’amibes sur peau saine ou sur plaie cutanée ne génère pas de réaction inflammatoire et ne perturbe pas le processus normal de cicatrisation. Dès lors, l’objectif de ce projet est de mettre au point un modèle murin d’inflammation de plaie cutanée générée par l’application topique d’une souche clinique de S. aureus et d’évaluer ainsi la capacité de souches amibiennes à contrôler la survenue d’une réaction inflammatoire par leur activité antibactérienne.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra dans un premier temps d’obtenir un modèle murin reproductible d’inflammation de plaies cutanées qui sera utilisé pour des expérimentations ultérieures. Ce projet permettra ensuite d’évaluer les propriétés antibactériennes et anti-inflammatoires de souches amibiennes lors de leur application sur plaies cutanées et plus largement d’avoir une idée de leur potentiel d’application dans un cadre thérapeutique, afin notamment de traiter des réactions inflammatoires et/ou infections cutanées chez l’Homme ou l’animal.

Procédures

Le premier jour des expérimentations, deux petites plaies cutanées circulaires seront réalisées sur la peau du dos de chaque animal. L’intervention chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale (durant 20 minutes), après avoir administré un antalgique en sous-cutané 30 minutes avant. Les souris recevront 2 doses d'antalgique/ jour les 2 jours suivant la chirurgie (30 secondes). Toutes les applications de suspension de bactéries et/ou d’amibes seront réalisées sous anesthésie générale (durée = 30 secondes). Un seul dépôt de bactéries sera effectué sur les plaies (1 goutte) au cours des expérimentations, le premier jour (durée 30 secondes) et pendant les 3 jours suivants 1 goutte de suspensions amibiennes sera déposée chez les animaux traités avec ces cellules (durée 30 secondes). Les mesures (photographies) seront réalisées sous anesthésie générale (2 minutes par animal). Les expérimentations dureront 15 jours.

Impact sur les animaux

Sur le dos des animaux sera réalisée des plaies cutanées qui répresenteront environ 5% de la surface totale du dos de la souris. Ces plaies seront suivi pour certains animaux, de l'application d'une bactérie, le saphyloccoque dorée ce qui engendrera une infection de la plaie. Les animaux recevront un antalgique et cela ne generera donc pas de douleur. La cicatrisation de la plaie pourrait engendrer une légère démengeaison. L'application de bandage ne genant pas les animaux dans leur mouvements, sera disposé sur les plaies afin d'eviter des grattage qui pourrait conduire à une augmentation de la taille des plaies. D’après notre expérience, il n’est donc pas attendu de troubles importants des fonctions corporelles. Les anesthesies répétées 5x/semaine pendant 15 jours pourront entrainer un leger stress chez les animaux

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de réaliser des prélèvements post-mortem. Des biopsies de peau seront prélevées afin de réaliser des analyses histologiques. Des ganglions lympathiques seront également prélevés afin d’analyser la réponse inflammatoire et l’effet anti-inflammatoire des souches amibiennes testées.

Remplacement

L'objectif de cette étude est de déterminer l’efficacité antibactérienne et anti-inflammatoire d’amibes libres, et ce dans l'objectif de leur utilisation thérapeutique pour traiter des infections cutanées d’origine bactérienne et résistantes aux antibiotiques. Un remplacement in vitro (application d'amibes sur matrice solide à l'interface liquide/air recouvert de bactéries) a déjà été utilisé et a permis de démontrer l'activité antibactérienne des amibes considérées ici. Un remplacement ex vivo (épiderme reconstitué) a été envisagé. Si ce remplacement permettrait de vérifier l'activité antibactérienne, il ne permettra pas de déterminer l'impact réel de cette activitée sur la résolution de l'infection et la cicatrisation (effet thérapeutique recherché). Enfin, nous disposons d'ôres et déjà de données démontrant l'inocuité de l'application d'amibes sur des plaies non-infectées. Aussi, seule la conduite d'étude in vivo sur plaies infectées permettra de déterminer le potentiel des amibes testées à un usage thérapeutique, tel que proposé dans la demande de brevet déposé au European Patent Office.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre afin d’optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimatation d'une semaine sera respectée avant le début des procédures expérimentales. Les animaux seront hébergés par groupes d'individus compatibles et dans des conditions contrôlées. Lors des expérimentations, les animaux seront placés sur un tapis chauffant et anesthésiés pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress pour l’animal. Des mesures seront mises en œuvre afin de limiter la douleur (anesthésie et injection d’un antalgique) et le stress des animaux.Ceux-ci seront endormis par anesthésie générale lors des procédures (formation des plaies, applications de bactéries et/ou d’amibes, mesures) et des points limites bien définis, suffisamment précoces et prédictifs pour prévenir tout stress et toute douleur de l’animal ont été mis en place. Un antalgique sera administré en sous-cutané, sur animaux vigiles, 30 minutes avant d’effectuer l’acte chirurgical ainsi que les 2 jours suivants. Afin d'eviter un grattage dû à la cicatrisation et/ou l'application des composés et qui pourrait conduire à une augmentation de la taille de la plaie, les plaies seront bandées aprés la chirurgie ainsi qu'aprés chaque application. Les animaux seront surveillés quotidiennement et notamment au moment des mesures du suivi de cicatrisation 5fois/semaine. Nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux des animaux.

Choix des espèces

La souris est un petit animal à cycle de reproduction rapide qui s’adapte bien à ce type d’expérimentations, selon notre expérience et celle de l’équipe collaboratrice. Le suivi clinique de l’inflammation a été éprouvé par l’équipe à travers des expérimentations visant à mieux comprendre l’allergie cutanée. Le protocole que nous projetons de réaliser est très proche de celui ayant déjà été mis en œuvre précédemment sur plaies cutanées et ayant permis de vérifier l’innocuité de l’application de l’amibe Vermamoeba vermiformis M-2 B4 dans ce contexte. Par ailleurs, différentes études disponibles dans la littérature démontrent que la souris est un animal adapté afin d’évaluer l’efficacité d’un traitement favorisant la cicatrisation cutanée. Les souris provenant du fournisseur arrivent à l’âge de 6 semaines et sont acclimatées au sein de notre animalerie avant d’entrer dans nos protocoles. Les souris entrent dans les procédures à 7 semaines, période correspondant à l’âge de maturité du système immunitaire.

1 500 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de tumeur sous la capsule du rein, des traitements par voies multiples et des séances d'imagerie sous anesthésie, la tumeur pouvant produire des métastases pulmonaires et une perte de poids, avant d'être tué. Le porteur, société "prestataire de services en recherche préclinique", décrit son offre de modèles tumoraux destinés à sélectionner des molécules pour l'industrie. Il affirme que les méthodes alternatives ne prédisent pas l'efficacité in vivo et que la reconstruction de tumeurs en 3D reste "marginale".

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre International de Recherche contre le Cancer. Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveaux composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Les modèles de ce projet sont des modèles orthotopiques rénaux ou des modèles dont la prise tumorale est faible dans des tissus communément utilisés (sous cutané par exemple) et dont la greffe en sub-capsulaire rénale améliore la prise tumorale, grâce à la forte vascularisation du rein. Pour certains modèles, les masses tumorales primaires greffées peuvent disséminer et créer des métastases. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme dans le cas des tumeurs de rein greffées par voie orthotopique, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tumorale tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

L’implantation de transpondeur pour identifier l’animal est réalisée sous anesthésie générale 0-3 jours avant la greffe (

Impact sur les animaux

Il pourra être nécessaire de mettre en place un implant sous cutané de diffusion hormonale pour les tumeurs hormonodépendantes, lors d’une chirurgie stérile sous anesthésie avec analgésie. Cela pourra entrainer une douleur modérée et un stress léger sur 1-2 jours. La greffe tumorale en subcapsulaire rénal (réalisée sous anesthésie générale et analgésie) pourra engendrer une douleur modérée sur 1-2 jours et un stress modéré. L’évolution de la tumeur pourra entraîner un développement de métastases pulmonaires causant des difficultés respiratoires, une perte de poids. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress de 1-2 jours. Les animaux pourront recevoir des traitements par voie intra-musculaire (avec analgésie), intradermique (avec analgésie) , sous-cutanée, intraveineuse (bolus), orale, intranasale, intra tumorale, intrapéritonéale et / ou seront exposés à des rayons ionisants à visée thérapeutique. Ces traitements pourront entrainer un stress léger et une douleur légère. Dans le cas des rayons ionisants, les animaux seront transportés dans leur cage d’origine vers la plateforme d’irradiation. Cela pourra entrainer un stress léger. Dans le cas de l’imagerie, les animaux seront transportés dans leur cage d’origine vers la plateforme d’imagerie et imagés sous anesthésie générale. Cela pourra entrainer un stress léger. Les prélèvements de sang peu invasifs (veine faciale, jugulaire, caudale) seront effectués sous anesthésie générale à l’Isoflurane. Cela pourra entrainer un stress léger. Dans certains cas, comme par exemple pour le prélèvement à la veine caudale ou à la veine saphène, le geste pourra être effectué sans anesthésie, uniquement sous contention. Cela pourra entrainer un stress modéré pendant le prélèvement. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation

Devenir

Etant porteurs de tumeurs les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (volume tumoral et/ou poids). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et aux paramètres étudiés : en général un groupe non traité et/ou traité par le véhicule utilisé pour la molécule à évaluer, puis un groupe par schéma de traitement (différentes doses, voies, molécules etc). Au minimum, une étude comportera un groupe avec tumeur, non traité et/ou traité avec le véhicule, et un groupe avec tumeur traité avec le composé à tester. Toutefois, dans la mesure du possible, le maximum de composés seront testés au cours de la même étude afin de ne pas démultiplier les animaux contrôles ainsi que les animaux surnuméraires non randomisés. Compte tenu de taux de prise tumorale variable et afin de pouvoir former des groupes homogènes en poids et/ou en volume tumoral, il sera en général nécessaire d’inclure au moins 10% d’animaux non randomisés. Le nombre d’animaux par groupe (en général 6 à 15 animaux) est choisi sur la base des précédentes études réalisées dans nos laboratoires pour les modèles connus afin de sélectionner le nombre d’animaux minimum pour observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et volume tumoral). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal pour remplacer des analyses terminales en cours d’étude.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine. Un gel nutritif et de l’eau gélifiée seront placés au fond de toutes les cages dès qu’une perte de poids >15% sera observée sur certains animaux en étude. La greffe subcapsulaire rénale, la pose d’implants hormonaux ou la thoracotomie seront réalisés sous anesthésie profonde avec injection pré-opératoire d’un opiacé et un alpha2 agoniste. Suite à la greffe du matériel tumoral en subcapsulaire rénal ou suite à la pose d’un implant, les animaux recevront 2 injections d’opiacé pendant 48, et éventuellement sur 24 heures supplémentaires si besoin. Les autres administrations et prélèvements seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (intraveineuse, prélèvement d’urine) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Les administrations douloureuses (intramusculaire, intradermique) seront réalisées avec analgésie préalable, et sous anesthésie si besoin. Les points limites concernant le poids sont adaptés en cas de tumeurs cachectiques. Dans les modèles connus pour induire des métastases pulmonaires, ou les modèles inconnus pouvant causer des métastases pulmonaires, une attention particulière sera portée à la respiration des animaux (posture, fréquence respiratoire). Les difficultés respiratoires marquées constitueront un point limite. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans la procédure. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites est observé, l’animal est mis en observation et un traitement est si possible mis en place. Par exemple, en cas de douleur constatée, le vétérinaire prescrira un traitement antalgique. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus suite à l’induction de pathologie cancéreuse et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux. En cas de toxicité sur l’animal, un arbre décisionnel validé par la SBEA (structure chargée du bien-être animal) sera utilisé. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie pour sortir l’animal de la procédure

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou induites) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation).

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit des bactéries intestinales par gavage cinq jours sur sept pendant plusieurs semaines, et des composés appliqués sous anesthésie sur les oreilles pour provoquer une dermatite, un psoriasis ou un eczéma, avant d'être tué pour prélever les organes. Le porteur indique que le gavage répété peut irriter la trachée et faire perdre du poids, et décrit l'inflammation induite comme légère et sans grattage. Il affirme qu'aucun test in vitro n'intègre la réaction immunitaire cutanée dans son ensemble.

Objectifs

Les maladies inflammatoires cutanées type dermatite atopique, psoriasis et eczema allergique de contact, touche une trés forte proportion de la population (plus de 20%). Il est largement admis que le microbiote intestinal joue un rôle important dans les maladies allergiques,dont la dermatite atopique et le psoriasis. Les probiotiques contribuent à l’amélioration de l’environnement intestinal, l’équilibre des réponses immunitaires et la régulation du métabolisme. La plupart des études suggèrent que les suppléments probiotiques peuvent être une alternative pour la prévention et le traitement notamment de la dermatite atopique et du psoriasis. Aussi, c'est dans ce contexte que les proprietés anti-inflammatoires de 2 bactéries intestinales seront testée dans trois modèles d'inflammation différentes chez la souris ( dermatite atopique, psoriasis et eczema allergique)

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'évaluer la capacité de deux bactéries, connues pour leurs propriétés anti-inflammatoires dans des modèles d’inflammation intestinales, à réguler l’inflammation cutanée de type psioriasis, eczema allerrgique de contact et dermatite atopique dans des modèles murins, et à long terme le developpement d'un nouveau traitement chez l'homme pour améliorer ces pathologies.

Procédures

Le traitement à base de bactéries intestinales sera réalisée par gavage sur animaux vigile, pour deux tiers des animaux il sera réalisé 5 fois par semaine entre 28 et 56 jours selon la procédure (durée 30sec), le tiers des animaux restants seront gavés pendant 28 jours 5jours / 7 au début puis avec une periode de 12 jours consécutifs (durée 30sec). L'application des composés servant à induire les différentes inflammations, seront appliquée sur les oreilles des animaux sous anesthésie pendant 30min. Pour cela, un tiers des animaux seront anesthesiés 3 jours consécutifs sur 2 semaines consécutives et une derniere fois aprés resolution de l'inflammation 7 jours plus tard (7 injections =30sec). Un tiers des animaux recevront 1 application par semaine pendant 7 semaine; et 2 applications consécutives à la 4e semaine pour booster la réponse) sous anesthésie pendant 30 min (8 injections =30sec). Le dernier tiers des animaux recevront 2 applications à 9 jours d'intervalle (2 injections =30sec) . Le traitement utilisé en control sera appliqué sur l'oreille des souris 6h aprés l'application du composé utilisé pour généré l'inflammation, et sur des souris anesthésiés pendant 30secondes. La mesure de la réponse clinique (mesure de l'epaisseur de l'oreille) sera réalisée sous anesthésie 5jours/7 pendant 30secondes. Un tiers des animaux seront egalement rasés sur le ventre à l'aide d'une tondeuse en vigile, durée 30sec.

Impact sur les animaux

Le gavage répétée sur plusieurs semaines pourrais induire une irritation de la trachée et donc une perte de poids. Les modèles d'eczema allergique,de psoriasis ou de dermatite atopique sont bien connus et utilisés dans l'equipe quotidiennement, ces derniers engendrent une inflammation legère au niveau de l'oreille qui ne gènent pas la souris et ne gènerent pas de grattage. Les souris seront regulierement anesthesiées (5j/7) durant plusieurs semaines ce qui peux génerer un stress.

Devenir

Toue les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude afin de récuperer les organes ce qui permettra d'analyser les propriétés anti inflammatoires des deux bactéries testées

Remplacement

L’objectif de cette étude est d'évaluer l'impact de candidat médicament sur différentes inflammations cutanées. Aucun test in vitro ne permet d’intégrer la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés dans leur ensemble dans le cadre de cette pathologie. Celle-ci ne peut donc être conduite qu’in vivo.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. Une seule dose de bactérie sera testée, celle çi ayant deja été validé dans une précedente procédure et pour une autre pathologie. Dans le but de diminuer le nombre d'animaux utilisé dans ce projet, un des groupes control sera commun à 2 procédures.

Raffinement

Des mesures seront mises en oeuvre pour optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimation d'une semaine sera respectée avant le debut de la procédure expérimentale, et les souris seront maintenues entre 4 et 5 souris par cage, afin de les maintenir au maximum en groupe social. Des points limites bien définis et suffisamment précoces et prédictifs pour prévenir tout stress et toute douleur de l’animal ont été mis en place. L’observation des animaux sera effectuée 5jours/7 et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceuxci. Dans le cas où des nimaux perdrait du poids, des aliments réhydratées seraient disposé dans la cage. Pour les gavages, des sondes gastriques souples reconnus pour etre moins irritante pour les animaux seront utilisés et les gavages seront réalisés par une personne expérimentée ayant déjà réalisé des gavages répétés.

Choix des espèces

L’espèce souris est un modèle très utilisé en pathologie immunologique telle que l’allergie et autre inflammation cutanée en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires. De plus, l’utilisation de ce modèle, couramment employé dans ce domaine, nous permettra de discuter nos résultats par rapport aux données existantes de la littérature. Les souris provenant de fournisseurs sont acclimatées au moins une semaine au sein de notre animalerie avant d'entrer dans nos protocoles. Les souris entrent dans les procédures à 7-25 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.

10 chèvres vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque femelle subit une ovariectomie chirurgicale d'environ une heure, puis est tuée pour prélever les organes olfactifs, l'utérus, les ovaires et le cerveau. Le porteur décrit un risque de douleur, d'hématome et d'infection postopératoires, ainsi qu'une irritation respiratoire possible liée à l'intubation. Il affirme que la question n'est "pas modélisable" autrement et rattache le bénéfice attendu à la gestion de la reproduction dans la filière caprine.

Objectifs

La chèvre est une espèce à reproduction dite "saisonnée", ce qui signifie que son activité de reproduction est naturellement restreinte à une période de l'année. C'est une espèce dite de "jours courts", c'est-à-dire que son activité sexuelle se déclenche en automne lorsque la durée du jour diminue. Cette saison sexuelle est suivie d'une période de repos sexuel (ou "anœstrus saisonnier") pendant laquelle les variations hormonales responsables des chaleurs et de l'ovulation sont stoppées lorsque la durée du jour augmente au printemps. La durée du jour n'est cependant pas le seul facteur environnemental pouvant impacter la reproduction de la chèvre. En effet, plusieurs études décrivent une modification de l'activité sexuelle de la femelle en fonction des contacts sociaux entretenus avec le mâle. Un phénomène nommé "effet mâle" a notamment été caractérisé chez cette espèce ainsi que chez les ovins. Ce phénomène permet, par l'introduction d'un mâle parmi des femelles en période de repos sexuel, une reprise des mécanismes hormonaux menant à l'ovulation. Les indices sensoriels, notamment olfactifs, pourraient jouer un rôle important dans le déclenchement de ce type de phénomène. Chez la souris, l'exposition à un mâle ou à son odeur déclenche une puberté précoce chez les femelles exposées. Chez la chèvre, l'exposition de femelles pendant l'anœstrus saisonnier à des stimuli olfactifs de mâle permet de stimuler les mécanismes hormonaux, pouvant mener à l'ovulation (50% des femelles adultes dans le cadre de l'effet mâle). Pour étudier la sensibilité des chèvres aux composés olfactifs de boucs, notre équipe a développé une approche basée sur une culture cellulaire, produite à partir de la récupération des tissus olfactifs de chèvre après euthanasie. Chez la souris, le statut hormonal influence le seuil de détection des odeurs et leur discrimination. Puisque la chèvre subit des variations hormonales drastiques au cours de l'année, nous aimerions explorer l'hypothèse que le statut physiologique de la femelle va modifier la sensibilité de ses tissus olfactifs aux composés de mâles.

Bénéfices attendus

Meilleure compréhension de l'influence des hormones sexuelles sur la sensibilité olfactive des femelles aux composés odorants de mâles chez un modèle à reproduction saisonnée. A terme, cette étude pourrait apporter des bénéfices à la filière d'élevage caprine via une meilleure gestion de la reproduction par les interactions sociales mâles/femelles et l'utilisation des indices sensoriels olfactifs, tout en limitant l'apport d'hormones exogènes.

Procédures

Les 10 femelles du lot OVX subiront une unique procédure chirurgicale d'ovariectomie (retrait des ovaires). La réalisation de cette procédure nécessite environ une heure.

Impact sur les animaux

Pour les animaux des lots SAISON et ANOESTRUS, les seuls effets indésirables attendus sont du stress lors des manipulations précédant l'enthanasie. Pour les animaux du lot OVX : stress possible lors des manipulations, de la phase pré opératoire, de l'induction de l'anesthésie, et de la phase de réveil. L'apparition de douleurs suite à la chirurgie est également possible (hématome au niveau de la plaie), ainsi qu'une éventuelle infection qui entraînerait abattement, fièvre et anorexie. Lors de l'anesthésie, une irritation de l’appareil respiratoire supérieur (liée à l’intubation) peut apparaître, mais ce cas reste rare. De plus, les différentes injections en intraveineuse peuvent engendrer un hématome.

Devenir

A l'issue de cette procédure, les 10 femelles du lots OVX retourneront en élevage. Dès que possible, ces femelles seront euthanasiées afin de récupérer les organes sensoriels olfactifs (épithélium olfactif principal et organe voméronasal) pour mesurer l’activité cellulaire sur des neurones en culture. L'organe voméronasal est un organe tubulaire du nez présent chez la plupart des mammifères et permettant la détection de molécules odorantes. Les résultats seront comparés à ceux obtenus sur les lots SAISON et ANŒSTRUS (non concernés par la procédure expérimentale faisant l'objet de cette saisine). Ceci nous permettra d'évaluer les effets des variations hormonales saisonnières sur la sensibilité olfactive des chèvres aux stimuli de mâle. Le tractus reproducteur (utérus/ovaires) et le cerveau seront également récupérés pour d'autres types d'expériences.

Remplacement

Le modèle animal ne peut pas être remplacé dans ce projet étudiant les effets de la saisonnalité sur la réponse des neurones olfactifs aux stimuli de mâle chez la chèvre car ceci n'est pas modélisable par des modèles alternatifs.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés (34 femelles) a été rationalisé dans le but de ne pas utiliser plus d'animaux que nécessaire pour pouvoir mettre en évidence un effet après analyse statistique. La taille de nos effectifs (10 à 13 individus par groupe) a été choisi grâce à un outil statistique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sur paille et bénéficieront d'enrichissement comme des caisses en bois et des ballons. Afin de prévenir tout stress, les animaux sont gardés en groupes sociaux stables, dans des conditions d’élevage optimales avec fourrages et concentrés de qualité et des locaux calmes. Pour les animaux du groupe OVX, la douleur est traitée préventivement avant l’acte chirurgical dès l’anesthésie, et le traitement est maintenu jusqu’à un état physiologiquement stable des animaux. Le retour à l’état normal est estimé à 3 jours postopératoires. Les animaux sont surveillés quotidiennement et plusieurs fois par jour en post-opératoire immédiat. Un animal anorexique, prostré, recevra l’administration de morphinique. Sans réponse physiologique satisfaisante, il sera procédé à l’euthanasie suivie du prélèvement du site lésionnel pour analyse. Tout animal qui ne se nourrit pas pendant 4 jours malgré le traitement sera euthanasié. Une fiche de suivi individuel est mise en place, renseignée tous les jours. Les animaux seront surveillés quodtidiennement sur 6 paramètres. Les point limites attendus sont : - Une prostration avec abattement et anorexie en cas de douleur importante : en ce cas ces animaux recevront des injections sous cutanées de morphine - Fièvre, abattement, polypnée en cas d’infection post opératoire : en ce cas, les animaux recevront des antibiotiques et des anti inflammatoires non stéroïdien en fonction de la gravité des symptomes.

Choix des espèces

Chez la chèvre, la présence d'un mâle sexuellement actif impacte la physiologie de la reproduction et les comportements sexuels de la femelle. Les indices olfactifs du mâle pourraient jouer un rôle assez important dans le déclenchement de ces divers phénomènes décrits, notamment dans le cadre de l'"effet mâle". Le statut hormonal d'un individu semble influencer le seuil de détection des odeurs et leur discrimination (données rongeurs). Ainsi, il serait donc intéressant de comprendre si les variations hormonales causées par la saisonnalité de reproduction de la chèvre conduisent également à une modification de la sensibilité de ses organes olfactifs aux stimuli de bouc. Nous utiliserons des femelles sexuellement matures (nées entre janvier et février 2021) pouvant donc afficher les variations hormonales saisonnières attendues pour comparaison.

2 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit un infarctus provoqué par ligature définitive d'une artère coronaire au cours d'une chirurgie de trente minutes, puis des échocardiographies sous anesthésie, avant d'être tué par surdose d'anesthésique. Le porteur mentionne une douleur postopératoire soulagée par analgésiques et une mortalité liée à la procédure. Il affirme que ces modèles murins sont un préalable "absolument nécessaire et indispensable" à la validation de traitements de l'infarctus chez l'humain.

Objectifs

Le nombre de patient atteints par un infarctus du myocarde et la mortalité associée par insuffisance cardiaque restent élevés malgré l’amélioration de la prise en charge des patients en aigu ou en chronique La compréhension des mécanismes impliqués dans cette pathologie est indispensable pour le développement de stratégies thérapeutiques visant à limiter le développement de l’insuffisance cardiaque et constitue un enjeu médical et sociétal majeur. Notre projet a pour but de comprendre finement les mécanismes moléculaires qui contrôlent la fonction réparatrice de certaines cellules de l’immunité, après un infarctus du myocarde, chez la souris. Divers modèles de souris génétiquement modifiées nous permettront d’analyser spécifiquement le rôle de ces cellules. Ces animaux subiront un infarctus du myocarde. L’analyse consistera à étudier la fonction cardiaque, le remodelage cardiaque et la réponse inflammatoire.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre comment des cellules de l’immunité telles que les macrophages, participent à la réparation du cœur après infarctus du myocarde. L’identification des mécanismes mis en jeu dans les macrophages est un prérequis indispensable au développement de stratégies thérapeutiques innovantes visant à réduire la mortalité chez les patients souffrants de pathologies cardiaques ischémiques en stimulant la réparation cardiaque après un infarctus.

Procédures

Chaque animal va subir une procédure chirurgicale de 30 min au cours de laquelle un infarctus du myocarde expérimental est réalisé par ligature permanente de l’artère coronaire antérieure gauche. Trois injections sous-cutanées d’analgésiques (durée inférieure à 30 secondes pour chaque injection) sont prévues, dont une en préopératoire. A différents jours après l’opération, une échocardiographie non-invasive indolore sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse, d’une durée maximale de 30 minutes.

Impact sur les animaux

Inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection. Douleur post-opératoire soulagée par des analgésiques.

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale toutes les souris sont mises à mort par par surdosage d’anesthésiques.

Remplacement

Pour respecter le principe des 3R, nous avons évalué nos hypothèses in vitro avec des cultures de macrophages autant que possible avant de l’étudier dans un modèle murin. Cependant, ces modèles murins sont une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes survenant au cours de l’infarctus du myocarde. En effet, ces événements sont des phénomènes complexes, que des modèles in vitro ne pourraient pas permettre de recréer. Nous voulons, in vivo, comprendre les différentes interactions cellulaires et tissulaires qui sont mises en jeu lors de la réparation cardiaque apres un infarctus. Ces modèles murins pré-cliniques sont également un préalable absolument nécessaire et indispensable pour la validation des stratégies thérapeutiques afin de les mettre en application chez des patients présentant un infarctus du myocarde.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à ce projet a été ajusté grace à l’utilisation de tests statistiques déterminant la taille minimale des groupes expérimentaux. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait pour détecter un changement de 20% de la fonction cardiaque par échocardiographie. Ces tests indiquent un nombre de 15 souris par groupe. Pour deux groupes, en supposant quelques problèmes de traitement des tissus et la mortalité inhérente à la procédure, nous estimons une taille de groupe de 20 animaux. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal : analyses échocardiographiques, anatomopathologiques, immunohistochimiques ainsi que des analyses des ARN, protéines et cellules cardiaques.

Raffinement

La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées pour les procédures et l’établissement de points limites adéquats. Les animaux seront élevés en cages enrichies avec eau et nourriture ad libitum dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris: - température contrôlée à 22°C - cycle de jour/nuit de 12 heures - nourriture et eau ad-libitum - hébergement dans des cages de 2 à 5 souris maximum - enrichissement des cages avec maisonnettes, bâtonnets en bois et coton Après la procédure chirurgicale, les animaux sont placés dans une cage de réveil chauffée et enrichie, sous surveillance jusqu’au réveil complet. Ensuite, les animaux retournent avec leurs congénères, dans une cage d’hébergement enrichie. La stratégie antalgique sera systématiquement poursuivie en post-opératoire pendant 48 heures, avec administration sous-cutanée de buprénorphine toutes les 12 heures, pendant 48 heures. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les expérimentateurs confirmés pendant les 5 premiers jours post-opératoires, puis par le personnel technique qualifié de l’animalerie pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Pour l’infarctus du myocarde et l’échographie, les animaux sont placés sur une plaque chauffante thermorégulée à 37°C dès l’induction de l’anesthésie.

Choix des espèces

Le choix de l'espèce murine nous permet d’avoir accès à des animaux génétiquement modifiés. Nous utiliserons des souris adultes non sénescentes, âgées de 10 semaines minimum chez lesquelles le système cardio-vasculaire est arrivé à maturité. En dessous de cet âge, la variabilité est accrue dans le remodelage et la survie fortement réduite à la suite d’un infarctus du myocarde.