Procédures modérées

496 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles gestantes reçoivent des injections intrapéritonéales puis sont tuées par césarienne pour récupérer les nouveau-nés, confiés à des mères adoptantes et analysés à huit semaines. Le porteur décrit comme nuisances l'isolement des mâles, les injections et les césariennes, sans autre détail sur les atteintes. Il affirme que le développement du système immunitaire embryonnaire ne peut être étudié in vitro et que le modèle murin est "essentiel" du fait de sa proximité avec l'humain.

Objectifs

Les ganglions lymphatiques se forment au cours du développement embryonnaire. Ceux sont de petits organes arrondis, aussi appelés organes lymphoïdes secondaires ou périphériques. Ils sont chargés de la régulation des interactions des antigènes avec les cellules du système immunitaire. Ces ganglions lymphatiques sont disséminés partout dans l'organisme sur le trajet de la circulation de la lymphe. Les premières étapes de mise en place dans l'embryon sont encore méconnues. Ces étapes impliquent l'interaction de différents types cellulaires et de différents signaux chimiques dans des régions spécifiques de l'embryon. Notre objectif est de caractériser tous les acteurs cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement du système immunitaire et de définir l'origine hématopoïétique de ces cellules en particulier en ce qui concerne la formation des ganglions lymphatiques et des vaisseaux lymphatiques. Le projet visera également à identifier quels sont les facteurs qui déterminent l'emplacement de l’initiation du développement de ces structures et quels sont les évènements qui se déroulent à ces sites spécifiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet attendus sont une meilleure connaissance des différents acteurs de la mise en place, à des coordonnées spécifiques dans l'embryon, des ganglions lymphatiques. En effet, de précédentes études ont montré que l'alimentation de la mère était très importante et pouvait être un facteur déterminant concernant la taille des ganglions lymphatiques par exemple. La vitamine A a été montrée comme un facteur essentiel au bon développement et fonctionnement du système immunitaire. Il existe un lien moléculaire entre les nutriments maternels (Vit A mais aussi certains métabolites intermédiaires du cholestérol) et la formation des structures immunitaires nécessaires à la résistance aux infections chez la progéniture. Ces études permettront donc de mieux comprendre quelles sont les conditions requises pour le bon développement du système immunitaire au stade embryonnaire. Ces conditions sont critiques car elles affecteront la fonction du système immunitaire adulte.

Procédures

Des injections intra-péritonéales (2 injections par souris, pour induire nos systèmes transgéniques) et des procédures de césariennes seront pratiquées sur nos souris gestantes.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont l'isolement des mâles, les injections intra-péritonéales, les procédures de césariennes et de mise à mort.

Devenir

A l'issu de la procédure, les femelles gestantes sont mises à mort afin de récupérer les nouveau-nés qui sont confiés à des mères adoptantes et qui seront analysés à l'âge de 8 semaines.

Remplacement

Le modèle animal est ici essentiel car il permet d'étudier un système immunitaire proche de celui de l'homme. Les nombreux modèles de souris transgéniques disponibles nous permettent d'étudier des facteurs spécifiques, comme par exemple les chimiokines impliquées dans ces processus de développement. Le projet concerne l’étude de mécanismes in vivo qui ne peuvent être abordés par des techniques alternatives de culture in vitro dans lesquelles les notions d’interactions cellulaires ne peuvent se faire. De plus, au cours du développement, de nombreux facteurs liés aux contraintes physiques influencent la morphogenèse et ces contraintes ne peuvent être reproduites in vitro. Les intéraction entre les différents types cellulaires impliqués dans le développement du système immunitaire ne peuvent être observées que sur modèle animal. Les études in silico ou in vitro ne permettent pas d'étudier ces différentes intéractions. De plus, nous souhaitons étudier l'embryon en 3D et seul le modèle animal le permet.

Réduction

Nous utiliserons le minimum de souris nécessaires pour nos expérimentations. Pour cela, nous validerons le nombre de souris nécessaire à nos expérimentations par les calculs de puissance statistiques.

Raffinement

Pour limiter la douleur, la souffrance et l'angoisse infligées, les souris seront hébergées en accord avec la loi européenne dans une enceinte dédiée, dans des cages de dimension suffisante, avec un enrichissement comprenant des nids en carton et du coton. Une grille d'évalutation des points limites permettra d'effectuer un suivi du bien-être des animaux. Si les critères sévères sont atteints, telle qu'une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, les souris seront euthanasiées.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi car le système immunitaire de la souris présente de grandes similitudes avec le système immunitaire humain. De plus, il existe de nombreux modèles de souris transgéniques disponibles et éprouvés permettant d'étudier les différents acteurs de la mise en place du système immunitaire. Les animaux seront utilisés aux stades embryonnaires E10.5, E12.5, E14.5, E16.5 et E18.5, soit 5 stades embryonnaires distincts afin de couvrir tout le développement embryonnaire du système immunitaire jusqu'à la naissance.

12 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dix-huit injections de thioacétamide sur six semaines, une hépatotoxine qui provoque une fibrose puis une cirrhose du foie, avec une perte de poids et une mortalité pouvant atteindre 15 % des animaux traités. Le porteur indique tuer les souris par ponction cardiaque pour prélever le foie, l'objectif étant de mettre au point une méthode d'imagerie 3D de la fibrose sur foie rendu transparent. Il affirme qu'aucun modèle de fibrose hépatique in vitro n'existe et qu'il est "contraint" de recourir à l'animal.

Objectifs

La stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD), est la première cause de maladie chronique du foie et sa prévalence ne cesse d’augmenter. La NAFLD inclus différents stades allant de la simple stéatose à la stéatohépatite non-alcoolique (NASH) caractérisée par de l’inflammation et une progression rapide de fibrose. Les patients atteints de NASH présentent un risque accru de développer une cirrhose ou un hépato- carcinome. De nombreux facteurs augmentent le risque de progression de la NAFLD à la NASH, mais les mécanismes sont encore peu connus. Il n’existe d’ailleurs actuellement aucun traitement contre la NASH. Les modèles précliniques d’étude de la NASH sont encore peu nombreux et ne récapitulent pas parfaitement les lésions observées chez les patients. Dans l’objectif de mieux caractériser le développement de réseau de fibrose, et avec l’émergence des nouvelles technologies d’imagerie, nous proposons de mettre en place une méthode pour caractériser et quantifier le réseau de fibrose hépatique en 3-dimensions par microscopie bi-photonique sur foie transparisé, c’est-à-dire rendu transparent. Pour rendre le foie transparent, nous utiliserons un protocole décrit nommé CUBIC pour « clear unobstructed brain/body imaging cocktails » ou cocktail pour l’imagerie du cerveau/corps clair et non obstrué. Suite à cela, nous visualiserons le réseau de fibrose en 3-dimensions sur des coupes d’organes de plus de 2 mm d’épaisseurs avec un microscope multi-photonique. Le projet vise ensuite à publier cette méthode dans un journal à comité de lecture afin que celle-ci soit accessible à toute la communauté scientifique.

Bénéfices attendus

Avec les prélèvements de foie fibrosé, nous envisageons de développer une méthode de transparisation de foie murin avec le réactif CUBIC, suivie de visualisation des fibres de collagène en microscopie multi-photonique en 3 dimensions (sur foie jusqu’à 2 mm d’épaisseur). La microscopie bi-photonique est une méthode d’imagerie basée sur la propriété de certaines molécules à générer des signaux seconde harmonie (SHG, pour second harmic generation) lorsqu’elles sont excitées à une longueur d’onde spécifique. Le collagène, la molécule caractéristique de la fibrose est une molécule décrite comme étant propice à la microscopie SHG. Ainsi, la méthode que nous souhaitons développer devrait permettre : 1) Une caractérisation spatiale du réseau de fibrose plus sensible et plus complète que les analyses classiques actuellement utilisées. 2) Une meilleure connaissance de la nature des fibres, avec la possibilité d’orienter l’angle de polarisation du laser pour discriminer différentes fibres. La microscopie bi-photonique avec le SHG est une méthode « label-free », c’est-à-dire qu’elle n’utilise pas de colorants ou d’anticorps. Cela implique donc qu’en plus de réduire les coûts, d’éviter l’exposition à des colorants et produits chimiques nocifs, cette méthode d’imagerie pourrait être couplée à des méthodes d’immunofluorescences classiques sur le même échantillon. On peut donc imaginer d’étudier la colocalisation entre les fibres de collagène hépatique et l’expression de protéines d’intérêt. A la suite de la mise au point de cette méthode, nous envisageons de la publier dans un journal à comité de lecture afin que celle-ci soit accessible à toute la communauté scientifique.

Procédures

Pour mettre au point cette nouvelle méthode d’imagerie en 3 dimensions, nous proposons d’utiliser du foie de souris issues d’un modèle de fibrose hépatique induite par hépatotoxine à savoir la thioacétamide (TAA). Le TAA est un organosulfure (formule chimique C2H5NS), anciennement utilisé comme fongicide, qui est maintenant couramment utilisé comme hépatotoxine pour induire un stade avancé de fibrose et de cirrhose chez le rongeur. Les souris seront soumises à 3 injections intra-péritonéales de TAA par semaine pendant 6 semaines (18 au total). Ces injections visent à induire une fibrose hépatique dans le but de notre étude. A la fin du protocole, un prélèvement de sang sera effectué par ponction cardiaque après anesthésie/analgésie chimique.

Impact sur les animaux

Le thioacétamide (TAA) est un organosulfure (formule chimique C2H5NS), anciennement utilisé comme fongicide, qui est maintenant couramment utilisé comme hépatotoxine pour induire un stade avancé de fibrose et de cirrhose chez le rongeur. L’administration de TAA provoque des lésions hépatiques, celles-ci peuvent atteindre le stade de cirrhose, avec ses complications associées. Cependant, celles-ci sont rarement sources d’inconfort pour les animaux. Une perte de poids modérés peut être observée. La mortalité peut atteindre 15% des souris traitées au TAA.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélever le foie.

Remplacement

La fibrose hépatique est un processus physiologique complexe, multi-cellulaire et dont la spatialisation du réseau de fibrose dans le foie a un impact physiologique (la fibrose péri-portale et différente de la porto-centrale). Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle de fibrose hépatique in vitro, c’est pourquoi nous sommes contraints d’utiliser un modèle animal pour ce projet.

Réduction

Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en œuvre. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.

Raffinement

Les procédures ont été réfléchies pour réduire au maximum le stress et les souffrances des souris soumises aux expérimentations. L’injection de TAA ne nécessite pas d’injection d’analgésique. Les souris sont hébergées par 2 à 5 par cage pour limiter l’isolement, et les cages seront enrichies en frisotis et d’un dôme en carton. Une observation quotidienne des souris et une pesée hebdomadaire seront effectuées. Si une souffrance de l’animal est détectée et jugée trop importante, alors la souris sera euthanasiée sans délai. Si un seul signe clinique spécifique ou 2 signes notables sont détectés alors le responsable du SBEA et le responsable de l’étude seront prévenus et la souris sera sacrifiée sans délai.

Choix des espèces

Le modèle de fibrose hépatique induite par TAA chez les C57Bl/6J mâles est un modèle de choix et reconnu pour le développement de fibrose. Avec ce modèle, il est très probable que la totalité des animaux traités au TAA soient atteints de fibrose hépatique après 6 semaines de traitement ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Les souris seront âgées de 8 semaines au début des injections. Les injections de TAA s’étaleront sur 6 semaines. Ce sont les durées généralement utilisées dans la littérature pour induire de la fibrose hépatique au TAA.

300 diamants mandarins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans être tués à l'issue, les adultes rejoignant l'élevage et les jeunes étant proposés à l'adoption. Les couples reproduisent trois mois en cages plus petites que les volières, une partie des jeunes est séparée du père, et chaque jeune passe six jours isolé lors d'un test de mémorisation spatiale, en contact auditif avec ses congénères. Le porteur décrit l'inconfort du confinement et le stress possible de l'isolement, qu'il dit atténuer par un environnement enrichi. Il affirme que l'étude de l'influence sociale sur le développement cognitif "nécessite" une espèce d'oiseau nidicole et exclut tout remplacement.

Objectifs

Chez les vertébrés et les oiseaux, il est reconnu que la qualité des soins parentaux et l’environnement peuvent avoir une incidence importante sur le développement des jeunes, notamment pour les espèces nidicoles. L’environnement social est ainsi essentiel pour les processus d’apprentissage des jeunes. A l’heure actuelle, la majorité des études se sont focalisées sur des comportements particuliers (ex : chant) ou sur la phase post-natale de développement au nid. Au contraire, l’impact de l’environnement social lors de la phase d’adolescence sur les capacités cognitives a été beaucoup moins étudié. Est-ce que l'instabilité du noyau parental affecte le développement cognitif des jeunes oiseaux ? Est-ce que la proximité sociale avec les autres membres de la famille améliore, ou au contraire, détériore le développement cognitif des jeunes oiseaux ? Est-ce que la proximité sociale permet d’atténuer les effets potentiels d’une perturbation du noyau parental ? Pour répondre à ces questions, nous visons à suivre le développement de 60 nichées de diamants mandarins confrontées à des conditions sociales différentes durant leur adolescence. Nous aurons ainsi 4 groupes d’oiseaux dont l’environnement social diffère durant la phase d’adolescence des jeunes. Lors de l’adolescence (après envol du nid) : (1) 15 nichées seront maintenus avec leurs deux parents dans un environnement social classique (grandes cages) ; (2) 15 nichées seront confrontées au retrait temporaire du père dans un environnement social classique (grandes cages) ; (3) 15 nichées seront maintenus avec leurs deux parents dans un environnement de proximité sociale (cages de taille modérée) ; (4) 15 nichées confrontées au retrait temporaire du père dans un environnement de proximité sociale (cages de taille modérée)). Une fois l'adolescence terminée, des tests cognitifs (mesures de mémorisation spatiale) seront effectués chez les individus devenus adultes pour répondre à nos questions. Cette espèce d'oiseau très social a été selectionnée car le père peut rester près des jeunes durant les deux semaines suivant l'envol, mais il peut également laisser sa descendance juste après l'envol pour entamer un nouvel épisode de reproduction. Ces deux conditions (absence ou présence du père) sont donc fréquemment retrouvées dans la nature et correspondent à uns situation "naturelle".

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’améliorer nos connaissances concernant l’apprentissage et la mise en place des comportements cognitifs chez les oiseaux nidicoles. Il permettra notamment de mieux comprendre l’impact de l’environnement social (noyau parental et proximité sociale) lors de l’adolescence sur la capacité de mémorisation spatiale des individus.

Procédures

Les animaux reproducteurs seront capturés pour transfert de leurs volières d'hébergement vers les cages de reproduction (2 captures par adulte en plus des captures hébdomadaires pour le suivi de la masse et de la santé des individus). Ces individus seront recapturés pour le retour en volière d'hébergement 3 mois après la mise en cage de reproduction quand les jeunes auront atteints l'age adulte. Les jeunes seront capturés 1 fois pour le transfert de la cage de naissance vers leurs volières d'hébergement. Il seront ensuite capturés 2 fois pour être transférés dans le dispositif de test de mémorisation et pour retourner dans leur volière d'hébergement. Pendant la phase de test de mémorisation, les individus seront isolés de leurs congénères (pendant 6 jours), mais ils resteront en contact auditif. Les procédures de capture et de transfert prendront 3 minutes au maximum. Les jeunes seront également capturés une fois par semaine pour le suivi de leur masse et de leur état de santé).

Impact sur les animaux

La reproduction des individus dans les cages plus petites que les volières pendant 3 mois peut représenter un léger inconfort. Tous les individus concernés seront placés dans des volières de très grande taille suite au projet. L’effet du retrait du père devrait être limité car c’est un âge où les jeunes ne sont plus dépendants de leurs parents pour l’accès à la nourriture. Dans la nature, c’est également un âge ou le père abandonne fréquemment les jeunes en les laissant sous la garde de la mère uniquement. Les tests de mémorisation spatiale pourraient provoquer un stress (6 jours consécutifs) et sera minimisé par des conditions optimisées durant le test (contact auditif avec congénères, reconstitution de l’environnement de la cage de naissance).

Devenir

Du fait des procédures légères utilisées, tous les animaux seront gardés en vie et seront réintégrés à l'élevage de l'établissement utilisateur (adultes) ou adoptés (jeunes).

Remplacement

L’essence de ce projet est de tester l’influence des conditions sociales lors de l’adolescence sur le développement cognitif des oiseaux nidicoles. De ce fait, le remplacement n’est pas possible et l’utilisation d’une espèce modèle d’oiseau nidicole est nécessaire.

Réduction

La taille des 4 lots permettra de disposer d’une quinzaine de couples par traitement, et de 45 jeunes par traitement. Ceci représente une taille adaptée pour tester l’effet des variables considérés sur la mémorisation spatiale. Le nombre de 45 jeunes par condition a été établi à l'aide d'un test dit de puissance et garantit l'obtention de résultats exploitables. Les résultats seront analysés par des tests statistiques dédiés.

Raffinement

La souffrance et l'angoisse des mandarins seront réduites au minimum en (1) fournissant un environnement enrichi aux individus reproducteurs et aux jeunes mandarins (cages enrichies avec jouets, bains, et abris, photopériode adéquate, température optimale); (2) réduisant la durée des interventions pour chaque cage (passage journalier de 10 minutes par cage avec observation des comportements et « scoring » des individus) ; (3) en faisant réaliser les tests cognitifs par du personnel expérimenté et en réalisant ces tests derrière un miroir sans tain.

Choix des espèces

Le diamant mandarin est une espèce classiquement utilisée pour étudier les oiseaux nidicoles en laboratoire. Leur élevage est facile et très bien maitrisé. De plus, c’est une espèce modèle pour étudier la cognition chez les oiseaux et les protocoles de tests cognitifs ont été validés dans de multiples études. C'est par ailleurs une espèce très sociale qui vit avec une proximité des individus très importante. Les individus seront étudiés durant la reproduction (60 couples) et le développement des jeunes issus de cette reproduction (180 individus).

1 716 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un traumatisme crânien leur est provoqué sous anesthésie, certaines recevant en plus une injection intracisternale, suivi d'injections répétées et de prélèvements sanguins, pour étudier le rôle d'un récepteur dans les lésions de la substance blanche. Le porteur indique que le traumatisme peut réduire temporairement la prise de nourriture et provoquer une légère perte de poids récupérée en quelques jours. Il affirme que les mécanismes en jeu ne peuvent être reproduits in vitro et qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal, les cerveaux étant prélevés après la mise à mort.

Objectifs

Le traumatisme crânien est un problème majeur de santé publique lourd de conséquences neurologiques et lésionnelles à court et long terme pour lequel il n’existe aujourd’hui aucun traitement. Ces conséquences tardives sont en grande partie reliées aux lésions de la substance blanche jusqu’ici largement sous-estimées et méconnues. La substance blanche contient essentiellement des cellules nerveuses entourées d'une gaine de myéline permettant la transmission des informations dans le cerveau. L'espoir d'améliorer le pronostic du traumatisme crânien repose sur la découverte des mécanismes impliqués dans les lésions de la substance blanche et les désordres neurocomportementaux conséquents. Parmi ces mécanismes, des études suggèrent le rôle de la neuro-inflammation dans les lésions de la substance blanche après un traumatisme crânien. La microglie est une cellule immunitaire du cerveau qui joue un rôle majeur dans la neuro-inflammation. Des études suggèrent que les débris de myéline induits par le traumatisme crânien pourraient activer à leur tour la microglie. Une fois activée, la microglie peut adopter 2 phénotypes distincts, c'est-à-dire qu'elle peut exercer des effets délétères, mais aussi des effets bénéfiques, et ceci, selon son environnement. Ainsi, des études ont rapporté aussi bien des effets pro- ou anti-inflammatoires des débris de myéline, mais à ce jour, aucun lien entre débris de myéline et activation microgliale n’a pu être mis en évidence dans le traumatisme crânien. De plus, la protéine étudiée, qui est notamment exprimée par les microglies, pourrait être impliquée dans la modulation des phénotypes microgliaux. Cependant, à ce jour, il n’existe aucune donnée sur l’implication de cette protéine dans les phénotypes microgliaux induits par les débris de myéline produits à la suite du traumatisme crânien. L'objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle de la protéine d’intérêt dans la neuro-inflammation microgliale induite par des débris de myéline produits et les lésions de la substance blanche à la suite d’un traumatisme crânien chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet s’intègre dans un projet plus large qui permettra (1) une meilleure caractérisation de la neuroinflammation et des lésions de la substance blanche induites par le traumatisme crânien et (2) de proposer une stratégie thérapeutique pour la réparation et la prévention des lésions de la substance blanche induites par le traumatisme crânien.

Procédures

• Un traumatisme crânien sera induit sous anesthésie générale. La réalisation de ce modèle de traumatisme crânien nécessite 10 minutes. L’anesthésie générale sera précédée de l’administration d’un analgésique 30 minutes avant par voie sous-cutanée. Cette injection sera réalisée sur animal vigile et prendra moins d’1 minute. Certaines souris recevront en plus une injection intracisternale tout de suite après le traumatisme crânien. Cette injection sera réalisée sous anesthésie générale et prendra moins d’1 minute. Toutes les souris soumises à un traumatisme crânien recevront 5 injections par voie sous-cutanée de sérum physiologique (2 fois par jour pendant 2 jours à compter du jour du traumatisme crânien) et 5 injections par voie sous-cutanée d’analgésique (2 fois par jour pendant 2 jours à compter du jour du traumatisme crânien). Ces injections seront réalisées sur animal vigile et prendront chacune moins d’1 minute. • Des prélèvements de sang seront réalisés chez toutes les souris du projet, soit 1 seule fois, soit 5 fois sur une période de 3 mois. Chaque prélèvement sera réalisé sur animal vigile en moins d’1 minute. • Des tests comportementaux seront réalisés 3 jours (score neurologique), 60 jours (tests de l’open-field et du labyrinthe de Barnes) et 90 jours (test du labyrinthe de Barnes) après le traumatisme crânien, mais également chez les souris contrôles n’ayant pas subi de traumatisme crânien. Le score neurologique, qui évalue les réflexes des souris, dure 2 minutes. Le test de l’open-field, qui évalue les comportements exploratoires des souris, dure 9 minutes. Le test du labyrinthe de Barnes, qui évalue l’apprentissage et la mémoire spatiale des souris, comprend une phase d'apprentissage durant 3 jours consécutifs (3 essais de 3 minutes maximum/jour ; le délai entre 2 essais est de 1 à 2 heures) avant de réaliser le test le 4e jour (une minute). • A la fin du projet toutes les souris seront mises à mort par exsanguination par perfusion intracardiaque de sérum physiologique sous anesthésie générale. La réalisation de cette perfusion nécessite 7-8 minutes. L’anesthésique sera administré sur animal vigile par voie intrapéritonéale en moins d’une minute et cette injection sera précédée 30 minutes avant de l’administration par voie sous-cutanée d’un analgésique en moins d’1 minute.

Impact sur les animaux

L'induction du traumatisme crânien peut entraîner une diminution temporaire de la prise alimentaire et d'eau (légère perte de poids durant les premières 48 h après le traumatisme crânien avec une récupération du poids initial au bout de 4 jours) . La contention des souris pour réaliser les injections sous-cutanées ou intrapéritonéales peut induire un stress correspondant à la durée du geste, c’est-à-dire moins d’1 minute.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort et leurs cerveaux seront prélevés pour réaliser différentes analyses.

Remplacement

Les mécanismes impliqués dans les lésions cérébrales induites par le traumatisme crânien mettent en jeu plusieurs types cellulaires dans différentes structures cérébrales qu’il est impossible de reproduire in vitro. Il est donc indispensable d’avoir recours à l’animal, afin de reproduire la pathologie humaine. De plus, les déficits comportementaux et les lésions cérébrales ne peuvent être évalués chez l'animal entier.

Réduction

Le faible taux d'échec (10%) des gestes pour réaliser le traumatisme crânien, ainsi que la bonne connaissance de la temporalité des mécanismes induits après le traumatisme crânien (activation microgliale, démyélinisation, détection des débris de myéline, déficits comportementaux, lésions de la substance blache) permettront de réduire le nombre d'animaux au minimum. Notre recul sur le modèle de traumatisme crânine nous permettant de déterminer au plus juste la taille des groupes d’animaux à utiliser, aucun test statistique ne sera utilisé pour déterminer le nombre d’animaux par groupe. Ce nombre d'animaux sera suffisant pour appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions pour analyser les résulats obtenus.

Raffinement

L'eau et la nourriture seront fournies à volonté et le milieu sera enrichi par des cotons compactés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables, afin de limiter tout stress et modification de hiérarchie. Afin de s'assurer du bien-être animal, l'intervention chirurgicale permettant de réaliser le traumatisme crânien sera réalisée sous anesthésie générale et un analgésique sera donné en pré- et post-opératoire, afin de limiter la souffrance des animaux. La mise en place de points limites et l'observation du comportement des animaux permettront d'identifier toute souffrance et douleur, et d'entraîner une mise à mort anticipée, si nécessaire. Pour pallier la déshydratation pouvant survenir à la suite du traumatisme crânien, les souris recevront une injection de sérum physiologique par voie sous-cutanée, matin et soir, durant 2 jours, à compter du jour du traumatisme crânien. . De plus, afin de faciliter l’accès à la nourriture, quelques croquettes seront déposées directement sur le fond de la cage des souris durant 2 jours, à compter du jour du traumatisme crânien.

Choix des espèces

Au vu de la littérature, la souris est l’espèce la plus utilisée pour la réalisation des modèles de traumatisme crânien et offre un large répertoire d’évaluation comportementale. De plus, cette espèce nous permet d’évaluer le rôle de notre protéine d'intérêt grâce à l'utilisation de souris transgéniques. Le traumatisme crânien sera réalisé chez des souris jeunes (6-8 semaines), puisque c'est un évènement fréquent dans cette tranche d'âge chez l'Homme. Les déficits comportementaux seront évalués 3 jours, 2 mois et 3 mois après le traumatisme crânien.

350 souris et rats vont être utilisés dans des procédures de formation impliquant un niveau de souffrance modéré, 65 d'entre eux étant adoptés à l'issue et les autres tués. Pendant environ dix mois, ces animaux sont manipulés de façon répétée par des élèves qui s'entraînent aux gestes de contention, d'injection, de gavage et de prélèvement sanguin, avec de l'eau ou du sérum physiologique. Le porteur reconnaît qu'un geste manqué par un apprenant peut provoquer douleur, lésion d'un organe ou étouffement, pouvant conduire à euthanasier l'animal. Il indique que les animaux sont tués en fin d'année scolaire parce qu'ils vieillissent et deviennent moins féconds, tout en admettant qu'une partie des travaux pratiques peut se faire sans animaux vivants.

Objectifs

La formation des professionnels de l’expérimentation animale, comme les techniciens aanimaliers, nécessite un apprentissage de bonnes pratiques en matière de soins, de contention, d’injection et de prélèvementsur les principales espèces utilisées . L’équipe enseignante de notre établissement a conçu une animalerie qui permet aux élèves du cursus professionnel de notre établissement d’apprendre et parfaire ces gestes » Les procédures réalisées dans le cadre de ce projet doivent permettre aux élèves de maitriser petit à petit les gestes techniques nécessaires pour l’utilisation de ces espèces en expérimentation animale dans le milieu professionnel. Au cours de ces manipulations aucun produit médicamenteux ne sera testé. Ce projet permettra également de réaliser les TP demandés dans le cadre de la formation applicateur de procédures expérimentales.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de permettre aux élèves de se familiariser avec les animaux et leur manipulation, en réduisant leur stress, dans un souci de bien-etre animal. Puis de maitriser des gestes techniques nécessaires pour le métier de zootechnicien applicateur de procédures en expérimentation animale, en se formant dans un cadre moins stressant que celui du milieu professionnel, dans le respect du bien-être animal. Enfin, ce projet permet de sensibiliser les apprenants sur l’utilisation et la manipulation des animaux, en tenant compte de la réglementation, de la regle des 3R et de l’éthique.

Procédures

Les animaux sont soumis à des gestes techniques de base (Injections sous cutanées, intrapéritonéales, intraveineuses, intramusculaires, intradermiques de serum physiologique, faibles volumes), gavage et prélévements sanguins (volume réduit), dans l'objectif que les apprenants se forment aux gestes techniques. Les animaux concernés sont des souris et des rats. Ils sont gardés sur l’ensemble de la procédure, environ 10 mois, avec 42 TP (cours de Travaux Pratiques) dont 11 d’habituation et 31 de gestes techniques (19 sur les souris et 12 sur les rats). Chaque TP dure environ 1h30. Chaque animal subit au cours du TP au maximum 2 interventions, puis reste au repos pendant environ 2 semaines. Une séance de TP dure 3h au maximum. Chaque geste dure au maximum une minute pendant laquelle l'animal est contenu et où on administre un produit ou un prélève du sang.

Impact sur les animaux

Les administrations sont réalisées en utilisant de l’eau (pour les gavages) ou du serum physiologique (pour les injections), qui sont des produits sans risques d’effets secondaires majeurs sur la santé des animaux. De plus, un animal subit au maximum 2 interventions par TP. Cependant, il est possible pour les apprenants de ne pas réussir le geste et donc de provoquer une douleur pour l’animal, lors des manipulations (injections ou prélèvements). Une mauvaise maitrise du geste peut induire des effets indésirables (douleur, stress, lésion d’un organe, étouffement ... ) et peut conduire, si necessaire, le formateur à euthanasier l’animal (par dislocation cervicale ou surdose d’anesthésiant).

Devenir

Tous les animaux utilisés pour l’ensemble des TP et manipulations de l’année scolaire sont gardés en vie, sauf exceptions des animaux qui montrent des signes cliniques nécessitant leur euthanasie. Après environ les 10 mois de procédure, apres les 42 TP prévus annuellement, nous estimons que les animaux commencent à vieillir et ont subi suffisamment de manipulations et gestes techniques. De plus ils deviennent moins fertiles (âges et proximité génétique) et donc ne peuvent pas constituer notre pool de reproducteurs de l’année suivante. Les animaux sont donc euthanasiés et les cadavres sont congélés et gardés pour les TP de dissection.

Remplacement

Pour ce projet, il est difficile de remplacer l'animal vivant par une méthode alternative, puisque l'objet de ce projet est de familiariser les apprenants à la manipulation, contention des animaux et de les former aux gestes techniques sur les rongeurs vivants. Par contre, un certain nombre de TP (entrainement à la manipulation de seringues, aiguilles, préparation de volume d'injection) ne nécessitent pas de travailler sur des animaux vivants. Certains TP préparatoires se font sur des modèles non vivants (organe isolé ou cadavres). Un Tp est réalisé en salle de simulation aux gestes techniques.

Réduction

La réduction du nombre d’animaux utilisés ou produits passe par une bonne gestion de notre élevage pour ne pas avoir d’animaux surnuméraires (une seule reproduction des animaux dans l’année). Nous récupérons également des animaux surnuméraires d’éleveurs agréés ou d’animaux en fin d’étude (replacement), pour éviter de reproduire nos animaux ou d’acheter de nouveaux animaux. D'autre part, pour nos TP, nous n'utilisons que le strict nécessaire d'animaux : suffisamment pour que les élèves puissent apprendre le geste en le réalisant correctement une fois durant la séance de TP, mais pas plus. Nos TP ne consistent pas à faire enchainer les gestes par les élèves.

Raffinement

Le raffinement passe par plusieurs étapes qui précèdent la réalisation de gestes techniques sur modèles vivants : la visualisation de vidéos sur les gestes techniques (observation et analyse des points critiques), l'identification et la mise en oeuvre des moyens pour réduire la douleur (anesthésique local, tranquilisant, acclimatation des animaux avant TP...), l'habituation des animaux aux gestes techniques par la méthode dite « tickling » par exemple, la mise en place de renforcement positif (interactions positives systematiques avec l’animal avant et apres manipulation ...), la vérification de la qualité des injections (sur aniamux morts, injection de bleu de méthylène), la présentation des méthodes d’imagerie, la proposition de plusieurs méthodes de contention (choix de la méthode pour améliorer à la fois le bien être de l’animal et celui de l’animalier, l’amélioration de l’enrichissement du milieu, la fréquence de manipulation des animaux (sans gestes techniques) pour diminuer leur stress lors des TP.

Choix des espèces

Les rongeurs (rats et souris) sont les espèces les plus utilisées dans les animaleries de laboratoires où les élèves sont en apprentissage. Le reférentiel de la formation Bac pro TEA, ainsi que la formation reglementaire applicateur de procédures expérimentales demandent à ce que les jeunes soient formés sur ces espèces. Ces espèces sont faciles à élever, à héberger, à reproduire, à manipuler. Les élèves apprécient de travailler avec ces espèces avec lesquelles ils peuvent interagir facilement et moins chargées émotionnement, pour eux, que les animaux de compagnie courants comme les chiens et chats. Les rongeurs sont achetés chez les eleveurs à l’âge de 7 à 8 semaines (à maturité sexuelle) puisqu’ils sont mis en reproduction après 1 semaine d’acclimatation. Les animaux issus de cette reproduction constitueront notre pool d’animaux de TP (sexage et sevrage à environ 3 semaines, manipulation et gestes techniques à partir de 6 semaines). Au total, par année scolaire, 42 TP sont réalisés répartis entre le 2ndes, 1ères et terminales Bac pro TEA. 11 TP concernent uniquement la reception et l’installation des animaux, leur mise en reproduction et l’entrainement sur la contention. Sur les 31 autres TP, 21 sont sur l’espèce souris et 10 sur les rats. Pour les souris, chaque animal est donc manipulé environ 21 fois, soit 1 fois toutes les 2 semaines. Chaque rat est donc utilisé 10 fois, soit 1 fois toutes les 3 semaines.

708 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales en sous-cutané puis des injections d'un virus candidat médicament dans la tumeur, avec deux prélèvements sanguins, pour en suivre l'effet sur la croissance tumorale. Le porteur anticipe l'apparition de tumeurs pouvant entraîner perte de poids, mobilité réduite et défaut de toilettage sur une durée maximale de soixante jours. Il affirme qu'aucun modèle non animal ne reproduit la mise en place des tumeurs, les souris étant tuées au terme et non réutilisables du fait des virus présents dans leur organisme.

Objectifs

Dans le domaine de la recherche en oncologie, l'utilisation de virus thérapeutiques est devenue l'une des principaux axes de recherche. En effet, cette stratégie permet une approche ciblée sur des marqueurs spécifiques des tumeurs et ainsi une attaque focalisée des cellules malades. Dans ce cadre, de nombreux candidats viraux sont testés afin de déterminer l'approche la plus efficace. Ce projet vise ainsi à mettre en évidence l'effet d'un candidat virus sur une lignée de tumeur greffées en sous-cutanée dans un modèle de Souris. Les effets seront suivis sur la croissance tumorale mais aussi sur les facteurs circulant au niveau sanguin. Les données générées nous permettront d'améliorer notre compréhension des mécanismes d'action dans un organisme complexe et de poursuivre le développement de ce candidat en déterminant sa chronologie d'action et son efficacité en fonction de la vitesse de croissance tumorale. Cette dernière sera liée à la quantité de cellules tumorales que nous allons greffer.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer notre compréhension des effets de candidats virus sur une lignée tumorale. Nous pourrons ainsi comprendre leurs capacités d'action et l'impact de leur injection sur des lignée tumorales déjà installées. Cette connaissance nous permettra de mettre en place des virus thérapeutiques permettant de soigner certaines tumeurs chez l'Homme.

Procédures

Les animaux subiront une greffe de cellules tumorales par injection sous-cutanée. Celle-ci déclenchera une altération de la capacité de mouvement et une potentielle dégradation de l'état général des animaux. Par la suite, des injections tumorales de virus seront pratiquées. Ces différentes injections sont effectuées en quelques minutes. Deux prélèvements sanguins seront aussi effectués, chacun durant quelques minutes.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous anticipons l'apparition de tumeurs sous-cutanées, qui pourra déclencher une éventuelle perte de poids, une mobilité réduite, un mauvais toilettage. Ce protocole aura une durée maximale de 60 jours.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à J60 ou à l'atteinte d'un point limite. Ils ne sont pas réutilisables du fait de la présence de cellules tumorales et de virus thérapeutiques dans leur organisme.

Remplacement

L'étude de l'effet thérapeutique de candidats médicaments sur des processus complexes tels que l'oncologie ne peut se faire sans l'utilisation de modèles animaux. En effet, il n'existe pas actuellement de modèle non animaux permettant de récapituler l'ensemble des mécanismes physiologiques complexe à l'oeuvre dans la mise en place de tumeurs ou la réponse immunologique associée.

Réduction

Ce projet a été mise en place en réduisant autant que possible la taille des groupes expérimentaux. Ainsi, nos connaissances des modèles tumoraux sous-cutanés chez la Souris nous permettent de dimensionner une première étude avec des groupes de 12 animaux par condition. Cet effectif nous permettra de disposer de conclusions statistiquement relevantes. Nous mesurerons les tailles de tumeurs et le poids de manière répétées. Grâce à ces données, nous réaliserons ensuite les études successives impliquant les virus thérapeutiques avec un nombre d'animaux optimal. Le maximum sera de 12 animaux mais si l'étude statistique nous permet de réduire ce nombre, nous essaierons autant que possible d'y procéder.

Raffinement

Les animaux seront placés dans les conditions optimales d'hébergement. Nous injecterons les cellules tumorales sur le flanc. Ensuite l'apparition de tumeurs et leurs croissances seront mesurées trois fois par semaine afin de suivre la progression ainsi que l'effet possible du virus candidat sur celle-ci. Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique à température. Nous suivrons à chaque pesée l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation, les sites d'injection et l'aspect des tumeurs. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer la mise à mort de l'animal pour éviter toute souffrance.En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. Le cas échéant, des soins locaux par spray de dermidine(R) seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommendations vétérinaires.

Choix des espèces

Le modèle Souris constitue un bon modèle pour l'étude de modèle tumoraux. En effet, il s'agit de mammifère au système immunitaire assez proche de l'Homme pour disposer d'une approche translationnelle valide. Nous analyserons des animaux âgés de 8 semaines au moment de l'injection. A cet âge, le système immunitaire est suffisamment développé.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie créant une lésion partielle du tendon d'Achille ou de la coiffe des rotateurs, pour suivre la cicatrisation à différents temps. Le porteur reconnaît que la douleur post-opératoire peut plonger l'animal dans la prostration et l'isolement, et qu'une infection des sutures est possible. Il affirme que la cicatrisation ne peut être reproduite sur cellules ou explants, les tendons étant prélevés après la mise à mort.

Objectifs

Le projet porte sur l’étude des populations cellulaires impliquées dans la cicatrisation tendineuse. Alors que les lésions tendineuses sont fréquentes et ont un impact sociétal majeur, leur prise en charge reste peu satisfaisante et les mécanismes impliqués dans la cicatrisation tendineuse restent à étudier. La biologie des ténocytes, qui sont les cellules majoritaires du tendon, n'est que partiellement connue et nécessite de nouvelles études pour comprendre les diverses populations présentes au sein du tendon et leurs rôles particuliers. L’objectif de l’étude est de collecter des tendons à différents temps de la cicatrisation après une lésion induite chirurgicalement et d’étudier les changements cellulaires au cours du temps. La technique de séquençage de cellule unique (en anglais, single cell RNA-Sequencing) permet l'analyse de l'information génétique à l'échelle d'une seule cellule. Elle permettra d'identifier dans chaque cellule, l'ensemble des gènes exprimés afin de pouvoir les grouper via leur profil d'expression. La réalisation de marquage ciblant certaines protéines exprimées par les cellules au sein du tissu permettra ensuite de localiser les différents groupes cellulaires au niveau de la zone de cicatrisation. Un groupe de souris subira une chirurgie au niveau du tendon achilléen et un autre groupe de souris subira la chirurgie au niveau des tendons de l'épaule pour étudier les deux sites les plus fréquemment atteints par la tendinopathie chez l'Homme.

Bénéfices attendus

La prise en charge des patients atteints de lésions tendineuses reste à ce jour insuffisante et aucun traitement agissant sur les lésions de tendinopathies n’est disponible. Le tendon est un tissu ayant un faible potentiel de régénération et le manque de connaissance sur la biologie des cellules du tendon (ténocytes) et le processus de cicatrisation tendineuse explique en partie ceci. Le projet permettra d’étudier les différentes populations de cellules impliquées dans la cicatrisation, ceci pouvant apporter de nouvelles pistes pour des approches thérapeutiques régénératives.

Procédures

Les animaux seront soumis à une unique chirurgie consistant en la réalisation d’une lésion tendineuse partielle, dans des conditions d’asepsie strictes, sous anesthésie gazeuse et traitement anti-douleur pré et post-opératoire. La procédure chirurgicale dure environ 10 minutes.

Impact sur les animaux

Dans les trois premiers jours après la chirurgie, si de la douleur est ressentie par l’animal, celui-ci peut entrer dans un état de prostration, s’isoler des autres animaux dans la cage et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Une surveillance quotidienne des animaux pourra permettre de repérer ces comportements et de prolonger le traitement analgésique si nécessaire. De plus, une infection pourrait intervenir au niveau des sutures post-chirurgicales. De façon générale, différents points limites (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué et réponse comportementale aux stimuli) seront attentivement pointés.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tendons et procéder aux analyses.

Remplacement

Les lésions tendineuses sont complexes et impliquent différents compartiments, le tendon lui-même, le péri-tendon, la bourse synoviale (pour l’épaule) et le muscle. Le tissu qui nous intéresse particulièrement ici est le tendon et bien que les ténocytes (principale population cellulaire du tendon) ou des explants tendineux puissent être utilisée en culture, il n’est pas possible de récapituler le phénomène de cicatrisation tel qu’il existe chez l’animal. De plus, la physiologie tendineuse nécessite que le tendon soit soumis à des contraintes mécaniques (tension, friction, compression) et celles-ci ne sont pas reproductibles aisément in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au strict minimum (20 par groupe) mais suffisant pour obtenir suffisamment de matériel cellulaire et pour démontrer des différences statistiquement significatives entre les groupes.

Raffinement

La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de quelques minutes, elle sera effectuée sur tapis chauffant afin d’éviter toute hypothermie éventuelle. Les souris seront ensuite transférées dans une cage également disposée sur tapis chauffant le temps de récupérer suite à ce réveil. Le reste du temps, au maximum 5 souris seront hébergées par cage afin de leur fournir un espace suffisant pour cohabiter sans encombrement et le milieu sera enrichi de litière mais également de dômes et de papier afin d’y construire un nid.

Choix des espèces

La souris est régulièrement utilisée pour des études sur le tendon de par son anatomie proche de celle de l’homme au niveau de la coiffe des rotateurs ou du tendon achilléen. La souris est également largement utilisée pour étudier la cicatrisation tendineuse et de nombreuses souris génétiquement modifiées sont disponibles pour de futures études. De plus, les coûts d’hébergement de la souris sont moindres qu’avec le rat ou le lapin. Des souris âgées de 16 semaines seront réceptionnées à l’animalerie, considérées comme adultes, afin d’étudier le phénomène de cicatrisation à l’âge où surviennent les lésions tendineuses. Après réception, les souris sont utilisées après une semaine d’acclimatation (17 semaines).

195 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous subissent une chirurgie cérébrale sous anesthésie et une IRM, une partie enchaînant une batterie de tests comportementaux étalée sur trois semaines, dont le détail n'est pas précisé, pour modéliser une démence vasculaire par microinfarctus. Le porteur indique que les nuisances tiennent surtout à la chirurgie, douloureuse, et que l'IRM sous anesthésie peut provoquer détresse respiratoire et hypothermie. Il affirme qu'un tel projet de neurosciences intégratives ne peut être mené in vitro, le cerveau étant prélevé après la mise à mort.

Objectifs

L’incidence des démences augmente progressivement avec l’âge à partir de 65 ans et atteint 28,5% de la population après 90 ans, dont 20% des formes sont dites « vasculaires ». La démence vasculaire est caractérisée par un déclin lent et progressif de la mémoire, de la pensée, du jugement et de l’apprentissage, dû à un défaut d’apport sanguin. Diagnostiquée radiologiquement, la maladie vasculaire cérébrale comprends deux types de lésions tissulaires qui sont majoritairement retrouvées chez les patients atteints : (i) les micro-infarctus, et (ii) les lésions lacunaires, caractérisées par une absence de tissu. Les études post-mortem indiquent que 64% des patients déments vasculaires présentent ces lésions, contre 24% dans la population générale. Ces deux lésions sont engendrées par l’occlusion, transitoire ou définitive, d’artères cérébrales. Les vaisseaux concernés sont des artères qui partent de l’extérieur du cerveau (cortex) pour en gagner le centre, la substance blanche, constituée de faisceaux de fibres nerveuses. Outre les conséquences locales sur la structure cérébrale, les lésions entraînent chez l’Humain une désorganisation des tissus, une diminution des zones contrôlant les fonctions et des altérations du fonctionnement de certains structures. Les modèles génétiques de la maladie sont peu reproductibles et pas adaptés à l’étude radiologique. Les modèles préexistants comme les injections carotidiennes de particules synthétiques provoquent principalement des lésions lacunaires, et la destruction d'artères par laser nécessite une technologie peu accessible. Aussi, les objectifs du projet sont : (i) d'établir un nouveau modèle de microembolies (caillots sanguins) cérébrales chez le rat permettant la génération des microinfarctus, se rapprochant ainsi de la physiopathologie de la démence vasculaire humaine, et (ii) de comparer ce modèle aux données de la clinique humaine en imagerie par IRM, en histologie, par des tests de mémoire et de comportement (anxiété et dépression). Des outils pharmacologiques (antidépresseur, anxiolytique) seront administrés aux animaux pour ce dernier volet lors des tests de dépression et d’anxiété.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux appréhender les mécanismes d'apparition des troubles fonctionnels, neurocomportemenaux et cognitifs dans la pathologie microembolique cérébrale, d'en évaluer leur rôles dans l'évolution vers la démence cérébrale, et d'y tester des approches thérapeutiques. Ce modèle à l'avantage d'utiliser des thrombus naturels, qui n'ont jamais été utilisés jusqu'à présent et se rapprochant donc de la clinique humaine.

Procédures

Tous les animaux subissent : une chirurgie sous anesthésie générale de 20 minutes, une IRM post-chirurgie d'une heure sous anesthésie générale, une ponction de LCR sous anesthésie léthale. Les animaux de la procédure 2 subissent, en sus : une batterie de test comportementaux répartis sur 3 semaines, à raison de 1 test par jour d'une durée variable de 10 à 120 minutes. Cette batterie est appliquée à J0 et à 3 mois post chirurgie; Une IRM d'une heure sous anesthésie générale. Pendant les tests comportementaux, 45 animaux receveront une dose unique de carbamazépine avant chaque test, 45 autres animaux receveront une dose unique de desipramine avant chaque test.

Impact sur les animaux

Les nuisances sur les animaux seront essentiellement dues à la chirurgie, qui entrainera une douleur, et la pathologie qui peut entrainer les troubles fonctionnels. L'imagerie en IRM sous anesthésie peut provoquer des détresses respiratoires et une hypothermie chez certains animaux. Les évaluations comportementales n'induisent pas de perturbation en elles-mêmes. De potentiels effets indésirables peuvent apparaitre en fonction des traitements administrés. Ils seront analysés au cas par cas.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort afin de permettre le prélèvement du cerveau pour en étudier les modifications au niveau cellulaire et moléculaire.

Remplacement

Il s'agit d'un projet portant sur l'impact de microembolies sur le fonctionnement cérébral et l'apparition de toubles comportementaux, un tel projet de neurosciences intégratives ne peut pas être mené avec des méthodes alternatives in vitro et nécessite l'utilisation d'un modèle animal.

Réduction

L’ensemble des procédures expérimentales nécessaires à l’accomplissement de ces études requiert un nombre total de 195 animaux. Le nombre minimal nécessaire d'animaux a été défini pour assurer la validité scientifique et statistique des résultats (différences statistiquement observables entre les animaux traités et les animaux contrôles). Les études neurocomportementales et la réponse aux différentes conditions présentent une certaine hétérogénéité qui nécessite d'avoir un nombre d'animaux suffisant par lot ainsi que plusieurs lots pour valider les résultats. Les données et les analyses statistiques sont conformes aux recommandations sur la conception expérimentale et l'analyse en pharmacologie. L'utilisation de l'imagerie par résonnance magnétique permet un suivi non invasif des lésions et de fait, l'économie de 135 animaux.

Raffinement

Dans tous les cas, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux, et en étant particulièrement vigilant sur les points limites afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les conditions d'hébergement sont optimisées avec un environnement contrôlé (température, pression, humidité de l'air), avec enrichissement. Des mesures de cocooning seront mise en place afin de diminuer au maximum la douleur, et l'anxiété des animaux. Des mesures de surveillances post-anesthésiques seront mise en place afin de s'assurer que les animaux ne présentent pas de stress majeur dans les 48 heures suivants la chirurgie à raison de 2 visites par jours, les animaux seront ensuites évalués une fois par jour. De potentiels effets indésirables peuvent apparaitre en fonction des traitements administrés. Ils seront analysés au cas par cas, et les animaux seront mis à mort en fonction des points limites décrits.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des espèces très employées dans le cadre de l'étude des maladies neurodégénératives. Les caractéristiques anatomiques et physiologiques vasculaires sont similaires à celle de l'Humain. Les rats ont une taille d'encéphale permettant une étude approfondie en imagerie. Les animaux de la phase 1 de l'étude seront inclus à l'äge de 10 semaines. Les animaux de la phase 2 seront inclus à l'âge de 6 semaines. Compte tenu du conditionnement opérant d'un mois pour le test du Touchscreen, ils seront ainsi opérés à l'âge de 10 semaines.

1 864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un œil reçoit des impacts laser sous anesthésie, provoquant une cécité partielle, puis des injections intraoculaires d'anti-VEGF et de molécules inflammatoires, tandis qu'un complément enrichi en polyphénols leur est administré par gavage pendant quarante-deux jours. Le porteur affirme n'impacter qu'un seul œil pour éviter la cécité totale et juge les supplémentations sans effet indésirable d'après des tests antérieurs. Il indique que ces compléments, déjà testés sur cellules rétiniennes, doivent être évalués sur l'ensemble de la rétine, les organes étant prélevés après la mise à mort.

Objectifs

La Dégénérescence Maculaire Liées à l’Age (DMLA) est la première cause de la perte partielle de la vision centrale chez les plus de 50 ans dans les pays industrialisés. La DMLA ne rend pas complétement aveugle mais reste très invalidante. Elle se traduit par une dégradation d’une partie de la rétine responsable de la vision haute définition et en couleur. La forme la plus sévère est la forme humide caractérisée par une formation excessive de vaisseaux sanguins. La phase précoce de la DMLA est caractérisée par un contexte de stress oxydant qui participe à la mise en place d’un stress inflammatoire favorisant la création de nouveau vaisseaux (néoangiogenèse). Ces néovaisseaux sont désorganisés et de mauvaises qualités, ce qui entraîne d’éventuelles hémorragies rétiniennes. Ils sont à l’origine d’une accumulation de liquide au niveau de l’épithélium rétinien entrainant une désorganisation des photorécepteurs et un décollement de la rétine, ce qui provoque une perte partielle de la vision centrale. Le traitement principal consiste en des injections dans l’œil d’anticorps permettant de contrecarrer l’action d’une molécule appelée VEGF qui favorise la néoangiogenèse. S’il permet de retarder l’évolution de la maladie, ce traitement n’est aucunement curatif et certains patients acquièrent une résistance aux anti-VEGF entrainant une perte de leur efficacité. Il est nécessaire de développer de nouvelles approches thérapeutiques permettant de prévenir la survenue de résistance et/ou d’améliorer les thérapies actuelles. La prise de compléments alimentaires riches en anti-oxydants tels que les oméga-3 ou encore les polyphénols est recommandée aux patients souffrant de DMLA de manière à diminuer son développement. Les polyphénols possèdent aussi des propriétés anti-angiogéniques démontrées dans le cadre de cancers. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’identifier si différentes supplémentations en polyphénols et/ou oméga-3 pourraient prévenir ou retarder la progression de la DMLA, dans un contexte pro-inflammatoire induit (Lipopolysaccharide) ou non. Pour cela, le modèle murin de néovascularisation choroïdienne, induit par impact laser dirigé contre la rétine et classiquement décrit dans la littérature pour mimer le phénotype de la DMLA, sera utilisé pour identifier de possibles nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’identifier les compositions de supplémentations polyphénoliques les plus prometteuses dans la lutte contre la DMLA et de déterminer la fréquence de supplémentations ainsi que les doses nécessaires afin d’obtenir un effet bénéfique lors de leur utilisation seules ou en combinaison avec les traitements actuels anti-VEGF. Si les supplémentations s’avèrent accroitre l’efficacité du traitement anti-VEGF dans le temps, ce projet pourrait faire émerger de nouveaux schémas thérapeutiques incluant des traitements nutritionnels en combinaison avec des injections d’anti-VEGF et notamment suggérer qu’avec certaines supplémentations un espacement entre ces injections est possible, tout en préservant l’efficacité du traitement. Ce serait d’autant plus précieux puisque ces injections d’anti-VEGF sont coûteuses et que leur trop grande fréquence est une contrainte majeure dans le parcours de soin des patients et augmente le risque de phénomènes de résistance. Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent l’efficacité de ces supplémentations. Les différents prélèvements d’organes ou de sang vont permettre de savoir si les différents agents, extraits et formulations sont capables de franchir la barrière hémato-encéphalique, s’accumuler dans la rétine (en globalité ou seulement certains de leur composants ou métabolites) et s’ils ont un effet protecteur global. De plus, des analyses protéiques et transcriptomiques de ces échantillons permettront d’analyser les mécanismes moléculaires responsables des effets bénéfiques des différentes supplémentations, effets anti-inflammatoires y compris.

Procédures

Tous les animaux seront soumis qu’à 3 types d’interventions. Afin de mimer la maladie, les animaux seront soumis à une séance d’impact laser touchant qu’un seul œil et durant laquelle les animaux seront anesthésiés. L’anesthésie sera réalisée par injection intrapéritonéale de kétamine, injection qui durera environ 5 secondes. Les souris resteront anesthésiées pendant 30 minutes, période au cours de laquelle elles recevront des impacts laser durant 30 secondes. Elles seront soumises, toujours sous anesthésie, à des injections intraoculaires d’anti VEGF (soit une injection à J31 soit 2 injections à J31 et J42) et de molécules conduisant à l’inflammation (une injection à J31) ou de solvant contrôle, et ce uniquement dans l’œil ayant reçu les impacts laser. Chaque injection durera 5 secondes. Enfin, il leur sera administré quotidiennement par gavage ou par alimentation des supplémentations ou des solvants contrôles pendant 42 jours. Seule cette dernière procédure sera réalisée sur animal vigile et durera 10 secondes lors des gavages et jusqu’à 30 minutes lors de l’administration à l’aide d’une croquette appétente. L’implantation de mini-pompes osmotiques sera réalisée par un personnel qualifié, avec du matériel chirurgical stérile, et se fera selon une procédure de chirurgie au niveau abdominal de 336 souris préalablement anesthésiées. La durée de la chirurgie est estimée à 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales ont été définies de manière à minimiser les dommages, souffrances, douleurs et angoisse. Supplémentation : l’innocuité des différentes supplémentations ont déjà été testées sur des modèles murins, elles n’induisaient pas d’effet indésirable. Impacts Laser : Les impacts lasers induisent une cécité partielle (atteinte de la vision centrale). Le fait de n’impacter qu’un seul des 2 yeux permet d’éviter la cécité totale. Cette pratique clinique est couramment utilisée chez l’Homme souffrant de pathologies rétiniennes et ne nécessite ni anesthésie générale ni prise d’antalgique. Cependant, tout animal sur lequel nous aurons induit une NVC à un œil et qui présenterait une anomalie sévère sur l’œil controlatéral (cataracte, kératite sévère) sera systématiquement mis à mort. Nous impacterons un seul œil ceci en pleine conformités avec les règles d’utilisation des animaux pour la recherche en ophtalmologie (directives de l’ARVO), qui interdisent l’intervention sur les 2 yeux d’un même animal. Implantation de mini-pompes osmotiques au niveau abdominal et traitement LPS : Des effets secondaires pourront être observés tels que des signes de fatigue, des diarrhées et une perte de poids. L’état générale des animaux sera évalué de manière journalière. De plus, tout animal présentant des signes de souffrance extrême tels qu’une perte de poids de plus de 20 % en 72 h sera mis à mort. Traitement intravitréen d’anti-VEGF et de LPS : Les effets secondaire associés aux injections intravitréennes d’anti-VEGF pourront être observés tels que l’apparition d’une cataracte ou kératite sévère. Tout animal sur lequel un œil présenterait une anomalie sévère (cataracte, kératite sévère) sera systématiquement mis à mort.

Devenir

Afin de prélever différents organes pour réaliser nos différentes analyses, tous les animaux serons mis à mort à l’issue de chaque expérience.

Remplacement

Les différentes supplémentations utilisées dans cette étude ont déjà fait l’objet d’études in vitro ayant démontrées leurs bénéfices sur une lignée cellulaire rétinienne humaine. Cependant, ces études ne montrent des résultats que sur des cellules séparées de leur environnement d’origine au sein de la rétine. Le modèle animal nous permet d’étudier l’impact de nos supplémentations sur l’ensemble de la rétine. Le modèle animal nous permettra d’étudier l’impact de nos supplémentations sur l’ensemble de la rétine. De plus, un de nos objectifs est de détecter et mesurer les taux de métabolites, ce qui est possible uniquement sur modèle animal car il est nécessaire d’avoir l’effet de premier passage hépatique. Les études sur lignées cellulaires ou encore sur des organoïdes de rétines ne nous permettraient pas d’étudier ce mécanisme. Des études précliniques avec des animaux sont incontournables pour la finalité de ce projet puisqu’il est nécessaire de considérer l’aspect pharmacocinétique et pharmacodynamique des molécules de nos différentes supplémentations incluant le processus de transformation de ces molécules par l’organisme (pouvant conduire à une augmentation de leur efficacité ou bien une perte de leur efficacité). Notre projet vise également à étudier l’impact de nos supplémentations sur l’inflammation aussi bien au niveau de la rétine qu’au niveau systémique. Si les études sur des macrophages primaires humains isolés nous permettent d’apprécier la capacité des supplémentations à diminuer l’inflammation produite par ce type cellulaire, elles ne nous permettent pas pour autant d’étudier l’inflammation au niveau systémique d’où la nécessité d’utiliser un modèle animal.

Réduction

L’induction par impact laser du modèle de murin de DMLA utilisée dans ce projet ainsi que les méthodes de suivi de l’angiogenèse associées sont parfaitement maitrisées au sein de notre équipe, évitant ainsi de réaliser des étapes de mises au point supplémentaires et, par conséquent, l’utilisation d’un trop grand nombre d’animaux. Dans le cadre de manipulations in vivo antérieures à ce projet, la majorité des supplémentations décrites dans ce nouveau projet ont déjà fait preuve d’une certaine efficacité dans un contexte de DMLA quand elles sont utilisées seules. Comme précédemment mentionné, cela permet d’avoir déjà des schémas de traitement (doses, fréquence) fiables et ainsi d’éviter la réalisation de mises au point supplémentaires et de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour ce projet. La maladie sera mimée sur un seul œil (droit) ce qui permettra d’utiliser le second d’œil (gauche) comme contrôle (sans NVC, sans traitement avec LPS et anti-VEGF) et ainsi de réduire le nombre d’individus utilisés. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminer de façon à avoir le minium d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statiquement analysables.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe (entre 3 et 10 animaux par cage) pour favoriser les contacts sociaux, avec un enrichissement du milieu approprié et nécessaire à leur bien-être, à savoir par cage : des objets et des jouets leur permettant de se cacher, de maintenir une activité et de développer leur répertoire comportemental. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Si les points limites que nous avons établis sont atteints, les souris seront mises à mort selon la méthode choisie. Après chaque procédure nécessitant une anesthésie (séance d’impact laser, injection intravitréenne, incision abdominale), nous instillerons une goutte de gel de méthylcellulose (Methocel® 2%) sur chaque œil afin d’éviter tout dessèchement de l’œil pouvant favoriser l’apparition d’une inflammation de la cornée non souhaitée. Les animaux seront ensuite replacés par groupe dans une cage de réveil sous conditions optimales de température et d’hygrométrie (respectivement 23°C et 55%). L’état des animaux sera évalué chaque 15 minutes jusqu’à leur réveil, puis toutes les 12 heures pendant les 36 heures suivantes.

Choix des espèces

La littérature justifie pleinement l’utilisation de la NVC induite par laser chez la souris pour mimer et étudier la DMLA in vivo et identifier à la fois les facteurs promouvant la maladie et l’impact bénéfique possible de traitements utilisés seuls ou en combinaison. Bien que d’autres modèles mimant la DMLA chez l’animal existe, le modèle de NVC est recommandé pour faire de la recherche à haut débit d’un grand nombre de molécules ou de formulations complexes pouvant aboutir à une utilisation chez l’Homme. Il est important de conserver ce modèle d’étude de la DMLA car il a déjà été démontré un potentiel santé du Resvega® et du Nutrof® à partir de ce même modèle. Ce nouveau projet nous permettra d’accroitre nos connaissances sur les différentes supplémentations en combinaison avec les anti-VEGF afin d’optimiser les traitements actuels utilisé chez l’Homme. Pour ce projet, nous utiliserons des souris de 8 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal et d’un poids minimum de 20 g. Nous pouvons considérer qu’à ce stade les souris ont acquis une maturité physiologique, ainsi qu’une maturité de l’acuité visuelle.