Procédures modérées

441 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie des mâles subit une ablation des testicules sous anesthésie, toutes sont infectées par un ver intestinal avec prélèvements sanguins répétés, puis euthanasiées quatorze jours après l'infection pour analyser la charge parasitaire et la réponse immunitaire. Le porteur indique que la chirurgie peut induire de faibles douleurs abdominales et affirme que le parasite, éliminé naturellement par les animaux, ne s'accompagne pas de douleur. Il conclut que la coordination des cellules immunitaires dans plusieurs organes ne peut être reproduite in vitro.

Objectifs

Comme c'est le cas pour la plupart des infections microbiennes, les individus mâles éliminent plus difficilement les parasites que les femelles. Les objectifs de notre projet seront d'identifier les mécanismes biologiques à l'origine de la plus grande susceptibilité des mâles à des infections par des parasites intestinaux. Nous évaluerons si la réponse immunitaire anti-parasitaire est différente entre les souris mâles et les femelles lorsqu'ils sont infectés avec le ver intestinal Strongyloïdes Ratti. Nous étudierons si les hormones sexuelles mâles, les androgènes, influencent la réponse immunitaire anti-parasitaire en particulier en régulant une population immune clé dans l'élimination des parasites, les cellules lymphoïdes innées de type 2.

Bénéfices attendus

La prise en compte des différences liées les sexes dans la santé et la maladie a toujours été négligée, voire intentionnellement mise de côté. Cependant, à l'ère du développement d'approches thérapeutiques personnalisées, il est essentiel de considérer le sexe comme une variable critique pour les maladies infectieuses. Connaître les mécanismes à l'origine des biais de sexe dans l'immunité permettra non seulement une meilleure connaissance physiopathologique des maladies chez les hommes et les femmes mais aussi le développement de nouvelles pistes thérapeutiques. Ce projet permettra de contribuer à identifier les mécanismes à l'origine de la plus grande susceptibilité des individus mâles aux maladies parasitaires.

Procédures

Une partie des animaux sera orchidectomisée (ablation des testicules) afin d'éliminer la source principale de production des androgènes (durée de l'opération = 5 min/souris). L'opération aura lieu sous anesthésie générale (l'animal est anesthésié pendant 60 min environ par une injection qui dure moins de 10 secondes). Toutes les souris seront infectées avec le parasite S. ratti (durée de l'infection = 1 min). Leur sang sera aussi prélevé à jour 0, 6 et 12 post-infection (durée de la prise de sang = moins d'1 min). L'infection et le prélèvement de sang auront lieu sous anesthésie gazeuse (durée de l'anesthésie = 2 min). Nombre total d'interventions chez les animaux non castrés = 4. Nombre total d'interventions chez les animaux castrés = 6

Impact sur les animaux

Les animaux récupèrent parfaitement d'une orchidectomie. Cependant, la chirurgie peut induire de faibles douleurs abdominales post-opératoires. Le parasite qui sera administré est naturellement éliminé par les animaux immuno-compétents qui seront utilisés dans ce projet. Son administration ne s'accompagne pas de douleurs chez les animaux.

Devenir

A l'issue de l'orchidectomie, les souris mâles castrés ainsi que d'autres lots d'animaux seront infectés par le parasite s.ratti. 14 jours après l'infection, toutes les souris seront euthanasiées. Les souris seront euthanasiées afin que nous prélevions et analysions dans les tissus (intestin, poumons) la charge parasitaire ainsi que le niveau d'inflammation et la réponse immunitaire induite par le parasite.

Remplacement

Les mécanismes de défense mis en place pour éliminer les parasites sont complexes. Ils nécessitent l'implication de plusieurs types de cellules immunitaires qui agissent de manière coordonnée et séquentielle avec des cinétiques précises dans différents organes (Intestins, poumons). Ces différentes étapes ne peuvent donc pas être reproduites in vitro.

Réduction

Les calculs de puissance statistique pour obtenir des résultats interprétables et reproductibles ont mis en évidence qu'un nombre de 7 animaux par groupe est requis. Nous répéterons les expériences 3 fois. Nous essayons d'effectuer le maximum d'analyse sur le même animal : analyse des tissus inflammés par histologie, analyse en cytométrie en flux pour analyser la nature, le phenotype et la fonctionnalité des cellules immunitaires infiltrant les tissus post-mortem et prélevements sanguins et de fèces au cours du temps pour évaluer l'inflammation et la charge parasitaire sur animal vivant.

Raffinement

Ce modèle n'induit généralement pas de dommages chez la souris qui, lorqu'elle est immuno-compétente comme c'est le cas avec les animaux ici utilisés, est capable d'éliminer complètement le ver. Les souris infectées ne perdent généralement pas de poids et n'ont pas de signes de douleurs apparentes. Cependant, les animaux seront attentivement observés après l'infection. Le poids des animaux sera mesuré et si les souris devaient perdre 20% de leur poids initial ou si nous observons des signes de douleurs apparentes (isolement, baisse importante de l'activité, posture voûtée ou prostrée, pilo-érection, absence de toilettage), l'animal sera mis à mort. Le même soin sera apporté aux animaux ayant subi une orchidectomie qui est cependant une procédure dont les animaux se remettent parfaitement mais qui recevront en complément un bolus d'antalgique en post-opératoire. Les animaux seront placés dans des cages avec enrichissement : igloo/maison, papier kraft pour nidification.

Choix des espèces

Tout comme chez l'Homme, il existe des biais de sexe dans les infections parasitaires chez la souris, les souris mâles étant plus sensibles aux infections. Du point de vue immunitaire, les souris présentent des caractéristiques proches de l'espèce humaine. Nous disposons aussi de modèles murins génétiquement modifiés qui nous permettront d'évaluer de manière directe si la plus grande susceptibilité des mâles à être infectés par un parasite est en partie expliquer par l'inhibition de la réponse immunitaire par les androgènes. Une partie des animaux mâles sera orchidectomisée autour de 4-5 semaines de vie, avant maturité sexuelle. Tous les animaux seront ensuite infectés à l'âge adulte avec les parasites (9-15 semaines).

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome en sous-cutané, puis des séances répétées d'imagerie sous anesthésie et, pour dix d'entre elles, une injection d'immunothérapie, afin de comparer une administration intra-tumorale couplée à un hydrogel à une administration systémique. Le porteur reconnaît un développement tumoral rapide, atteignant des "masses importantes" occasionnant une gêne pour l'animal. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet d'étudier l'effet d'une thérapie sur le développement de tumeurs, les masses étant prélevées après la mise à mort.

Objectifs

L’avènement de l’immunothérapie dans la prise en charge thérapeutique des cancers a permis, en monothérapie ou de manière combinée, l’amélioration de la survie des patients notamment ceux atteints de mélanome. Cependant, cette thérapie lorsqu’administrée en intra veineux est responsable d’effets secondaires systémiques d’ordre immunologique. Pour pallier ces effets secondaires fréquents et parfois sévères, des équipes ont étudié l’injection de l’immunothérapie intra tumorale direct, déjà utilisée dans des études cliniques avec des résultats prometteurs permettant de réduire le nombre d’injection ainsi que les doses utilisées. D’autre part, les propriétés intéressantes des hydrogels thermosensibles telles que la gélification entre 36 et 38°C ainsi que leur dégradation progressive en font un support de choix pour la délivrance ciblée et progressive de drogues intra tumorales permettant de réduire l’élimination sanguine dans ces tumeurs très vascularisées. L’objectif de notre étude est donc de prouver le bénéfice d’une administration intra tumorale de l’hydrogel chargé de l’immunothérapie dans la survie et la réponse tumorale.

Bénéfices attendus

Démontrer l’efficacité d’une administration ciblée et prolongée d’une immunothérapie par couplage avec un hydrogel. Comparer l’efficacité d’une administration intra-tumorale versus systémique. En effet, une thérapie administrée en intra-tumoral permettrait de s’affranchir des effets secondaires consécutifs à une administration systémique.

Procédures

Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie gazeuses (Isoflurane ou sévoflurane). Les 60 animaux de l'étude auront une implantation sous cutanée de suspension cellulaire tumorale. Les 10 animaux du groupe traité par immunothérapie en IP auront une injection IP de 30µL avec une aiguille de 26G. Les 60 animaux seront imagés (TEP, échographie, scanner) tous les 5 jours post-implantation tumorale ou tous les 3 jours post-traitement. L'échographie nécessite 10 minutes d'acquisition, le scanner 5 min et l'imagerie TEP 30min.

Impact sur les animaux

Développement tumoral rapide, atteignant des masses importantes occasionnant une gêne pour l'animal.

Devenir

L'intégralité des animaux utilisés dans ce projet sera mise à mort. Le prélèvement post-mortem des masses tumorales étant nécessaires pour les analyses immunohistochimiques.

Remplacement

Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro ou in silico pour étudier l’impact d’un nouveau médicament / thérapie sur le développement de tumeurs. La souris est un modèle de choix puisqu’elle permet le développement et le suivi de lignées tumorales. L'induction de modèle de mélanome murin chez la souris est une techniques simple et documentée.

Réduction

Sur l’ensemble de ce projet, nous utiliserons au maximum 60 souris âgées d’au moins 7 semaines (jeune adulte). L’imagerie TEP et l’échographie sont des imageries non invasives qui permettent de suivre un même animal de manière longitudinale et contribuant ainsi à hautement réduire le nombre d’animaux. Le choix du nombre d'animaux par groupe tient compte de la possibilité que la croissance tumorale ne soit pas homogène entre les individuts. Le nombre d'animaux par groupe pourra être réévalué à la baisse suite à l'étude préliminaire sur 10 souris. Le nombre de souris nécessaires par groupe a été défini selon notre expérience et non selon une approche statistique. En effet, l'analyse statistique des résultats par comparaison des groupes se fera par tests (ANOVA 2-way, Wilcoxon ou Mann-Whitney) qui nécessitent un minimum de 6 animaux par groupe.

Raffinement

Au cours de l’étude, les souris seront hébergées entre 2 à 5 individus par cages enrichies de dômes, tunnels ou batonnets de bois et copeaux, sur portoir ventilé, dans une pièce avec des cycles de lumière-obscurité de 12h, dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées en permanence et avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel qualifié ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe de souffrance pour la prendre en charge. Pour limiter au maximum la souffrance et le stress des animaux, l’induction des modèles tumoraux se fera sous anesthésie générale selon des protocoles internes validés et une surveillance accrue des animaux se fera jusqu’à leur réveil. La surveillance de l'aspect et de la taille de la tumeur sera réalisée tous les 2 jours afin de vérifier que les points limites spécifiques du projet ne sont pas atteints. Des antalgiques seront administrés en cas de signes de douleurs. Toutes les imageries se feront également sous anesthésie ; nous privilégierons dans ce cas une anesthésie gazeuse qui permet un endormissement et un réveil rapide. Afin d’éviter la souffrance, tout signe et comportement anormal : difficultés à respirer, souris prostrée ou en retrait, ou une perte de poids supérieure à 20% du poids initial des animaux ; entraineront la fin de l’expérimentation, et leur mise à mort sans délai.

Choix des espèces

Le modèle tumorale de mélanome est validé dans la litterature sur cette espèce Les animaux seront utilisés au stade adulte, à 7 semaines, conformément au modèle décrit dans la littérature. Après réception, les animaux seront hébergéspendant 7 jours avant le début du protocole.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une myopathie liée à un déficit en cavéoline 3, elles subissent des tests de force hebdomadaires, des courses forcées jusqu'à épuisement contraintes par de petits chocs électriques, un isolement de douze heures, des prélèvements sanguins par la queue et des examens cardiaques sous anesthésie. Le porteur reconnaît que les nuisances comprennent la contention, la chute dans la litière et l'extension de l'animal par tirement de la queue, tout en indiquant que les souris ne présentent pas de symptômes cliniques sévères. Il affirme qu'évaluer la force musculaire in vivo est "indispensable" pour tester deux thérapies, les souris étant tuées pour prélever leurs muscles.

Objectifs

Les cavéolinopathies sont des maladies rares du muscle associées à de la faiblesse, des crampes et des douleurs musculaires chez les patients. Actuellement, aucun traitement n’existe. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique de deux thérapies, capables d’améliorer les fonctions motrices de souris atteintes d’autres maladies du muscle et présentant des symptômes similaires.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra fournir les premières preuves de concept pour soigner des patients atteints d'une maladie rare du muscle. Elle permettra, en outre, de mieux comprendre cette maladie et les acteurs impliqués.

Procédures

Des tests de force non invasifs et durant 1 minute au maximum seront réalisés une fois par semaine entre 7 et 12 semaines. Chacun de ces tests sera réalisé 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 mins. Un autre test de fonction motrice consistant à faire courir la souris jusqu'à épuisement sera réalisés entre 1 et 3 fois durant la période de test des animaux et durera au maximum 1h40. L'animal sera également laissé libre dans une cage pendant 12h afin d'étudier ses mouvement spontanés. Des prélèvements de sang seront effectués toutes les deux semaines au maximum et ne dépasseront pas 10% du volume total de l'animal. Durant ces prélèvements, les souris seront maintenues dans un tube pendant moins de 5 mins afin d'avoir accès à leur queue pour la prise de sang. Des tests cardiaques seront réalisés sur des souris anesthésiées au cours de la même expérience, afin de limiter le nombre d'anesthésies. Ces tests dureront au maximum 30 mins. Un test final sera effectué sur souris anesthésiées précédant l’euthanasie des animaux pour mesurer la force musculaire des souris. Ce test dure au maximum une heure. Une biopsie auriculaire durant moins de 2 mins sera effectuée à 3 semaines afin d'identifier les animaux ainsi que leur mutation grâce à l'ADN qui sera extrait de cette biopsie.

Impact sur les animaux

Il est attendu que les animaux n’aient pas de symptômes cliniques sévères. Les nuisances causées par les différents tests sont la contention temporaire de l’animal, la chute de l’animal dans une cage remplie de litière, l’extension de l’animal par tirement progressif de la queue par l’expérimentateur, l’isolement de l’animal dans un cage spéciale pendant 12 h, la contrainte à la course par délivrance de petits chocs électriques et l’anesthésie générale de l’animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issu des tests afin de récolter les muscles nécessaires aux analyses moléculaires et d'évaluer à une échelle plus petite les effets potentiellement bénéfiques des thérapies.

Remplacement

Le projet consiste à évaluer l'effet bénéfique de deux thérapies sur le muscle et la fonction cardiaque. Malheureusement, l’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni sur l’ensemble de l’organisme. Evaluer les fonctions motrices et la force musculaire in vivo est indispensable pour déterminer l'efficacité d'un traitement contre des myopathies. Le modèle murin est suffisament proche physiologiquement et structurellement pour étudier la physiopathologie ainsi qu'une potentielle amélioration des symptômes dans le cadre d'une thérapie.

Réduction

La grande majorité des tests étant non invasif, il est possible de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. Les tests histologiques et moléculaires seront effectués sur les mêmes animaux après euthanasie. Ces deux points nous permettent de réduire drastiquement le nombre d'animaux. Le nombre d'animaux a été choisi à partir des données présentes dans la littérature, ainsi que de façon à pouvoir détecter une différence statistiquement significative entre les animaux malades, sains et traités.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage avant d'être hébergés en groupe. Chaque cage sera enrichie avec des nids de chanvre ainsi que du carton, pour permettre aux souris de ronger. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 1 à 2 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. L’animal sera sorti de la cage à l’aide d’un tube ou les mains du manipulateur disposées en coupe pour réduire leur stress. Lors de l'évaluation des fonctions cardiaques sous anesthésie, une crème ophtalmique sera appliquée pour éviter l’assèchement des cornées et la phase de réveil s’effectuera sous une lampe chauffante dans une cage où l’animal sera seul, puis l’animal sera replacé dans sa cage avec ses congénères. Durant les mesures de force, l'animal sera anesthésié et analgésié afin d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. Pour chaque anesthésie, la température corporelle de l'animal sera maintenue au moyen d'une plaque et d'une lampe chauffante. Pour chaque expérience de phénotypage, l'animal sera tout d'abord familiarisé avec le matériel pour minimiser autant que possible son stress.

Choix des espèces

Le modèle murin utilisé reproduit les problèmes de dégénérescence de fibres musculaires retrouvés chez les patients. Les souris malades ne présentent cependant pas de symptômes cliniques importants et peuvent vivre aussi longtemps que des souris saines sans être handicapées au quotidien. Dès 8 semaines, on retrouve des défauts de fibres musculaires, et à 12 semaines une forte régénération des fibres. Les tests seront donc réalisés entre 7 et 12 semaines, sur souris adultes.

12 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit sous anesthésie un implant en silicone au graphène ou un disque de titane en sous-cutané, neuf d'entre elles subissant un prélèvement intracardiaque avant la mise à mort destinée à récupérer l'implant et les tissus. Le porteur affirme que ces matériaux, déjà utilisés en clinique, sont "parfaitement tolérés" et que les animaux ne montrent aucun signe de souffrance après réveil. Il indique que les tests in vitro, jugés "indispensables", ont été réalisés, l'étape sur animaux répondant à une demande réglementaire et au choix de l'industriel commanditaire.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer la tolérance d’un implant en silicone traité avec des nanoparticules de graphène pouvant induire un changement de forme (comparé à un implant en silicone non traité) ou d’un disque de titane nano-texturé après une implantation sous-cutanée chez la souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de pouvoir développer des matériaux innovants permettant d’améliorer des dispositifs médicaux (comme des prothèses, des cathéters…). Les disques de titane ont été modifiés pour posséder une nano-texture augmentant leur énergie de surface afin de modifier l’adsorption de protéines. Ce dispositif aura pour but de fournir en toute sécurité des cellules régénératrices et/ ou des produits biothérapeutiques dont les cibles pourraient être les cellules bêta productrices d’insuline. L’implant en silicone coaté avec des nanoparticules de graphène pouvant changer de forme dans le corps sous l’influence d’un stimulus externe permettra une avancée révolutionnaire dans différents domaines d’application tels que la cicatrisation des plaies à la demande, la fermeture de sphincter, la cicatrisation des tissus mous, le réglage de dispositifs médicaux implantés etc…) tout en s’affranchissant d’une ré-ouverture chirurgicale.

Procédures

La mise en place de l’implant chez la souris sera réalisée sous anesthésie fixe 30 min après une administration d’analgésique. La procédure chirurgicale sera réalisée stérilement et le disque (titane ou silicone) sera inséré. La plaie sera ensuite refermée. La durée de la chirurgie pour chaque animal est évaluée à 10 minutes environ. Le changement de forme induite par le dispositif se fera sous anesthésie fixe et ne durera quelques secondes. 9 souris seront soumises à un prélèvement intracardiaque sous anesthésie fixe avant la mise à mort. Les autres souris (3) seront mises à mort par sans prélèvement intracardiaque.

Impact sur les animaux

S’agissant de matériels étrangers implantés en sous-cutané (sans infection bactérienne), les effets indésirables attendus pourraient principalement être de nature tissulaires (nécrose au site d’implantation, œdème, hématome, altération de la morphologie tissulaire). Les implants en titane et en silicone sont déjà largement utilisés en pratique clinique et sont parfaitement tolérés. L’atteinte tissulaire à type de collection purulente (en cas de contamination bactérienne), d’œdème au niveau du site d’implantation peut être attendue mais les expériences menées par le passé par l’équipe montrent que celles-ci sont extrêmement rares voire inexistantes. Les animaux retrouvent une mobilité immédiatement après leur réveil et ne montrent aucun signe de souffrance. De plus les essais in vitro ne montrent pas de toxicité particulière de ces différents supports. Le changement de forme induite par le dispositif Si traité se fera sous anesthésie fixe et ne dura quelques secondes. Si toutefois, l’animal présente un score clinique entre 5 et 7 une injection de buprénorphine pourra être envisagée pour soulager l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude afin de récupérer l’implant et le tissu environnant pour une étude histologique et bactérienne

Remplacement

Lors du développement de nouvelles stratégies anti-infectieuses, ou encore dans le domaine de la médecine régénérative, les molécules ou matériaux sont tout d’abord testées selon des méthodes traditionnelles in vitro (mesure de l’activité bactéricide selon différentes normes, de l’inflammation, de changement chimique ou encore de structure). Ces études in vitro sont indispensables à l’avancée des travaux de recherche et développement et ont en effet été réalisés par le commanditaire de l’étude. Les instances règlementaires demandent à ce stade d’évaluer ces nouveaux dispositifs en conditions réelles, c’est-à-dire dans des modèles vivo, afin d’approcher au mieux les conditions de cicatrisation tissulaire.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude a été réduit au maximum : 4 souris par groupe pour évaluer la phase de tolérance des différents dispositifs. - Implant Ti - Implant en Si traité Implant en Si non traité

Raffinement

D’une façon générale pour l’ensemble de l’étude, la prise d’anti-inflammatoires est contre indiquée du fait de l’interaction reconnue avec les modulateurs de l’inflammation. De plus, les marqueurs à analyser lors de cette étude sont essentiellement inflammatoires. L’utilisation d’un antalgique, 30 min avant l’anesthésie permettra de diminuer la douleur et une récupération plus rapide de la mobilité des souris. Lors de la mise en place de l’implant, les souris seront anesthésiées. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant du début de la chirurgie jusqu’à leurs réveils. La plaie sera observée quotidiennement et désinfectée sur les 3j suivant la chirurgie. Les souris reprennent une activité normale dès leur réveil et ne présentent pas de signes de souffrance particuliers, selon l’expérience de l’équipe. Par ailleurs, il s’agit d’une implantation sans infection donc en aucun cas une infection locale ou systémique ne sont anticipées. Si toutefois, l’animal présente un score clinique entre 5 et 7 une injection de buprénorphine pourra être envisagée pour soulager l’animal. Enfin, un enrichissement du milieu (jouets en plastique, igloos en carton) sera utilisé et une surveillance quotidienne sera réalisée tout au long de l’étude.

Choix des espèces

Les modèles d’implant utilisent le plus souvent le cochon d’Inde ou la souris. Dans notre cas, la demande de l’industriel a porté sur l’utilisation de la souris. Des souris C57Bl6 de 7 semaines de façon à avoir un poids corporel de 23-25g

30 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Vingt-huit reçoivent le dépôt d'un produit test dans les deux yeux, puis un prélèvement sanguin sous anesthésie, avant d'être tués pour prélever les structures oculaires, deux lapins de réserve pouvant être replacés s'ils ne servent pas. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable du produit, de la classe infectiologie, et prévoit une surveillance des yeux pour repérer rougeurs et gonflements. Il conclut qu'aucune méthode ne reproduit la diffusion d'un produit dans le sang et qu'il est donc "nécessaire de recourir à l'animal dans son ensemble".

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de déterminer les paramètres pharmacocinétiques d'un produit test aprés une simple administration oculaire dans les deux yeux chez le lapin et de mesurer la tolérance, l'impact de ce produit au niveau structural.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir déterminer les paramètres PK de la formulation test et de démontrer la bonne tolérance de cette formulation au niveau des structures oculaires. Cela sera bénéfique pour l'homme dans le cadre des infections au niveau de l'oeil.

Procédures

Les animaux seront contentionnés pour réaliser l'administration oculaire. L'administration consiste à un simple dépôt (50 µL dans chaque oeil en utilisant une micropipette et cônes adaptés). Durée estimée de l'ordre de quelques minutes. Puis les animaux seront anesthésiés durant le temps du prélèvement sanguin. De l'ordre de quelques minutes également. Les animaux seront euthanasiés pour pouvoir collecter les structures oculaires par administration d'un euthanasique. Durée de l'injection de l'euthanasique: de l'ordre de la minute.

Impact sur les animaux

Le produit test fait partie de la classe thérapeutique infectiologie. Il n'y a pas d'effets indésirables attendus. Un suivi quotidien (et plusieurs fois par jour le jour des administrations) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général) plus particulièrement observation des mouvements de tête. Observation au niveau des yeux comme rougeurs, gonflements, présence au non de larmes....

Devenir

Dans ce projet 30 animaux seront inclus. 28 animaux seront administrés et 2 animaux seront des animaux de réserves. Si les animaux de réserve ne sont pas utilisés ils pourront être replacés. Les 28 animaux administrés seront mis à mort pour récupérer un échantillon de sang et les structures oculaires pour être analysés.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang et aucune méthode alternative ne permet d'évaluer l'impact de la formulation à testée au niveau oculaire sur du tissus vivant il est donc nécessiare de recourir à l'animal dans son ensemble.

Réduction

30 animaux seront inclus dans ce projet. 28 animaux seront administrés et 2 animaux de réserve sont prévus. Les animaux seront réparti en 7 groupes de 4 animaux. 4 animaux par groupe est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats significatifs par rapport aux paramètres pharmacocinétiques et par rapport aux éventuelles modifications tissulaires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en boxes collectifs dés l'arrivée jusqu'à la fin de la phase animale. 6 boxes de 5 animaux. Cet hébergement collectif est nécessaire durant l'étude pour un contact visuel et olfactif entre congénères, surface suffisante de l'hébergement, milieu enrichi adapté à l'espèce (copeaux, cachette, buchette à ronger ..) Toutes les manipulations sur les animaux seront faites par un personnel formé, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront observés pendant la phase de réveil. Un suivi quotidien (et plusieurs fois par jour le jour des administrations) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général) plus particulièrement observation des mouvements de tête. Observation au niveau des yeux comme rougeurs, gonflements, présence au nom de larmes.... L'animal sera préalablement anesthésié avant la réalisation du prélèvement sanguin et avant de ce fait avant d'être euthanasié. Les points limites stricts et spécifiques de ce projet seront appliqués à savoir: - Douleurs ( animal prosté, oreilles en arrières, grattage au niveau de la gueule, oeil mi-clos) - Rougeurs, gonflements, grattage au niveau des yeux - Ecoulement oculaire important - Oeil complètement fermé - Lésions tissulaire oculaire

Choix des espèces

Le lapin est une espèce fréquemment utilisée en recheche pre-clinique pour le développement de médicaments destinés à l'homme et la taille de cet animal permet de le manipuler assez facilement. Les animaux utilisés sont de jeunes adultes afin de ne pas avoir de pathologies liées au vieillissement au niveau des structures oculaires.

Implantées au cerveau de cellules de glioblastome issues de patients, sous anesthésie, puis suivies par imagerie deux fois par semaine pendant 28 jours, 864 souris immunodéficientes, dépourvues de lymphocytes, sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. À partir du septième jour, elles reçoivent deux ou trois fois des lymphocytes T humains, par chirurgie dans la tumeur ou dans un ventricule cérébral, ou par voie intraveineuse, chaque méthode étant d'abord appliquée à 108 souris. La méthode jugée la plus favorable est ensuite appliquée à 540 souris de plus. Le porteur attend des douleurs postopératoires, une cicatrisation difficile, de l'agressivité, une prostration, une fonte musculaire et une tête penchée. Toutes sont tuées à l'issue pour l'analyse de leur cerveau.

Objectifs

Les glioblastomes sont les tumeurs du cerveau les plus fréquentes, affectant 3 personnes sur 100 000. Elles sont caractérisées par leur grande agressivité, et leur résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique conduit à une survie inférieure à 15 mois chez la moitié des patients atteints. La mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques est donc primordiale. Les immunothérapies, basées sur l’exploitation du système immunitaire du patient, sont extrêmement prometteuses dans le traitement des glioblastomes, et contribuent au développement actuel de nouvelles thérapies. Dans ce projet, nous nous intéressons a une sous-population spécifique de cellules immunitaires, appelés lymphocytes T γδ Vδ2 négatifs, qui a déjà montré son potentiel pour le traitement de différents cancers, mais n’a pas été exploitée jusqu’ à présent pour le traitement des glioblastomes. Nous avons effectué de nombreuses expériences préliminaires in-vitro montrant que ces lymphocytes T sont capables d’éliminer des cellules cancéreuses provenant de tumeurs cérébrales de patients. Néanmoins, pour compléter ces études in-vitro, il nous faut valider et approfondir les résultats, notamment en déterminant si les lymphocytes T γδ Vδ2 négatifs sont capables d’infiltrer et d’éliminer durablement les tumeurs de cerveau dans un organisme vivant (in-vivo), et ce en utilisant des modèles animaux. L’objectif de cette étude est donc de mettre en évidence les propriétés anti-glioblastome de ces lymphocytes T γδ in-vivo, pour permettre ensuite leur utilisation en essais cliniques.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d’améliorer la connaissance fondamentale des propriétés anti-tumorales de cette sous-population de cellules immunitaires, les lymphocytes T γδ Vδ2 négatifs. Il nous permettra notamment de mieux comprendre comment ces cellules peuvent atteindre la tumeur, la reconnaitre spécifiquement, et l’éliminer. D’autre part, ce projet constituera la première évaluation de l’efficacité de cette thérapie cellulaire chez des organismes vivants. Cette évaluation préliminaire est nécessaire avant tout développement d’essai clinique chez les patients atteints de glioblastome. Ainsi, si les résultats obtenus dans ce modèle sont satisfaisants, on s’attend à des bénéfices sur le long terme en essais cliniques et plus généralement pour la prise en charge des patients atteints de glioblastomes. Améliorer la survie de ces patients est actuellement un enjeu de santé public majeur.

Procédures

La totalité des animaux de ce projet (864 souris) seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’implantation intracrânienne de cellules de glioblastome. Cette chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale plus locale, sur une durée de dix minutes par souris. Suite à cette chirurgie, la taille des tumeurs sera suivie par une méthode d’imagerie non invasive, qui dure 20 minutes environ, et sera réalisée 2 fois par semaine, entre le jour 0 et le jour 28 d’expérimentation (post-implantation). Suite à l’implantation de cellules de glioblastome, les animaux seront injectés 2 à 3 fois par la thérapie cellulaire de lymphocytes T (aux jours 7 puis 14 puis après implantation). Cette injection sera faite selon trois procédures différentes. Les deux premières seront des procédures chirurgicales d’implantation intracrânienne de lymphocytes T, soit au niveau de la tumeur, soit au niveau du ventricule, réalisées sous anesthésie générale plus locale, sur une durée de 25 minutes par souris. La troisième procédure d’injection sera intraveineuse. Ces trois méthodes d’injection de lymphocytes T concerneront chacune 108 souris dans un premier temps (324 souris au total). Puis, dans un second temps, la méthode associée au meilleur bénéfice pour les souris sera sélectionnée, et concernera alors 540 souris supplémentaires.

Impact sur les animaux

Suite à l'implantation dans le cerveau des souris de cellules de glioblastome puis de lymphocytes T, les effets indésirables suivants peuvent être attendus : des douleurs post-opératoires, des points sautés suite à la chirurgie, une cicatrisation difficile, un comportement anormal (dont agressivité, perte de masse musculaire, comportement névrotique, prostration), ou encore un penchement de la tête. Par ailleurs, sur la durée totale des expérimentations, une perte de poids des animaux peut être attendue.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, toutes les souris concernées par ce projet (864 animaux) devront être euthanasiées pour permettre l'analyse de leur cerveau et ainsi l'étude des lymphocytes T injectés et du bénéfice apporté par cette thérapie sur la progression de la tumeur et la survie des souris.

Remplacement

La capacité des lymphocytes T utilisés ici à éliminer des cellules tumorales de glioblastomes issues de différents patients a déjà été démontrée in vitro, posant ainsi de solides bases pour cette étude in vivo. L’utilisation de ce modèle animal répondra uniquement aux questions ne pouvant être élucidées in vitro, notamment en déterminant si les lymphocytes T peuvent migrer jusqu’à la tumeur, l’infiltrer, éliminer les cellules tumorales et améliorer significativement la survie des souris.

Réduction

Grâce à des analyses bioinformatiques et statistiques, nous utiliserons le minimum nécessaire d’animaux pour être statistiquement significatifs et scientifiquement irréprochables. Par ailleurs, un suivi longitudinal de la croissance des tumeurs sera effectué par imagerie, ce qui permettra de réduire le nombre de souris par groupe expérimental. Enfin, nous utiliserons toutes les femelles et tous les mâles issus de croisements, ce qui réduit de 50% l’utilisation des animaux.

Raffinement

Afin de respecter la notion de raffinement, et éliminer ou réduire toute douleur, souffrance, angoisse, ou tout dommage durable susceptible d’être infligé aux animaux, leur bien-être sera pris en compte quotidiennement de leur naissance à leur mort et évalué par le personnel zootechnique expérimenté. Notamment, afin de réduire les douleurs liées aux chirurgies d'implantation de tumeurs et aux procédures de transfert de lymphocytes T, des protocoles analgésiques et antalgiques seront mis en place. Un suivi quotidien des animaux permettra aussi de prévenir leur affaiblissement et de prendre une décision rapide quant à leur sacrifice. Enfin, le suivi non invasif de la croissance des tumeurs par imagerie participera à maximiser le bien-être animal.

Choix des espèces

Un modèle de souris (Mus musculus) immunodéficientes est utilisé. Leur système immunitaire ne possède pas de lymphocytes. Ce modèle présente un double intérêt pour ce projet : -Les tumeurs de glioblastomes issues de patients s’y développent de manière très reproductible, permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés. Ce modèle est très pertinent d’un point de vue préclinique, car les tumeurs y reconstituent les caractéristiques complexes observées chez les patients humains. - Ce modèle immunodéficient permet le transfert de lymphocytes T humains sans que ceux-ci ne soient rejetés par le système immunitaire de la souris receveuse. Nous utiliserons des souris âgées de 7 à 9 semaines, qui permettent une croissance tumorale optimale en s’affranchissant de l’affaiblissement d’individus plus âgés.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées, sous anesthésie ou à l'état vigile, à une chaleur croissante de 33 à 44 degrés mimant une canicule, avec une contention en tube que le porteur reconnaît stressante, pour étudier la thermorégulation de la peau au cours du vieillissement. La mise à mort se fait par dislocation cervicale pour des prélèvements terminaux. Le porteur qualifie les techniques d'indolores et proches de celles utilisées chez l'humain, tout en classant les procédures en gravité modérée.

Objectifs

Ce projet est un projet de recherche fondamentale sur la thermorégulation vasculaire de la peau. Avec le réchauffement climatique et le vieillissement de la population, les vagues de chaleur vont avoir un effet critique grandissant sur notre système de santé. En effet, la population âgée est particulièrement vulnérable aux épisodes caniculaires dû à une altération de la thermorégulation conduisant à une incapacité à dissiper la chaleur et pouvant entraîner de graves complications voire un décès. Bien que ces défauts soient rapportés au cours du vieillissement depuis longtemps, les mécanismes qui sous-tendent ces défauts fonctionnels ne sont pas encore connus, ce qui limite fortement les approches thérapeutiques envisageables pour les personnes âgées. Les thermorécepteurs TRPV3 exprimés dans la peau sont mis en jeu dans les processus de sensation de température et dans la thermorégulation vasculaire cutanée. Ce projet vise à caractériser le rôle de TRPV3 et des nerfs sensoriels de l’épiderme (couche superficielle de la peau) dans les mécanismes neurovasculaires cutanés de la thermorégulation au cours du vieillissement, en utilisant des lignées de souris génétiquement modifiées permettant de bloquer la fonction de TRPV3 ou ayant un défaut d’innervation cutanée.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes de la thermorégulation au cours du vieillissement permettra, à terme, de proposer des pistes de traitement adaptées aux défauts de thermorégulation qui peuvent affecter la population âgée.

Procédures

Les lignées de souris nécessaires pour ce projet sont déjà disponibles et présentent à l’âge adulte jeune un défaut de réponse vasculaire au chauffage local mais ne présentent pas de trouble susceptible d'affecter leur bien-être dans les conditions d’hébergement standard. Les souris seront anesthésiées (durée environ 45 minutes) afin d’effectuer des mesures non invasives pour caractériser la fonction barrière et leur capacité vasculaire cutanée lors d’une exposition à un chauffage local ou un chauffage global mimant un épisode de canicule. Une exposition à une chaleur croissante (33 à 44°C ; +1°C/minute) sera également envisagée chez des souris vigiles afin de mesurer leur capacité à maintenir leur température interne stable dans ces conditions thermiques mimant une canicule. Les techniques utilisées sont indolores ; elles sont également utilisées chez l’homme. Afin d’étudier le rôle de TRPV3 et des nerfs sensoriels de la peau au cours du vieillissement nous étudierons des souris d’âge différents (jeunes, matures et âgées).

Impact sur les animaux

Toutes les techniques envisagées sont non invasives et utilisées dans les études cliniques. Aucune douleur n’est attendue. Pour les mesures sur souris vigiles, l’utilisation de tubes de contention peut générer un stress qui sera minimisé grâce à une habituation préalable. Pour cela, les souris seront placées dans un tube de contention pendant 10 minutes, deux jours différents dans les 7 jours précédents. Sous anesthésie générale, l’exposition à un chauffage local (augmentation de la température de la peau de 33 à 44°C à +1°C/min) sur 1 des pattes ne représente pas de nuisances particulières d’après notre expérience. L’exposition à un chauffage globale de la souris va déclencher des mécanismes de thermorégulation périphériques et centraux, induire une sudation afin de préserver une température interne le plus stable possible. Notre étude précédente a montré que les souris exposées à un chauffage passif de 33 à 44°C à raison de +1°C/min induisait une augmentation de la température rectale d’environ 3°C (en vigile et sous anesthésie). Afin de limiter les effets indésirables, l’exposition à la chaleur sera immédiatement arrêtée si l’augmentation de la température rectale atteint +4°C (en vigile ou sous anesthésie). Les souris ne présentent pas de phénotype dommageable. Au cours du vieillissement, les souris peuvent perdre du poids et baisser leur température interne. Ces deux paramètres seront suivis au minimum 1 fois par semaine pour les souris âgées de 15 mois et plus.

Devenir

Mise à mort par dislocation cervicale. Cette étude vise à comprendre le rôle de TRPV3 et de l’innervation épidermique dans le défaut de thermorégulation au cours du vieillissement. Pour cela plusieurs prélèvements terminaux doivent être réalisés, en particulier pour analyser l'effet du vieillissement sur la réactivité vasculaire (mesures ex vivo sur vaisseaux isolés) et l'expression de TRPV3 dans la peau.

Remplacement

Ce projet nécessite l'utilisation d'animaux car il est actuellement impossible de reproduire la réactivité vasculaire cutanée en réponse au chauffage qui repose sur une interaction fonctionnelle des systèmes nerveux et vasculaires.

Réduction

Le nombre total de souris prévues pour ce projet est de 360. Ce nombre maximal inclut la possibilité de reproduire les expériences en cas d'imprévu, donc il est très vraisemblable que le nombre réel d'animaux utilisé sera inférieur à ce nombre maximal. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions sur ces mêmes modèles.

Raffinement

Les souris seront suivies avec un soin particulier, elles seront observées 3 fois par semaine au minimum et pesées une fois par mois avant 15 mois puis plus régulièrement pour les animaux vieillissants (pesée hebdomadaire). Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance.

Choix des espèces

Les modèles murins, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier l’intégrité fonctionnelle de la peau. Cette espèce possède une physiologie vasculaire proche de celle de l'Homme et permet d'étudier la fonction vasculaire par les même approches (laser Doppler, iontophorèse), tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaire et moléculaire. De plus, ce projet inclut des expériences utilisant des modèles animaux modifiés génétiquement disponibles uniquement chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées minimum de 10 semaines lorsque leur système sensoriel et vasculaire est développé. Afin d’étudier le rôle de TRPV3 et de l’innervation épidermique au cours du vieillissement, les souris seront utilisées à 3 âges différents (18 mois).

1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des administrations orales et des injections répétées de composés, subissent des prélèvements de sang et d'urine, dont un recueil par pression sur la vessie, avant une autopsie et le prélèvement des os, pour rechercher une toxicité osseuse de médicaments. Le porteur indique qu'une réaction inflammatoire peut apparaître en cas de toxicité. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit le remodelage de l'os et qualifie l'usage d'animaux d'"indispensable".

Objectifs

L’objectif du présent projet est d’évaluer les atteintes osseuses potentielles qui pourraient survenir lors de traitements thérapeutiques. En effet, des études de pharmacovigilance ont montré que la fragilisation osseuse peut être induite par des médicaments, par carence ou pertes en calcium, phosphate et vitamine D, ou réduction de la minéralisation / densité minérale de l’os. La classe thérapeutique la plus fréquemment en cause est celle des corticoïdes mais d’autres médicaments sont aussi suspectés comme les antirétroviraux, des antiacides, des médicaments antiépileptiques, des antithrombotiques mais aussi des antidépresseurs, des neuroleptiques, et médicaments utilisés par exemple dans le traitement du cancer du sein. A noter aussi qu’un risque d’ostéoporose est évoqué pour les statines, et retrouvé significatif à forte dose. D’autre part, si le risque d’effets indésirables osseux est plus ou moins bien documenté les mécanismes mis en jeu ne sont pas encore connus avec précision. Il devient donc essentiel et indispensable dans le développement de nouveaux médicaments et tout particulièrement pour les classes thérapeutiques citées ci-dessus, de vérifier l’absence d’effets secondaires délétères pouvant intervenir sur l’os afin de ne pas dégrader la qualité de vie des patients. C’est donc, dans ce contexte que s’inscrit ce projet et cette demande de renouvellement afin d’évaluer sur l’animal les effets secondaires potentiels de composés thérapeutiques actuellement en développement chez nos clients. Les études permettront de définir les types de lésions osseuses qui pourraient être observées, et d’améliorer les schémas thérapeutiques d’administration des composés évalués afin de réduire et/ou abolir les effets délétères, voire même de stopper le développement de certains composés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur la potentielle toxicité osseuse des composés étudiés. - Long terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques osseuses chez les animaux après application du composé. De plus, ce projet doit permettre d’établir des plans de prévention, prophylaxie (ensemble des mesures à prendre pour prévenir les maladies), et diagnostic robustes indispensables à la prise en charge et au suivi de maladies, chez l'homme et/ou les animaux.

Procédures

Les administrations orales de composés seront réalisées sur animaux vigiles (moins de 5 minutes par administration). Les fréquences d’administration (au maximum 2 fois par jour) dépendent de la prophylaxie des composés testés. Les injections de composés en parentéral (sous cutanée ou intramusculaire ou intrapéritonéale : dans le cadrant caudal droit de l'abdomen ventral) seront réalisées sur animaux vigiles ou anesthésiés (moins de 5 minutes par injection). Les fréquences d’injection (au maximum 2 fois par jour) dépendent de la prophylaxie des composés testés. Les prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles ou anesthésiés (moins de 5 minutes par prélèvement). Un traitement analgésique sera systématiquement appliqué aux animaux. Si un prélèvement à l’aorte abdominale est effectué, il ne se fera qu’en point final sous anesthésie avant sacrifice de l’animal. Les urines pourront être prélevées en cours de protocole sur animaux vigiles, en pressant sur la vessie des animaux (moins de 5 minutes par prélèvement) ou en point final, sur animaux euthanasiés. Elles peuvent être également collectées suite au placement des animaux en cage métabolique pendant 24h au maximum où l’urine libérée par l’animal pendant ce laps de temps sera collectée.

Impact sur les animaux

Une possible réaction inflammatoire pourra apparaître au cours du temps en cas de toxicité osseuse (due à l’administration du traitement thérapeutique). Pour prévenir ce cas de figure, les animaux sont suivis de près et des grilles d’évaluation clinique ainsi que les conduites à tenir en cas de l’observation de ces signes ont été prévus.

Devenir

A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront humainement euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins et urinaires seront utilisés pour doser le composé et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser les composés et / ou réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie.

Remplacement

De manière systématique, les composés que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des agents thérapeutiques testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, le tissu osseux est un tissu en perpétuel remodelage avec une activité de résorption et de formation osseuse. Cet équilibre repose sur des mécanismes de régulations systémiques et locaux grâce à une communication étroite entre les différentes cellules osseuses afin de maintenir les différentes constantes du tissu entre les limites des valeurs normales. Ce mécanisme complexe ne peut être mimé par un modèle simple de culture in vitro. Il n'existe donc pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer l’apparition de lésions osseuses. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux principes actifs et en accord avec l’article R.214-105 du Code rural et de la pêche maritime, 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance), sur nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif sera revu à la baisse dans le cas où le traitement évalué est connu, et après analyse des résultats d’études précliniques préliminaires d’efficacité, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre. Pour chacune des procédures, des tests statistiques seront réalisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors des prélèvements sanguins en submandibulaire. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux ou trois fois par semaine. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera euthanasié. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors du traitement expérimental et lors des prises de mesures). Dans la mesure du possible, la prise de mesures sera effectuée dès l’apparition de la première phase de douleur aigüe de manière quotidienne et seulement deux fois par semaine dans les phases de douleurs chroniques

Choix des espèces

La souris a été choisie pour ce projet car cette espèce mammifère (à l’identique du rat) présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires notamment en termes de remodelage osseux, proches de celles observables chez l'homme. La souris, étant fréquemment utilisé à des fins de recherche, l’étude des effets de composés chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, un volume suffisant de liquides biologiques peut-être récupéré et analysé. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents composés seront utilisés.

466 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ablation des testicules, puis des injections intrapéritonéales quotidiennes et des gavages pendant 28 jours, pour tester deux molécules contre la récidive du cancer de la prostate après castration. Le porteur indique que le gavage comporte un risque de perforation de l'oesophage et de détresse respiratoire, et que les injections répétées peuvent irriter la zone d'injection. Il affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit les stades du développement tumoral et que la validation chez la souris est "nécessaire".

Objectifs

Le cancer de la prostate est le cancer le plus diagnostiqué chez les hommes en France et le second en termes de mortalité par cancer. Pour les cancers de la prostate invasifs sa seule thérapeutique proposée est la castration chimique (déprivation en androgène) qui est, dans un premier temps efficace, mais dans 100% des cas la tumeur récidive en étant agressive (métastases). Dès lors, il n’existe aucun traitement efficace conduisant inéluctablement au décès du patient. Une équipe de recherche a identifié des cellules potentiellement initiatrices de cette récidive tumorale dans la prostate chez la souris, Dans un modèle de souris génétiquement modifié développant un cancer de la prostate résistant à la castration, le contingent de ces cellules est fortement amplifié. Ces cellules alors ont pu être isolées et caractérisées, ce qui a permis d’une part de montrer que cette population était constituée de plusieurs sous populations et de déterminer deux cibles thérapeutiques théoriques exprimées par ces cellules de la sous population la plus agressive. En utilisant deux drogues, chacune agissant sur une des deux cibles, nous montrons que ces drogues sont très efficaces pour tuer ces cellules et que leur effet est additif dans un modèle de culture de ces cellules en 3D, et ce en présence et en absence d’androgènes. Ces cellules ont aussi été identifiées chez l’Homme. Sur une lignée cellulaire humaine de ce type de cellules issue d’une tumeur prostatique de patient, nous avons montrés la même efficacité de ces drogues. L’objectif de ce projet est, chez le modèle de souris génétiquement modifié qui développe des tumeurs prostatiques résistantes à la castration : - d’une part de caractériser finement les sous populations cellulaires identifiées et ce, notamment post-castration, - d’autre part d’évaluer/confirmer l’impact thérapeutique de ces deux composés chimiques sur le développement et la récidive tumorale directement. Ces deux drogues seront administrer seule ou en combinaison chez la souris castrée ou non.

Bénéfices attendus

Pour améliorer la survie des patients développant des cancers de la prostate résistant à la castration, il est nécessaire de comprendre les mécanismes à l’origine de la récidive tumorale et notamment d’identifier les cellules à son origine, afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les études préliminaires in silico et in vitro ont permis d’identifier une nouvelle population cellulaire présentant toutes les propriétés théoriques recherchées. Des résultats et des tests fonctionnels in vitro de sur ces cellules ont permis de déterminer deux cibles potentielles majeures dont l’inhibition pourrait affecter la survie de ces cellules. Ce projet permettra de mieux caractériser ces cellules afin de comprendre l’évolution de leurs sous-populations au cours de divers traitements, dont la castration, et de confirmer l’efficacité de l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques, seul ou en combinaison pour empêcher ou ralentir la récidive tumorale. Les tests seront basés sur le traitement d’un modèle murin développant des formes de cancer de la prostate résistant à la castration.

Procédures

Les interventions subies par les animaux seront : - 1- Des chirurgies (ablations de testicules) de 15 min sous anesthésie gazeuse et sous analgésique (injection sous cutanée 30 min avant l’intervention puis à J+1 et à J+2 si nécessaire). - 2- Des traitements en injections (de moins d’une minute) intra péritonéal de drogues quotidiennement pendant 28 jours. - 3- Des traitements en gavage (de moins d’une minute) bi-hebdomadaires pendant 28 jours. Chaque animal subira une combinaison de ces interventions: dans un cas, l’ensemble des souris, sera soumis à l’intervention 1. Dans un deuxième cas les animaux seront soumis aux interventions selon leur groupe : - 108 souris subiront une chirurgie de castration (intervention 1) puis les animaux recevront des traitements comme suit : • 36 souris seront soumises à l’intervention 2 uniquement ; • 36 souris seront soumises à l’intervention 3 uniquement ; • 36 souris seront soumises aux interventions 2 et 3. - 108 autres souris recevront des traitements comme suit : • 36 souris seront soumises à l’intervention 2 uniquement ; • 36 souris seront soumises à l’intervention 3 uniquement ; • 36 souris seront soumises aux interventions 2 et 3.

Impact sur les animaux

L’ablation des testicules est un acte non douloureux car réalisé sous anesthésie et analgésie mais il peut occasionner une hypothermie, une déshydratation et l’asséchement des yeux. Suite à la chirurgie, les animaux peuvent souffrir et la plaie chirurgicale peut présenter des signes d’inflammation ou d’infection. Les anesthésies lors des chirurgies sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections intra péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection.

Devenir

Chaque animal intégré sera mis à mort : - soit parce qu’il atteint avant la fin un score supérieur ou égale à 3 de la grille d’évaluation indiquant une souffrance nécessitant sa mise à mort. - soit parce qu’il est un animal d’intérêt ou contrôle pour lequel il est nécessaire à la fin de prélever la prostate afin d’évaluer l’efficacité du traitement testé.

Remplacement

Nous avons dans un premier temps mené l’étude par différentes approches pour aborder ces questions, incluant, des études de prédiction par analyse bio-informatiques de données transcriptomiques, des cultures cellulaires 2D et 3D in vitro, selon le principe de Remplacement. Pour remplir nos objectifs, nous sommes contraints d’utiliser des modèles murins, car aucun système in vitro et aucun modèle d’organismes plus simples ne permet de reproduire les différents stades du développement tumoral prostatique et de sa récidive post-castration.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est une estimation permettant de couvrir les diverses études que nous réaliserons sur 5 ans. Il est important de noter qu’une souris permettra de réaliser plusieurs études in vitro par différentes méthodes de biologie cellulaire ou moléculaires. La multiplicité des tests réalisés grâce à une souris permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisé au cours de nos études. Une validation in vivo de l’efficacité des inhibiteurs testé in vitro est cependant nécessaire après validation sur divers modèles cellulaires. Selon le principe de Réduction, le nombre d'animaux utilisé in vivo pour valider ces données est calculé pour permettre d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. En revanche, des animaux pourraient être écartés de l’étude, il est donc nécessaire de prévoir un effectif légèrement supérieur à celui calculé dans cette section. C’est pour cette raison que nous avons fixé un nombre final de 18 animaux par condition, tenant compte de tous ces paramètres.

Raffinement

Pour s’assurer du bien-être des souris tout au long de leur vie, elles bénéficieront de coton, de maisonnettes, de tunnels et de bâtonnets de bois à ronger afin de les occuper et afin qu’elles puissent se construire un nid. Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie. A la suite des chirurgies, la personne en charge du protocole les observera tous les jours (pendant une semaine) et une fois par semaine par la suite. A leur entrée en traitement, elles seront pesées tous jours pendant les 28 jours. Afin de réduire la douleur associée à la castration, la chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale. Un analgésique sera administré en pré- et post-opératoire. A la suite de la chirurgie la souris sera réveillée au chaud et surveillée pendant les heures qui suivent et la bonne cicatrisation sera observée tous les jours durant la semaine qui suit l’opération par la personne en charge du protocole. Des points limites spécifiques ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort. Si, pour des raisons de protocole (mise à mort de certains congénères ayant atteint un point limite), une souris devait se retrouver seule dans une cage, l’enrichissement sera augmenté.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, les modèles animaux créent le lien indispensable entre les tests in vitro et les études cliniques. Les animaux seront pour une première partie castrés entre 3 et 13 mois afin de regarder l’effet de l’orchidectomie sur des populations cellulaires, avant et après avoir laissé les structures tumorales se développer. Après la castration, les animaux seront mis à mort après un lapse de temps pouvant aller de 5 jours à 6 mois maximum (si la castration s’est faite entre 3 à 7 mois d’âge). Les animaux dans une deuxième partie subiront à partir de 6 mois une orchidectomie, afin d’attendre la mise en place du développement tumoral avant de les castrer. Ils seront ensuite traités à 8 mois. S’ils ne subissent pas d’orchidectomie, mais reçoivent uniquement le traitement, les animaux seront traités à partir de 8 mois afin de comparer l’efficacité du traitement entre le groupe de souris non castrées et le groupe de souris castrées.