Procédures modérées

2 496 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie cérébrale pour injection virale, avec douleur post-opératoire, puis une restriction alimentaire faisant perdre 10 à 15 % de leur poids pour les motiver aux tests de mémoire. Le porteur teste des molécules censées retarder le déclin cognitif dans un modèle de maladie d'Alzheimer, les pistes thérapeutiques restant attendues. Il indique que l'évaluation de la mémoire ne peut se faire que sur des animaux.

Objectifs

L’hippocampe est une des premières structures cérébrales atteintes dans la maladie d’Alzheimer. Une dysfonction de ce dernier entraîne des troubles de la mémoire épisodique, celle qui permet la mémorisation de nos expériences passées. Deux processus cognitifs sous-tendent cette mémoire : le pattern separation – qui permet la discrimination de deux souvenirs plus ou moins similaires – et le pattern completion – qui permet de reconstruire une information globale à partir de souvenir partiels. Des défauts en pattern separation et pattern completion ont été observés chez des patients atteints de la maladie d’Alzheimer ainsi que chez les modèles animaux de cette pathologie. Notre équipe a récemment découvert des molécules permettant d’améliorer le pattern separation et du pattern completion, chez la souris non-transgénique, sans aucun effet délétère. A la suite de cette découverte, nous souhaitons les utiliser afin d’améliorer le pattern separation et le pattern completion dans un modèle de souris Alzheimer. L'objectif de ce projet est de tester si ces nouvelles molécules permettent de retarder le déclin cognitif des souris modélisant la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Nos résultats préliminaires montrent que les souris non-transgéniques injectées avec un virus permettant d’exprimer une molécule candidate, ont une amélioration du pattern separation par rapport aux souris non-injectées. Ainsi, en injectant les souris modélisant la maladie d’Alzheimer (MA) avec ce même virus, nous espérons retarder leur déclin cognitif. En utilisant d’autres constructions virales liées à cette molécule candidate, nous souhaitons restaurer à la fois le pattern separation et le pattern completion chez les souris modélisant la MA. Ce projet permettra donc la caractérisation et l’utilisation de molécules pouvant retarder le déclin cognitif, nous offrant de nouvelles pistes thérapeutiques. En fonctions des résultats obtenus, nous pourront développer une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires et cellulaires engagés dans la maladie d’Alzheimer (MA). Il est à noter que les virus utilisés servent uniquement à faire exprimer une molécule dans une zone précise du cerveau et n’ont aucun effet nocif ou délétère sur les animaux.

Procédures

Nous souhaitons retarder le déclin cognitif de souris modélisant la maladie d'Alzheimer en injectant directement dans le cerveau des virus non-infectieux qui vont permettre l'expression de molécules candidates. Pour ce faire, les animaux seront injectés sous anesthésie avec un volume très restreint de virus. La durée de la chirurgie est d'environ 40 minutes. Une fois injectés, les capacités cognitives des animaux seront testées quotidiennement avec des tests comportementaux non-aversifs. Le cerveau des animaux sera finalement prélevé pour vérifier la localisation de l'injection et la présence de la molécule candidate.

Impact sur les animaux

Nous devons pratiquer une chirurgie stéréotaxique nous permettant d’injecter des virus dans une zone très précise du cerveau, particulièrement touchée dans la maladie d’Alzheimer. Cette méthode est stressante pour les animaux et entraîne une douleur post-opératoire pendant environ 48h. L’évaluation des capacités cognitives de nos souris nécessite l’utilisation de tests comportementaux. Nous avons deux tests non-aversifs basés sur le principe de récompense qui nécessite une restriction alimentaire, afin de motiver nos animaux à apprendre ces tests. Cette restriction alimentaire entraine une perte maximale de 10 à 15% du poids initial des souris, privation classiquement utilisée dans ce test, qui peut entraîner un stress léger mais ne met pas en péril le bien-être des animaux.

Devenir

Les animaux injectés passés en tests expérimentaux ne seront pas gardés en vie à la fin de l'expérience et seront utilisés pour des analyses biochimiques ou histologiques.

Remplacement

Ce projet s’intègre dans un projet plus global combinant différents travaux de recherche complémentaires réalisés dans le laboratoire. Beaucoup d’études « in-vitro » sont donc effectuées sur des cellules en amont de l’utilisation de lignées d’animaux pour limiter au maximum leur utilisation. L'évaluation de la cognition et de la mémoire doit se faire via des études comportementales qui ne peuvent se faire que sur des animaux. De plus, les modèles de souris Alzheimer que nous utilisons dans ce projet sont bien référencés et caractérisés.

Réduction

Afin d’utiliser le nombre minimal d'animaux mais de garantir la validité scientifique et statistique des résultats, nous avons évalué via la bibliographie et une étude empirique qu’un nombre minimum de 15 animaux par groupe est nécessaire pour nos tests comportementaux et que 6 animaux par groupe étaient nécessaire pour nos analyses morphologiques et biochimiques.

Raffinement

Pour améliorer au maximum le bien-être des animaux, toutes les mesures sont mises en place tout au long du projet. Le transport est réalisé plusieurs jours avant le début des expérimentations, pour permettre une acclimatation des animaux à leur nouvel environnement et réduire le stress du transport. Les animaux sont élevés en cage collective enrichie avec un nid végétal, sont surveillés régulièrement et des points limites suffisamment précoces ont été mis en place. De plus concernant la chirurgie, un anti-inflammatoire et un anesthésique local sont administrés avant la chirurgie ainsi qu’un analgésique et anesthésique (gazeux) pendant la chirurgie. Nous effectuons également un suivi post-opératoire biquotidien pendant 48h (weekend compris), pour lequel nous avons établi des points limites précoces et des mesures conservatoires adaptées à chaque point limite. Concernant les tests comportementaux (non-aversifs en eux-mêmes) nous devons effectuer une restriction alimentaire chez nos animaux, entraînant une légère perte de leur poids initial.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris, animal pour lequel la manipulation génétique est possible, ce qui permet de produire des modèles mimant les pathologies humaines telles que la maladie d’Alzheimer. De plus, notre laboratoire possède une expertise et le matériel nécessaire pour étudier la mémoire et la cognition chez la souris, ce qui facilitera la mise en place des tests comportementaux chez ces lignées murines. Nous souhaitons évaluer les souris modélisant la maladie d’Alzheimer et leurs contrôles à plusieurs stades de développement afin de 1. Caractériser leur déficit en pattern separation et pattern completion et 2. Tester nos molécules candidates afin de stopper ou retarder ces déficits en intervenant à un âge précoce de la maladie d’Alzheimer. Ainsi, nous utiliserons des souris à deux stades de développement (âge précoce : 4-7 mois ; âge tardif : > 7 mois).

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe tumorale et des traitements par injection, certaines subissant une incision cutanée ou une laparotomie pour exposer un ganglion ou l'intestin à la lumière. Le porteur étudie la migration de lymphocytes régulateurs de l'intestin vers la tumeur pour comprendre la résistance à une immunothérapie. Il affirme qu'il n'est pas possible de reproduire ces interactions immunologiques ex vivo, rendant l'animal vivant "indispensable".

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'étudier les mécanismes de résistance à une des pronicipaux types d'immunothérapie. Notre équipe et d’autres également on montré que le microbiote intestinal joue un rôle important dans la réponse du patient au blocage des points de contrôles immunitaires. Dans une étude récente, nous avons trouvé que le microbiote intestinal dicte l’efficacité thérapeutique du blocage des points de contrôles immunitaires en régulant la migration des lymphocytes T régulateurs (Tregs) de l’intestin à la tumeur et dans les ganglions drainant. En raison du rôle pivot du blocage de ce points de contrôle immunitaire dans les Tregs, nous supposons que la migration des Tregs dérivés de l’intestin pourrait dicter l’efficacité thérapeutique du blocage.

Bénéfices attendus

Cette étude pourrait révéler d’importants mécanismes médiant la résistance aux immunothérapies les plus couramment utilisées à l"heure actuelle, et des informations utiles afin de personnaliser les traitements ou encore de nouvelles cibles de traitement pour améliorer la prise en charge du patient.

Procédures

Les souris seront soumises à des injections de cellules tumorales, pour greffe (une injection, durée 1 minute, anesthésie locale). Les souris auront également des traitements par injection sous anesthésie locale (3 traitements à , Jour 6, 9 et 12, durée 1 minute). Certaines souris subiront des incisions cutanées pour exposition d'un ganglions à la lumière (photoconversion, durée 5 minutes). Certaines subiront une laparotomie pour exposition des instestins à la lumière (photoconversion), durée maximale 15 minutes, sous anesthésie générale, ces souris seront sacrifiés 24h après l'intervention (prélèvements d'organes et de tissus).

Impact sur les animaux

Certains de ces protocoles incluent en plus d'une implantation tumorale, des actes chirurgicaux et des traitements à base d'immunothérapie. L'acte chirurgical entraînera soit une incision cutanée (douleur minime), soit une ouverture du péritoine et donc des douleurs abdominales. L'implatation tumorale ainsi que les traitements peuvent entraîner des pertes de poids (assez rare, car selon nos études précédentes, il n'y a pas eu de perte de poids notable).

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés afin de prélver divers organes pour analyses futures (qPCR, Cytométrie en flux, ELISA, Culturomique)

Remplacement

Il n'est pas possible de reproduire ou modéliser toutes les interactions immunologiques de manière ex vivo. L'utilisation d'animaux vivants est donc indispensable pour répondre à la question scientifique du projet. En revanche, nous avons utilisé les découvertes faites dans les publications précédentes pour optimiser au maximum le plan expérimental.

Réduction

Le nombre de souris par lot a été précisément déterminé par calcul de puissance et en tenant compte du taux de prise des greffes de tumeurs. Les témoins seront regroupés au maximum pour minimiser le nombre total d'animaux.

Raffinement

Pour toutes les procédures, des mesures spécifiques seront prises en compte pour ajuster les attentions portées aux souris selon leur condition : Les souris qui sont porteuses de tumeur seront suivies quotidiennement avec mesure de la taille tumorale et du poids 2 fois par semaine. Les souris ayant une tumeur et subissant une chirurgie feront l'objet d'une attention plus poussée. Une injection de d'antiinflmmatoire sera réalisée une fois la chirurgie finie et également 12h après. Les souris seront surveillées au réveil,puis quotidiennement pour vérifier l'état général et le bon maintien des clips (servant à fermer l'incision, dans le cas où les souris perdent du poids, nous mettrons du dietgel dans le cage. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Génétique proche de celle de l’Homme Les voies de signalisation immunologique des tumeurs sont comparables chez l’humain et la souris. La souris est le moèle de référence dans le domaine de la cancérologie . Le modèle Kaede proposé permettent le suivi des cellules immunitaires in vivo. Cela n'est pas possible chez l'homme (pour des raisons éthiques et techniques, le marquage in vivo des cellules immunitaires dans l'intestin humain, par exemple par des traceurs radioactifs, n'est pas justifiable sur le plan éthique). Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines développées sur un fond génétique C57BL/6 et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité et l’effet des différents traitements sur la réponse anti-tumorale. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines. A cet âge là, le système immunitaire est tout à fait fonctionnel et permet un suivi de plusieurs semaines sans que la souris ne soit trop vieillissante et que son système immunitaire soit en déclin.

860 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis intégrées à un autre projet ou tuées selon la décision du responsable de la lignée. Elles sont issues de nouvelles lignées génétiquement modifiées et mises en reproduction, pour repérer l'apparition d'un phénotype dommageable lié à leur modification génétique. Le porteur présente cette évaluation comme une obligation réglementaire préalable à d'autres recherches en cancérologie ou sur les maladies neurodégénératives. Il affirme qu'aucun remplacement n'est envisageable puisque le projet porte sur la création même des lignées.

Objectifs

Ce projet ne sera utilisé que lorsque l’on supposera que le phénotype (c'est à lire l'ensemble des caractères observables d’un individu) de la nouvelle lignée créée pourrait être dommageable ou à posteriori si un phénotype dommageable était découvert sur une nouvelle lignée de façon inattendue. Pour rappel une souris génétiquement modifiée est un animal dont le génome a été modifié par l'insertion ou le remplacement d'un ou plusieurs gènes. Lorsque l’on souhaite créer de nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées, les recommandations du décret 2013-118 (article R.214-89 et 110) nous imposent d’avoir un projet autorisé par le ministère de l’enseignement supérieur, de la recherche et de l’innovation, pour évaluer tout phénotype, qui pourrait être dommageable vis-à-vis du bien-être des animaux. Afin de répondre à la réglementation en vigueur, l'objectif de ce projet est l’évaluation du caractère dommageable ou non de la modification génétique réalisée sur ces nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées par croisement avec des lignées déjà existantes ou sur un fond génétique particulier et ceci afin de répondre à de nouvelles questions scientifiques en lien avec les thématiques de recherche des instituts de recherche comme par exemple en oncologie, sur les maladies neurodégénératives, sur des pathologies de la grossesse ou sur des modèles de différentes pathologies touchant des organes. Cette procédure a pour vocation de caractériser des effets secondaires possibles ou probables dans une lignée afin de mettre en place ultérieurement, dans une autre DAP si nécessaire, les mesure d'élevage propre à minimiser les nuisances subies par ces animaux. Une recherche ciblée des effets délétaires pressentis comme sévères d'une mutation seront fait dans une DAP spécifique.

Bénéfices attendus

Ces modèles vont permettre de répondre à de nouvelles questions scientifiques en lien avec les thématiques de recherche de l’institut comme par exemple en oncologie, sur les maladies neurodégénératives, sur des pathologies de la grossesse ou sur des modèles de différentes pathologies touchant des organes. Le but de ce projet est de permettre de mieux connaitre l'impact des modifications de leur génome sur le bien être des animaux, et par la suite, de raffiner ces modèles et réduire tout impact sur le bien être de l'animal.

Procédures

Les animaux pourront être mis en reproduction, une fois dans leur vie pendant une durée maximale de 8 mois. Leur comportement, état général, croissance, fertilité, nombre de portées et nombre d'animaux par portée... sera étudié quotidiennement par observation des animaux.

Impact sur les animaux

En cas d'apparition de phénotype dommageable ou de la douleur. La nature de ses effets indésirables est l'objet de cette demande afin de les éviter ou d'y remédier par la suite. Les points limites mis en place visent à ne pas dépasser un stade modéré dans ces diverses catégories, stade auquel l'animal sera mis à mort.

Devenir

A l'issu de la procédure d'évaluation du phénotype, les animaux pourront être gardés en vie et être intégrés à un autre projet de l'équipe de recherche ou euthanasiés sur décision du responsable de la lignée.

Remplacement

Aucun remplacement ne pourra être envisagé puisque ce projet sert à la création de nouvelles lignées et à l'évaluation du phénotype des animaux générés et il est donc impossible de le réaliser in vitro ou in silico.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, la production sera rationnalisée par l’établissement de programme d’élevage afin de produire le nombre minimal d'animaux nécessaires pour évaluer leur phénotype. Seuls seront comptés dans ce projet les animaux présentant un phénotype dommageable. Nos calculs du nombre d'animaux se basent donc sur une estimation majorée de ce que nous pourrions avoir.

Raffinement

Les animaux présentant le génotype d’intérêt feront l’objet d’une surveillance particulière selon les recommandations de l'Union Européenne afin d’établir si ces créations de nouvelles lignées provoquent l’apparition d’un phénotype dommageable vis-à-vis du bien-être animal, et si c’est le cas, des points limites seront mis en oeuvre et éventuellement réadaptés en fonction du phénotype observé pour limiter la souffrance chez les animaux. Les animaux sont hébergés en groupe dans un environnement enrichi. Ils sont observés quotidiennement et des points limites ont été définis afin de prendre en compte d’éventuels effets inattendus pour lesquels il sera décidé de mettre en place un traitement approprié ou une euthanasie.

Choix des espèces

Ce projet a pour but de répondre aux besoins de création de lignées de souris génétiquement modifiés pour les recherches menées dans l’institut dont le modèle animal est la souris. Ces souris génétiquement modifiées permettent notamment de mieux comprendre le fonctionnement et l’utilité de certains gènes et/ou de créer des modèles de pathologies humaines étudiées au sein de l’institut (cancer, maladies neurodégénératives, pathologies de la grossesse, modèles de pathologies diverses,…) Les animaux sont étudiés à tous les stades c’est-à-dire qu’on observe le comportement et l’état physique des animaux à la naissance, au sevrage, à maturité sexuelle voir plus tardivement si le phénotype est susceptible de s’exprimer à un âge avancé.

110 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ou deux chirurgies cérébrales d'environ une heure, puis des tâches comportementales de locomotion fine. Le porteur utilise une lignée porteuse d'une mutation humaine reproduisant la sclérose latérale amyotrophique, qui développe une paralysie progressive du train arrière, et vise à enregistrer l'activité de certains neurones avant l'apparition des symptômes. Il indique que ces neurones, parmi les plus longs de l'organisme, sont impossibles à reconstituer en culture ou à modéliser, d'où le recours à l'animal.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie affectant le système moteur, qui se caractérise par la dégénérescence de plusieurs populations de neurones : ceux contrôlant l’activité des muscles (les motoneurones, situés dans la moelle épinière), ainsi que ceux transmettant l’information provenant du cerveau vers la moelle épinière (les neurones corticospinaux). Notre projet a pour but d’étudier l’activité fonctionnelle des neurones corticospinaux afin de mieux comprendre leur rôle dans l’évolution de la pathologie, dans un modèle murin de sclérose latérale amyotrophique. Plus précisément, nous avons pour objectif de : 1) identifier les neurones corticospinaux sur les enregistrements électrophysiologiques 2) comparer l’activité de ces neurones chez l’animal sain vs. dans un modèle de sclérose latérale amyotrophique, et 3) évaluer le rôle de cette voie dans divers comportements locomoteurs, à un stade peu avancé de la pathologie.

Bénéfices attendus

Chez certains patients SLA, une activité électrique anormale a été détectée dans le cortex moteur. Celle-ci est susceptible de nuire à la communication neuronale vers la moelle épinière, et d’endommager par conséquent les neurones qui, en bout de circuit, contrôlent l’activité des muscles. Grâce à l’analyse de l’activité électrique de neurones dans le cortex moteur d’animaux éveillés libres de leurs mouvements, notre projet va nous informer, avec un degré de détail jamais encore égalé, sur les propriétés électriques de ces neurones et leurs éventuels changements anormaux dus à la sclérose latérale amyotrophique. Notre objectif est de quantifier ces changements internes avant l’apparition des symptômes moteurs. Il est attendu que ce projet améliore de façon significative la compréhension des mécanismes de la sclérose latérale amyotrophique.

Procédures

Les animaux subiront soit une chirurgie unique durant environ 1,5 heure, soit deux chirurgies à 2 semaine d'écart, chacune durant au plus 1 heure. Au minimum une semaine après la dernière chirurgie, les animaux effectueront des tâches comportementales de locomotion fine.

Impact sur les animaux

Les chirurgies entrainent inévitablement un stress et des douleurs chez la souris. Une perte de poids est souvent constatée les jours suivant la chirurgie mais l’animal récupère son poids initial en 3-4 jours. Les sutures peuvent aussi entrainer une gêne ou des démangeaisons qui poussent l’animal à se gratter et, très rarement, à endommager sa cicatrice. Cette gêne disparait également en quelques jours. La lignée SOD1 G93A développe un phénotype dommageable avec des premiers signes cliniques (non invalidants, membre postérieur partiellement affaissé dans le test de suspension de la queue) à P90, puis avec une partie du pied arrière qui traine à partir de P110. Si les animaux seront utilisés avant l’apparition de ces signes dans les procédures 2 et 3, ils seront maintenus au-delà dans la procédure 1 d’élevage, jusqu’à l’apparition d’une atteinte sévère (paralysie du train arrière à P120, âge médian).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement.

Remplacement

Les expériences de ce projet ont pour but d'étudier l’atteinte des circuits locomoteurs chez la souris dans un modèle pathologique. Les neurones étudiés sont parmi les plus longs de l’organisme, allant du cortex à la partie lombaire de la moelle épinière. Ils sont impossibles à reconstituer avec des techniques de remplacement de type culture cellulaire et doivent être intacts pour pouvoir être étudiés. Ils sont impossibles à modéliser numériquement car leur évolution au cours de la pathologie est encore méconnue. Nous devons donc recourir à l’animal pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Les mesures pour réduire le nombre d’animaux ont été étudiées en adéquation avec le projet. Le nombre d’animaux utilisé a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement valides. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire et produire des résultats spécifiques de genre. Afin de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés, les procédures regroupent un ensemble de tests comportementaux dont l'enchaînement est compatible avec le bien-être de l'animal, ce qui permet de réduire grandement l’effectif.

Raffinement

Les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations quotidiennes et l'enrichissement des cages est systématique (bâton à ronger, matériaux de nidification). Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire et la température de l’animal est maintenue grâce çà un tapis chauffant thermostaté relié à une sonde rectale. Les yeux sont hydratés avec un gel oculaire. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement après la procédure chirurgicale et estimé selon une grille de score pondérée qui évalue l'apparence générale de l'animal, l'apparence de la plaie, le comportement spontané, le comportement provoqué et le poids. Des points limites ont été établis pour chaque item permettant de soustraire l’animal à la souffrance. L’âge médian d’apparition des premiers signes de la pathologie est de 90 jours après la naissance, mais il existe toutefois une variabilité individuelle autour de cette date. Nous prévoyons donc un suivi avec observation bi-hebdomadaire des animaux à partir de 76 jours après la naissance. De plus, à partir de cette date, des croquettes alimentaires seront placées dans le fond de la cage, ainsi que de l’aliment gélifié et un biberon à tétine longue afin de faciliter la prise d’eau et d’aliment.

Choix des espèces

Le modèle choisi est basé sur une forme familiale de la SLA chez l’homme, due à une mutation de la protéine SOD1 (G93A). Cette mutation (gène humain), introduite chez la souris entraîne une série de symptômes proches de la SLA. Il s’agit donc d’un modèle pré-clinique bien documenté de la sclérose latérale amyotrophique. Animaux utilisés à partir de 30 jours après la naissance, car c’est l’âge à partir duquel la voie de communication entre le cortex et la moelle a fini son développement

482 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie sont des souriceaux nouveau-nés soumis à des injections dans le foie pour caler le geste technique, avec une mortalité attendue, les autres reçoivent une greffe tumorale et des injections répétées sur plusieurs semaines. Le porteur teste des cellules progénitrices modifiées contre un lymphome, l'application clinique restant présentée comme un espoir à valider. Il affirme qu'aucun modèle in vitro n'obtient des globules blancs matures et que seule la xénogreffe le permet.

Objectifs

Une nouvelle approche thérapeutique pour traiter les patients atteints de cancer consiste à prélever leurs globules blancs en les modifiant pour leur permettre de reconnaitre et de cibler des protéines présentes à la surface des cellules cancéreuses. Après réinjection aux patients, ces cellules modifiées sont ainsi capables de reconnaitre et de détruire spécifiquement les cellules cancéreuses. Elles représentent aujourd’hui un espoir dans le traitement de certaines leucémies réfractaires ou en rechute et ont considérablement amélioré le résultat global des patients. Cependant plusieurs obstacles restent à résoudre dans ce domaine. Tout d'abord, malgré un taux élevé de patients montrant une réponse complète à ce traitement par thérapie cellulaire, la rechute de la maladie reste un défi important avec des taux de survie sans progression inférieurs à 50 %. Après le traitement, la survie à 3 ans est de seulement 16,1 %. Plusieurs raisons expliquent cet échec à obtenir des rémissions durables. La perte précoce, la faible expansion et l'épuisement des cellules thérapeutiques modifiées, sont des facteurs d’échec importants. La reconstitution tardive des cellules immunitaires effectrices possédant une activité anti-tumorale après la thérapie cellulaire, représente un autre défi important. Cette immunodéficience augmente non seulement les risques de rechute, mais entraîne également un taux important d’infection post-greffe. Dans ce contexte, une stratégie d'implantation de cellules progénitrices pourrait contourner certains de ces principaux défis (disponibilité immédiate, expansion efficace et réponse antitumorale durable) en accélérant la reconstitution d'un thymus chez les patients. Le modèle animal développant une tumeur de lymphome, ainsi que l’efficacité des cellules thérapeutiques modifiées matures ont été validés précédemment. Dans le cadre de ce projet, nous allons évaluer l’effet thérapeutique des cellules progénitrices, en suivant notamment la régression des tumeurs, la maturation des cellules anti-cancéreuses et leur persistance in vivo.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de valider et justifier la mise en place d'une stratégie thérapeutique utilisant des cellules progénitrices, et donc d'une plateforme de développement de ces cellules à visée d'utilisation clinique. L’acquisition de ces données est indispensable au développement de cette thérapie innovante, à fort potentiel translationnel. Cette stratégie pourrait offrir des réponses anti-cancéreuses durables et efficaces en contournant les obstacles majeurs reportés à ce jour dans le domaine des immunothérapies pour le cancer.

Procédures

Durant cette étude, nous procéderons à : - des injections intrahépatiques (1X; durée 5 sec); - des injections par voie sous-cutanée (1X/sem pendant 5 semaines; durée 5-10 sec); - des injections par voie intraveineuse (1 ou 2X selon la procédure; durée 2-3 minutes); - des injections par voie intrapéritonéale (6X/sem pendant 6 à 14 semaines selon la procédure; durée 5-10 sec); - des anesthésies sous isoflurane (1X/semaine, pendant 5 à 13 semaines selon la procédure; durée 20 min maximum ); - des prélèvements sanguins par ponction dans la veine temporale superficielle (1X ou 3X maximum selon la procédure; durée 2-3 min); - un prélèvement sanguin par ponction intracardiaque (1X, après euthanasie).

Impact sur les animaux

Les animaux seront maintenus en hébergement en cage individuelle ventilée et manipulés sous hotte par du personnel compétent pour éviter tout risque d’infection lié à leur immunodéficience. Lors de la mise au point de la technique d’injection intra-hépatique, une perte du nombre d’animaux peut être attendue en raison du jeune âge des animaux, ainsi que du rejet de la mère après les manipulations. Par ailleurs, les cellules matures pourraient occasionner au long cours une réaction des globules blancs humains contre les tissus de souris. Cet effet peut être observé chez la souris immunodéficiente greffée depuis plus de six mois avec des cellules-souches sanguines humaines. Bien que cet effet soit moins attendu avec les cellules progénitrices grâce à leur maturation dans le thymus de la souris, et donc une tolérance contre les cellules murines, la durée de nos études ne dépassera pas six mois pour éviter cet éventuel effet indésirable. D'autre part, ce projet comprenant l’apparition de tumeurs, le bien-être des animaux sera surveillé de manière attentive. Le poids des animaux et la croissance tumorale suivie par imagerie seront ainsi enregistrés tout au long de l’étude. Enfin, des difficultés respiratoires peuvent apparaitre, signe de présence de cellules tumorales au niveau des poumons, ou de métastases.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des procédures afin de prélever le sang en vue d'analyses post-mortem.

Remplacement

Toutes les étapes visant à améliorer la performance du produit de thérapie cellulaire ont été mises au point avec des expériences exclusivement in vitro et notamment des caractérisations du produit final par des méthodes de séquençage et d'analyse de populations cellulaires. Néanmoins il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’obtenir les globules blancs matures du point de vue fonctionnel. La seule méthode existante consiste en un système de co-culture des cellules-souches sanguines avec des cellules-souches nourricières . Bien que ce modèle permette d’obtenir des globules blancs exprimant les marqueurs de différenciation, les cellules n’atteignent pas la maturité fonctionnelle. Seule l’injection dans un modèle de xénogreffe permettra de répondre à ce point, modèle où le greffon provient d'une espèce différente du receveur, respectivement cellules d'origine humaine implantées dans un modèle de souris. Cette xénogreffe permettra la maturation et la différenciation complète des progéniteurs des globules blancs dans l’environnement du thymus de la souris. Les expériences chez l’animal interviennent donc au terme d’un long processus et s’inscrivent dans le cadre d’une validation in vivo de l’effet thérapeutique de ces cellules avant un développement clinique.

Réduction

La première étape de ce projet vise à acquérir le geste technique d’injection intra-hépatique chez le souriceau nouveau-né, notamment la reproductibilité du mode opératoire et l’inter-opérabilité, ainsi que le suivi de la survie des animaux. Nous utiliserons à cet effet 4 portées par stade post-natal, soit environ 152 souriceaux agés de 0 à 3 jours. Il n'y aura pas d'analyse statistique pour cette première étape de mise au point technique. La deuxième étape du projet consiste à injecter les cellules progénitrices et à valider leur effet thérapeutique dans un modèle de cancer . Le produit avec lequel nous envisageons d’effectuer les tests fonctionnels in vivo a été optimisé au préalable, augmentant ainsi la probabilité d’obtention de réponses favorables dès les premières séries d’expérimentations. Par ailleurs, le modèle animal choisi dans cette étude est un modèle murin immunodéficient, utilisé avec succès comme souris receveuses de greffe de cellules-souches sanguines humaines. L’utilisation de ces souris nous permettra d’obtenir des résultats homogènes et de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental; nous utiliserons ainsi 6 souris par groupe et par condition. En utilisant des tests statistiques non paramétriques, selon le paramètre mesuré (croissance tumorale, poids des souris, analyse des globules blancs), nous réaliserons des études permettant de mettre en évidence des différences significatives entre les groupes expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en hébergement en cage individuelle ventilée et manipulés sous hotte par du personnel compétent pour éviter tout risque d’infection lié à leur immunodéficience. Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Une surveillance quotidienne de l'état de santé des animaux sera assurée, avec un suivi de leur poids et de la croissance tumorale. En cas de signe de souffrance, le personnel qualifié et le vétérinaire pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes sont utilisées avec succès comme souris receveuses de greffe de cellules humaines. Cette lignée ne présente pas de phénotype dommageable. Le profond déficit immunitaire de ces souris permet la prise de greffe de cellules-souches sanguines humaines, et offre la possibilité d’étudier l’effet d’immunothérapies avec des cellules humaines dans un hôte murin. Ce modèle est notamment très utilisé pour tester l’efficacité anti-cancéreuse de globules blancs modifiés ou de leurs cellules progénitrices. Par ailleurs, le thymus de ces souris, tout comme celui des patients atteints de déficits immunitaires ou conditionnés pour recevoir une allogreffe de cellules-souches sanguines (greffon et hôte de même espèce), sont caractérisés par une atrophie majeure et une architecture altérée. Ces souris présentent donc un environment similaire à celui des patients. Nous utiliserons des souris nouveaux-nés (P0), permettant une bonne prise de greffe des cellules progénitrices. Nos précédentes études ont démontré que les cellules progénitrices pourraient se greffer dans le thymus sans conditionnement (irradiation ou chimiothérapie) chez les souriceaux nouveau-nés (0 à 3 jours post naissance). Une fois cette période passée, afin d’obtenir une prise de greffe dans le thymus, il faut irradier les animaux et co-administrer les cellules progénitrices modifiées avec les cellules souche hématopoïétiques.

42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une administration orale quotidienne pendant huit semaines et des pesées hebdomadaires, avec un risque de fausse route lors du gavage. Le porteur mesure l'accumulation musculaire d'un composé X pour le compte d'un client, un éventuel médicament contre la faiblesse musculaire restant renvoyé aux étapes suivantes. Il affirme qu'il n'existe "pas de modèle de substitution suffisamment prédictif" pour un traitement chronique chez l'animal entier.

Objectifs

Le présent projet constitue une étape préliminaire visant à étudier la capacité du composé X à s'accumuler au niveau tissulaire (et tout particulièrement au niveau musculaire) afin d'atteindre des quantités seuils nécessaires à son activité biologique. Il s'agit donc d'une étude d'accumulation tissulaire à long terme (56 jours d'administration). L'étude sera néanmoins optimisée par une analyse de la composition des fibres musculaires afin d'obtenir des premiers indices d'efficacité.

Bénéfices attendus

Ce projet constitue une phase préliminaire dans le développement du composé X visant, en premier lieu, à étudier la propriété pharmacocinétique d'accumulation tissulaire. Si ce paramètre s'avère satisfaisant, le développement du composé X sera poursuivi dans les étapes précliniques (efficacité et sécurité) et clinique. A terme, le composé X pourrait devenir un médicament visant à traiter la faiblesse musculaire chez l'adulte pathologique ou liée au vieillissement.

Procédures

Les animaux seront pesés une fois par semaine pendant 10 semaines. Ils recevront également des administrations quotidiennes par voie orale pendant 9 semaines (1 semaine pour les habituer à la voie d'administration et 8 semaines de traitement).

Impact sur les animaux

L'ensemble des traitements quotidiens par voie orale et les pesées hebdomadaires peuvent être source de nuisances pour les souris. En effet, ces procédures nécessitent une brève manipulation des animaux qui peut être source de stress. Par ailleurs, bien que cela soit extrêmement rare, les traitements par gavage sont susceptibles d'être source de fausses routes. Dans ce cas, l'animal concerné serait immédiatement euthanasié.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des analyses biochimiques et histologiques sur les organes qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.

Remplacement

Les composés testés ont d'abord été développés à l'aide de méthodes sur cultures cellulaires (myocytes) et sur explants tissulaires (muscle gastrocnémien) afin de déterminer leur action sur l'activité mitochondriale. Des résultats positifs ayant été obtenus dans ce cadre, il est nécessaire de vérifier que les données restent cohérentes sur l'animal entier. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe pas de modèle de substitution suffisamment prédictif pour garantir une bonne accumulation tissulaire d’un composé dans le cadre d'un traitement chronique chez l'animal entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire et par notre client sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de réaliser les dosages tissulaires du composé X (4 animaux/groupe) et de réaliser par ailleurs les analyses relatives à l'activité mitochondriale et à la composition des fibres musculaires (5 animaux/groupe). Nous avons donc fixé à 9 le nombre d'animaux nécessaire pour chacun des groupes. Concernant les groupes constitués de souris âgées (21 mois à réception), nous avons ajouté 3 animaux supplémentaire par groupe afin de prendre en compte la mortalité naturelle attendue entre 21 et 23 mois d'âge. Le projet emploiera donc un total de 2 x 9 + 2 x 12 = 42 souris.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés par groupes de 3 par cage afin de leur permettre de maintenir une interaction sociale. Un enrichissement sera apporté sous forme de dômes en cartons et de matériel de nidification spécifiques pour rongeur de laboratoire. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis, notamment l'emploi d'analgésie (buprénorphine) pour soulager la douleur le cas échéant.

Choix des espèces

La physiologie musculaire est bien documentée dans la littérature chez la souris c57Bl/6, ce qui permettra des comparaisons avec les résultats obtenus au cours de la présente étude. Par ailleurs, le client de l'étude a déjà obtenus des résultats préliminaires sur ce même modèle avec d'autres composés en développement et souhaite donc conserver le modèle à des fins de comparaison. La partie des animaux seront au stade jeune adulte (8 semaines) alors que l'autre sera au stade de souris âgées (21 mois). Ces stades de développement correspondent aux âges des population cibles du composé X en développement (jeune adulte pathologique ou sujets âgés).

170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis trois injections de traitement par semaine pendant huit semaines, avec un suivi de la tumeur au pied à coulisse. Le porteur teste un pro-médicament censé cibler le métabolisme des cellules cancéreuses, les retombées thérapeutiques restant renvoyées à de futures approches. Sur le remplacement, il affirme qu'il est "absolument nécessaire" de recourir à un modèle in vivo, aucune méthode ne reconstituant selon lui la complexité du système immunitaire.

Objectifs

Les cellules tumorales sont souvent caractérisées par un niveau élevé des espèces réactives de l’oxygène mais aussi par des composants cellulaires déficients (mitochondries). C’est pourquoi les cibler simultanément représente une stratégie de traitement intéressante. Des expérimentations in vitro ont permis de déterminer qu’un agent ciblant les espèces réactives et les mitochondries a une action cytotoxique sur des lignées cancéreuses et induit la production d'espèces réactives mitochondriales. Nous souhaitions confirmer in vivo l’effet anti-tumoral de ce composé. L’analyse des tumeurs après traitement nous informera sur la capacité de cette molécule à stimuler les réponses immunitaires anticancéreuses et donc à rétablir une immunosurveillance défaillante caractéristique des tumeurs. Si notre hypothèse est validée, nous testerons aussi l’effet de cet agent en présence d’une chimiothérapie immunogène et stimulant le système immunitaire.

Bénéfices attendus

. Ce projet permettra de valider in vivo l’application thérapeutique d'une nouvelle classe de molécule en ouvrant ainsi des nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Toutes les souris recevront des injections de cellules tumorales une fois. Cette procédure durera en moyenne 5 min. Par la suite, les souris seront manipulées brièvement 1min à chaque fois pour mesurer la croissance tumorale. Tous les animaux recevront 3 injections de traitement sous anesthésie locale par semaine, pendant 8 semaines. L’injection prend 1 min.

Impact sur les animaux

Les nuisances découleront des interventions et greffes suite à une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie, des injections de traitements intra péritonéaux par contention de l’animal avec anesthésie locale, des suivis de croissance tumorale par contention de l’animal vigile à l'aide d'un pied à coulisse 3 fois par semaine. Ces différentes manipulations pouvant entrainer du stress chez l’animal. Les traitements chimiotherapeutiques peuvent entrainer une perte d’appétit et donc une perte de poids chez la souris.

Devenir

Toutes les souris ayant reçu des cellules cancéreuses, elles seront euthanasiées en fin de procédure.

Remplacement

Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenus in vitro. Ce projet ayant pour objectif de tester si notre composé induit une réduction de la croissance tumorale et une activation du système immunitaire, il est nécessaire d’utiliser un modèle mimant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité. Il est donc absolument nécessaire pour ce projet d’utiliser un modèle in vivo.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de d'une taille permettant une évaluation statistique solide des effets analysés. Le calcul de puissance nous a permis de calculer le nombre de souris nécessaires par groupe . Nous regrouperons les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux témoins. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids, de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation. Des mesures seront prises pour limiter le stress: plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux,, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réaliséés sous anesthésie générale ou locale selon le geste à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limite ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Plusieurs justifications d’ordre scientifique, pratique et éthique sont à la base du choix de la souris comme modèle préclinique, notamment le fait que la souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale. Cela permet de travailler sur un modèle de mammifère suffisamment petit pour en avoir un certain nombre, suffisamment grand pour une mise en place des méthodologies envisagées relativement aisée et dont la génétique est la mieux connue. La souris est le modèle le plus utilisé dans notre centre de recherche, ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. De plus, la pratique expérimentale que nous avons acquise sur cette espèce est désormais confirmée. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.