Procédures modérées

1170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une sécheresse oculaire est provoquée par mutation génétique ou par instillation quotidienne d'un conservateur allergène, puis des tests de douleur et des échographies sont menés, avant la mise à mort pour analyses. Le porteur indique qu'aucun analgésique ne peut soulager cette douleur oculaire, c'est le paramètre évalué. Il présente les résultats obtenus chez le rat comme "très encourageants" et défend une molécule sous brevet.

Objectifs

La sècheresse oculaire (Dry Eye Disease ou DED) est l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie. Sa prévalence varie de 5 à 35 % chez des sujets âgés de plus de 50 ans. Cette pathologie du segment antérieur de l’oeil est caractérisée par des sensations de douleur variables en intensité, allant du simple inconfort à une douleur oculaire prononcée. Les douleurs oculaires sont très difficiles à traiter et leurs mécanismes physiopathologiques demeurent peu connus. Nous avons récemment conçu une molécule qui induit la sécrétion d’eau à partir des glandes lacrymales. Une simple goutte de cette molécule dans les yeux de rats augmente la production de larmes pendant 24h au moins. Notre projet a pour but d’apporter la preuve de concept nécessaire pour proposer cette molécule comme thérapie de la sécheresse oculaire en recherchant 1) si la composition des larmes induites est équilibrée et stable au cours du temps et 2) si, en induisant cette sécrétion naturelle, la molécule prévient l’inflammation et réduit l’activation des nocicepteurs responsables de la douleur oculaire. Nous utiliserons deux modèles de souris complémentaires, validés pour l’étude du DED : l’un, pharmacologique, permettant d’étudier la mise en place et la progression du syndrome, et l’autre, génétique, présentant une anomalie des glandes lacrymales pouvant mimer une sécheresse oculaire modérée. Les effets de la molécule d’intérêt (sous brevet) seront analysés dans chaque modèle in vivo en utilisant différents tests (nociception, volume des larmes et aspect de la cornée) et post mortem par des techniques de biologie cellulaire et histologie. Cette étude chez l'animal est un prérequis pour évaluer de manière intégrée les conséquences d'un traitement du DED par notre molécule. Au total ce projet utilisera au maximum 1170 animaux dans le respect de la règle des 3R. Grâce à nos études préalables in vitro, nous avons déjà caractérisé le mode d'action de la molécule et ses effets (remplacement). Le recours aux séances d'habituation et à l'anesthésie gazeuse légère et rapide permet de limiter le stress des animaux (raffinement). Enfin, les prévisions obtenues avec l'utilisation de logiciels statistiques nous permet d'anticiper le nombre optimal d'animaux pour obtenir des résultats significatifs et reproductibles et nous réduirons en cours de projet ce nombre dès lors que nos résultats nous indiqueront que nos données sont suffisamment robustes (réduction).

Bénéfices attendus

La sécheresse oculaire est à l’origine d’une douleur oculaire chronique pouvant être accompagnée de troubles de la vision, de photoallodynie (sensibilité accrue à la lumière) et de dommages de la surface oculaire, et elle représente l’un des principaux motifs de consultation en ophtalmologie. C’est le plus important signe d’alerte en réaction à une inflammation ou à un traumatisme des structures du segment antérieur de l’oeil (cornée, conjonctive, sclère et structures uvéales). Elle affecte la qualité de la vie et près de 60 % des patients se déclarent gênés dans leurs activités quotidiennes. En outre, 80 % des patients qui souffrent de douleur oculaire ne l’estiment pas suffisamment prise en considération tant par leur entourage que par leur médecin. La douleur chronique oculaire est très difficile à traiter et les mécanismes physiopathologiques, de nature neurogène et/ou inflammatoire, demeurent de nos jours très mal connus. Les traitements actuels sont invasifs, peu efficaces et diminuent la qualité de vie des patients. De ce fait, la sécheresse oculaire est considérée comme un désert thérapeutique malgré son incidence grandissante liée au vieillissement global de la population, l’augmentation du recours à la chirurgie réfractive, l’usage des écrans et la pollution environnementale. La molécule que nous avons caractérisée représente donc une stratégie thérapeutique prometteuse: en effet, une expérience pilote menée sur le rat a montré clairement que l'administration de cette molécule permet de restaurer une production de larmes équivalente à celle des rats contrôles, ce qui nous permet d'envisager que cette molécule soulagera efficacement la sécheresse oculaire. Le protocole mené chez la souris sera similaire à celui utilisé chez le rat, à la simple différence que rats et souris sont caractérisés par des seuils de sensibilité légèrement différents mais très bien caractérisés que nous prendrons en compte. Les bénéfices suceptibles de découler de ce projet sont une avancée significative dans la prise en charge de la sécheresse oculaire et un premier pas vers la création du médicament et l'industrialisation de ce traitement.

Procédures

Un phénotype de sécheresse oculaire modérée sera induit chez les animaux soit génétiquement soit pharmacologiquement par administration quotidienne dans l'oeil pendant 7 jours d'un produit conservateur allergène. Chaque procédure dure 5 à 6 semaines. Le test d'évaluation de la gêne/douleur associée à la sécheresse oculaire dure environ 1h. Les tests de mesure du volume et de la stabilité des larmes et l'échographie Dopler seront réalisés sous anesthésie légère (15-20 minutes). Les groupes d'animaux étudiés subiront entre 1 et 4 fois fois la série de tests (avec une semaine d'intervalle entre chaque série de tests).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont associés à la sécheresse oculaire qui sera induite soit par le BAC (conservateur traditionnellement utilisé dans les gouttes pour les yeux et le nez chez l'homme et décrit pour induire une sensibilisation) soit par la mutation Tabby qui induit une réduction de la taille des glandes lacrymales et donc une réduction de la production de larmes. Ces deux modèles murins présentent donc une sécheresse oculaire d'intensité modérée. Cette sécheresse oculaire engendre potentiellement un inconfort voire une douleur (comme chez certains patients humains) qui ne pourront être soulagés par des analgésiques puisque c’est ce paramètre (et son soulagement) que nous évaluerons. Nos résultats pilotes obtenus sur le rat indiquent clairement que notre molécule soulage efficacement cet inconfort et nous laissent envisager des résultats très positifs pour ce projet puisque nous utiliserons le même protocole. Nous compenserons et limiterons l'inconfort et les nuisances infligées aux animaux par l’observation stricte de points limites spécifiques et adaptés. Les effets du traitement seront évalués sur 28 jours puis les animaux seront mis à mort. Les animaux auront 3 mois lors de leur entrée en procédure. La durée des nuisances et effets indésirables auxquels ils seront exposés sera donc de 6 semaines maximum pour les souris BAC (habituation aux tests la semaine précédant le démarrage du protocole, 1 semaine d'établissement du phénotype et entre 1 et 4 semaines de traitement et de tests) et de 4,5 mois pour les souris Tabby (à l'âge de 3 mois, habituation aux tests la semaine précédant le démarrage du protocole, et entre 1 et 4 semaines de traitement et de tests).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses histologiques post mortem.

Remplacement

Nos études préalables ont permis de caractériser et de breveter la molécule d'intérêt, de déterminer sa structure et son mode d'action dans différentes cultures cellulaires sur le transport de chlore. De plus, nous avons établi une première collaboration qui nous a permis de montrer que l'administration de cette molécule dans l'oeil de rat wild-type induit la sécrétion naturelle de larmes et qu'elle restaure un volume normal de larmes dans un modèle de rats atteints de sécheresse oculaire. Ces résultats préliminaires sont très encourageants et justifient le développement de la partie in vivo de ce projet et sa prématuration pour développer et industrialiser la molécule comme stratégie thérapeutique novatrice. Cette phase de prématuration du projet exige maintenant un système biologique intégré tel qu’un organisme vivant pour caractériser précisément et quantifier les effets de la molécule in vivo. Le syndrome de sécheresse oculaire est d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Son apparition et sa gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts (neuro-inflammation etc) et les études sur l’animal intact sont essentielles et ne peuvent être remplacées. Ceci ne peut malheureusement pas être modélisé in vitro à ce stade du projet. Néanmoins, nous mènerons en parallèle des analyses protéomiques sur des cultures immortalisées de cellules de l'oeil.

Réduction

Le nombre d‘animaux correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs. Il sera réduit chaque fois que possible, et toute expérience rendue inutile par des résultats précédents obtenus ne sera pas réalisée. Nos prédictions suggèrent que des lots de 10 animaux par condition permettront une analyse statistique valide permettant d’exclure toute répétition additionnelle. Nous anticipons et choisissons a priori d’inclure 15 animaux/groupe par précaution, et nous réduirons ce nombre dès lors que les résultats seront statistiquement significatifs et en particulier si les deux sexes donnent des résultats similaires. Les rares médicaments utilisés pour réduire la sécheresse oculaire sont peu efficaces et nécessitent des administrations quotidiennes répétées (3 à 6 fois), ce qui représente un inconvénient majeur pour les patients. Nous avons donc décidé d'administrer notre molécule 1 ou 2 fois par jour maximum, et d'évaluer son effet après 1 ou 2 applications. Cependant, l'effet après 1 application sera évalué en 1ere intention, l'effet après 2 applications étant évalué seulement si les résultats avec 1 application montrent une efficacité partielle. Si l'étude après 1 seule application donne les résultats escomptés, nous ne procèderons pas à l'analyse de 2 applications et le nombre d'animaux sera donc réduit de moitié. Au total, nous utiliserons 1170 animaux maximum.

Raffinement

Notre expertise nous permet de mettre en place des conditions de raffinement adaptées et de réaliser les gestes techniques requis de manière précise et rapide. Nous porterons une attention particulière à limiter au niveau le plus faible le stress occasionné aux animaux. Ceux-ci seront hébergés et manipulés avec calme dans un environnement limitant toute source de nuisances, dans une salle calme uniquement dédiée à ces tests dans laquelle nous pouvons moduler l'intensité lumineuse et avec un équipement spécialement conçu pour la bonne réalisation des procédures. Ainsi, nous mettrons en place des séances d'habituation en amont de chaque test et nous réaliserons certains de ces tests sous anesthésie gazeuse légère. En cours de procédure, nous suivrons les animaux en nous appuyant sur une grille de score permettant de mettre en oeuvre des points limites précoces et un arbre décisionnel: utilisation de solutions analgésiques oculaires en fonction de l'aspect de l'oeil (oeil fermé, sécrétions) et du comportement de l'animal (démangeaisons...) ou mise à mort en cas de souffrance. Les animaux seront hébergés avec un environnent enrichi, sans isolement, en accord avec la réglementation en vigueur. Enfin, l'utilisation de l'imagerie par échographie-Dopler représente un avantage dans le respect de la règle des 3R et permet non seulement de réduire le nombre d'animaux mais de diminuer leur manipulation car c'est une technique non invasive et rapide sous anesthésie.

Choix des espèces

Nous avons choisi Mus musculus comme modèle d’étude en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Les deux modèles murins reproduisant le syndrome de l’œil sec (DED, Dry Eye Disease) sont des modèles validés et classiquement utilisés dans la littérature. Des animaux âgés de 3 à 5 mois seront utilisés. A cet âge les animaux sont de jeunes adultes, ce qui nous permet de déterminer l'efficacité de notre molécule sur la physiologie oculaire en nous affranchissant de biais potentiels liés au vieillissement.

945 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage quotidien pendant un mois, un rasage et des injections de cellules tumorales, avec un suivi de la croissance des tumeurs, avant la mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur indique que les lignées transgéniques développent dès trois semaines une tumeur de l'œil qui métastase à la peau, aux poumons et aux ganglions, avec une baisse de l'acuité visuelle. Il présente l'amélioration de la prise en charge des patients comme un bénéfice conditionnel.

Objectifs

Le mélanome cutané est un cancer de la peau à haute capacité métastatique responsable de nombreux décès chaque année. Ces dernières années, les nouvelles immunothérapies restaurant les fonctions protectrices du système immunitaire ont permis d'améliorer le pronostic vital des patients. Néanmoins 60% d’entre eux résistent à ces nouveaux traitements, d’où la nécessité d’identifier de nouveaux marqueurs pronostiques ou de résistance à l’immunothérapie. Du fait de ses propriétés pro-tumorales, notre protéine d'intérêt a émergé comme une nouvelle cible thérapeutique potentielle. Nous nous intéréssons plus particulièrement à son rôle délétère sur le système immunitaire. Sachant qu'elle est principalement exprimée par des cellules immunitaires associées à un mauvais pronostic, nous émettons donc l’hypothèse qu’elle favorise leurs fonctions pro-tumorales. Nous souhaiterions déterminer le rôle spécifique de chacune des cellules exprimant l'enzyme dans le développement du mélanome.

Bénéfices attendus

Nous déterminerons comment notre enzyme affecte la fonction des cellules immunitaires dans le contexte du mélanome. Ce projet permettra de mieux comprendre le mécanisme d'action de l'enzyme afin, à terme, de mieux la cibler. En combinaison avec les immunothérapies actuelles, la prise en charge des patients atteints de mélanome métastatique sera donc améliorée.

Procédures

Gavage quotidien sur souris vigiles (5 minute/gavage/souris) pendant 1 mois soit 30 gavages/souris au total. Rasage sur souris vigiles (5 minutes/souris). Une injection sous cutanée d'1M de cellules tumorales sur souris vigiles (5 minutes/injection/souris). Une injection par voie intra-veineuse d'1M de cellules tumorales sur souris vigiles (6 minutes/injection/souris). Evaluation de la croissance tumorale 3 fois par semaine par mesure de la taille des tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse sur souris vigiles.

Impact sur les animaux

Les lignées transgéniques présentent un phénotype dommageable : elles développent une tumeur primaire au niveau de l'oeil dès l'âge de trois semaines qui métastase rapidement au niveau de la peau, puis des poumons et des ganglions. Les principales nuisances attendues sont un trouble du comportement et une diminution de l'acuité visuelle de ces souris due au développpement de la tumeur primaire. Les souris transplantées peuvent présenter une tumeur ulcérée ainsi qu'un trouble du comportement. La transplantation intra-veineuse de cellules tumorales peut exceptionnellement induire une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale pour analyse de la composition immunitaire des différents organes prélevés (tumeur primaire, métastases, ganglions drainants et non drainants, rate, péritoine).

Remplacement

Des expériences préliminaires ont été réalisées in vitro pour étudier les conséquences sur les fonctions de différentes cellules immunitaires. Des expériences de stimulation in vitro ont également été réalisées pour déterminer quelles sont les cellules qui expriment l'enzyme. Cependant, le recours à un modèle animal est indispensable car la complexité de la réponse immunitaire in vivo dans la tumeur et les organes lymphoïdes secondaires des vertébrés ne peut être reproduite par des méthodes alternatives in vitro ou ex vivo.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Ainsi, les expériences reposant sur le modèle de souris transgénique de mélanome spontané nécessitent 40 souris par groupe. Le modèle de transplantation de cellules tumorales présente l’avantage d’être fortement reproductible d’une souris à l’autre. Ainsi, les expériences de transplantation de mélanome nécessiteront des groupes de seulement 10 souris.

Raffinement

Nous avons défini des points limites adaptés aux différents modèles utilisés et au delà desquels les animaux seront mis à mort. Ainsi, l’état général des animaux sera suivi lors des changes par le personnel qualifié de l'animalerie (apparence physique, changement de comportement). Tout état anormal sera communiqué aux responsables de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en oeuvre (euthanasie). De plus, les souris RET seront diagnostiquées une fois par semaine par les responsables de projet pour suivre l'évolution du mélanome. La tumeur sous-cutanée des souris transplantées sera mesurée trois fois par semaine afin de surveiller l'aspect et la croissance tumorale. Les animaux injectés par des cellules B16 en IV seront pesés à J0, J7 et J12. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés.

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la réponse immunitaire anti-tumorale, de nombreuses voies étant conservées entre la souris et l'homme. De plus, les souris transgéniques développant une tumeur spontanée permettent de comparer la réponse immune à différents stades du développement du mélanome (à un stade précoce ou tardif de la maladie). Ce modèle est relevant cliniquement par rapport à la pathologie humaine et permettra d’étudier les cellules immunes au sein d’une tumeur qui vient de se développer, ce qui est éthiquement impossible à partir de mélanome primitif chez l’homme. Enfin la disponibilité de modèles transgéniques permet d'étudier finement le rôle de l'enzyme dans le contexte tumoral. Le modèle de transplantation des cellules de mélanome, largement utilisé, présente l’avantage d’être reproductible d’une souris à l’autre et ne requiert pas un grand nombre de souris par groupe. Les données obtenues dans ces trois modèles seront complémentaires. Tous les animaux seront utilisés à l'âge adulte (>6 semaines) car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral.

1080 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de tumeurs implantées sous la peau ou en profondeur, elles subissent des injections, des séances d'imagerie et une illumination laser de la tumeur sous anesthésies répétées, avant la mise à mort pour analyse des organes. Le porteur résume les bénéfices attendus au "développement de nouvelles nanoparticules PDT et de nouveaux traitements pour le cancer". Il affirme que la biodistribution ne s'obtient que sur l'animal, sans autre modèle possible.

Objectifs

La PDT (thérapie photodynamique) consiste à sensibiliser les tissus cancéreux à l’action de la lumière par l’injection préalable d’une molécule photosensibilisante préférentiellement captée et retenue dans les tumeurs cancéreuses. Après injection intraveineuse du photosensibilisant en soi inactif, celui-ci va être capté et fixé préférentiellement par les tumeurs cancéreuses pour des raisons diverses. Dans un deuxième temps, l’exposition de la tumeur à une lumière de type laser va provoquer une photo activation définie par le changement d’état des molécules chromophores induit par la lumière. La molécule excitée possède un excès d’énergie qu’elle va perdre rapidement et spontanément soit sous forme de chaleur, soit en émettant une fluorescence (photo diagnostic), soit enfin, en passant par un état intermédiaire dit «triplet» responsable des phénomènes de photosensibilisation. La cytotoxicité induite par la PDT est donc principalement le fait de phénomènes d’oxydation entraînant la dégradation des acides aminés, de certaines bases nucléiques et des lipides composant les membranes cellulaires et les mitochondries. La thérapie photodynamique est une méthode thérapeutique originale et séduisante ; après une période de doute, un renouveau apparaît grâce à l’apport de nouvelles technologies, notamment au niveau des sources de lumières laser plus accessibles sur le plan financier et technique et aussi par le développement actuel de nouvelles molécules photosensibilisantes plus adaptées aux différentes pathologies cancéreuses. Le but ici sera d'évaluer l'efficacité de plusieurs nouvelles nanoparticule PDT.

Bénéfices attendus

Développement de nouvelles nanoparticules PDT et de nouveaux traitements pour le cancer.

Procédures

Dans le cadre du développement de tumeurs sous-cutanée, les animaux subiront des injections sous-cutanées sous anesthésie gazeuse (1 fois, 2 minutes). Dans le cadre du développement de tumeurs orthotopiques, les animaux subiront des procédures chirurgicales d'implantations orthotopiques de cellules cancéreuses dans leur environnement, sous anti-douleurs et sous anesthésie gazeuse (1 fois, 10 minutes) puis des injections intrapéritonéales chaque semaine dans le cadre du suivi par bioluminescence (1 fois par semaine, 1 minute)suivi d'une anesthésie gazeuse le temps de l'imagerie (1fois par semaine, 5 minutes). Dans le cadre des procédures d’imagerie, les animaux subiront une injection IV sous anesthésie gazeuses (1 fois, 2 minutes) puis seront simplement anesthésiés au gaz pendant l'imagerie (6 fois, 5 minutes). Dans le cadre des procédures d'efficacité PDT les animaux subiront une illumination de la tumeur sous anesthésie gazeuse (3 fois, 5 minutes).

Impact sur les animaux

Dans cette étude la principale nuisance attendue sera une exposition répétée à l'anesthésie gazeuse (pour l'implantation de tumeurs, pour l'imagerie et pour l'illumination des tumeurs). Certaines souris subiront une chirurgie pouvant également entrainer des nuisances (contrôlées grace à des antidouleurs). Ces souris auront également chaque semaine une injection intrapéritonéale.

Devenir

A l'issus des procédures 1 et 2, les animaux sont mis à mort pour analyse des organes en fluorescence invivo. A l'issus des procédures 3 et 4, les animaux sont mis à mort pour analyse des organes en histologique

Remplacement

Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de composés/particules à tester ainsi que le nombre de lignées de cellules. Les paramètres de biodistribution sont obtenus uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés afin d’obtenir des résultats significativement exploitables et valides. Les nombres de souris indiqués par condition sont nécessaires pour une analyse statistique fiable, évitant de refaire l’expérience. (test satistique utilisé : Mann and Whitney). De plus, comme expliqué dans le projet, si la bioditribution d'une nanoparticule n'est pas satisfaisante, nous ne la passeront à l'étape P2, ce qui permettera de réduire le nombre d'animaux réelement utile à l'étude.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales seront réalisées dans un établissement autorisé et en stricte conformité avec le comité local de protection des animaux, les lignes directrices de l'UE (directive 2010/63/UE) et le Comité national français (2010/63). Les animaux seront hébergés et surveillés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément. La conception et l’application des procédures expérimentales, le soin et l’hébergement des animaux seront effectuées par du personnel compétent et formé. La plus grande vigilance sera apportée aux animaux afin de prévenir, minimiser et/ou abroger la souffrance et le stress. La mise à mort sera faite sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Les souris immunodéprimées permettent le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. Les méthodes utilisées pour induire une tumeur sont rapides et reproductibles et la bonne connaissance de ces modèles de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont bien connues. Les modèles animaux permettent d’avancer dans la mise au point de nouvelles thérapies et procéder à leur évaluation préclinique avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. La souris est l’espèce la plus adaptée et la mieux décrite pour la mise en oeuvre de protocoles de thérapie in vivo. Les souris seront utilisées à 5 semaines. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes avec une prise tumorale optimale.

77 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans le muscle de la jambe, après incision, une injection de cardiotoxine et de vésicules extracellulaires, avant l'euthanasie pour prélever les tissus. Le porteur indique n'avoir pas observé de nuisance importante lors d'injections comparables antérieures. Il affirme que l'animal est le "seul organisme vivant" permettant d'étudier l'effet de ces vésicules sur un muscle lésé.

Objectifs

Les objectifs du projet sont de déterminer in vivo les impacts de deux types de Vésicules Extracellulaires (microvésicules et exosomes) produits par les macrophages au cours du diabète de type 2 sur le processus régénératif musculaire.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de déterminer si les Vésicules Extracellulaires relarguées par les macrophages au cours du diabète de type 2 affectent le métabolisme du muscle squelettique et participent à l'apparition d'une sarcopénie qui se caractérise par une diminution de la masse musculaire, de la force musculaire et des performances physiques, bien connue chez les patients diabétiques. Le rôle de l'inflammation musculaire, et plus particulièrement le rôle du dialogue macrophage-muscle est peu connu et ce projet permettra d'identifier des mécanismes nouveaux permettant d'expliquer la dégradation du métabolisme musculaire. Ce projet permettra aussi de travailler sur l'environnement du muscle faisant intervenir d'autres types cellulaires : les cellules immunitaires, les fibroblastes, les cellules satellites

Procédures

En dehors de l’injection de cardiotoxine et de Vésicules Extracellulaires, les animaux ne seront pas soumis d’autres interventions. La chirurgie consistera a réaliser une incision cutanée de 2 à 3 mm pour aller cibler le muscle TA (Tibial Antérieur) et y injecter en un ou plusieurs points les cardiotoxines et vésicules extracellulaires.

Impact sur les animaux

A travers une expérience précédente dans le cadre d’un projet de recherche similaire nous n’avons pas observé de nuisances importantes suite aux injections intramusculaires. Afin de minimiser d’éventuelles nuisances nous souhaitons réaliser une analgésie avec de la Buprénorphine (Vetergesic®) à la dose de 0.08 mg/kg injectée en sous-cutané minimum 30 minutes avant la procédure chirurgicale. Les animaux seront suivis en post-injection à l'aide d'une grille de points limites afin de réagir au besoin et de prendre en charge une éventuelle douleur.

Devenir

A l'issue de la procédure décrite dans ce projet, tous les animaux de cette étude seront euthanasiés afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses moléculaires et histologiques nécessaires au projet. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l'animal.

Remplacement

Le remplacement d'animaux ne sera pas possible dans cette étude car l’objet est ici précisément de tester l’effet des vésicules extracellulaires in vivo après avoir généré des données expérimentales in vitro, et ce, dans le but de déterminer leurs pertinences biologiques. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier cet impact sur le phénotype d’un muscle lésé.

Réduction

Le nombre d'animaux inclus sera de 11 souris par groupe soit un nombre maximal de 77 animaux au total. Ce nombre est basé sur notre expérience précédente de protocoles de thérapie cellulaire lors desquels nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles dans des groupe. Ce nombre est basé sur notre expérience précédente de protocoles de thérapie cellulaire lors desquels nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles dans des groupes de cette taille. Cela semble être un nombre minimal qui permette d’assurer la robustesse des résultats sans qu’il soit excessif en termes d’animaux à inclure. Une étude statistique est prévue pour comparer les groupes.

Raffinement

1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec enrichissement du milieu (tunnels en cartons, frisottis de papier (sizzle dry), bûchettes de bois et hébergement à deux animaux si possible). 2) un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement), 3) l'instauration de points limites pertinents avec mise en place de mesures adaptées (anesthésies, analgésie ou euthanasie si pas d'autre alternative), 4) une réactivité accrue du personnel animalier avec mise en place d’une grille de scoring de la douleur dès que nécessaire pour détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions (anesthésie et analgésie si nécessaire).

Choix des espèces

Le projet s'inscrit dans un contexte de diabète de type 2 et la souris C57BL6 est le seul fond génétique qui développe un diabète "gras" suite à un régime hyperlipidique ou hyperlipidique/hyperglucidique. Afin de rester cohérent avec les autres études de l'équipe sur le diabète, basés sur l'utilisation de la C57BL6, nous utiliserons ce fond génétique pour cette étude. L’injection des vésicules extracellulaires (VEs) sera réalisée chez les animaux à l'âge de 2,5 mois puis ceux-ci seront suivis durant 6 jours, date à laquelle ils seront sacrifiés. Il s'agit donc de jeunes adultes. Dans la mesure où une lésion musculaire va être générée pour suivre l'impact des vésicules sur le processus régénératif, nous souhaitons nous placer à un âge où la croissance est bien avancée et où les tissus musculaires présentent un aspect homogène pour éviter toute variable dans nos mesures.

1260 jeunes souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Irradiées au cerveau dès l'âge de dix jours sous anesthésie, elles subissent des imageries et des prélèvements de sang, puis sont euthanasiées à différents délais pour prélever le cerveau. Le porteur indique attendre surtout une hypothermie et un stress liés à l'anesthésie et à l'irradiation. Il justifie l'étude par l'évaluation du risque des scanners et opérations sous rayons X pratiqués chez les enfants, un bénéfice présenté comme lointain.

Objectifs

Des millions de scanners de la tête sont pratiqués chaque année chez des enfants. De même des opérations de chirurgie de la tête sous radio sont réalisées chez des enfants. Ces pratiques apportent un bénéfice considérable en termes de santé publique. Néanmoins, le risque lié à ces actes, nécessitant l’utilisation de rayons X, chez des enfants nécessite d’être évalué. D’un point de vue épidémiologique, les conséquences au niveau du développement du cerveau de l’exposition cérébrale d’enfants à des doses de rayonnements ionisants inférieures à 2 Gy ne sont pas clairement établies et sont peu documentées. En ce qui concerne les connaissances scientifiques dans ce domaine, elles restent limitées. Dans ce contexte, nous avons développé des modèles d’irradiation du cerveau ou de structures cérébrales chez la souris âgée de 10 jours afin d’évaluer : (i) les seuils d’apparition des troubles du comportement chez les souris adultes, (ii) les mécanismes liés à ces effets et (iii) la manière dont l’irradiation impacte le cerveau en développement selon la zone irradiée. Des troubles (comportement, mémoire) ont pu être observés à l’âge adulte par suite de ces irradiations dans des projets précédents. Afin d’évaluer les mécanismes liés à ces effets, la formation de nouveaux neurones au niveau de certaines parties du cerveau a été étudié ainsi que l’inflammation au niveau du cerveau chez les souris adultes. Pour compléter nos résultats, nous souhaiterions étudier, dans le temps, l’effet de l’irradiation (dans des doses faibles à modérées) du cerveau ou d’une partie du cerveau de jeunes souris sur la vascularisation et l’inflammation du cerveau.

Bénéfices attendus

Tout d’abord, l’étude des vaisseaux et de l’inflammation après irradiation permettra d’améliorer notre compréhension sur les mécanismes d’action de l’irradiation pouvant avoir des effets sur les fonctions cérébrales. Ce projet est un complément de projets déjà réalisés avec ces mêmes modèles expérimentaux. Ensuite, ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances scientifiques sur les effets de l’irradiation sur la vascularisation cerveau dans le cadre d’exposition à des stades jeunes. Ainsi à plus long terme nos résultats pourraient contribuer à une meilleure évaluation du risque encouru par les enfants ayant été exposés à des dans des procédures médicales.

Procédures

Les jeunes souris mâles seront anesthésiées pour l’irradiation, les imageries éventuelles, le prélèvement de sang et les perfusions au moment de l’euthanasie (solution pour fixer les tissus et/ou pour colorer certains tissus).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables de l’anesthésie et de l’irradiation peuvent être une hypothermie, un réveil plus long de l’anesthésie ou un stress lors de la journée d’irradiation. Aux doses d’irradiation utilisées, il n’est pas attendu et il n’a pas été observé de lésions de brulure pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de réaliser les prélèvements de cerveaux et des imageries.

Remplacement

L’impact de l’irradiation sur la mise en place de la vascularisation cérébrale ainsi que sur la réponse inflammatoire du cerveau et les conséquences potentielles à l’âge adulte nécessite d’être étudiés in vivo au sein d’un système complexe intégré qui évolue dans le temps. Ce type d’études n’est pas actuellement possible avec des méthodes non animales.

Réduction

Nous utiliserons des tests statistiques. D’après nos études précédentes, il est nécessaire d’avoir 8 ou 10 animaux pour chaque groupe selon les analyses réalisées afin d’obtenir des résultats exploitables et robustes.

Raffinement

Avant la mise bas, les femelles gestantes seront mises une par cage afin d’éviter tout stress avec du papier kraft et du coton pour qu’elles puissent faire un nid et également une petite maison. Le jour de l’irradiation, les souriceaux sont mis ensemble dans une cage à 37°C, puis anesthésiés pour l’irradiation. Au réveil, ils sont remis dans leurs cages avec leurs mères. Puis, les petits resteront avec leurs mères jusqu’au moment du sevrage. Les animaux seront ensuite hébergés par groupe de 5 maximum dans des cages adaptées avec un enrichissement. Un suivi strict des animaux sera réalisé au quotidien. Leur comportement, leur poids, et tout signe clinique seront évalués afin d’identifier les points limites qui nécessiteront leur euthanasie anticipée.

Choix des espèces

Nous souhaitons utiliser des souris dans ce projet. Elles ont été notamment choisies car elles ont déjà été largement étudiées en neurobiologie. De plus, nos modèles d’irradiation ont déjà été développés et validés dans ce modèle au sein de notre laboratoire. Les animaux seront irradiés 10 jours après leur naissance. Cet âge correspond à une période critique de sensibilité du cerveau aux effets de l’irradiation et autres chimiques. Les euthanasies seront réalisées pour plusieurs temps post-irradiation : 6 heures, 3 jours, 1 semaine, 4 semaines et 3 mois. Les effets préalablement observés l’ont été majoritairement au temps 3 mois post-exposition. D’une part, ce projet complétera les données pour ce temps. D’autre part, l’étude à différents temps post-irradiation permettra de mieux comprendre les mécanismes d’action de l’irradiation pouvant conduire aux effets observés à 3 mois post-irradiation.

448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses et diabétiques par un régime gras pendant quinze semaines, elles subissent un jeûne, un régime cétogène ou un gavage d'antidiabétique, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline et des prélèvements sanguins répétés, avant l'euthanasie par dislocation cervicale. Le porteur signale une hypoglycémie et une hypothermie possibles lors du jeûne. Il affirme travailler sur "l'animal entier" au motif qu'aucune méthode alternative ne peut mimer les voies métaboliques en jeu.

Objectifs

Les maladies métaboliques du foie (stéatose hépatique non alcoolique, ou NAFLD pour non-alcoholic fatty liver disease) sont en expansion dans les pays industrialisés, parallèlement à la prévalence croissante de l’obésité. Le premier stade de la maladie correspond à une accumulation de graisses dans le foie et est bénin mais peut évoluer chez certains patients vers une forme inflammatoire, puis vers une cirrhose, à l’origine d’autres complications sévères telles que le cancer du foie. Ces maladies représentent la deuxième cause de transplantation de foie et aucun traitement médicamenteux efficace n’est disponible à ce jour. Dans ce projet, nous souhaitons évaluer la capacité de différentes traitements ou interventions nutritionnelles et pharmacologiques à diminuer l'obésité, le diabète et la stéatose hépatique et à en comprendre les mécanismes. Ainsi pour cette étude, des souris mâles et femelles seront nourries avec un régime gras induisant une obésité, un diabète de type 2 et une pathologie hépatique mimant celle observée chez l'Homme. Une fois la pathologie installée, les animaux seront soumis à différentes interventions : un retour à un régime contrôle, un jeûne aigu ou intermittent, un régime cétogène, un traitement avec un anti-diabétique utilisé en clinique. Les effets de ces différentes interventions seront évalués grâce à des bilans sanguins et des analyses sur des prélèvements postmortem de différents tissus (foie, tissus adipeux brun et blanc).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir les effets de différentes interventions sur la progression de l'obésité, du diabète de type 2 et de la stéatose hépatique. En effet, aucun traitement de référence n’est disponible à ce jour pour les patients atteints de ces maladies chroniques du foie qui représentent actuellement la 2ème cause de transplantation de foie dans le monde.

Procédures

Les animaux seront nourris avec un régime obésogène riche en graisses pendant 15 semaines. A l'issue de ces 15 semaines, les animaux subiront l'une des interventions nutritionnelles ou pharmacologiques suivantes : une mise à jeun pendant 16h, un jeûne intermittent de 16 h par jour pendant 4 semaines , un régime cétogène riche en gras et pauvre en sucre pendant 4 semaines, un traitement par gavage oral avec un anti-diabétique (inhibiteur du transporteur de glucose rénal SGLT2, 10 mg/kg/jour dans un volume maximum de 200 ul)) utilisé en clinique pendant 4 semaines, un régime standard pendant 4 semaines, un groupe contrôle qui restera nourri avec le régime obésogène pendant 4 semaines. Le gavage oral avec l'anti-diabétique durera moins de 30 sec (contention comprise) par animal et par jour. Les animaux seront aussi soumis à des tests de tolérance au glucose (OGTT) ou à l’insuline (ITT) au début et à la fin de chaque intervention. Pour les tests de réponse au glucose (OGTT) et à l’insuline (ITT), des prélèvements d’une seule goutte de sang (

Impact sur les animaux

Les régimes obésogènes vont induire une obésité et des perturbations du métabolisme associées tels qu'un diabète et une stétaose, sans souffrance visible des animaux ni changement de leur comportement. La mise à jeun peut entraîner une hypoglycémie et une hypothermie. Le prélèvement sanguin à la veine maxillaire et le gavage oral de glucose et d'insuline peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention. De plus, le prélèvement à la joue peut induire un épanchement au niveau de la joue chez les individus et le gavage oral au glucose peut induire une irritation de l’œsophage.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale afin de réaliser des bilans sanguins et des analyses sur des prélèvements postmortem de différents tissus (foie, tissus adipeux brun et blanc) dans le but d'évaluer les effets des différentes interventions sur l'obésité, le diabète de type 2 et la stéatose.

Remplacement

Nous travaillons sur l’animal entier car les phénomènes biologiques étudiés (voies métaboliques) font intervenir différents tissus agissant en synergie (foie, tissus adipeux, intestin, cerveau, muscle). Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés (calcul de puissance) et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d'hébergement : hébergement collectif (4 ou 5 animaux/cage) et environnement contrôlé (température, hygrométrie). Des enrichissements du milieu de vie (cabanes en inox et ouate de coton ou de cellulose) seront disposés dans les cages afin de pouvoir se distraire, se cacher et fabriquer des nids. Pour un meilleur raffinement et limiter le stress, les animaux seront habitués à l'expérimenteur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l'apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons leur consommation alimentaire et hydrique afin de véridier la bonne tolérance des différentes expérimentations. Des points limites gradés seront mis en place pour l'évaluation des ces différents paramètres (indice 0 = normal ou léger, indice 3 = changements importants par rapport à la normale). Si un animal présente un signe quelconque de souffrance avec un score de 3 après évaluation de ces paramètres, l'animal sera aussitôt retiré de l'étude.

Choix des espèces

L'utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet de mimer rapidement la pathologie étudiée grâce à l'utilisation de régimes obésogènes. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (7 semaines d'âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l'individu adulte.

5 macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisés à l'issue plutôt que tués. Après plusieurs mois d'habituation, ils subissent une chirurgie possible d'implantation d'un plot de tête, une restriction hydrique, des injections d'un agent de contraste à base de fer et des séances d'IRM fonctionnelle vigile avec prélèvements sanguins. Le porteur reconnaît un stress lié à l'immobilité, au bruit et à la restriction hydrique, et un risque de troubles hépatiques dû au fer. Il affirme que le modèle primate est "essentiel" pour cette recherche fondamentale et évoque un sanctuaire, la mise à mort restant le dernier recours.

Objectifs

La perception de l'environnement construite par le cerveau est fondamentalement multi sensorielle et basée sur la combinaison de l'information sensorielle allocentrique (prend sa source en dehors du sujet, e.g. visuelle, auditive, olfactive) et égocentrique (prend sa source en référence au sujet lui-même, e.g. tactile, vestibulaire). Afin d’au mieux refléter le monde, le cerveau doit intégrer les informations multi sensorielles associées à une même source tout en séparant celles provenant de sources différentes ou encore les associer sur la base du contexte (ainsi un groupe qui s’enfuit prédit un cri ou une explosion, et un objet qui s’approche de nous à grande vitesse prédit un impact sur le corps). La combinaison des différents sens permet d’améliorer notre perception en réduisant les ambigüités notamment lorsqu’une modalité sensorielle ne donne pas suffisamment d’information (ex : pour se déplacer dans le noir). Comprendre les mécanismes neuronaux sous-jacents à ces processus cognitifs est essentiel pour mieux comprendre la compensation sensorielle et cognitive qui se mettent en place lors du vieillissement normal (compensation adaptative) ou encore les hallucinations ou les difficultés sensorielles qui s’expriment lors de troubles psychiatrique (compensation mal-adaptative; e.g. schizophrénie, autisme). Par ailleurs, ce projet s’inscrit dans le cadre d’une étude plus large, comparant les bases neurales de la cognition chez différentes espèces : l’homme, le macaque, le marmouset et le chien.Ici, nous utiliserons l’IRM fonctionnelle (IRMf) pour étudier les mécanismes neuronaux sous-jacents au traitement de stimuli sensoriels à connotation sociale (e.g. pour la modalité visuelle : une scène de grooming) en comparaison avec le traitement de stimuli socialement neutres (e.g. pour la modalité visuelle : un objet). Dans la modalité visuelle, nous nous intéresserons au traitement des scènes sociales complexes. Nous nous intéresserons également à la façon dont les animaux intègrent une information de récompense pour modifier la façon dont ils explorent une scène visuelle dynamique. Dans la modalité auditive, nous nous intéresserons au traitement des vocalisations y compris entre espèces. Enfin, dans la modalité olfactive, nous intéresserons à la spécificité du traitement des phéromones. Ce projet s’inscrit dans un projet comparatif plus large impliquant des sujets humains (bases de données accessibles), des macaques et des chiens.

Bénéfices attendus

Ce projet est conçu pour enrichir nos connaissances fondamentales concernant le fonctionnement cérébral et son évolution à travers les espèces. Grâce à ce projet, nous pourrons comprendre comment les macaques interprètent des scènes sociales dynamiques et comment leur cerveau traite ce type d’informations, en comparaison à l’homme. Par ailleurs, nous serons en position de comparer le traitement de vocalises entre trois espèces : homme, macaque et chien, permettant ainsi de mieux comprendre d’une part la spécificité du traitement auditif dans chaque espèce à l’histoire évolutive différente. Enfin, nous seront en position de comparer les bases neuro-cognitives du traitement olfactif d’odeurs et de phéromones entre ces trois espèces. Cette comparaison est rendue possible grâce à l’utilisation de l’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle chez des sujets éveillés chez ces trois espèces, permettant ainsi la comparaison directe entre les activations cérébrales obtenues. Il est à noter ici que les aspects éthiques de l’imagerie chez le chien sont traités à part. Ces questions relèvent clairement du domaine des neurosciences fondamentales, et notre principale ambition est de mieux comprendre comment le cerveau met en œuvre ces fonctions cognitives chez l'homme et les primates non humains et d’autres espèces plus éloignées phylogénétiquement. Cependant, nous pensons que les réponses que nous apporterons pourront alimenter de nombreux domaines des sciences appliquées, des neurosciences cliniques, des sciences vétérinaires à l'intelligence artificielle. A titre d’exemple, ce projet pourrait permettre de mieux comprendre les mécanismes à l’origine d’hallucinations ou de déficits sensoriels et sociaux chez des patients atteints de maladies psychiatriques et définir des cibles de traitement de maladies comme la schizophrénie ou l’autisme.

Procédures

Habituation à la sortie de cage (3 mois) ; 1 Chirurgie potentielle sur deux animaux maximum, sous anesthésie générale (3h); Habituation aux tâche comportementales (6 mois); Habituation à l’injection d’agent de contraste (2 mois) comprenant 1 injection vigile; Campagnes d’acquisitions IRMf vigile comprenant (3 semaines, 1 session par jour, maximum de 3 campagnes d’acquisition par an): 1 injection pour chaque session, 3 prélèvements sanguins pour chaque campagne d’acquisitions IRM pour contrôler les niveaux de fer circulants. La procédure dans son ensemble est considérée comme modérée.

Impact sur les animaux

L’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) ne constitue pas une source potentielle de nuisances importantes. Les animaux peuvent toutefois subir un stress de par l’immobilité imposée ainsi que de par le bruit important généré par la machine. La restriction hydrique peut s’avérer stressante. Des injections de produit de contraste seront effectuées en vigile (Molday Ion®). Ce produit de contraste est un oxyde de fer supra-magnétique, qui peut induire des élévations du taux de fer sanguin et potentiellement des troubles hépatiques.

Devenir

A la fin du protocole, en concertation avec le vétérinaire réfèrent et dépendamment du degré réel de sévérité de la procédure pour chaque animal, les singes seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude. Ces animaux auront acquis une grande valeur scientifique, du fait de leur entrainement à réaliser des taches cognitives. Les animaux ayant un plot implanté seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude nécessitant des approches IRMf. De ce fait, nous ne prévoyons pas de désimplantation chirurgicale à la fin de notre protocole. Également, notre protocole ne nécessite pas l'euthanasie de ces animaux pour des fins scientifiques. Si la décision est prise d’une sortie de protocole, le plot de tête sera désimplanté. A la fin du protocole, en concertation avec le vétérinaire et dépendamment du degré réel de sévérité de la procédure pour chaque animal, les singes pourront être réutilisés pour une autre étude, ou un replacement dans un sanctuaire sera envisagé. En dernier recours, si aucune solution alternative n’est possible, les animaux seront sacrifiés.

Remplacement

L’utilisation du macaque s’inscrit dans un projet comparatif plus large impliquant plusieurs espèces (humain, macaque, marmouset, chien) dont le but est d’étudier l’évolution des différentes fonctions cognitives. Le macaque possède une place phylogénétique cruciale pour la compréhension de processus évolutif des modalités sensorielles humaines et non-humaines. L’utilisation du modèle primate non-humain apparait essentiel pour la réalisation de cette étude de recherche fondamentale et comparative, utilisant des approches d’imagerie IRMf. Nous cherchons à comprendre le fonctionnement cérébral dans des taches comportementales variées ne pouvant être réalisées que par des animaux (aucun model in silico, in vitro ou ex vivo ne permet pour l’instant de reproduire le fonctionnement d’un cerveau de mammifère dans des situations comportementales). La connaissance produite par ce projet participera à la construction de modèles in silico des fonctions cérébrales. Nous privilégions l’utilisation du macaque car phylogénétiquement, ce modèle d’étude pré-clinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle. Ainsi, les informations obtenues seront plus facilement comparables (approche évolutive) transposables et identifiables à une application chez l’humain. De plus, des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. Enfin, le projet scientifique porte spécifiquement sur la comparaison des fonctions cognitives chez l’homme et le macaque. A terme, cela permettra donc de préciser les circonstances expérimentales et cliniques dans lesquelles le macaque peut être utilisé comme un modèle de la cognition humaine, et les conditions où il ne le peut pas.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit à la valeur minimale permettant d’atteindre une significativité et reproductibilité des observations. Au total, nous prévoyons la possibilité d’inclure 5 animaux dans le protocole (3 en réutilisation et deux en nouvelle inclusion). Ce nombre a été choisi sur la base du nombre minimum standard d’animaux (n=3) défini par la communauté scientifique abordant des problématiques comportementales avec des méthodes d’imagerie chez le primate non-humain, et sur la possibilité d’avoir à remplacer des animaux en cours de protocole (n=2). Tous les protocoles seront lancés sur les mêmes animaux ce qui nous permettra de comparer différentes acquisitions sur les mêmes sujets et ainsi optimiser la puissance statistique de notre étude. Les animaux en réutilisation, pour cette étude, suite à des recherches peu invasives, sont déjà entrainés à l’IRM et hébergé dans le laboratoire. Cette réutilisation est d’autant plus importante que ces animaux doivent être entraînés sur une longue durée de temps, avec renforcement positif, pour arriver à un comportement stable, avant de pouvoir passer à la phase de collecte de données. Nous prévoyons de lancer 9 campagnes d’acquisitions par animal (15 sessions par animal, chaque sessions incluant de 2 à 15 scans en fonction de la motivation des animaux).

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bienêtre des animaux. Par exemple, l’imagerie constitue une approche non-invasive qui va nous permettre d’étudier l’activité cérébrale dans le cerveau entier des animaux sans engendrer d’effets délétères. L’implantation du plot, réalisée chirurgicalement sera réalisée avec les meilleures techniques d’asepsie possible, par un neurochirurgien, afin de réduire le risque d’infection ou de désimplantation. En dehors des sessions d’imagerie qui seront réduites le plus possible sans compromettre les résultats scientifiques, les animaux seront hébergés dans un environnement social, incluant du matériel de fourrageage et de multiples formes d’enrichissement (selon un protocole défini en SBEA et implémenté par les chercheurs et les techniciens animaliers). Pour favoriser des interactions sans stress excessif entre l’animal et l’expérimentateur, les animaux seront entrainés à la technique d’association positive entre un son (clicker), une action, et une récompense alimentaire. Une sortie de cage vers la chaise sans canne est également à l’étude dans notre structure. Les points limites gradés, précis et adaptés ont été défini et permettrons en fonction des observations la prise de décisions selon un arbre décisionnel. Les critères d’arrêts sont définis et appliqués selon les mêmes critères que les points limites.

Choix des espèces

Pour cette étude, le modèle primate non-humain (macaque) apparait essentiel pour plusieurs raisons : - Cette étude s’intéresse à des mécanismes neurobiologiques chez le macaque pour des raisons de connaissance fondamentale. - Phylogénétiquement, ce modèle animal est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle la rendant notamment plus « facilement » comparable pour des études évolutives - Cette étude s’inscrit explicitement dans une perspective comparative entre espèces, la comparaison homme macaque étant un point clé de cette étude. En plus des connaissances fondamentales générées cela va permettre de préciser l’opportunité d’utiliser le macaque comme un modèle de la cognitive humaine et de ses dysfonctions. -Des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes du point de vue des neurosciences fondamentales. -Toutes informations physiologiques ou physiopathologiques obtenues chez le primate non-humain est plus facilement transposable à une application chez l’humain. Les trois animaux réutilisés sont des animaux matures. Les animaux reçus de nos fournisseurs sont de jeunes adultes (3.5-4 ans). Ils arrivent généralement déjà en groupe et sont socialement compatibles permettant de les pairer pour leur hébergement. L’étude portant sur des sujets adultes, les variations de maturation ou de vieillissement au sein de cette tranche d’âge restes minimes et ne devrait pas engendrer de variations significatives des réponses neuronales dans les taches étudiées. Les données recueillies abonderont PrimeDRE, une initiative de partage de données d’imagerie fonctionnelle de primates non-humains. A terme, des analyses portant sur un possible effet âge sur les traitements cognitifs qui nous intéressent pourront être entreprises à plus large échelle.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique créant une lésion cérébrale, un test comportemental du cylindre, puis des injections quotidiennes de lévodopa pendant trois à quatre semaines qui provoquent des mouvements involontaires. Le porteur décrit ces dyskinésies, rotations, mouvements excessifs des pattes et de la langue, toilettage excessif, ainsi qu'une perte de poids et de poils. Il justifie le modèle par l'impossibilité de reproduire in vitro la complexité du réseau neuronal en jeu.

Objectifs

La maladie de Parkinson est causée par la mort progressive des neurones dopaminergiques, qui se manifeste par des tremblements et la perte progressive de la mobilité du patient. Le traitement le plus courant consiste à administrer un précurseur de la dopamine, la lévodopa (L-DOPA), qui compense dans un premier temps le manque de dopamine. Malheureusement, au fil des années de traitement, l’administration de la lévodopa, nécessaire au patient pour son activité motrice, déclenche également des mouvements involontaires (dyskinésies). Ces dyskinésies s’amplifient progressivement au point d’amener à l’arrêt du traitement. Des études récentes sur des modèles animaux ont permis de mieux comprendre comment la répétition du traitement lévodopa génère ces dyskinésies. Ces travaux indiquent que, au fil du traitement, certains neurones développent une hypersensibilité à la levodopa, qui est directement la cause des dyskinésies. Nous proposons une nouvelle approche pour modérer la réponse neuronale à la dopamine en modifiant l’action d’une enzyme, ce qui pourrait prévenir les dyskinésies chez les patients. L’objectif de ce projet est d’établir la preuve de concept de cette nouvelle stratégie thérapeutique, et comporte deux volets. D’une part, nous validerons le mécanisme d’action thérapeutique sur des préparations de neurones in vitro ; d’autre part, nous testerons l’effet thérapeutique in vivo. Ces deux volets seront réalisés à partir de souris parkinsoniennes, traitées par la lévodopa pour l’induction de dyskinésies. L’effet thérapeutique sera validé in vivo en administrant des activateurs ou inhibiteurs de l’enzyme ciblée, et en mesurant l’effet de ces molécules sur la production de dyskinésies chez la souris. L’imagerie de biosenseurs permet de mesurer in vitro la réponse des neurones à la dopamine. Nous mesurerons avec cette méthode, sur des neurones provenant des mêmes animaux, l’efficacité des molécules thérapeutiques pour réduire la réponse à la dopamine.

Bénéfices attendus

Alors que l’administration de lévodopa plusieurs fois par jour reste la thérapie la plus courante, il reste malheureusement peu d’option thérapeutique lorsqu’un patient parkinsonien développe des dyskinésies trop invalidantes. La recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques apparaît donc comme un impératif de santé publique. Sur la base d’études fondamentales d’une part, et de données obtenues sur des modèles animaux de la maladie, nous mettons en avant une hypothèse tout à fait originale pour modérer la réponse neuronale excessive à la dopamine qui survient lors de l’administration de lévodopa, et qui est la cause des dyskinésies. Ce projet vise à tester cette hypothèse in vitro et in vivo : si elle se vérifie, notre travail apportera des arguments solides qui motiveront le lancement de nouvelles recherches pharmacologiques pour développer de nouveaux médicaments. Si notre hypothèse est invalidée, cela forcera à reconsidérer nos connaissances dans ce domaine et à affiner nos modèles théoriques, ce qui pourra alors orienter les recherches vers d’autres cibles thérapeutiques. Par ailleurs, la partie imagerie in vitro de notre étude apportera des données tout à fait nouvelles quant à la réponse à la dopamine dans les neurones provenant de souris parkinsoniennes. Ce nouveau jeu de données, avec une précision spatiale et temporelle encore jamais atteinte, amènera des nouvelles connaissances sur les changements subis par les neurones au cours des différentes phases de la maladie de Parkinson et de son traitement par la lévodopa. Enfin, ces mesures seront extrêmement utiles pour établir des modèles numériques de neurones, ce qui permettra d’avancer dans la direction d’études physiologiques «in silico».

Procédures

Tous les animaux seront impliqués dans les actes suivants : - une chirurgie stéréotaxique afin d’induire le modèle hémi-parkinsonien ; effectué sous anesthésie/analgésie (1h). - 3 semaines après la chirurgie : l’étendue de la lésion est évaluée par le test comportemental du cylindre réalisé 1 fois pendant 3 minutes (l’animal est placé dans un cylindre en verre transparent pendant 3 minutes et un expérimentateur compte le nombre de fois où l’animal touche la paroi du cylindre avec sa patte avant droite ou gauche) - Traitement quotidien sur animal vigile pendant 3 à 4 semaines par injection intra-péritonéale, avec ou sans les molécules pharmacologiques à tester (quelques secondes par souris) - Une euthanasie en vue des différents prélèvement et analyses sous anesthésie Une partie des animaux subira une étape supplémentaire juste avant l’euthanasie : - une deuxième chirurgie sous anesthésie/analgésie (1h20) pour injecter un virus nécessaire pour de l’imagerie de biosenseurs. L’animal est euthanasié le lendemain.

Impact sur les animaux

A l’inverse du patient parkinsonien, chez qui la perte de dopamine a lieu dans l’ensemble du cerveau, le modèle animal utilisé dans ce projet présente une lésion seulement dans l’hémisphère droit. Des symptômes moteurs sont visibles dans les jours suivant la chirurgie, ce qui se manifeste par une activité motrice amoindrie, associée à une perte de poids. L’hémisphère cérébral gauche non lésé compense progressivement et après une à deux semaines, seuls des tests spécifiques peuvent révéler l’existence de la lésion. Le traitement répété par la lévodopa induit progressivement l’apparition de dyskinésies. Celles-ci peuvent apparaître entre 10 min et 3 h après injection de la lévodopa. La lésion étant effectuée à droite, les mouvements anormaux se produisent uniquement du côté opposé à la lésion. Ces mouvement anormaux apparaissent sous diverses formes : rotation à gauche, rotation du buste de l’animal vers la gauche, mouvement excessif des pattes, sortie excessive de la langue, toilettage excessif. Ce traitement quotidien peut mener chez certains animaux à une faible perte de poids ainsi qu’une perte de poils au niveau du flanc gauche suite aux mouvements et toilettages répétés à gauche.

Devenir

L'objectif étant d'effectuer des mesures par imagerie sur des neurones ou bien des analyses biochimiques sur le cerveau, tous les animaux sont nécessairement euthanasiés à l'issue de la procédure, pour le prélèvement du cerveau.

Remplacement

Ce projet vise à analyser les mécanismes neuronaux à l’origine des dyskinésies induites par le traitement à la lévodopa, et à tester une nouvelle stratégie thérapeutique pour limiter ces mouvements involontaires. L’effet de la lévodopa et le développement des dyskinésies impliquent de nombreuses adaptations au sein d’un réseau de neurones impliquant diverses régions du cerveau. Il est à notre connaissance impossible de reproduire la complexité des effets du lévodopa sur des cultures de neurones. Les études par modélisation «in silico» ne sont pas non plus possibles pour étudier les dyskinésies induites par la lévodopa car le fonctionnement de neurones n’est pas encore connu avec suffisamment de précision pour pouvoir développer des modèles numériques fiables. Un des objectifs de notre projet est justement de produire des données qui permettront ensuite de concevoir des modèles numériques plus fiables et représentatifs de la maladie. Enfin, ni des observations sur cultures cellulaires, ni des modélisations numériques, ne prédisent avec une fiabilité suffisante l’efficacité éventuelle d’un traitement pour des patients. Pour que la nouvelle stratégie thérapeutique que nous suggérons puisse déclencher des recherches pharmaceutiques ultérieures, il est indispensable de démontrer cet effet dans une situation expérimentale qui reproduit les aspects critiques du phénomène, ce qui, à ce jour, ne peut être obtenu que dans un modèle animal. C’est pourquoi nous proposons d’utiliser des souris avec une lésion d’un seul hémisphère, une situation dans laquelle cette moitié lésée du cerveau reproduit de nombreux aspects des dyskinésies induites par la lévodopa.

Réduction

Les souris seront utilisées pour l’étude comportementale in vivo ainsi que pour l’étude mécanistique ex vivo par l’approche d’imagerie de biosenseurs. Cette double utilisation permet de valoriser au mieux les animaux utilisés dans ce projet. De plus, pour l’étude mécanistique, nous avons optimisé la méthode d’imagerie afin d’effectuer en moyenne deux enregistrements à partir d’une même souris. Les mesures effectuées à l’aide des biosenseurs sont comparées entre animaux test et contrôles, et les différences sont validées par des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. La taille des effectifs est établie grâce à un calcul de puissance et permet d’estimer le nombre de répétitions de chaque mesure à 6. Ce projet utilisera un total de 320 souris. Les résultats issus de cette étude seront partagés avec la communauté scientifique par une ou plusieurs publications. Par ailleurs, l’ensemble des données obtenues à partir de ces expériences sera mis à disposition de la communauté scientifique sur un site d’archivage en ligne. Cela évitera de répliquer l’expérimentation dans d’autres laboratoires. Ces données pourront être analysées par d’autres chercheurs pour répondre à d’autres questions scientifiques.

Raffinement

Les souris sont hébergées dans une animalerie adaptée avec nourriture et eau à volonté, matériel pour édifier le nid. L’animal est suivi quotidiennement pendant toute la procédure par un personnel compétent. La lésion des neurones dopaminergiques est réalisée uniquement dans un hémisphère du cerveau ce qui induit peu de perturbations motrices après récupération. Pour contrôler la douleur : injection sous-cutanée d’un anti-douleur opiacé le matin et le soir de la chirurgie. Avant le début de la chirurgie : injection sous-cutanée d’un produit protégeant les neurones non dopaminergiques. Pour la chirurgie, l’animal est anesthésié et placé sur tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Il reçoit une injection locale d’un anti-douleur au niveau de la peau du crâne et une injection sous cutanée de sérum physiologique glucosé pour prévenir la déshydratation. Les yeux sont protégés du dessèchement par un gel oculaire. Le lendemain de la chirurgie, l’animal reçoit une injection d’anti-inflammatoire non stéroïdien. Pendant trois jours, l’animal est pesé et reçoit des injections sous-cutanées quotidiennes de sérum physiologique sucré. Pendant toute la durée de récupération, l’animal est placé sur un tapis chauffant et une nourriture enrichie est à sa disposition. Au delà des trois premiers jours, le poids de l’animal et la présence de signe de douleur sont évalués. Des points limités sont définis au préalable et un suivi quotidien permet de garantir le bien être des animaux. Dans le cas contraire, des mesures sont mises en œuvre pour y remédier (utilisation d’analgésique, d’anti-inflammatoire non stéroïdien ou euthanasie).

Choix des espèces

Notre projet doit faire appel à un modèle animal qui représente avec un maximum de fidélité les aspects de la maladie de Parkinson que nous souhaitons étudier. En particulier, notre modèle doit reproduire les dyskinésies produites par l’administration de L-DOPA, ce qui est le cas avec le modèle murin hémiparkinsonien. Ce modèle animal présente une lésion d’un seul côté du cerveau, ce qui minimise les dommages infligés à l’animal. De plus, les symptômes parkinsoniens et dyskinésies sont obtenus sur un laps de temps de quelques semaines, ce qui est court par-rapport à d’autres modèles de maladie de Parkinson : la durée des procédures est donc réduite. Ce modèle animal est bien décrit pour des souris mâles de 8 à 12 semaines au début du protocole, ce qui détermine notre choix.

1750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une injection de virus dans le cerveau et l'implantation d'une fenêtre crânienne, puis une tâche de détection tactile la tête fixée, avant la mise à mort en fin de projet. Le porteur décrit un risque de douleur postopératoire et d'infection lié aux chirurgies et aux implants. Il présente les retombées pour la santé humaine comme lointaines et justifie le recours à l'animal vivant éveillé par la nécessité d'un cerveau intact.

Objectifs

L'attention spatiale régule la réactivité sensorielle et la perception, agissant comme un "projecteur" qui rend le stimulus plus significatif et plus visible. L’attention facilite galement les processus d'apprentissage. L'activité neuronale est modulée par l’attention dès les premières étapes du traitement sensoriel au niveau cortical. Il a été proposé que le substrat neuronal véhiculant l’information attentionnelle serait porté par des connexions descendantes (top-down), c’est-à-dire depuis des aires corticales secondaires ou associatives vers le cortex sensoriel primaire. Dans le cas de la perception tactile, ces informations attentionnelles descendantes seraient projetées sélectivement vers l’aire du cortex somatosensoriel primaire (S1) traitant des informations de la partie du corps concernée. Bien qu’il existe des données appuyant cette hypothèse, aucune démonstration directe de la transmission des signaux attentionnels par ces connexions descendantes n’a été faite. De même, les mécanismes permettant à ces connexions descendantes de moduler la perception et l'apprentissage sensoriel restent inconnus. Je propose de tester cette hypothèse chez des souris effectuant une tâche de détection tactile guidée par l'attention.

Bénéfices attendus

Dans nos sociétés vieillissantes, les problèmes d’attention liés à des conditions pathologiques ou à l’âge prennent une place grandissante. Il devient donc crucial de comprendre les mécanismes de l’attention pour améliorer les diagnostics médicaux et développer de futurs traitements. Les résultats issus de nos travaux auront donc des implications importantes dans le domaine de la santé, pour l’amélioration des conditions de vie humaine.

Procédures

- 1 procédure chirurgicale pour injection de virus :sur des animaux P0 et animaux adultes entre 10 et 20 min - 1 procédure chirurgicale avec implantation fenêtre cranienne : entre 1 et 2H

Impact sur les animaux

Les procédures postopératoires et l'analgésie se feront sans douleur. Le stress sera limité avec une habituation progressive à l'expérimentateur. Toutes les procédures ont été régulièrement utilisées en laboratoire. Les expérimentateurs auront une solide expérience dans l'exécution des procédures. Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte.

Devenir

Les animaux seront maintenus en vie après les protocoles de chirurgie et comportement ensuite ils seront mis à mort à la fin du projet

Remplacement

Ce projet vise à comprendre les mécanismes qui sous-tendent une fonction cognitive complexe : l’attention tactile. Le cerveau doit donc être intact pour que les connections entre les différentes aires cérébrales soient maintenues et que nous puissions étudier leur interactions réciproques. De plus, nous étudions les mécanismes neuronaux qui sont engagés au moment précis de l’attention. Le projet ne peut donc se faire que sur des animaux vivants éveillés. Cependant, la tâche comportementale est totalement non douloureuse et non stressante, et la chirurgie sera réalisée sur des souris anesthésiées dont le niveau de souffrance est contrôlé pharmacologiquement.

Réduction

Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production: en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet : logement sur des racks ventilés, dans des cages adaptées, enrichissement de l'environnement (matériel de nidification et tunnels) et points limites adaptés pour éliminer ou réduire toute douleur. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L'expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. L’organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires à l'échelle comportementale. Les propriétés du néocortex de la souris ont de nombreuses similitudes avec le néocortex des autres mammifères, y compris les humains. Cela rend les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris largement transférables à l’homme. Les injections de virus seront réalisées sur des animaux de 1 semaines à 6 mois. Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux de de plus de 5 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation.