Procédures modérées

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent un entraînement forcé sur tapis roulant et sur échelle, des tests moteurs et un test de reconnaissance d'objet, puis une suspension du train arrière jusqu'à trois semaines simulant la microgravité, avec des injections intrapéritonéales, avant le prélèvement de tissus. Le porteur indique que la suspension provoque un stress et une perte de poids modérée les premières 48 heures. Il justifie l'usage animal par l'absence de modèle cellulaire des effets "corps entier" de l'impesanteur, pour une recherche à finalité spatiale et clinique.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de développer des méthodes de prévention des effets néfastes de l’inactivité physique et de la microgravité sur la santé. Celui-ci s’intègre donc à la fois dans la recherche spatiale (astronautes) mais également dans la recherche clinique (alitement, immobilisation, opération, sédentarité…). Pour répondre à ces objectifs, 7 équipes de recherche de spécialités différentes travailleront enssemble pour évaluer l’effet des méthodes de prévention sur l’ensemble de l’organisme et plus particulièrement l’appareil locomoteur qui est fortement impacté. L’expérimentation proposée sur le modèle rongeur devra permettre de mettre en place des recommandations pour une étude clinique humaine future, et proposer des hypothèses de travail pour des recherches cliniques en lien avec la sédentarité. Ces travaux se centreront autour de trois axes principaux : 1- Évaluer l’intérêt d’une préparation physique spécifique avant un vol spatial. 2- Evaluer un assortiment de moyens de prévention du déconditionnement de l’appareil locomoteur pendant la phase d’immobilisation. 3- Evaluer l’étendue de la récupération dans les différents organes de l’appareil locomoteur induite par les moyens de prévention proposés. L’ensemble de ce projet expérimental vise donc à la fois des études scientifiques fondamentales centrées sur les différents environnements (microgravité et remise en charge), mais également l’évaluation de contremesures pour préparer les défis spatiaux de demain. Enfin, bien que ces expérimentations soient réalisées dans le cadre d’étude du domaine spatial, leurs résultats auront un impact important dans le domaine clinique sur Terre, que ce soit en rapport à l’alitement prolongé, la sédentarité, les maladies chroniques, ou le vieillissement, ainsi que sur les moyens de prévention.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet permettront à la fois d’accroitre les connaissances scientifiques en lien avec l’appareil locomoteur et la microgravité/inactivité, mais également d’évaluer des mesures concrètes pour en atténuer les effets néfastes en se basant sur de nombreux travaux antérieurs. En effet, l’inactivité est, dans l’espace mais également sur Terre dans le domaine clinique, un réèl probème en matière de santé. Ces expérimentations sont de fait à la fois une étape importante pour réaliser les objectifs de demain dans l’exploration spatiale, mais également un axe de recherche primordiale en matière de santé humaine. Ces résultats pourraient donner lieu à des recommandations importantes lors d’immobilisation, de blessure, d’alitement prolongé dans le domaine clinique, ou encore au cours du vieillissement.

Procédures

Les animaux suivront un programme d’entrainement sportif sur tapis roulant (au maximum 9 fois 30 minutes pendant 3 semaines). Cet entraînement sera qualibré de manière individuelle. Les animaux suivront un programme d’entrainement sportif sur échelle d’escalade (au maximum 9 fois 30 minutes pendant 3 semaines). Cet entraînement sera qualibré de manière individuelle à l’aide d’un test de force d’agripement et un test de retournement réalisé une fois préalablement. Les animaux réaliseront également une évaluation de coordination motrice (3 fois 5 min), une évaluation de composition corporelle (3 passages de moins de 2 minutes), et un test comportemental de reconnaissance d’objet (1 passage; 15minutes). Enfin, une partie des animaux seront suspendus selon le modèle de suspension du train arrière (7 jours ou 3 semaines) et 3 injections intra-péritonéales (5 secondes par injection) seront réalisées au cours des 3 derniers jours de suspensions respectant les volumes préconisés (200 microlitres).

Impact sur les animaux

La nuisance à laquelle vont être soumis les animaux durant l’expérimentation sera lié à l’inactivité induite par le modèle de suspension du train arrière. En effet, celui-ci peut induire du stress et durant les premières 48h une perte de poids modérée et des bouchons externes des voies uro-génitales. Cette perte de poids s’arrête ensuite. Les animaux seront aussi stréssés lors des tests de force et de l’entrainement sur tapis roulant. Les animaux auront 3 injections intra-péritonéales respectant les volumes recommandés, et induisant une douleur légère de courte durée.

Devenir

A la fin des expérimentations, les animaux sont euthanasiés pour permettre les différents prélèvements de tissus pour analyses.

Remplacement

Dans le cadre de ces expérimentations très spécifiques, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux étant donné l’absence de modèle cellulaire permettant de mimer les effets corps entier de l’impesanteur sur l’ensemble des tissus d’interêt ainsi que les effets des méthodes de prévention. De plus, ces expériementations ne peuvent pas être directement réalisées chez l’homme. L’utilisation d’animaux est donc ici une étape obligatoire mais également extrêmement enrichissante du point de vue scientifique de part les résultats très précieux qu’elle génère.

Réduction

Ces expérimentations ont été adaptées pour diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés au moyens de deux axes de réductions. Le premier axe consiste à centraliser les procédures de 7 équipes de recherches lors d’une unique expérimentation animale, réduisant ainsi par 7 le nombre de souris qui aurait été classiquement employées. Le deuxième axe consiste à réduire le nombre d’animaux par groupe au moyen d’analyses statistiques réalisées préalablement en vue des effets attendus (logiciel Gpower).

Raffinement

Du point de vue du raffinement, les procédures engagées durant l’expérimentation n’entraînent pas de douleurs spécifiques. Pour l’activité physiques et les tests sportifs réalisés sur tapis roulant, les animaux y sont préalablement habitués progressivement pour réduire le stress induit. L’animal est libre de cesser de courir lorsqu'il le souhaite. Pour les différentes supplémentations de molécules naturelles, celles-ci sont associées à la nourriture. Les procédures de suspension du train arrières ont été validées et optimisées, et des soins quotidiens sont réalisés pour prévenir toute complication. La température d'élevage sera de 24 à 25 degrés pour éviter le refroidissement des animaux. De plus, les souris seront suspendues par deux pour éviter l’isolement social. Chaque procédure possède également des points limites et critères d’arret stricts. Nous assureront un suivi quotidien des animaux et mesureront le poids des souris tous les 3 jours. Enfin, pour permettre les prélèvements finaux des différents tissus d’intérêt les animaux sont anesthésiés par voie gazeuse avant d’être mis à mort.

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été privilégiée pour plusieurs raisons. Même si il existe des différences subtiles, les espèces murines rat et souris se rapprochent de l'humain en ce qui concerne le système musculosquelettique. Les souris sont par exemple utilisées lors des missions dans l'espace « Bions » pour étudier les effets de la microgravité réèlle. De très nombreuses études ont employé ce modèle et témoignent de sa fiabilité. Les animaux seront utilisés entre 3 et 7 mois en fonction de leurs groupes. Cette tranche d'âge permet de travailler avec des animaux adultes mais non vieillissant, ce qui nous est indispensable vis à vis des différentes analyses (exemple : analyses osseuses) réalisées par la suite.

4 011 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de médicament et de cellules cancéreuses, une incision de la glande mammaire sous anesthésie, de nombreux prélèvements sanguins et jusqu'à sept séances d'imagerie, pour comparer des nanoparticules censées mieux cibler les tumeurs du sein HER2 positives. Le porteur reconnaît des nuisances tumorales, perte de poids et nécrose, et prévoit une mise à mort selon des points limites. Il qualifie la recherche de nouveaux traitements d'"indispensable" et renvoie les bénéfices pour les patientes, une toxicité réduite, au conditionnel.

Objectifs

Le cancer du sein est le premier cancer chez la femme en France, dont 10 à 20% sont HER2 positifs (protéine exprimée à la surface des cellules positives). Cependant, des résistances aux traitements proposés actuellement se développent, et la toxicité systémique (toxicité qui affecte l’ensemble de l’organisme) des traitements existants reste problématique. Il reste donc indispensable de chercher de nouveaux traitements contre le cancer du sein. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de valider l’efficacité thérapeutique de nouvelles molécules associées à des nanoparticules ciblant HER2, réduisant les effets secondaires dans le traitement du cancer du sein. Nous espérons ainsi ouvrir de nouvelles pistes pour résoudre cette problématique de santé publique.

Bénéfices attendus

Menée à bien, cette étude devrait permettre de connaître la place des différentes nanoparticules dans l’arsenal thérapeutique actuel du cancer du sein. La comparaison des différentes nanoparticules ciblées devrait permettre de mieux comprendre l’influence de la taille et de la composition des nanoparticules sur le ciblage de la tumeur, et de montrer leur intérêt d’un point de vue pharmacocinétique. Cela montrera l’intérêt des nanoparticules pour réduire les toxicités associées aux traitements du cancer du sein humain grâce à l’amélioration de la pharmacocinétique par rapport aux chimiothérapies classiques.

Procédures

- Un groupe de 700 souris subira 1 injection du médicament sur animal vigile d’une durée de 10 secondes, puis 2 prélèvements sanguin à deux jours d’intervalle, sous anesthésie (durée : environ 30 secondes). Les souris subiront cette séquence d’une semaine sur 4 semaines (4 injections et 8 prélèvements au total). - Un groupe de 2100 souris subira 1 injection du médicament sur animal vigile d’une durée de 10 secondes, puis un prélèvement sanguin sous anesthésie terminale (sans réveil) (durée : 30 secondes). - Un groupe de 210 souris subira 2 injections de cellules cancéreuses (10 secondes chacunes) sur animal anesthésié, puis une injection du médicament (7 à 15 jours après) sur animal vigile d’une durée de 10 secondes ; puis sera observée à 7 temps différents par imagerie sous anesthésie (durée : 30 secondes) réparties sur 3 jours. - Un groupe de 1001 souris subira 1 incision sous anesthésie et analgésique (durée 10 secondes) suivie d’une injection de cellules cancéreuses dans la glande mamaire sous anesthésie et analgésique (durée 10 secondes), puis 10 à 20 jours plus tard, huit injections du médicament (10 secondes) sur animal vigile, et deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude (4 mois maximum), une injection de la luciférine (nécessaire à l’imagerie) sur animal vigile (durée 10 secondes) suivie de l’examen en imagerie (durée 1 min) sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Il n’y a pas de nuisances attendues sur les souris saines autre que la toxicité éventuelle de la molécule à haute dose (perte de poids, perte de poils). Le poids, le comportement et l’apparence physique de la souris sera alors contrôlée quotidiennement pour l’euthanasier selon des points limites prédéfinis. Les nuisances attendues pour l’incision du flanc sont des douleurs au niveau de la zone incisée. Les nuisances attendues pour les souris porteuses de tumeurs sont la nuisance due à la tumeur : perte de poids, nécrose, etc. Le poids, le comportement et l’apparence physique de la souris sera alors contrôlée quotidiennement pour l’euthanasier selon des points limites prédéfinis. Après injection intraveineuse, des irritations au point d’injections peuvent apparaître et seront surveillés.

Devenir

Les souris sont prélevées post-mortem pour des analyses ultérieures, elles seront donc toutes mises à mort. Les souris dont la pousse tumorale n'a pas prise seront mises à mort car elles ont étés injectées avec des cellules tumorales.

Remplacement

Nous avons préalablement réalisé des études in vitro afin de remplacer en partie l’expérimentation in vivo autant que possible, mais à ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux reste inévitable pour examiner l’aspect translationnel de nos travaux. En effet, cette étude préclinique, visant à évaluer la pertinence clinique de l’utilisation des nanoparticules pour le traitement du cancer du sein nécessite obligatoirement l’utilisation d’animaux entiers pour déterminer la biodistribution des nanoparticules, leur pharmacocinétique et leur efficacité.

Réduction

Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus pour l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales lorsque cela était possible grâce au suivi par imagerie non invasive et non irradiante (croissance tumorale et biodistribution des formulations dans les modèles de souris porteuses du cancer du sein). Une étude préliminaire, avec un nombre restreint de groupes conditionnera la suite du projet, le nombre d’animaux annoncé est donc un nombre maximum.

Raffinement

Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Un analgésique sera localement appliqué sur les sites d’ouverture de la souris. Les souris seront observées quotidiennement et la croissance des tumeurs sera mesurée tous les 3 jours. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en portoir ventilés en groupe sociaux selon les normes en vigueur avec des conditions d’hébergement et d’enrichissement de leur environnement conformes à la validation de la structure du bien-être animale.

Choix des espèces

La raison la plus importante du choix des souris pour nos études est leur similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. La plupart des antécédents génomiques de la souris sont similaire à ceux de l’homme (env. 95%), ce qui rend les souris particulièrement utiles pour la recherche sur les maladies humaines. Les souris seront utilisées à partir de l’âge de 6-8 semaines, âge adulte de manière à avoir un poids corporel plutôt stable d’environ 20g.

170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues diabétiques et hypertendues, elles subissent des injections intrapéritonéales quotidiennes, une chirurgie, des séjours en cage métabolique, des mesures de pression et une échographie sous anesthésie, avant un prélèvement sanguin terminal et le prélèvement des organes. Le porteur reconnaît une possible atteinte du cœur, des reins et des rétines, et décrit un modèle où les souris urinent abondamment. Il indique recourir, malgré des cultures cellulaires, au modèle souris pour ses interactions entre organes, pour une étude dont le bénéfice annoncé se limite à mieux comprendre l'atteinte des vaisseaux.

Objectifs

Le diabète est une maladie vasculaire très répandue affectant plus de 500 millions de personnes en 2021. Les cellules endothéliales, tapissant la face interne des vaisseaux, sont les premières affectées par les modifications métaboliques générées par le diabète. Il est connu que l'excès de sucre dans le sang et une dérégulation de la composition du gras participe à l'atteinte des vaisseaux que l'on retrouve chez les patients diabétiques. Nos données ont permis d'identifier un potentiel système dérégulé dans le diabète et participant au maintien du fonctionnement normal des vaisseaux sanguins. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle de la protéine identifiée sur les vaisseaux chez des souris diabétiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de l'atteinte des vaisseaux sanguins dans le diabète.

Procédures

Une injection intrapéritonéale quotidienne pendant 5 jours (20 sec/ jour) puis pendant 2 jours (20 sec/ jour). Une procédure chirurgicale (10 min). Prélèvements urinaires en cage métabolique sur animal vigile (6 heures d'isolement par semaine). Mesure non invasive de la pression artérielle (15min par semaine) et échographie sous anesthésie (20min). Un prélèvement sanguin terminal sur animal anesthésié (1 minute).

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés à l'expérimentation: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection, inconfort lié aux cages métaboliques. Effets de la chirurgie: douleurs post-opératoire soulagée par des analgésiques. Effets des modèles pathologique de diabète et d'hypertension artérielle: potentiellement atteinte des organes cibles (coeur, reins et rétines).

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes

Remplacement

Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte microvasculaire liés au diabète incluant les cultures cellulaires. En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours du diabète comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire ou les interactions entre organes. C'est pourquoi nous aurons aussi recours au modèle animal, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille.

Réduction

Réduction : le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait sur le logiciel en ligne https://sealedenvelope.com/power/continuous-superiority/ ce qui donnait 25 animaux par groupe requis. 5 animaux de plus sont prévus par groupe pour pallier aux risques du modèle expérimental. Nous optimisons l'utilisation des organes pour les différentes analyses afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Raffinement : les animaux seront élevés en cages enrichies avec eau et nourriture ad libitum et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris diabétiques et hypertendues urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux par cage est limité à 3 et les cages sont changées plus fréquemment et dès que nécessaire. Nous appliquerons strictement les points limites définis dans le projet pour éviter toute souffrance. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie péri-opératoire.

Choix des espèces

La souris est un modèle permettant de réaliser des expériences de physiopathologie de mammifère. De plus, les modèles de diabète et d'hypertension artérielle utilisés au cours de ce projet sont établis et validés par la communauté scientifique. Souris adultes agées de 8-12 semaines car il faut de jeunes adultes. En effet, l'age est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop agées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux.

200 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'extraction de leur cerveau. Chacune subit une chirurgie stéréotaxique d'une à trois heures pour l'implantation d'une barre en acier et une injection virale, avec des fibres optiques dans le cerveau pour 100 d'entre elles, puis un à cinq mois d'entraînement en réalité virtuelle, tête fixée, isolée en cage et maintenue par restriction hydrique à 85 % de son poids d'origine. Environ 180 subissent ensuite une craniotomie, et des électrodes leur sont insérées dans le cerveau, parfois chaque jour, pendant un à quinze jours d'enregistrement. Le but est d'observer comment le cerveau prépare plusieurs décisions à la fois pendant une recherche de nourriture ou d'eau, comportement que le porteur qualifie d'"éthologiquement intéressant". Il écarte la drosophile au motif que son circuit neuronal diffère de celui des mammifères, et conclut qu'il "s'avère donc nécessaire" de recourir à la souris.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'identifier les principes neuronaux et computationnels indispensables à la flexibilité comportementale. L’hypothèse centrale est que le cerveau peut imaginer et préparer plusieurs décisions simultanément pour pouvoir changer plus facilement de décisions lorsqu'une situation change. Nous combinerons des tâches comportementales réalisées en réalité virtuelle chez la souris avec des techniques innovantes d’électrophysiologie et de stimulation optique (optogénétique), et des modèles théoriques de décodage de l’activité neuronale. Cette approche nous permettra d’enregistrer et de manipuler simultanément des centaines de neurones dans un large réseau cortico-sous-cortical impliqué dans le contrôle volontaire de l’action durant la prise de décision. Nous choisirons d’étudier un comportement éthologiquement intéressant : le « foraging », qui consiste en la recherche de ressources en nourriture ou en eau.

Bénéfices attendus

Le projet produira une quantité sans précédente de données utiles à un large éventail d'études scientifiques. Ces données seront partagées avec la communauté scientifique après publication des résultats. Ces données seront donc réutilisables pour répondre à des questions scientifiques variées. Plus particulièrement, les résultats de ce projet pourront offrir une nouvelle approche de la flexibilité cognitive au cours de la prise de décision. Ce projet éclairera également les variations individuelles dans les processus décisionnels, ouvrant la voie pour mieux comprendre la diversité comportementale et ses dysfonctionnements cognitifs.

Procédures

(1) Implantation d’une barre en acier et de fibres optiques : cette phase expérimentale consiste en une procédure chirurgicale qui s’effectuera sur tous les animaux (N = 200) sous anesthésie générale. Durant la procédure, une injection virale sera réalisée à l’aide d’un nano-injecteur et des fibres optiques miniatures seront insérées dans le cerveau de certains animaux (N = 100) sur lesquels nous effectuerons des expériences de stimulations optiques. Ces chirurgies stéréotaxiques durent entre 1h et 3h pour chaque animal. (2) Entrainement : cette phase durera entre 1 mois et 5 mois en fonction de la performance de l’animal. Les animaux (N = 200) seront placés dans la plateforme expérimentale 5 jours par semaine pendant 20 à 60 min et pesés quotidiennement avant la séance. (3) Craniotomies : certains animaux entrainés (approximativement N = 180) subiront une seconde procédure chirurgicale sous anesthésie générale qui permettra de réaliser de petites craniotomies. Cette intervention est rapide (20 à 30 min). (4) Enregistrement : l’animal sera placé dans sa plateforme expérimentale et une ou plusieurs électrodes seront lentement insérées jusqu’à leurs positions finales. Cette procédure pourra être répétée quotidiennement pendant plusieurs jours. Cette phase peut durer entre 1 et 15 jours en fonction des résultats. (5) Mise à mort : Tous les animaux (N = 200) seront euthanasiés à la fin de la procédure.

Impact sur les animaux

Plusieurs effets plus ou moins nuisibles à la santé des animaux peuvent être attendus. 1) Isolement : pour leur protection, les animaux devront être hébergés individuellement dans leur cage 2) Restriction hydrique : les animaux seront maintenus à 85% de leur poids originel 3) Interventions chirurgicales sous anesthésie : les conséquences de ces interventions sont parfois néfastes (hémorragie, infection, détresse respiratoire, douleurs post-opératoires) 4) Implants : potentielle gêne occasionnée par un corp étranger 5) Stress lié à la manipulation : les animaux seront manipulés durant les phases de tests 6) Restriction des mouvements : les animaux auront la tête fixée durant les périodes de tests

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette procédure dans le but de procéder à l'extraction du cerveau à des fins histologiques.

Remplacement

Pour évaluer la complexité des comportements adaptatifs, comme proposé dans ce projet, il est fondamental d'utiliser un modèle animal approprié qui ne peut être facilement remplacé par des expériences in vitro ou des modèles informatiques. D’autre part, l'étude des bases neuronales de la prise de décision par l’enregistrement et la manipulation sélective de l’activité des neurones nécessitent des techniques invasives qui ne peuvent pas être réalisées chez des sujets humains sains et extrêmement rarement chez des sujets malades. Certaines espèces d'invertébrés, telles que la mouche des fruits (drosophile), pourrait sembler adaptées à l’étude du comportement de foraging et aux manipulations génétiques des systèmes cérébraux. Cependant, l'anatomie du circuit neuronal de la drosophile est considérablement différente de celle des mammifères. Ainsi, les résultats scientifiques obtenus chez ces espèces ne sont pas facilement généralisables aux questions abordées dans ce projet. En l'absence de méthode de remplacement possible, il s’avère donc nécessaire d'avoir recours au modèle animal murin dans ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire pour pouvoir obtenir des résultats statistiques fiables et significatifs. L'utilisation d'outils électrophysiologiques comportant des centaines de sites d'enregistrement réduira aussi considérablement le nombre de sessions d'enregistrement et d'animaux nécessaires pour obtenir des statistiques fiables. Par ailleurs, les données comportementales et neuronales seront extraites des mêmes individus pour réduire encore d’avantage le nombre d’animaux. D’après nos études précédentes, nous estimons que 45 souris par axe de recherche sont nécessaires, et le double pour l'axe de recherche necessitant un comparaison entre un groupe test et un groupe contrôle (soit 180 animaux au total). Etant donné la difficulté technique qu’implique la réalisation des enregistrements et la bonne performance des animaux dans la tâche, un pourcentage de perte de l’ordre de 10% ou plus est à prévoir, ce qui augmente l’estimation finale à 200 animaux pour les 5 ans.

Raffinement

Des méthodes de raffinement seront mises en place dans le but d’atténuer les nuisances provoquées par les procédures expérimentales. Le poids des animaux sera surveillé quotidiennement et la poursuite du protocole de restriction hydrique sera décidée en fonction du bien-être des animaux. L’eau naturelle ad-libitum sera remise à disposition pour assurer la récupération totale du poids si la perte de poids est supérieure à 20%. Afin de réduire le stress, les animaux seront habitués, par étapes, à la présence et aux interactions avec l’expérimentateur plusieurs jours avant le début des tests. L’angoisse éventuellement ressenti par l’animal due à la contention sera atténuée par une habituation renforcée positivement via des récompenses (eau sucrée).  Pour prévenir la douleur et les inflammations, nous administrerons à chaque chirurgie des médicaments aux propriétés antalgiques, antipyrétiques et anti-inflammatoires.En cas de sècheresse ou rougeur légère de la peau autour de l’implant, l’animal sera traité localement par une solution dermatologique. Dès l’apparition de comportements anormaux (ex : absence de toilettage, perte de plus de 20% du poids) ou autres signes de souffrance (évalués sur une grille d’évaluation de la douleur) survenant après l’implantation, l’animal recevra un traitement analgésique en sous cutané. Si des signes de souffrances persistent plus de 72h l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est le modèle animal le plus approprié pour ce projet et il n'existe pas d'alternative méthodologique. Tout d’abord, l'organisation du néocortex chez la souris comporte des similitudes avec d'autres espèces de mammifères, y compris les humains, et peut donc être utilisée pour révéler des principes généraux de prise de décision. Les souris peuvent aussi être entraînées à effectuer des tâches assez complexes dans des environnements expérimentaux contrôles. Les outils génétiques pour cibler et moduler des populations spécifiques de neurones sont également très bien développés chez la souris et relativement faciles à utiliser. Comme les souris ont un cerveau relativement petit, il est aussi possible d’enregistrer plusieurs régions cérébrales simultanément. Le fait que toutes ces procédures soient devenues l'état de l'art chez la souris facilitera et accélèrera donc grandement l'avancement du projet. Nous utiliserons de jeunes adultes au moment de l’implantation (âgées de 8 à 12 semaines). Il est important que les animaux soient relativement jeunes pour un apprentissage plus rapide et une meilleure performance dans la tâche. Cependant, les animaux doivent avoir terminé leur croissance pour éviter que la taille de la boite crânienne ne change au cours de l’expérience.

Un prélèvement de sang représentant, selon le résumé, "25% de leur volume corporel", fait sur des souris éveillées juste avant leur mise à mort : 960 souris mâles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Avant cela, les souris reçoivent, sauf un groupe témoin, une injection de cardiotoxine dans chaque tibia sous anesthésie pour provoquer une lésion musculaire, puis, pour les groupes traités, jusqu'à sept jours d'injections de glucocorticoïdes, afin d'étudier le rôle de ces hormones dans la régénération du muscle. La plupart appartiennent à la lignée LysM-Cre, et une seconde lignée, inductible, reçoit en plus cinq jours d'injections de tamoxifène pour invalider le récepteur des glucocorticoïdes. Le porteur écrit que ces procédures n'entraînent "généralement pas de souffrance", pour un protocole qui lèse un muscle et s'achève par une saignée sur souris éveillées puis une perfusion de fixateur dans le cœur.

Objectifs

Dans le cadre d’une blessure les glucocorticoïdes comme la cortisone peuvent être prescris pour leurs effets anti-inflammatoires efficaces mais dont la prise prolongée peut induire une perte de la masse musculaire. Les études sur les effets des glucocorticoïdes réalisées in vitro sur des cellules en culture montrent des résultats souvent contradictoires. Ainsi, malgré cette utilisation courante le mode d’action précis grâce auquel les glucocorticoïdes produisent leurs effets bénéfiques comme délétères sont encore mal connus. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels les glucocorticoïdes sont impliqués dans la dégénérescence et la régénération musculaire via certain type de cellule immunitaire. Cette étude permettra aussi de mieux décrire, in vivo, le lien entre une partie du système immunitaire et les cellules souches du muscle. Enfin, grâce à ce projet nous espérons pouvoir identifier le meilleur moment pour administrer les traitements aux glucocorticoïdes en évitant les effets secondaires indésirables.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces études nous permettra d'identifier le rôle des glucocorticoïdes dans des conditions physiologiques de régénération musculaire. Ce projet permettra aussi de décrire les effets induits par des traitements aux glucocorticoïdes. Nous pourrons ainsi disséquer les conséquences d’un potentiel dysfonctionnement du système immunitaire sur les processus d’inflammation mais aussi les conséquences sur la réparation des fibres musculaires. En comprenant les cibles et le rôle précis des glucocorticoïdes des traitements pourront être développer pour cibler un type cellulaire en particulier et être administrés au moment adéquat.

Procédures

Les animaux vigiles, c’est-à-dire non anesthésiés, seront soumis principalement des injections de différents types ne nécessitant pas de contention de plus de 30 secondes. Une première vague d’injection de tamoxifène, permettant l’invalidation du récepteur des glucocorticoïdes, sera réalisée une fois par jour pendant 5 jours. Ensuite, l’induction de la lésion musculaire se fera sur des animaux endormis à l’aide d’un gaz à savoir l’isoflurane. Les animaux endormis recevront une injection unique de cardiotoxine dans chacun des tibias. Une fois l’animal endormi cette procédure dure environ 1,5 minute. Durant la régénération musculaire, les traitements par glucocorticoïdes seront réalisés grâce à une injection par jour sur une période allant de 1 à 7 jours maximum. L’injection unique d’une molécule, pour visualiser la prolifération cellulaire, sera réalisée par injection sur des animaux vigiles deux heures avant leur mise à mort. Le prélèvement de sang sera réalisé via l’artère temporo-mandibulaire sur des animaux vigiles juste avant leur mise à mort et représentera 25% de leur volume corporel. Enfin, pour l’anesthésie létale les animaux vigiles seront injectés avec un mélange de xylazine/kétamine afin de subir une chirurgie. Cette dernière consiste à réaliser une perfusion de paraformaldéhyde intracardiaque cœur afin que le système circulatoire permette au fixateur d’atteindre tous les organes. Cette technique permet de fixer et préserver les tissus de manière homogène.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont toutes maîtrisées par notre équipe et les expérimentateurs prévus sur ce projet. Par ailleurs, le nombre d’injection et la période prévues ont été définies car on sait qu’aucun effet secondaire majeur n’avait été observé auparavant. En effet, 7 jours de traitement aux glucocorticoïdes ne provoquent normalement pas d’atrophie musculaire. Ainsi, nous n’attendons pas d’effets secondaires majeurs causés les molécules injectées. Néanmoins nous ne pouvons exclure le risque d’infection due au point d’injection qui sera surveillé. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …).

Devenir

A l'issue de la procédure tous le animaux expérimetaux seront sacrifiés pour réaliser des analyses moléculaires et histologiques.

Remplacement

Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes endogènes et synthétiques (dexaméthasone) sur la régénération musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, lors de la régénération musculaire, les cellules du système immunitaire provenant de la circulation sanguine sont impliquées mais aussi d’autres facteurs comme les hormones. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un animal entier afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte (exemple : niveaux d’hormones circulantes). Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de régénération musculaire est semblable à celui de l'homme et pour lequel nous disposons de tous les outils nécessaires pour mener à bien cette étude. Par ailleurs, le temps de gestation de la souris est relativement court (21 jours en moyenne) et permet la production d’un nombre assez important d’individu, contribuant à la production de résultats significatifs.

Réduction

De nombreuses études menées au laboratoire sur la régénération musculaire ont mené à une bonne connaissance du modèle ainsi que des traitements à réalisés. Ainsi, comme tous les traitements sont déjà bien décris et le modèle validé, nous n’aurons à optimiser aucun traitement et disposons de protocoles précis pour chaque expérimentation. Par ailleurs, les deux pattes des souris seront systématiquement utilisées afin de réduire de moitié le nombre d'animaux requis.

Raffinement

Dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux. Néanmoins, si l’un des animaux atteint un point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort par afin d'éviter toute souffrance inutile. Par ailleurs, après injection, les souris seront attentivement suivies. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …). De plus, le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’administration du composé induisant un dommage musculaire. Enfin, comme tous les traitements sont déjà bien décris et le modèle validé, nous n’aurons à optimiser aucun traitement pouvant entrainer des effets secondaires délétères sur les animaux.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de régénération musculaire est semblable à celui de l'homme et pour lequel nous disposons de tous les outils moléculaires nécessaires pour mener à bien cette étude. Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront des mâles entre 10 et 15 semaines pour éviter les variations causées par la puberté. La régénération musculaire se faisant en plusieurs étapes, nous effectuerons une cinétique. Dans un premier temps, nous étudierons les mécanismes d'action entraînant la dégénérescence musculaire et l’inflammation en analysant les souris à 1, 3 et 5 jours après injection de la cardiotoxine. Puis, nous étudierons les mécanismes d'action entraînant la régénération musculaire et les mécanismes anti-inflammatoire en analysant les animaux à 7, 14, 28 et 60 jours après l’injection de la cardiotoxine. Un groupe d’animaux sera également analysé en l’absence de traitement à la cardiotoxine, constituant ainsi le jour 0. Pour la majorité des expérimentations nous utiliserons les souris de la lignée LysM-Cre, cette Recombinase Cre étant constitutive elle ne nécessite pas d’injection au tamoxifène. Néanmoins, si nous observons des phénotypes sur ces souris, nous voudrions exclure une cause développementale c’est pour cela qu’il nous sera indispensable d’utiliser une seconde lignée inductible LysM-CreERT2. Il est difficile à cette étape de prévoir à quel stade nous utiliserons ces souris car cela dépendra du phénotype des souris issues de la lignée LysM-Cre.

Pour chercher comment le cerveau récupère d'une héminégligence, perte de perception d'une moitié du champ visuel après un AVC, 15 singes écureuils vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour le prélèvement de leur cerveau. Tous ont déjà subi des procédures légères dans un projet antérieur. Dix d'entre eux subissent une lésion chirurgicale du cerveau sous une anesthésie pouvant durer huit heures, et jusqu'à trois singes du groupe témoin reçoivent, après retrait d'une partie du crâne, un dispositif de fixation de la tête, avec jusqu'à quatre chirurgies chacun. Tous passent jusqu'à quatre IRM et des enregistrements cérébraux sous anesthésie, et les singes implantés en font aussi éveillés, pendant des tests visuels que le résumé ne détaille pas. Les singes lésés sont tués trois ou douze mois après la lésion. Le porteur écrit que chez les primates la récupération est "rapide et spontanée", grâce à un mécanisme "qui n'existe pas chez l'être humain", et juge pourtant le primate non-humain le plus "pertinent" pour une transposition à l'humain.

Objectifs

Une très large majorité des cas d’accident vasculaire cérébral droit montre des troubles de la perception consciente qui conduisent à des symptômes neuropsychologiques handicapants tels que l’héminégligence. Ce trouble se caractérise par une perte de la perception de la moitié du champ visuel. Les patients héminégligents semblent vivre dans un monde amputé d’une moitié ; ils ne mangent pas la partie gauche de leur plat, ne voient pas les obstacles situés sur le côté gauche, mais plus important encore, la vie quotidienne d’un patient héminégligent présente plusieurs dangers, qui incluent des risques d'accidents de la route et des chutes graves. Seulement 40% des patients héminégligents récupèrent une capacité visuelle normale dans les 6 mois qui suivent leur accident vasculaire. Cela signifie que chaque année, 480.000 nouveaux patients européens resteront héminégligents, ce qui nuit à leur qualité de vie et les empêche de retourner au travail. Il a récemment été démontré qu'une bonne communication entre deux aires du cerveau (le lobe frontal et le lobe pariétal) est essentielle à la récupération de l’héminégligence. Cependant, chez l’animal, la récupération de l’héminégligence est rapide et spontanée même dans les cas de coupure de communication entre ces deux régions du cerveau. Les primates utilisent donc un mécanisme de récupération qui n’existe pas chez l’être humain. C’est pourquoi ce projet propose d’étudier la récupération de l’héminégligence chez le primate afin de découvrir de nouvelles pistes thérapeutiques chez l’être humain.

Bénéfices attendus

En étudiant la récupération de l’héminégligence chez le primate, ce projet a pour objectifs de mieux en comprendre les mécanismes et ainsi d’en déduire de nouvelles pistes thérapeutiques. A terme un traitement pourrait améliorer la récupération des patients souffrant d’héminégligence suite à un accident vasculaire cérébral. De plus, en validant l'utilisation du primate comme modèle d’héminégligence et en proposant des tests d’évaluation de ce trouble adaptés, notre étude apporte une base indispensable aux tests de traitements pharmacologiques. Cette étape est nécessaire avant la mise en place des essais chez l’être humain. Cela représente un gain de temps important dans le processus de développement d’éventuels traitements.

Procédures

• Imagerie à Résonnance Magnétique (IRM) : Les 15 animaux (le groupe contrôle et les deux groupes lésés) réaliseront au maximum 4 IRM (séquences complètes) avec une durée d’anesthésie maximale de 7 heures pendant toute la durée du projet. • Afin de maintenir la tête des animaux pendant les enregistrements, un dispositif doit être implanté sur la tête de l’animal. Ce dispositif comprend également une chambre d’enregistrement dans laquelle une partie du crâne a été retirée pour permettre l’enregistrement de l’activité cérébrale. Cette chirurgie aura lieu une fois pour 1 à 3 animaux du groupe contrôle avec une durée maximale d’anesthésie de 8 heures. Afin d’éliminer la douleur durant la chirurgie et après l’opération, les animaux recevront des anti-douleurs. Il est possible que d’autres chirurgies soient effectuées (3 au maximum par animal) dans le cas où l’animal perdrait le dispositif ou si les soins d’entretiens deviennent difficiles. Ces 1 à 3 animaux du groupe contrôle auront ainsi au maximum 4 chirurgies (1 pour la pose de la chambre d’enregistrement/retrait d’une partie du crâne, 1 pour la remise en place du dispositif et 2 pour entretiens du dispositif). • Afin de créer le trouble de l’héminégligence, une lésion chirurgicale du cerveau est réalisée durant une chirurgie chez 10 animaux (les 2 groupes lésés) avec une durée d’anesthésie maximale de 8 heures. Afin d’éliminer la douleur durant la chirurgie et après l’opération, les animaux recevront des anti-douleurs. • Les animaux implantés du dispositif d’observation (3 animaux du groupe contrôle) participeront à des enregistrements de l’activité du cerveau et des neurones pendant qu’ils réalisent des tests visuels. Ces enregistrements dureront au maximum 2 heures sur une période comprise entre 3 et 12 mois. • Les animaux anesthésiés (15 animaux) participeront à des enregistrements de l’activité du cerveau. Ces enregistrements dureront au maximum 2 heures sur une période comprise entre 3 et 12 mois. • Les animaux (15 animaux) seront euthanasiés. Les deux groupes ayant eu une lésion (2 groupes de 5 animaux chacun) seront euthanasiés respectivement 3 et 12 mois après la lésion. Le groupe contrôle (5 animaux) seront euthanasiés après que l’euthanasie des deux autres groupes ait été réalisée.

Impact sur les animaux

Il est attendu que la lésion réalisée induise une perception altérée de la moitié de leur vision et impacte leur comportement (déplacement et alimentation difficiles pouvant entraîner une perte de poids). Les animaux ayant eu une chirurgie (retrait d’une partie du crâne, lésion et pose de chambre d’enregistrement/système de fixation de la tête) pourront ressentir de la douleur à la suite de la chirurgie. La chirurgie peut, dans certains cas, causer une accumulation de liquides et/ou abîmer la couche de tissu protectrice du cerveau. Les animaux soumis à une anesthésie pourront présenter des difficultés à se déplacer (de 1 à 4 jours). L’implantation d’une chambre d’enregistrement/système de fixation de la tête peut induire une difficulté à se déplacer et des collisions à cause de l’encombrement (pendant quelques jours avec une variabilité individuelle). L’isolement nécessaire aux tâches comportementales peut induire un stress chez l’animal concerné. Celui-ci peut notamment se manifester par des stéréotypies (gestes répétitifs, rythmés sans but apparent) ou des dépilations. Suite à des bagarres, une chute ou un choc, l’animal pourrait perdre son dispositif composé de la chambre d’enregistrement et du système de fixation de la tête. L’installation de la chambre d’enregistrement peut faciliter une infection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures afin de pouvoir effectuer différents prélèvements (cerveau…) pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Ce projet a pour objectifs de comprendre et de manipuler à des fins thérapeutiques les processus de récupération du cerveau suite à un accident vasculaire chez le primate. Ces processus sont complexes ce qui rend difficile/impossible à l’heure actuelle leur modélisation. Dans ce contexte, il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux vivants par des méthodes alternatives. Par ailleurs, il est indispensable d’obtenir des données d’études sur les modèles animaux avant de pouvoir tester de nouvelles approches thérapeutiques chez les patients humains. Le modèle animal et en particulier l’utilisation du primate non-humain est donc le plus pertinent pour espérer une transposition à l’homme la plus fiable possible.

Réduction

La taille des groupes et le nombre total d’animaux nécessaire pour cette étude a été déterminée par des calculs de puissance. Il a été ainsi établi que 3 groupes de 5 animaux pour 15 animaux au total seraient essentiels pour la réalisation de ce projet. Des tests statistiques seront nécessaires pour obtenir une interprétation fiable des résultats. Tous les animaux de ce projet ont déjà réalisé des procédures de classe légère lors d’un précédent projet validé par le comité d’éthique et ayant obtenu un agrément.

Raffinement

Etat Général : - Entraînement des animaux avec renforcement positif (récompense) pour créer une routine qui limite les contentions et le stress lors des manipulations et les tâches demandées. - Adaptation de l’hébergement, de l’enrichissement et l’alimentation pour stimuler les animaux (recherche nourriture, jeux, vidéo…) et limiter les comportements anormaux (mouvements répétitifs, immobilité…). Chirurgies et IRM : - Actes réalisés sous anesthésie générale avec la mise en place d’anti-douleurs adaptés (avant, pendant et après l’opération), surveillance accrue de l’animal anesthésié pour éviter toutes les complications (déshydratation, baisse de la température, rythmes cardiaque et respiratoire, infection…). Ces risques sont bien identifiés et une réponse est apportée à chaque point. Par exemple : tapis chauffant pour la température, gel ophtalmique pour l’hydratation des yeux, désinfection et utilisation de matériel stérile pour éviter l’infection, anesthésique local pour l’intubation et l’installation des barres d’oreilles (dispositif de maintien de la tête fixe), intubation pour sécuriser la respiration, matériel chirurgical permettant d’avoir un geste précis et en limitant les saignements… - Le dispositif implanté sera le plus petit possible pour le confort de l’animal et limiter la gêne. Il sera posé dans des règles strictes d’asepsie… - Limitation des IRM à une fois toutes les 2 semaines. Post-opératoire : - A chaque anesthésie, la récupération de l’animal doit être complète avant la poursuite du reste du projet. - Après lésion, les animaux sont hébergés par 2 dans des cages ajustables pour prévenir les chutes. Ces cages conservent des aménagements permettant une stratification de l’espace tout en préservant l’animal des risques de chute. Une alimentation riche pourra être proposé pour faciliter la récupération. - Suite aux différentes chirurgies, les comportements alimentaires et sociaux des animaux peuvent être modifiés, ils feront donc l’objet d’une surveillance augmentée. Des observations post-anesthésie et post-chirurgie régulières et rigoureuses seront faîtes pour détecter le moindre inconfort de l’animal. Points scientifiques : - Dès que les données permettant de répondre à nos questions scientifiques seront obtenues, les expérimentations impliquant les animaux seront arrêtées.

Choix des espèces

La complexité des processus de récupération d'un accident vasculaire cérébrale rend indispensable d’utiliser un modèle suffisamment proche de l’Homme pour tester ensuite de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le primate non-humain est ainsi un modèle particulièrement approprié pour notre étude. De plus, les capacités d’apprentissage des singes permettent la réalisation de tâches comportementales similaires à celles réalisées par l’Homme. La complexité du cerveau rend difficile/impossible à l’heure actuelle, la modélisation de ces processus. Il est primordial d’étudier ces aspects dans un modèle primate non-humain. Il y a plusieurs raisons motivant le choix du singe écureuil par rapport à d’autres espèces de primates : Le choix de cette espèce a été fait car le singe écureuil est plus facile d’accès et est particulièrement adapté à ce genre d’étude en comparaison du macaque. La taille de cette espèce est un paramètre intéressant puisqu’il permet d’utiliser des appareils IRM plus puissants dont le diamètre d’entrée est plus petit. De plus, le choix ne s’est pas porté sur les rongeurs car contrairement aux primates non humains, les rongeurs ne semblent pas présenter de symptômes d’héminégligence. Par ailleurs, nous n’avons pas choisi le macaque car il a été démontré qu’une lésion de la zone cérébrale causant le trouble de l’héminégligence chez cette espèce induisait des symptômes qui pouvaient perdurer plusieurs mois, voire même plusieurs années. Ces différents points expliquent les raisons pour lesquelles nous avons décidé d’utiliser le modèle du singe écureuil pour ce projet. Les animaux utilisés seront tous adultes (âge supérieur à 3 ans). Étant donné que l’âge est un facteur de risque pour les accidents vasculaires cérébraux, nous utiliserons des animaux les plus âgés possibles. En effet, il a été observé chez d’autres espèces de primates que par rapport aux plus jeunes, les animaux âgés étaient plus sensibles à la lésion et que le syndrome obtenu était généralement plus stable.

10 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous la peau deux implants d'un biomatériau lors d'une chirurgie, avec un risque d'hématome, d'abcès et de douleurs à l'alimentation. Le porteur, en collaboration avec deux partenaires industriels, évalue la tolérance d'un film destiné à prévenir les fistules après ablation du larynx chez l'humain. Il indique que le dispositif n'a jamais été testé in vivo et qu'un modèle in silico n'est pas envisageable.

Objectifs

Le présent projet vise à développer un biomatériau innovant sous la forme d'un film double couche pour la prévention des fistules salivaires (fuite de salive par défaut de cicatrisation) après une chirurgie du cou / de la gorge (laryngectomie totale). Cette chirurgie consiste en l'ablation du larynx, généralement pratiquée pour traiter un cancer. La fistule salivaire est une complication fréquente de cette chirurgie, et elle est associée à de fréquentes complications, un allongement de la durée d'hospitalisation, des chirurgies répétées, des dépenses de soins accrues, une qualité de vie moindre, voire un décès. Le projet est une collaboration entre un établissement de santé spécialisé en cancérologie, 2 laboratoires de recherche académique spécialisés dans les biomatériaux et 2 partenaires industriels. Ce projet s’appuie sur des résultats préliminaires concernant le design d'un biomatériau. Le projet présenté ici consiste à évaluer le biomatériau implanté sous la peau chez le petit animal (10 souris). L'objectif de ce projet est l'étude de la tolérance et l'intégration du biomatériau (bioadhésion et biointégration).

Bénéfices attendus

Développement d'un biomatériau innovant permettant de diminuer le taux de fistule salivaire (fuite de salive par défaut de cicatrisation) après chirurgie du cou / de la gorge (laryngectomie totale) chez l'homme. De nombreux bénéfices secondaires sont attendus, comme une diminution du taux de fistule salivaire et des complications suscitées qui en découlent, et donc de la durée d'hospitalisation moyenne après laryngectomie totale.

Procédures

Une chirurgie sous anesthésie générale sera effectuée, consistant à effectuer une insertion du biomatériau sous la peau. Chirurgie durant 10 minutes environ.

Impact sur les animaux

Risque d'hématome, infection du site opératoire (abcès), douleurs à l'alimentation, impact sur le comportement et détérioration de l'état général.

Devenir

Mise à mort nécessaire car l'objectif primaire de l'étude concerne l'étude de la tolérance et l'intégration du biomatériau (bioadhésion et biointégration), requérant une analyse histologique (autopsie pour analyse de l'explant).

Remplacement

ll n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. En effet, avant de pouvoir mettre en place les premiers essais cliniques chez l'Homme, il est nécessaire de vérifier la bioadhésion et la biocompatibilité de ce biomatériau nouveau dans une étude préalable sur modèle animal. Le dispositif médical n'a jamais été testé in vivo. Les analyses in vitro ont été réalisées dans un milieu non calcique seulement. Un modèle in silico n'est pas envisageable pour ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires a été réduit par une analyse statistique optimale établie en fonction des résultats attendus, ainsi que le choix de modèles animaux et de protocoles déjà validés dans la littérature. Des tests in vitro ont été réalisés au préalable afin de limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés. 10 animaux sont nécessaires pour atteindre l'objectif de l'étude selon un design établi au préalable. De plus, chaque animal sera porteur de deux implants, ce qui divise par deux le nombre de souris nécessaires.

Raffinement

Le bien-être animal sera raffiné par une optimisation de la gestion de la douleur. Les animaux seront surveillés avec attention (comportement, prise alimentaire) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience. Les difficultés à l'alimentation seront surveillées et la prise alimentaire sera facilitée par les antalgiques et un accès ad libitum à l'eau et à de l'alimentation. Elle sera supplémentée par des compléments hypernutritifs en cas de perte de poids. Les cages contiendront 3 à 4 souris et seront de taille adaptée à la règlementation. Le change sera effectué 2 fois par mois. Un enrichissement environnemental dans les compartiments sera réalisé avec mise en place de cachettes, de papier, coton pour réaliser des nids. Des points limites seront respectés pour éviter toute souffrance excessive. L'ensemble du personnel est qualifié et compétent en matière d'expérimentation animale, et l'animalerie possède l'agrément et le plateau technique nécessaires. A noter que les animaux ne pourront pas être réutilisés car une analyse de l'intégration du biomatériau au microscope est nécessaire (autopsie pour analyse des explants).

Choix des espèces

Modèle animal simple, fiable et suffisamment robuste pour l'objectif de l'étude. Souris adultes d'au moins 5 semaines. Les souris seront utilisées à l'âge adulte car le taux d'hormone de croissance et les capacités de cicatrisation sont accrus chez les animaux en croissance. Des souris mâles seront utilisées. Aucune étude ne prouve de différence de capacité de cicatrisation chez la souris adulte en fonction du sexe, notre choix a donc été guidé par l'aspect logistique (éviter de mélanger les sexes en cage) et car les cancers de la tête et du cou touchent principalement les hommes.