Procédures modérées
Fonction et régulation des macrophages des îlots pancréatiques chez la souris, en physiologie et lors d’une obésité.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
2 730 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont soumises à un régime gras jusqu'à atteindre 45 grammes, reçoivent des injections d'un agent neutralisant les macrophages, subissent des jeûnes, un gavage et des prélèvements de sang dont un prélèvement rétro-orbital, pour étudier le rôle des macrophages des îlots du pancréas dans l'obésité. Le porteur justifie des groupes de 60 souris par le faible nombre de macrophages récupérables par animal. Il indique avoir tenté l'étude in vitro sur îlots humains et de souris sans succès, et conclut qu'il est impossible de s'affranchir d'un organisme entier.
Objectifs
Les îlots de Langerhans sont des micro-organes dans le pancréas et sont indispensables à la régulation du glucose dans l’organisme. Lors d’une obésité induite par un régime riche en graisses, des cellules spécifiques des îlots doivent compenser la résistance à l’insuline qui s’installe avec la prise de poids en augmentant leur nombre ainsi que la quantité d’insuline qu’elles produisent. De la même façon d’autres cellules de l’îlot produisent des quantités anormales de glucagon. Le système immunitaire inné, et en particulier les macrophages, joue un rôle important dans la régulation du métabolisme. Des macrophages sont également retrouvés dans les îlots pancréatiques. Des premières études ont montré que l’absence de macrophages peut compromettre le nombre et le bon fonctionnement des cellules de l’îlot indispensables à la régulation du glucose dans l’organisme (via la production d’insuline ou de glucagon). Les mécanismes impliqués dans ce phénomène restent flous. De même, une différence dans la quantité de macrophage dans les îlots en fonction du sexe a été constatée mais reste inexplorée. Les mécanismes cellulaires et moléculaires permettant la régulation des macrophages vers un caractère pro-inflammatoire ou au contraire anti-inflammatoire des îlots ne sont pas connus à ce jour. Une sur-activation des macrophages dans les îlots pourraient influencer les cellules productrices d’insuline et pourraient promouvoir l’apparition d’un diabète. Nos travaux préliminaires ont permis d’identifier deux voies potentielles capables de réguler localement le caractère pro ou anti-inflammatoire des macrophages. Les objectifs principaux de ce projet sont donc de définir le rôle des macrophages dans la régulation des cellules présentes dans les îlots, y compris dans le cas d’une obésité, et de confirmer le rôle des voies précédemment identifiées.
Bénéfices attendus
Il est aujourd’hui admis que les macrophages jouent un rôle primordial dans la régulation métabolique notamment dans le tissu adipeux et le foie. Les macrophages résidant dans les îlots pancréatiques n’ont eux été décrits que tardivement et les contraintes liées à leurs techniques d’analyse font qu’ils restent encore largement ignorés. En effet, les macrophages représentent seulement 1% des cellules totales des îlots ce qui ne représente qu’environ 1200 macrophages par souris. Cela limite donc le type et le nombre d’expériences pouvant être effectuées sur les échantillons de chaque souris, or nous avons besoin des données provenant de trois grandes techniques, qui une fois combinées, nous permettrons de répondre à nos hypothèses. Malgré ces obstacles, notre laboratoire a acquis l’expertise nécessaire pour travailler sur ce tissu complexe. Ce projet représente donc une étape majeure dans la compréhension des macrophages résidant dans les îlots pancréatiques et de leur influence sur le métabolisme du glucose. Nous porterons notre attention sur le développement de l’obésité induite par un régime riche en graisses qui est une condition où les îlots sont très sollicités et sur l’impact du sexe qui n’a pas été étudié jusqu’ici. Notre projet s’attaque donc à déchiffrer les voies cellulaires et moléculaires encore inconnues qui seraient capables de garder les macrophages de l’îlot sous contrôle. Comprendre ces mécanismes pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques qui permettraient de prévenir et/ou traiter l’inflammation pathologique observée lors de l’apparition d’un diabète. Selon les résultats obtenus, ces voies pourraient être testées dans de nouveaux modèles de souris diabétiques de type 2 ou de type 1 (auto-immun) dans un futur projet.
Procédures
Les animaux seront soumis à différents types d'alimentation (régime standard ou régime riche en graisses) sur une durée d'une ou douze semaines. Les animaux peuvent également recevoir une ou quatre injections (fonction de la durée du régime) d'un agent permettant de neutraliser les macrophages spécifiquement dans les îlots pancréatiques (quelques secondes par injection). Des prélèvements sanguins seront effectués en fin de procédure de façon à contrôler la glycémie ou la sécrétion d'insuline (prélèvement répétés de petits volumes de quelques secondes: 6 prélèvements répartis sur 2h) pour nous permettre de déterminer si la souris contrôle correctement son métabolisme glucidique. Ces tests nécessitent une mise à jeun de 16h ainsi qu’un gavage (10 secondes) pour la glycémie et une mise à jeun de 6h ainsi qu’une injection d’insuline (quelques secondes) pour la sensibilité à l’insuline. En fin de protocole, afin de doser différents marqueurs, nous réaliserons un prélèvement dans une poche à proximité de l'œil présente chez les souris. Ce prélèvement (quelques secondes) nécessite une anesthésie gazeuse (2 à 3 minutes) et un anesthésique local sera apposé à la fin du prélèvement.
Impact sur les animaux
Aucun effet néfaste n’est connu pour les différents traitements d’agent neutralisant et les différents modèles de souris transgéniques. - Injection intrapéritonéale (IP) : douleur légère due à la piqure, le volume ou la solution injectée ne créeront pas d’effet dommageable sur l’animale. - Régime riche en graisse (HFD) : Pas d’effet dommageable pour les animaux suivis sur 1 semaine de traitement, les animaux suivis sur 12 semaines vont prendre du poids au fur et à mesure des semaines (jusqu’à 45 grammes) et devenir un peu moins actifs. En fin de protocole : - Mise à jeun : Les animaux n’auront plus accès à la nourriture, ils pourront subir une gêne due à la sensation de faim. - Gavage : contention soutenue pour quelques secondes afin d’introduire correctement la sonde dans l’œsophage et jusqu’à l’estomac. Le volume et la solution administrés ne provoquerons pas d’effet dommageable sur l’animal. Il n’y a pas de risque d’irritation de l’œsophage car le geste n’est effectué qu’une seule fois. - Microcoupure à la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. - Prélèvement rétro-orbital : gêne/douleur modérée au point de prélèvement. L’animal sera anesthésié au moment du prélèvement et recevra en complément un anesthésique local pour son réveil. L’animal ne subira donc aucun traumatisme dû au geste ou à la contention, la douleur éventuelle au point de prélèvement sera amoindrie après le réveil.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires pour mettre en œuvre les trois grandes techniques qui nous sont indispensables à la compréhension des mécanismes que nous souhaitons explorer dans ce projet.
Remplacement
Afin de comprendre le rôle des macrophages des îlots en physiologie et dans le développement d’une obésité, nous avons choisi d’utiliser la stratégie de neutralisation des macrophages au niveau des îlots. Des études préliminaires nous ont permis d’orienter nos études sur seulement deux voies qui pourraient s’avérer jouer un rôle majeur dans les mécanismes du métabolisme du glucose et le rôle que pourraient y jouer les macrophages. Nous avons tenté de réaliser cette étude in vitro à partir d’échantillons humains. Malheureusement nous n’avons que rarement la possibilité d’étudier des îlots pancréatiques humains. De plus, ces îlots proviennent de donneurs cadavériques aux caractéristiques variables et passent plusieurs jours en culture avant réception, ce qui peut influencer le nombre, les caractéristiques ou la viabilité des cellules les îlots et leurs macrophages. Nous avons également tenté des réaliser cette étude in vitro à partir d’îlots de souris, la neutralisation des macrophages s’est révélée insuffisante. Ainsi, les modèles animaux vivants nous permettent d’étudier les îlots pancréatiques dans des conditions reproductibles et d’investiguer précisément le modèle de développement de l’obésité. De plus, les îlots pancréatiques répondent à la prise de poids et au dialogue entre les différents organes métaboliques, il est donc impossible de s’affranchir d’un organisme dans son ensemble.
Réduction
Pour chaque condition expérimentale, des groupes de 60 souris seront créés. Cela prend en compte la mortalité naturelle (10%) et surtout les limites techniques associées à l’isolement des îlots et à l’étude des macrophages des îlots, nous avons donc besoin de partir avec 20 animaux pour chacune des trois grandes techniques que nous souhaitons mettre en place (20x3=60). Comme décrit précédemment, de par le faible nombre d’îlots/macrophages que nous obtenons par animal (environ 200 îlots/souris), nous ne pouvons cumuler les différentes analyses à partir des échantillons d’une seule souris et nous devons donc prévoir un groupe (n=20) pour chaque type d’analyse. Ainsi, le nombre de souris utilisées reflète le nombre d’îlots/macrophages nécessaire pour le succès de notre projet. - Expression génique (100 îlots/condition) couplée aux tests fonctionnels (80 à 120 îlots/condition selon le test) - Cytométrie en flux (> 150 îlots/condition) - Histologie sur pancréas total (1 pancréas/souris) Pour répondre à nos questions de recherche, il est important de combiner ces différentes techniques qui apportent des informations complémentaires. Cependant, afin de réduire le nombre d’animaux dans l’étude, nous avons développé des protocoles permettant l'évaluation de la tolérance au glucose et l’évaluation de la sensibilité à l’insuline sur un même animal avec une période de récupération entre chaque test. De plus, les souris seront utilisées pour plusieurs projets du laboratoire avec l’analyse d’autres organes tels que le tissu adipeux et le foie notamment.
Raffinement
Les animaux sont hébergés sur des portoirs ventilés et ont un accès libre et illimité à l'eau et la nourriture. Les conditions de température et d'humidité sont contrôlées et monitorées tous les jours pour qu'elles soient optimales pour les souris. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (8h-20h), les souris étant des animaux nocturnes une période importante d'obscurité est indispensable à leur bien-être. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum, en effet la souris est un animal grégaire, la vie en groupe est un facteur important pour son bien-être. Si, pour des raisons de protocole, une souris devait se retrouver seule dans une cage, l’enrichissement sera augmenté. Pour s’assurer du confort des souris, elles bénéficieront de coton et de «maison» afin de les occuper et qu’elles puissent se construire un « nid ». Les souris seront sous surveillance quotidienne de la part de l'équipe professionnelle de zootechnie. Aucun effet néfaste n'est connu après l'injection des agents neutralisants ou sur les lignées transgéniques. Les souris sous régime riche en graisse vont prendre du poids et devenir un peu moins actives. Nous avons tout de même tenu à mettre en place, en plus de la surveillance journalière de la part des animaliers, un suivi hebdomadaire de la part de l'équipe scientifique avec prise en compte des critères (poids, aspects visuels et comportementaux) informatifs sur l'état de bien-être des animaux. Si, à l'aide de ces critères, un animal est jugé en mal-être, il sera sorti du protocole expérimental.
Choix des espèces
La souris est le modèle de référence dans l'étude de l'obésité et du diabète, en effet les gènes impliqués dans l’obésité et le diabète (dont les gènes de l'inflammation chronique) jusqu’à présent identifiés sont très proches chez la souris et chez l’Homme. De plus la souris est un modèle permettant l'obtention relativement rapide du nombre d'individus suffisant et que nous sommes en capacité d'héberger dans des conditions (surface, température, luminosité) nécessaires à son bien-être. La souris est également un modèle pour lequel il existe beaucoup d’outils disponibles : modification du génome pour créer les meilleurs modèles d'études possible, méthodes d'analyses des tissus prélevés, etc. L'ensemble de ces critères font de la souris le modèle optimal pour répondre aux questions du présent projet. Nous avons choisi de commencer les études sur des souris qui ont entre 8 et 10 semaines. Cela correspond à la maturité sexuelle (stabilisation hormonale) et équivaut à l'entrée dans l'âge adulte chez l'Homme.
Impact de la désorganisation de l’hétérochromatine et de l’activation des éléments transposables sur la fonction des cellules souches hématopoïétiques au cours de l’âge, en réponse aux stress, ou dans le contexte d’une hématopoïèse clonale.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
8 236 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des irradiations du corps entier, parfois létales et suivies d'une greffe, ainsi que des injections répétées d'un produit inflammatoire pendant un mois, pour étudier le vieillissement des cellules souches du sang et le risque de leucémie. Le porteur indique que l'irradiation létale peut provoquer des diarrhées et modifier la croissance des dents, et que les injections sont douloureuses. Il affirme que la fonction des cellules souches ne peut être testée qu'in vivo et met en avant des méthodes réduisant le nombre d'animaux.
Objectifs
Les cellules souches du sang s’auto-renouvellent et différencient pour donner l’ensemble des cellules du sang . Avec l’âge, la fonction des CSH est affectée et des mutations apparaissent. L’âge induit un contexte pré-leucémique dans les cellules souches du sang et un risque accru de développer des leucémies (cancers du sang). L’inflammation augmente avec l’âge et est un facteur important du développement de leucémies. Certaines mutations confèrent un avantage compétitif à la cellule mutée, donnant lieu à une production illimitée de cellules cancéreuses. Ces cellules mutées sont sélectionnées et s’amplifient en réponse à des stress tels que l’inflammation ou l’exposition à des rayonnments ionisants, prédisposant ainsi au développement leucémique. Le vieillissement, l’inflammation et les rayonnements ionisants, qui induisent un vieillissement prématuré, induisent des altérations de la disponibilité de l'ADN de la cellule. Notre projet a pour but de caractériser l’impact de l’âge, de l’inflammation et de l’exposition à des rayonnements ionisants dans les cellules souches du sang de souris normales ou présentant une perte de fonction de gènes importants.
Bénéfices attendus
D'un point de vue fondamental, comprendre comment l'état de protéines déterminant la conformation et la disponibilité de l'ADN cellulaire peut influencer l'identité et la fonction des cellules souches du sang est d'un intérêt majeur pour appréhender les pathologies liées au vieillissement, telles que certaines leucémies. Sur le plan clinique, la découverte de voies susceptibles d'être ciblées thérapeutiquement pour remédier au déclin du tissu régénrateur du sang pourrait conduire à de nouveaux moyens de prévenir ou traiter les leucémies, mais aussi différentes maladies chroniques liées au vieillissement.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux sont par lots différents: une Irradiation sub-létale corps entier (durée 3 minutes); des injections tous les 2 jours pendant 30 jours (durée 1 minute, anesthésie locale); une irradiation létale (durée 12 minutes) suivie d'une greffe par injection sous anesthésie générale (durée 2 minutes).
Impact sur les animaux
Les injections répétées d'un produit inflammatoire peuvent induire une réponse inflammatoire localisée et douloureuse. L'irradiation léthale peut induire des diarrhées transitoires et des modification de la croissance des dents. Le injections simples induisent très peu de nuisances.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. En effet, à la fin de chaque procédure, nous prélèverons les cellules souchés hématopoïétiques pour réaliser des exériences de génomique, ou les cellules de la moelle osseuse pour analyser le pourcentage de cellules mutées dans la moelle par cytométrie.
Remplacement
L’hématopoïèse est le processus physiologique qui conduit à la formation de toutes les cellules du sang. C’est un processus qui met en action plusieurs cellules de la niche hématopoïétique, que l’on ne sait pas encore reproduire in vitro. Il ne peut par conséquent pas être totalement étudié in vitro. D’autre part, nous travaillons sur les cellules souches hématopoïétiques, qui différencient dès qu’elles sont mises en culture in vitro : à partir du moment où nous travaillons hors de l’organisme, ce ne sont plus les mêmes cellules. Finalement, si de nombreux marqueurs permettent la caractérisation phénotypique des celluels souches hématopoiétiques, leur caractérisation finale est fondée sur leur capacité unique de reconstituer l’hématopoïèse dans son ensemble dans un organisme vivant. Cette fonction ne peut être testée qu’in vivo.
Réduction
Nous limiterons au maximum le nombre de souris utilisées. Les nombres d’animaux nécessaires aux différents types d’expérimentation ont été estimés sur la base d’expériences préliminaires, l’objectif étant d’utiliser le nombre d’animaux le plus petit possible tout en étant suffisant pour obtenir des résultats significatifs d’un point de vue statistique. Pour les analyses moléculaires, nous récupèrerons toutes les cellules souches possibles seront utilisées. Pour le séquençage d'acide ribonucléique, nous avons récemment développé des préparations de librairies à partir de petites quantités de matériel. Cette méthodologie, utilisée maintenant en routine au laboratoire, est très importante pour augmenter le nombre d’échantillons exploitables et donc réduire le nombre de souris nécessaires. Une technologie récente, développée au laboratoire cette année, nous permet aussi de faire les analyses épigénétiques sur les cellules issues d'une seule souris quand il en fallait 10 fois plus auparavant. Les expériences de transplantations ne seront réalisées que pour confirmer un effet sur la fonctionnalité des cellules préalablement observée sur des tests in vitro. Les cellules transplantées seront des pools issus de plusieurs souris pour limiter la variabilité inter-individu des souris donneuses.Parmi les souris nées dans les élevages de souris transgéniques les souris non mutées seront aussi utilisées, comme témoins, évitant d'utiliser des souris spécifiques pour cela. Nous utiliserons des tests statistiques pour tester l’effet de plusieurs conditions en parallèle. Concernant les expériences à grande échelle sur génome entier, les analyses statistiques seront faites par des bioinformaticiens.
Raffinement
Les injections seront faites sous anesthésie locale ou générale . Une observation des animaux sera réalisée quotidiennement, afin de s’assurer que l’animal ne présente pas de complications. Afin de favoriser le bien-être des animaux, l’hébergement se fera en groupe pour favoriser la socialisation des animaux. Un enrichissement environnemental du milieu (sizzlenests, tunnels, maisons) sera mis en place dans chaque cage. Les animaux seront observés quotidiennement lors de chaque intervention des expérimentateurs (injection, pesées). Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux bénéficieront d’un environnement enrichi en tout temps. Un complément alimentaire énergétique et appétent sera ajouté dans les cages après transplantation ou en cas de diminution de la prise alimentaire.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour étudier l’hématopoïèse et la leucémogénèse. Les souris possèdent un système physiologique proche de celui de l’homme. Les souches des animaux sont bien caractérisées génétiquement ce qui permet d’effectuer des transplantations de cellules souches en palliant les problèmes liés au rejet de greffe. De plus, cette espèce permet le développement rapide d’animaux transgéniques qui sont nécessaires pour étudier les rôles de gènes/protéines dans l’hématopoïèse normale et le développement de pathologies en présence d’un système immunitaire compétent. Enfin, Il s’agit d’espèces faciles à élever qui permettent l’obtention relativement rapide de résultats du fait de leur temps de génération réduit. Nous utiliserons des souris de 8-14 semaines car elles sont considérées comme adulte. En effet, dans le cadre de notre étude, nous avons besoin que les animaux aient atteints l’âge adulte.
Développement de modèle de fibrose évoluant vers la cirrhose hépatique chez le rat. Application à l’évaluation de propriétés thérapeutiques de composés dans la décompensation aigue de la cirrhose.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
1 380 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 1 140 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une vingtaine de gavages, une injection de bactéries ou de LPS et une chirurgie abdominale avec ligature et perforation du caecum, pour reproduire une cirrhose décompensée et tester des composés. Le porteur indique s'attendre à des animaux en état de choc et en détresse cardio-respiratoire, et reconnaît limiter l'analgésie parce que la buprénorphine s'est révélée délétère et introduirait un biais. Il affirme que l'évaluation finale des composés reste "nécessaire" chez l'animal vivant.
Objectifs
La décompensation de la cirrhose est caractérisée par la jaunisse, l’œdème, l’ascite et des troubles du système nerveux central, elle conduit à la mort dans un délai de 5 ans. La transplantation hépatique doit être envisagée pour maintenir le patient en vie. Chez un malade chronique du foie, elle est appelée défaillance hépatique aigüe, elle provoque des défaillances d’autres organes (reins), qui sont souvent fatales. La décompensation aigue est provoquée par une inflammation induite par une infection microbienne ou prise abondante d’alcool. La recherche de moyens médicaux est nécessaire et nécessite des modèles animaux pour les développer. Notre projet vise donc à développer le modèle décrit proche de la situation vécue par les malades de cirrhose et à évaluer la capacité de nouveaux médicaments à améliorer leur état général. Pour satisfaire à la règle des 3 R, nous avons estimé le nombre d’animaux pour chaque procédure pour avoir une réponse statistiquement analysable. Les procédures seront appliquées par des personnes habilitées, dans un hébergement adapté et bénéficiant de l’enrichissement du milieu, respectant au maximum le bien-être des animaux. Afin de prévenir des souffrances non nécessaires et de ne pas altérer les résultats de l'étude, des points limites seront définis, au-delà desquels les animaux seront retirés de l'étude et mis à mort de façon éthique. Etant donné la complexité de l’évènement étudié qui produit le dysfonctionnement de plusieurs organes, il nous est impossible de totalement remplacer cette expérimentation par des expériences in vitro mais la sélection des composés est effectuée in vitro ce qui participe partiellement à l’emploi de méthodes alternatives. Ainsi le nombre total de souris prévu est de 1380 animaux sur 5 années.
Bénéfices attendus
Lors de défaillance hépatique aigue, il est nécessaire de prendre en charge les patients pour les multiples troubles qui affectent les autres organes le plus précocement possible. Aujourd’hui on utilise des traitements qui vont agir sur la pression sanguine, l’infection, les hémorragies du système digestif, ou le dysfonctionnement des reins à l’aide de corticoïdes. Le but est de préserver les fonctions vitales dans les meilleures conditions afin de conserver les chances de succès de la greffe du foie. Les traitements que nous espérons proposer visent à agir simultanément très tôy sur les mécanisme qui sont à l’origine des défaillances multiples des organes. (Infection, inflammation, immunité et métabolisme).
Procédures
Les animaux recevront 20 gavages par sonde oro gastrique (volume de 2ml/kg), chaque gavage prendra 15 secondes au cours d’une période de 12 semaines. Les animaux subiront 1 seul prélèvement sanguin intermédiaire à la fin de la période d’induction de la fibrose (en 10 semaines) et un second prélèvement sanguin à la fin de la procédure ( à la douzième semaine), ils seront pratiqués sous anesthésie, la durée totale d’un acte (anesthésie et prise de sang) prend 5 minutes. Les animaux recevront 1 injection intrapéritonéale au moment du déclenchement de l'ACLF (injection LPS ou Bactéries à la fin de la douzième semaine), elle sera pratiquée sur animaux vigiles contraints. La durée d’un acte est de 30 secondes. Les gestes suivants seront réalisés aux animaux qui subiront une chirurgie abdominale : • rasage de la fourrure (état vigile) durée 3 minutes • 1 injection péritonéale d'agents anesthésiques (la durée d’un acte est de 30 secondes) • laparotomie, ligature et percement du cécum, suture du plan musculaire et du plan cutané (sous anesthésie). La durée totale de l’acte chirurgical sur l’animal anesthésié est de 10 minutes.
Impact sur les animaux
La rupture des fonctions hépatiques représente un évènement grave chez un patient, sa survie est engagée. Le modèle d’étude développé chez l'animal présente dans sa phase finale des signes cliniques d’inconfort manifestes. On s’attend à observer des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux atteindront des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé. Pour évaluer les effets de nos composés, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin de procédure au moment du prélevement terminal pour recueil des organes en vue d'analyses.
Remplacement
La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d'une pathologie présent chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles des outils translationnels très pertinents. Bien qu'une première phase de sélection des meilleurs composés soit effectuée in vitro, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux comme nous le rappelle la règle des 3R’s, l’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. Le recours à l'emploi d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et «global », capable de métaboliser les pricipes actifs donc de déceler les effets secondaires, capable d'activer toutes les voies de signalisation qui participent à la caractérisation de ce modèle. Son remplacement à ce stade du projet scientifique (phase pré clinique) n'est pas envisageable dans une système biologique isolé ou cellulaire qui quelque soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l'expérimentation in vivo.
Réduction
La stratégie de réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La réduction du nombre d'animaux est motivée par la longueur/lourdeur des procédures expérimentales, cela nous a conduit lors d'essais pilotes ou préliminaires de cibler le juste nombre d'individus nécessaires à l'obtention de résultats pertinents. Les paramètres que nous étudions in vivo (bio marqueurs, induction/repression de gènes, effets histologiques etc) doivent être relevants. Nous écartons les paramètres dont la pertinence serait trop faible pour être statistiquement décelable qu'avec des effectifs trop importants. Ces études pilotes permettent sur la base des effets et résultats obtenus d'établir une approche statistique du choix des effectifs par un calcul de la puissance statistique.
Raffinement
L'utilisation du phénobarbital en temps qu'agent sensibilisateur à l'agent hépatotoxique à pour but d'homogénéiser, raccourcir le délai d'exposition et réduire les riques de mortalité, permettre de réduire le nombre d'animaux et la durée d'inconfort des animaux. L'établissement de points limites dans ce modèle expérimental nous permet d'écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important ou de la douleur. Bien conscient que nous développons dans ce projet des modèles sévères, nous nous efforçons d'avoir recours à des moyens analgésiques adaptés et non confondants. La pathologie et les mécanismes qui la déclenchent sont en partie connus, l'emballement inflammatoire en est une composante, le recours à des moyens de lutte contre la douleur introduirait un biais expérimental. Nous avons fait l'étude des effets de buprénorphine dans un de ces modèle qui se sont avérés délétères. Dans un premier temps une étude bibliographique plus approfondie sur l'emploi de moyen analgésique d'autres classes médicamenteuses est menée. Pour le modèle chirurgical , nous employons en prémédication la lidocaine localement et la buprénorphine pour la prise en charge de la douleur causée par l'acte chirurgical, la médication permet d'améliorer le bien être de l'animal en phase post-op et de réduire la durée de la période de récupération.
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie. Le génome du rat et celui de l'homme ont 90% de leurs gènes en commun et ces derniers sont présents dans le même ordre sur les chromosomes, ce qui fait des petits rongeurs un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Très jeunes rats à l’arrivage (environs 21 jours, âge du sevrage), la taille optimale du rat pour commencer le traitement au phénobarbital a été déterminée à 100 g dans la littérature scientique.
Etude du rôle des macrophages thymiques dans la mise en place de la myasthénie autoimmune dans le modèle murin
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
270 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées pendant une à six semaines, subissent des tests moteurs répétés et un électromyogramme sous anesthésie, pour tester l'hypothèse d'un lien entre déficit en macrophages thymiques et myasthénie. Le porteur indique que les molécules injectées peuvent provoquer une fébrilité transitoire. Il justifie le recours à l'animal par un "besoin" de valider chez la souris des observations faites chez des patients et in vitro.
Objectifs
La myasthénie grave est une maladie auto-immune rare. Elle est liée à la production d’auto-anticorps dirigés contre le récepteur à l’acétylcholine (RACh), situé à la jonction entre le nerf et le muscle. Ces auto-anticorps altèrent la transmission du message nerveux entre le nerf et le muscle conduisant à des faiblesses musculaires plus ou moins invalidantes. Il n’existe actuellement aucun traitement pour guérir de la myasthénie. Les traitements actuels proposés aux patients sont essentiellement pour limiter les symptômes ou non-spécifiques, et doivent être pris à vie. Dans la myasthénie, si le muscle est l’organe cible, l’organe effecteur est le thymus. Une diminution du nombre des macrophages dans le thymus des patients myasthéniques a été récemment mise en évidence. Notre hypothèse est que ce défaut en macrophages de l’inflammation du thymus à l’origine de la myasthénie. Ce projet de recherche a pour but de démontrer chez la souris qu’une diminution du nombre de macrophages thymiques induit des changements thymiques comme ceux observés chez les patients, et à long terme une myasthénie.
Bénéfices attendus
La myasthénie autoimmune est une maladie chronique invalidante. On ne sait pas exactement encore pourquoi des personnes développent cette maladie. La compréhension des mécanismes étiologiques est donc très importante pour proposer de nouveaux traitements plus adaptés aux patients. En effet, à l’heure actuelle, les traitements proposés sont souvent des immunosuppresseurs à vie et/ou une ablation radicale du thymus. Dans ce projet, nous souhaitons démontrer qu’un défaut en macrophages thymiques serait à l’origine de l’inflammation thymique conduisant à la myasthénie. Il n’y a pas de modèle spontané connu de cette pathologie chez la souris. Nous souhaitons utiliser une combinaison de molécules pour : 1) Démontrer que l’injection intrapéritonéale de ces molécules peut induire au bout d’une semaine, une inflammation dans le thymus. 2) Démontrer que les effets ces molécules sont exacerbés chez des souris transgénique qui ont moins de macrophages. 3) Sur des manipes plus longues (6 semaines), rechercher chez des souris ayant moins de macrophages thymiques, l’apparition de symptômes myasthéniques. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre comment la myasthénie se met en place afin de proposer ensuite de nouvelles approches thérapeutiques aux patients.
Procédures
1) L’injection intra péritonéale consiste à injecter un produit directement dans le péritoine, en bas de l’abdomen, afin d’induire une réponse systémique rapide. Cette manipulation se fait sur souris vigiles et dure quelques secondes. Geste réalisé sur chaque souris et selon les procédures: - 3/sem pendant 1 semaine pour 90 souris – 3/sem pendant 4 semaines pour 36 souris – tous les jours pendant 1 semaine 36 souris – 2/sem pendant 6 semaines pour 108 souris. 2) Les tests cliniques visent à étudier l’activité motrice des différents animaux afin d'évaluer l'apparition de la pathologie et les effets du traitement. L’évaluation comportementale de l’activité motrice des souris est pratiquée à l’aide de tests usuels, basés sur le comportement spontané des rongeurs (Grip test après une course sur tapis de 5 minutes et grille retournée) et la mesure du poids. 5 mesures sont faites par souris pour le grip test et un test de la grille retournée; chaque test durant 1 minute maximum. Ces tests concernent 108 souris et sont menés tout au long du protocole expérimental : une séance d’habituation (pour minimiser le stress associé aux manipulations répétées) est effectuée quelques jours avant la première injection et ensuite des séances régulières sont espacées de 8 à 12 jours. 3) L’electromyogramme permet de suivre le statut myasthénique suite à une stimulation du muscle squelettique. Pour ce protocole les souris sont anesthésiées. Après l’examen, les souris sont ensuite replacées dans leur cage initiale. L’examen, qui dure en totalité de 10 à 15 minutes par animal, sera pratiqué quelques heures avant l’euthanasie de la souris à la fin du protocole expérimentale et ne sera donc réalisé qu’une seule fois par animal. Cette procédure concerne 108 souris dans ce projet.
Impact sur les animaux
Les molécules injectées peuvent entrainer une fébrilité transitoire due à l’activation du système immunitaire. Les injections intrapéritonéales ne sont pas invasives pour les souris, le geste étant rapide et n’entrainant pas de blessure chez l’animal ou de gêne pour le déplacement. Les tests cliniques n’entrainent pas de stress particulier chez la souris. L’électromyogramme sera effectué sur les souris anesthésiées et elles ne ressentiront pas la douleur dût au test. Dès la fin de la manipulation, l’animal est euthanasié et n’est donc pas impacté pour la suite par cette procédure.
Devenir
Tous les animaux à la fin de ce projet sont euthanasiés. Effectivement à la fin de chaque protocole, il est nécessaire de prélever différents organes et tissus pour pouvoir étudier l’impact physiologique et moléculaire des différents traitements utilisés. Ceci a pour but d’optimiser l’utilisation des souris de ce projet.
Remplacement
A ce jour notre projet découle d’observations faites chez des patients myasthéniques et d’expériences in vitro. Maintenant, nous avons besoin de valider nos observations avec des modèles animaux, afin de démontrer que la myasthénie pourrait être due à une diminution des macrophages thymiques
Réduction
Le nombre de souris par condition expérimentale est déterminé pour permettre une bonne analyse statistique des données et par un test de puissance, pour obtenir des résultats fiables à la suite de nos expériences, tout en utilisant le minimum d'animaux. En tout 270 souris sont nécessaires à la réalisation de ce projet expérimentale
Raffinement
Lors de leur arrivée dans l’animalerie, les souris sont acclimatées pendant au moins 1 semaine. Les souris sont stabulées sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (les lumières s'allument automatiquement à 6h du matin et s’éteignent le soir à 18h). L'utilisation de "Sizzlenests" (bandes de papier Kraft autoclavées) permet aux rongeurs de faire rapidement des nids. Le nid leur permet d’être moins dérangés par le bruit, la lumière, le mouvement et les changements de température. Il donne un sentiment de sécurité, ce qui réduit le stress des animaux et donc leur agressivité. Lorsqu'il y a apparition de signe clinique de la maladie, de la nourriture humidifiée est mise dans la cage pour éviter aux souris, si elles sont faibles d'aller chercher la nourriture en hauteur. Afin de limiter au maximum la douleur et le stress chez les animaux lors des injections intrapéritonéales, elles seront effectuées alternativement à gauche et à droite dans la partie basse de l’abdomen. Une séance d’habituation aux tests cliniques est effectuée quelques jours avant la première injection pour minimiser le stress associé aux manipulations. Le score clinique complet est évalué tous les 8-12 jours. Lors de l’électromyographie, la souris est anesthésié afin qu’elle ne ressente pas la douleur. La souris est ensuite euthanasiée juste après les mesures et ne ressent pas les conséquences de ce protocole. Les souris sont surveillées quotidiennement par les animaliers pour repérer d’éventuels signes de mal-être, de blessures ou si elles atteignent des points limites. Dans ces cas la souris est euthanasiée.
Choix des espèces
Les souris sont couramment utilisées pour la mise en place de modèles pour des maladies autoimmunes, dont la myasthénie. L’avantage de la souris est que le système immunitaire est bien mieux connu et que des souris transgéniques, déficientes pour des gènes précis, peuvent être utilisées. Des souris femelles seront utilisées car la myasthénie est une maladie qui touche majoritairement les femmes. Les expériences seront effectuées sur des souris de 6 semaines au début de l’expérience ce qui correspond à l’adolescence, période d’apparition de la maladie chez l’humain.
Caractérisation in vivo des effets aigus et à long-terme des stimulations magnétiques dans un modèle rongeur d’épilepsie-absence
- Recherche appliquée
- Maladies animales
160 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 85 d'entre eux étant maintenus sous anesthésie jusqu'à leur mise à mort sans réveil. Une partie subit une trépanation et l'implantation d'un dispositif d'enregistrement cérébral, avec les risques de douleur et d'infection que le porteur mentionne, pour tester une stimulation magnétique sur un modèle d'épilepsie-absence de l'enfant. Le porteur décrit la stimulation elle-même comme indolore et renvoie l'usage en clinique au long terme. Il affirme que ces enregistrements in vivo sont "indispensables" et ne peuvent pas être remplacés.
Objectifs
Ce projet a pour but d’évaluer les effets thérapeutiques de la stimulation magnétique transcrânienne sur l’épilepsie dans un modèle rongeur d’épilepsie-absence de l’enfant, le rat GAERS (‘Genetic Absence Epilepsy Rat from Strasbourg’). Par le passé, les neurones à l’origine des crises chez le GAERS ont été identifiés, i.e. une sous-population de neurones présentant une hyperactivité et une hyperexcitabilité. Il a par ailleurs été mis en évidence chez des rats témoins que la stimulation magnétique avait pour effet de diminuer l’activité et l’excitabilité des neurones de la même région corticale que les neurones initiateurs des crises. En admettant qu’elle ait les mêmes effets inhibiteurs sur les neurones corticaux des rats épileptiques, elle pourrait bloquer la genèse des crises et ainsi constituer un nouvel outil thérapeutique prometteur pour le traitement de cette pathologie.
Bénéfices attendus
L’épilepsie-absence est une épilepsie généralisée non-convulsive affectant principalement les enfants et les adolescents. Cette épilepsie se traduit lors des crises par une perte soudaine de conscience associée à un arrêt comportemental. Les crises d’absence sont de courte durée mais surviennent très fréquemment ce qui handicape lourdement les jeunes patients qui souffrent de déficits de perception et de mémorisation. Nous espérons pouvoir corriger l’hyperexcitabilité des neurones corticaux à l’origine du déclenchement des crises d’épilepsie-absence à l’aide de la stimulation magnétique transcrânienne. Notre projet consistera à mettre en évidence les effets de cette stimulation sur les crises chez l’animal vigile et d’en identifier les mécanismes cellulaires chez des animaux anesthésiés à l’aide d’enregistrements électrophysiologiques multi-échelle non réalisables sur les animaux vigiles. A long-terme, on peut envisager que ces stimulations soient utilisées en clinique pour diminuer la fréquence de récurrence des crises chez les jeunes patients.
Procédures
Pour l’étude des effets aigus de la stimulation magnétique cérébrale sur les crises d’épilepsie dans un modèle rongeur de la maladie, des enregistrements de l’activité cérébrale à différentes échelles (au sein d’une région cérébrale et au niveau des neurones individuels) seront réalisés chez des animaux sous anesthésie générale complémentée par une injection d’analgésiques avant et pendant la chirurgie. Au cours des actes chirurgicaux, les animaux seront anesthésiés. Une fois la chirurgie terminée (environ 2h), l’activité cérébrale sera enregistrée de façon à calculer le nombre, la durée et la fréquence des crises d’épilepsie et de recueillir l’activité des neurones (environ 8h). Une session unique de stimulation magnétique transcrânienne indolore sera alors appliquée et les effets de cette stimulation sur les crises d’épilepsie sera étudiée. Un total de 85 animaux sera utilisé recevant une stimulation réelle (n = 50) ou fictive contrôle (n = 35). Cette étude nous permettra d’étudier les effets potentiellement thérapeutiques de ce type de stimulation sur les neurones à l’origine des crises d’épilepsie. Pour l’étude des effets d’un traitement chronique de la stimulation magnétique sur les crises d’épilepsie dans un modèle rongeur de la maladie, les animaux épileptiques et témoins seront stimulés 10 minutes par jour pendant 10 jours. Cette procédure comprend 75 animaux au total (45 rats épileptiques et 30 rats témoins). Pour étudier les effets de ce traitement, durant les 10 jours de stimulation, seront réalisés des enregistrements (1 heure/jour) de l’activité cérébrale en temps réel sur les animaux éveillés. Pour ce faire, des électrodes d’enregistrement seront placées sur la surface du cortex sous anesthésie générale complémentée par une injection d’analgésiques avant, pendant et après la chirurgie. A l’issue de ces 10 jours de traitement par stimulation transcrânienne indolore, seront réalisés des enregistrements comme décrits précédemment. Cette partie de l’étude nous permettra de comparer les effets sur les crises d’un traitement aigu ou chronique.
Impact sur les animaux
Il n’existe pas de nuisances ou d’effets indésirables liés à la stimulation magnétique puisqu’elle est sans bruit, sans vibration et sans douleur hormis un éventuel stress lié à la manipulation des rats lors des séances de stimulation. Les nuisances ou effets indésirables liés aux chirurgies d’implantation pour les enregistrements chez les animaux éveillés sont la trépanation ainsi que les éventuels risques liés à ces chirurgies (douleur, infection, fatigue). Sont à prévoir également les contraintes liées au système d’implantation et à l’hébergement individuel une fois l’implantation réalisée. Enfin, les enregistrements quotidiens nécessiteront un changement d’environnement (aller-retour quotidien entre la cage d’hébergement et la cage d’enregistrement). Les nuisances ou effets indésirables au cours des enregistrements chez les animaux anesthésiés sont liés aux procédures chirurgicales (trachéotomie, trépanation, points d’incision et de contention), à l’anesthésie prolongée lors des enregistrements (manque ou excès d’anesthésiques) et à la mise sous ventilation artificielle après curarisation (blocage de la canule par des sécrétions, volume d’air inspiré insuffisant).
Devenir
A l’issue de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés en raison d’analyses post mortem supplémentaires afin de déterminer les caractéristiques morphologiques des neurones enregistrés et leur localisation au sein du cortex cérébral.
Remplacement
Nos expériences d’enregistrement de l’activité cérébrale in vivo sont indispensables à la réalisation de ce projet et ne peuvent pas être remplacées puisque c’est la seule préparation permettant de caractériser de façon précise les changements d’activité et d’excitabilité induits par la stimulation magnétique transcrânienne. Cependant, les expériences que nous avons précédemment réalisées chez des rats témoins nous ont permis de déterminer la fréquence de stimulation optimale pour diminuer l’excitabilité des neurones ciblés. Nous nous servons donc de cette base d’études pour restreindre le nombre de fréquence de stimulation à tester et ainsi n’effectuer que les expériences nécessaires pour répondre aux objectifs du projet.
Réduction
Une stratégie expérimentale méthodique a été mise en place pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Ainsi, nous nous baserons sur nos études précédentes qui nous permis de déterminer la fréquence optimale de stimulation à appliquer pour réduire l’excitabilité corticale. Nous combinerons également différents protocoles (différents tests sur l’activité et les propriétés des neurones à l’échelle unitaire, enregistrements de longue durée et si possible de plusieurs neurones/animal) au sein d’une même expérience, ce qui nous permettra de n’utiliser que les animaux nécessaires à l’obtention de résultats fiables et reproductibles. Enfin, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance (160 animaux au total) et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Après la chirurgie, l’animal sera isolé dans une cage enrichie afin d'éviter toutes morsures du connecteur par un congénère. Pour faciliter l’hydratation, de l’hydrogel et des croquettes seront placés dans la cage. Une surveillance sera effectuée durant 72h par un personnel compétent afin de s'assurer de l'absence de points limites. Nous réaliserons une pesée quotidienne des animaux pendant ces 72 h, puis de façon hebdomadaire afin d’éviter une perte de poids supérieure à 10%/24h comparé au poids précédent la chirurgie. Un antalgique sera administré après la procédure. Cependant, si des points limites étaient observés, nous mettrons en place un traitement analgésique supplémentaire. Enfin, en cas d'observation de léthargie, d’inconscience, d’immobilité ou de perte excessive (> 10 %) ou prolongée (> 3 jours consécutifs) de poids, l’animal sera euthanasié. Des enregistrements électroencéphalographiques d’une heure/jour seront effectués dans des cages d’enregistrements adaptées permettant un accès libre à l’eau et à la nourriture. Ces enregistrements seront précédés d’une période d’acclimatation de 30 minutes, afin de réduire le stress. La température de la pièce et le comportement de l'animal seront monitorés par un système d’enregistrement vidéo et pourront être visionnés à distance. En amont de la période d’enregistrement et de la chirurgie, les animaux seront habitués à la cage d’enregistrement à raison d’une heure par jour durant 5 jours. Les stimulations (indolores et sans bruit) seront appliquées 10 minutes chaque jour durant 10 jours. L’animal sera donc maintenu par l’expérimentateur. Afin d’habituer les animaux à la manipulation humaine, une semaine avant la chirurgie d’implantation, les rats seront quotidiennement manipulés à raison de 15 minutes par jour. Un soin tout particulier sera apporté à la réduction de l'inconfort, de la douleur ou du stress des animaux grâce à une surveillance constante des paramètres physiologiques (activité cérébrale, fréquence cardiaque, température, oxygénation du sang) et la mise en place de protocoles d'interventions spécifiques (utilisation appropriée d'anesthésiques généraux ou locaux et myorelaxants, analgésie) pour chaque indicateur de souffrance (sensibilité au pincement de la patte, réflexes musculaires, variation de température ou de la fréquence cardiaque, modification de l’activité cérébrale). Avant l’enregistrement, 30 à 40 minutes d’acclimatation sera observée.
Choix des espèces
Les expériences seront réalisées sur des rats épileptiques ainsi que sur des rats témoins « normaux », âgés de deux à six mois, pesant de 250 à 450 g. La souche de rat épileptique utilisée ici est reconnue comme étant un excellent modèle d’épilepsie-absence parce qu’elle présente une très forte homologie (propriétés des crises) avec la pathologie humaine. Les rats témoins constitueront les rats « contrôles » non-épileptiques. Nous utiliserons des rats GAERS adultes, stade auquel ils présentent des crises matures typiques et des rats Wistar du même âge comme contrôles pour que l’âge ne puisse pas biaiser nos résultats.
Implication fonctionnelle de diverses structures cérébrales dans les troubles anxio-dépressifs liés à une douleur chronique par constriction du nerf sciatique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent une constriction du nerf sciatique et des chirurgies cérébrales avec implantation d'une fibre optique, puis des tests de douleur et des tests anxio-dépressifs, pour étudier les structures cérébrales liées à la douleur chronique. Le porteur indique que cette douleur ne peut pas être soulagée "car c'est l'objet de l'étude" et que les animaux vont développer des troubles anxio-dépressifs. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut remplacer l'observation comportementale sur l'animal vigile.
Objectifs
La douleur neuropathique est consécutive à une lésion ou une pathologie du système nerveux responsable des sensations somatiques. Généralement chronique, avec une prévalence de 5 à 7% dans la population, elle s’accompagne d’un fort risque de développement de troubles de l’humeur (anxiété, dépression). En effet, environ 50% des patients présentent ces deux symptômes associés : douleur chronique et troubles de l’humeur. Ceci constitue un enjeu important de santé publique. Malgré les données cliniques, les mécanismes sous-jacents de ce lien entre ces 2 pathologies (douleur et troubles de l’humeur) restent encore inconnus et nécessitent des études précliniques. Chez la souris mâle des données de la littérature suggèrent que plusieurs structures cérébrales clés seraient impliquées dans les conséquences affectives à long terme d’une douleur neuropathique. Les données clinique chez l’homme mais également préclinique chez l’animal montrent que non seulement la dépression majeure mais aussi les situations douloureuses s’accompagnent de changements dans des structures cérébrales bien précises. Mais de nombreuses données de la littérature montrent également d’importantes différences dans la sensibilité à la douleur entre les hommes et les femmes ; données également observées chez les rongeurs. De plus, la prévalence des troubles anxieux et dépressifs, dans la population ainsi que chez les patients douloureux chronique, présente également des différences intersexuelles. De telles différences suggèrent très probablement des mécanismes spécifiques à chaque sexe. Ainsi, bien que les régions cérébrales impliquées dans les troubles de l’humeur provoqués par la douleur chronique soient sans doute les mêmes, les altérations des réseaux que ces structures forment sont sans doute différentes chez des individus mâles et femelles. Le but de ce projet est donc de comparer les changements anatomo-physiologiques éventuels entre mâles et femelles dans un modèle spécifique de douleur neuropathique.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est d'étudier les modifications d’activité et d’interaction dans trois régions cérébrales pouvant être à l’origine du lien entre la douleur chronique et les troubles de l’humeur. A l’issue de ce projet, nous serons en mesure de détailler pour la première fois les adaptations d’activité cérébrale liées au développement des comportements de type anxieux et dépressif chez les deux sexes. Cette avancée pourrait permettre de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques (structures cérébrales d'intérêts) spécifiques au sexe et donc potentiellement différentes chez le mâle et la femelle.
Procédures
Les animaux seront soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. Ils subiront une chirurgie au niveau de la patte droite de l'animal d’une durée de 10 min environ et pour certains à 2 chirurgies stéréotaxiques avec injection de virus puis implantation de fibre optique d’une durée de 45 min environ. Ces 3 chirurgies se dérouleront sous anesthésie, soit 3 anesthésies générales. Les animaux subiront 3x le test de douleur d'une durée de 20 minutes environ avec 10 min d'habituation) avant la chirurgie neuropathique puis deux fois par semaine (délai d’1 semaine minimum après les chirurgies avant la reprise des tests) jusqu’à la fin du protocole expérimental soit un total de 15 tests maximum. Ils subiront également 1 semaine après la 2ème chirurgie stéréotaxique, 5 tests anxio-dépressifs d'une durée de 5 à 10 min selon le test (avec 24h minimum entre chaque test).
Impact sur les animaux
Il y a présence de douleur qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Suite à la chirurgie neuropathique (présente dans toutes les procédures de ce projet), une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. Les chirurgies neuropathique et d’injection cérébrales peuvent induire une inflammation et/ou infection et/ou une perte de poids de l’animal qui seront suivi et pris en charge. Les animaux vont développer des troubles anxio-dépressifs, objectifs de l'étude.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort pour prélèvements et analyses anatomiques des structures cérébrales impliquées.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l'analyse fonctionnelle du développement des troubles anxio-dépressifs dans un modèle de douleur neuropathique nécessite une observation comportementale réalisée sur l’animal vigile.
Réduction
Afin d’obtenir des résultats fiables et robustes à l’issue de l’étude tout en tenant compte des variabilités entre individus, le nombre d’animaux utilisé a été déterminé statistiquement. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure. Pour cette raison une même cohorte d’animaux sera étudiée et caractérisée au niveau comportemental et émotionnel, puis fera l’objet d’investigations anatomiques.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des enrichissements sont placés dans la cage pour favoriser le bien-être animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Des points limites ont été établis pour l’ensemble des procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le modèle de douleur neuropathique utilisé dans cette étude a été caractérisé et validé pharmacologiquement chez la souris et non dans une autre espèce comme le rat par exemple. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g).
Mécanismes de l’atteinte des vaisseaux sanguins dans le diabète chez la souris, multisites 1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues diabétiques et hypertendues, elles reçoivent des injections intrapéritonéales quotidiennes, subissent une chirurgie, des séjours en cage métabolique et une échographie sous anesthésie, avant un prélèvement sanguin terminal, pour étudier l'atteinte des vaisseaux dans le diabète. Le porteur indique que ces modèles peuvent provoquer une atteinte du coeur, des reins et des rétines. Le seul bénéfice avancé est une meilleure compréhension de la maladie, et le porteur affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent pas la complexité des mécanismes en jeu.
Objectifs
Le diabète est une maladie vasculaire très répandue affectant plus de 500 millions de personnes en 2021. Les cellules endothéliales, tapissant la face interne des vaisseaux, sont les premières affectées par les modifications métaboliques générées par le diabète. Il est connu que l'excès de sucre dans le sang et une dérégulation de la composition du gras participe à l'atteinte des vaisseaux que l'on retrouve chez les patients diabétiques. Nos données ont permis d'identifier un potentiel système dérégulé dans le diabète et participant au maintien du fonctionnement normal des vaisseaux sanguins. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle de la protéine identifiée sur les vaisseaux chez des souris diabétiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension de l'atteinte des vaisseaux sanguins dans le diabète.
Procédures
Une injection intrapéritonéale quotidienne pendant 5 jours (20 sec/ jour) puis pendant 2 jours (20 sec/ jour). Une procédure chirurgicale (10 min). Prélèvements urinaires en cage métabolique sur animal vigile (6 heures d'isolement par semaine). Mesure non invasive de la pression artérielle (15min par semaine) et échographie sous anesthésie (20min). Un prélèvement sanguin terminal sur animal anesthésié (1 minute).
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l'expérimentation: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection, inconfort lié aux cages métaboliques. Effets de la chirurgie: douleurs post-opératoire soulagée par des analgésiques. Effets des modèles pathologique de diabète et d'hypertension artérielle: potentiellement atteinte des organes cibles (coeur, reins et rétines).
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes
Remplacement
Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte microvasculaire liés au diabète incluant les cultures cellulaires. En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours du diabète comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire ou les interactions entre organes. C'est pourquoi nous aurons aussi recours au modèle animal, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille.
Réduction
Réduction : le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait sur le logiciel en ligne https://sealedenvelope.com/power/continuous-superiority/ ce qui donnait 25 animaux par groupe requis. 5 animaux de plus sont prévus par groupe pour pallier aux risques du modèle expérimental. Nous optimisons l'utilisation des organes pour les différentes analyses afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Raffinement : les animaux seront élevés en cages enrichies avec eau et nourriture ad libitum et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Une grille de score de souffrance et des points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. Les souris diabétiques et hypertendues urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux par cage est limité à 3 et les cages sont changées plus fréquemment et dès que nécessaire. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie péri-opératoire.
Choix des espèces
La souris est un modèle permettant de réaliser des expériences de physiopathologie de mammifère. De plus, les modèles de diabète et d'hypertension artérielle utilisés au cours de ce projet sont établis et validés par la communauté scientifique. Souris adultes agées de 8-12 semaines car il faut de jeunes adultes. En effet, l'age est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop agées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux.
Identification du rôle d’une hormone dans le psoriasis chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rasées puis enduites d'une crème à l'imiquimod provoquant des lésions cutanées, elles reçoivent des injections sous-cutanées et un prélèvement de sang par voie rétro-orbitale, avant la mise à mort pour prélever la peau et divers organes. Le porteur indique une perte de poids d'environ 10 %, une peau rouge, squameuse et lésée après 48 heures, et un stress lié à la contention quotidienne. Il vise à comprendre le rôle d'une hormone du fer dans le psoriasis et à tester des pistes thérapeutiques.
Objectifs
Le psoriasis est une maladie inflammatoire chronique qui affecte principalement la peau et est associée à des comorbidités importantes. C'est une maladie courante qui touche 2 à 3 % de la population mondiale, sans distinction d'âge, de sexe ou d'ethnie. Les différents types comprennent notamment le psoriasis en plaques (ou psoriasis vulgaire), le plus répandu et le psoriasis pustuleux (PP), considéré comme plus résistant. Le PP, caractérisé par des pustules riches en cellules immunitaires, ne représente qu'une petite fraction des cas, mais peut mettre la vie des patients en danger lorsqu'il est étendu. Malgré des avancées majeures dans la compréhension de sa pathogenèse et dans son traitement, le psoriasis reste une maladie chronique courante dont les causes ne sont pas encore totalement élucidées. Le PP est particulièrement difficile à traiter. Des études ont montré une augmentation des niveaux de fer dans la peau de patients atteints de psoriasis. Le fer est indispensable au niveau cellulaire mais peut être toxique lorsqu’il est en excès. Il existe une hormone, principalement produite par le foie, qui régule les niveaux de fer dans l’organisme. Ce petit peptide est, de manière inattendue, exprimé dans la peau de patients atteints de psoriasis. Des données montrent que l'accumulation du fer et de "l'hormone du fer" dans la peau de patients souffrant de psoriasis est néfaste. Le projet visera à comprendre les mécanismes par lesquels cette hormone induit des effets délétères chez ces patients, mais également visera à tester différents agents thérapeutiques (médicaments ciblant le fer ou l'hormone) dans un modèle murin de psoriasis.
Bénéfices attendus
Dans la peau, l’hormone de régulation du fer pourrait avoir un rôle pro-inflammatoire en induisant d’une part la rétention de fer dans les cellules de ce tissu et d’autre part en activant les cellules immunitaires. Ce projet pourrait avoir des retombées en recherche fondamentale (meilleure connaissance des processus physiopathologiques du psoriasis) mais également en recherche appliquée en porposant de cibler l’hepcidine ou le fer comme alternative thérapeutique au traitement du psoriasis.
Procédures
Les souris seront rasées au dos avec une tondeuse sous anesthésie (1 minute par souris). Une crème est appliquée (temps d’application : 30 secondes) sur des animaux vigiles suite à une prise en contention 1 fois/jour pendant 1 à 5 jours. Le poids des animaux est pris chaque jour après l’application de la crème. Une injection en sous-cutané (temps de la réalisation impliquant la contention: 20 secondes) est réalisée 2 fois (Jour 0 et jour 3 suivant l’application de la crème).30 minutes avant le prélèvement de sang, les souris seront injectées avec un analgésique (temps de réalisation impliquant la contention : 30 secondes); 500µl de sang seront prélevé par voie rétro-orbitale. (1 minute par souris).
Impact sur les animaux
Les animaux perdent du poids jusqu’au 3ème jour (environ 10% de leur poids) puis commencent à récupérer à nouveau. La peau traitée par l’imiquimod devient rouge après 48h avec des lésions et des écailles. Un stress est généré par la contention quotidienne et les injections.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort pour prélever la peau et d'autres organes à des fins d'analyse immunohistochimique, d'expression génique, d'expression protéique et de cytométrie en flux.
Remplacement
Des tests in vitro sur des cellules de la peau ont été effectués en amont pour déterminer le rôle de l’hormone du fer dans l’inflammation. Nous avons en parallèle accés à des biopsies de patients atteints de psoriasis.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. L'étude statistique permet de calculer au plus juste le nombre d'animaux à utiliser.
Raffinement
Pour respecter le principe des 3R, la durée et la dose de traitements utilisée seront réalisées selon les protocoles préétablis. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance quotidienne et des soins adaptés. Le raffinement comprend l'utilisation d'anesthésie (pour rasage et avant exsanguination) et d'analgésie (avant exsanguination) et la surveillance quotidienne des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les études de processus inflammatoires et pour évaluer l’infiltrat immunitaire. Seule cette espèce possède des modèles murins génétiquement modifiés permettant l’étude de ce gène au cours de ces pathologies. De plus, la peau murine est similaire à la peau humaine (consituée de 3 parties : épiderme, derme, hypoderme). Des souris adultes de 8 à 12 semaines seront utilisées, car à cet âge la repousse du poil est la plus lente, donc adéquate pour le rasage du dos des souris. De plus, à cet âge, le système immunitaire est mature ce qui est indispensable à l’étude du psoriasis.
Etude comportementale dans un modèle de lésions cérébrales associées à la prématurité chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
64 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de lésions cérébrales reproduisant l'encéphalopathie du prématuré, elles subissent des tests d'activité circadienne, d'anxiété, de mémoire et de capacités cognitives, avec isolement, eau acidifiée et prélèvement sanguin, avant la mise à mort pour analyser le cerveau en IRM. Le porteur étudie deux âges, 7 et 16 mois, pour observer un vieillissement précoce. Les retombées annoncées, prévention et pistes thérapeutiques, restent renvoyées au long terme.
Objectifs
La prématurité est la principale cause de décès et de handicaps chez les nouveau-nés. Dans les pays industrialisés, en raison de l'amélioration des soins intensifs néonataux, le nombre des nourrissons de très faible poids de naissance qui ne survivent pas au-delà de l’enfance est en baisse. Cependant, le cerveau de ces prématurés reste extrêmement vulnérable et peut ainsi présenter des lésions. L’inflammation périnatale que subissent dans 20 à 40% des cas les enfants prématurés, et la grande vulnérabilité des cellules cérébrales en développement à ce stress inflammatoire est à l’origine de l’apparition de la plupart de ces lésions. Elles induisent des handicaps moteurs, des déficits cognitifs et des troubles comportementaux qui persistent à l’âge adulte qui sont regroupées sous le terme d' "Encéphalopathie du Prématuré". Certaines cellules cérébrales, appelées cellules gliales, sont les relais majeurs des modifications environnementales dans le cerveau, dont les réponses inflammatoires. Ces cellules résidentes du système nerveux central, analysent de manière continue leur environnement et participent à la stabilisation de ce dernier. On sait aujourd’hui que les mécanismes qui permettent la maturation cérébrale sont les mêmes que ceux qui sont perturbés au cours du vieillissement. Nous cherchons donc à comprendre l’impact de l’inflammation périnatale sur le vieillissement en émettant l'hypothèse que celle-ci peut être à l'origine d'un vieillissement prématuré. Dans ce projet nous allons donc caractériser le comportement des souris à 7 mois ce qui correspond à un temps dit de « milieu de vie » auquel on peut s’attendre à l’apparition de premiers signes de vieillissement prématurés et à un âge avancé, c’est-à-dire à 16 mois où un phénotype clair de vieillissement est attendu. Nous étudierons à ces deux âges l’activité circadienne des animaux, leur comportement de type « anxieux », leurs capacités mnésiques et cognitives. Des prélévements sanguins seront réalisés et envoyés au partenaire pour des dosages complémentaires. A la fin de ce projet les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir analyser leurs cerveaux en IRM.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra la caractérisation des conséquences à long terme de l'encéphalopathie du prématuré et ainsi la mise en place d'outils de prévention chez les individus concernés. A long terme, nous pouvons penser que ce projet permettra l’amélioration du pronostic de cette pathologie et la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients.
Procédures
Les tests comportementaux auront les durées suivantes : -Activité circadienne des animaux durée du test : 32h - Test d’anxiété durée du test : 5 minutes - Test de mémoire : 15 +10 + 10 minutes - Test capacités cognitives : 21 jours Un prélèvement sanguin sera effectué en fin d’étude pour analyser des paramètres biochimiques. Ces prélèvements, un par souris, se font en quelques minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances seront les suivantes : pour le test des capacités cognitives les animaux auront des conditions d’hébergements non standards avec un accès à de l’eau acidifiée pendant 21 jours. Pour connaitre l’activité circadienne des animaux, ils seront isolés pour une période de 32h. Enfin, les animaux auront un stress léger lié à l’anesthésie qui précédera le prélèvement sanguin.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux afin de réaliser des analyses IRM.
Remplacement
L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'implication de la neuro-inflammation dans le développement d'un vieillissement précoce. Cela suppose des interactions complexes entre différentes cellules du système nerveux central. Il n'est pas possible de reproduire ces interactions complexes in vitro ou dans un système de cellules en culture, et il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal pour reproduire ces interactions complexes. A cet égard la souris est un modèle pertinent, car elle présente une organisation du système nerveux proche de celle de l'Homme.
Réduction
Dans un souci de réduction, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire à la validation d'un effet significatif. Nos études antérieures nous montrent qu’un nombre minimal de 32 animaux par groupe est nécessaire pour obtenir une réponse significative et peu de variabilité. En fonction de la répartition des données nous utiliserons un test paramétrique ou non paramétrique pour mettre en évidence des différences significatives dans les résultats des tests comportementaux entre les groupes expérimentaux (Avec inflammation et Contrôles sans inflammation) : activité circadienne, niveau d’anxiété, capacités mnésiques et cognitives.
Raffinement
Afin de réduire l'inconfort des animaux et le stress des animaux, la durée minimale sera appliquée pour chaque test. Des phases de récupération, d’au minimum une semaine, entre les différents tests seront prévues. De plus, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Nous avons défini des points limites éthiques dans le cadre de la procédure expérimentale. Chaque animal sera ainsi suivi avant les expériences afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt avant l’expérimentation voire l’euthanasie de l’animal.
Choix des espèces
Afin d'étudier les interactions entre les cellules du système nerveux, il est nécessaire d'utiliser une espèce animale qui présente un système nerveux central proche de celui de l'homme. La souris remplit très bien cette condition. Dans ce modèle d'inflammation périnatale un vieillissement précoce est attendu. Nous nous intéressons ainsi à 2 temps de vie chez les animaux : 7 et 16 mois de vie. Le temps de 7 mois est ainsi communément admis comme étant un temps de "milieu de vie" (40-45 ans). Alors que le temps 16 mois correspond à un âge déjà avancé (80 ans).
Evaluation de l’efficacité d’un nouveau composé chez une souris modèle de dégénérescence rétinienne
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
77 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Exposées à une lumière intense de 20 000 lux pendant une heure et demie pour provoquer une dégénérescence de la rétine, elles reçoivent un composé par gavage et subissent un électrorétinogramme sous anesthésie, avant le prélèvement des yeux. Le porteur décrit les dommages rétiniens attendus, la perte de l'intégrité et de l'activité des photorécepteurs. Il présente ces essais comme "indispensables" pour prouver l'efficacité du composé sur un organisme complet, une preuve de concept d'un traitement préventif.
Objectifs
Il s’agit de faire la preuve de concept d’un traitement préventif de la perte de fonction visuelle par un nouveau principe actif avec une nouvelle formulation par voie orale dans une situation de dégénérescence rétinienne chez la souris modèle de la Dégénérescence Maculaire Liée à l’Age (DMLA). Il permet également d'évaluer l'impact de la formulation sur l'amélioration potentiel de l'efficacité du composé à protéger de la perte de la fonction visuelle en comparant des souris traitées avec la formulation vs sans formulation.
Bénéfices attendus
La rétinopathie regroupe plusieurs pathologies de la rétine qui sont soit génétiques, comme la rétinite pigmentaire et la dystrophie maculaire de Stargardt, qui touchent respectivement la périphérie et le centre (macula) de la rétine, soit multifactorielles, comme la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). Nous voulons apporter à ces patients un traitement préventif contre la progression de ces maladies. Ce projet est donc à profil santé publique avec une échéance à moyen terme applicable à l'échelle clinique.
Procédures
Gavage voie orale : durée : 30 secondes Exposition à la lumière à 20 000lux : 1h 30 Mise à l’obscurité : 5 jours ERG (éléctrorétinogramme) : 10min par souris
Impact sur les animaux
La nuisance attendue sur les souris est l’exposition lumineuse. les souris sont placées dans l’obscurité 24 h avant l’exposition à la lumière pour minimiser le temps et l’intensité lumineuse. Les dommages rétiniens engendrés sont la perte de l’intégrité et de l’activité des photorécepteurs minimiser le temps et l’intensité lumineuse. Les dommages rétiniens engendrés sont la perte de l’intégrité et de l’activité des photorécepteurs
Devenir
A l'issue de cette procédure, les souris seront euthanasiées. Une analyse histologique et/ou biochimique pourra être effectuée après la mort après prélèvement des yeux.
Remplacement
Toutes les approches in cellulo ne peuvent pas se substituer aux essais chez l’animal qui restent plus proche du patient. L'approche animale est la suite logique des résultats précédemment obtenus sur cellules rétinienne qui nous ont permis de prouver l'efficacité du composé. Ces études précliniques sont indispensables pour prouver l'efficacité sur un organisme complet.
Réduction
Cette quantité d’animaux a été réduite le plus possible sans compromettre les résultats expérimentaux et les études statistiques Comme ces 77 souris se répartissent en 11 lots de 7 souris, en cas d’atteinte de la significativité avant l’utilisation de tous les lots, les souris restantes pourront être réutilisées.
Raffinement
A l’arrivée dans le laboratoire, les animaux sont hébergés au calme et surveillés pendant une période d’acclimatation d'une semaine. Celle-ci leur permet de récupérer du stress lié au transport et de s’adapter aux nouvelles conditions de vie. Ce n’est qu’à l’issue de cette période qu’ils pourront être inclus dans cette étude. L’hébergement des souris se fait obligatoirement en groupe d’étude dans des cages de stabulation sous une lumière (90 lux) faible qui n’affecte pas la réponse rétinienne. Comme de nombreuses souches de souris construisent des nids, la présence de matériaux de nidification est un impératif dans les cages. La nidification permet aux souris de réguler leur température et de gérer leur exposition à la lumière. Dans le déroulement de cette étude, on administre aux animaux un produit dont on souhaite connaître les effets. On en connaît déjà les caractéristiques physico-chimiques ainsi que l’activité sur des extraits biologiques et des cellules (études in vitro), ce qui permet d’éviter d’administrer aux animaux des substances non biocompatibles. L’examen spécialisé (électrorétinographie) nécessite une anesthésie. Celle-ci est réalisée en conformité avec les pratiques vétérinaires et par des personnes formées.
Choix des espèces
La souris de laboratoire (Mus musculus) représente 60% du total des animaux utilisés en recherche. Ce rongeur est devenu le modèle expérimental de prédilection des scientifiques. Sur le plan génétique, la souris est très similaire à l’homme : 99 % de ses gènes présentent un gène homologue chez l'humain. De plus, elle possède tous les atouts pour l’élevage en laboratoire : une descendance nombreuse, un développement rapide et une taille réduite. L'utilisation de souris non génétiquement modifiées allège l'aspect réglementaire qui est très bien respecté par le fournisseur agréé. La souris est une lignée consanguine albinos couramment utilisée dans la recherche biomédicale. En ophtalmologie, elle est très sensible à la lumière fluorescente blanche, ce qui constitue un trait intéressant pour mimer la rétinopathie à évolution rapide. Stade adulte jeune (2-3 mois). La rétine est bien développée à ce stade et la réponse rétienne à la lumière est optimale
Modulation des niveaux de BIN1 et DNM2 dans le traitement de la maladie de Charcot-Marie-Tooth
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
Les souris qui perdent 20 % de leur poids en une semaine sortent du protocole, et une grille de score prévoit jusqu'à une "douleur intense", traitée par buprénorphine toutes les douze heures. 1 246 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à sévère, toutes tuées à l'issue, pour tester la modulation de deux gènes contre la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Le projet utilise trois lignées qui présentent, selon le porteur, les anomalies de la myéline de cette maladie, et 584 souris reçoivent entre leur premier et leur vingt-et-unième jour des injections de virus, certaines dans le nerf sciatique sous anesthésie. À six mois puis à un an, 720 passent un test d'agrippement où l'expérimentateur tire sur la queue, un tapis roulant, un cylindre rotatif surélevé, une immersion de la queue dans un bain-marie et une plaque chauffée à 52 °C. Le porteur affirme que ces lignées ne présentent "aucun signe de douleur", et déclare un niveau de souffrance sévère pour une partie des souris.
Objectifs
Le but de ce projet est de développer une stratégie thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles souris. La maladie se manifeste au début de l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par des repliements complexes des gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses et une vitesse de conduction nerveuse réduite. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d'utiliser ces souris et de moduler l'expression de deux gènes impliqués dans une voie de signalisation associée à la CMT pour tenter d'atténuer les symptômes associés aux anomalies de la myéline. Nous réaliserons cette modulation par des techniques de croisement génétique ainsi que par l'injection de virus adéno-associés couramment utilisés dans la recherche médicale.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre quelle(s) voie(s) de signalisation sont impliquée(s) dans le dévelopement de la CMT. Une meilleure connaissance des processus moléculaires permettra de mieux comprendre la maladie et potentiellement de proposer de nouvelles thérapies plus ciblées.
Procédures
Pour réguler l'expression des gènes impliqués dans la voie de signalisation étudiée dans notre équipe, une partie de nos animaux (584 sur 1246) sera injectée (durée d'injection de quelques secondes) avec des virus adéno-associés entre le 1er et le 21ème jour après la naissance A soix mois et à un an, 720 souris (dont 360 injectés avec des AAV) seront soumises à une série de tests comportementaux pour évaluer la force musculaire, la coordination motrice, la sensibilité, ainsi que la conduction nerveuse. Pour évaluer la force musculaire, les souris sont placées sur la grille d'un dynamomètre et la force d'agripement sera mesurée. Pour évaluer la coordination motrice, les animaux se déplaceront sur un tapis roulant et sur un cylindre rotatif. Pour évaluer la sensibilité, les queues des souris seront mises dans un bain-marie et la latence d'enlèvement de la queue sera mesurée avec une durée limite du test de 20 secondes. Les animaux seront également placés sur une plaque chaude à 52°C et la latence de réaction sera notée avant de sortir l'animal avec un temps limite de 30 secondes. Pour évaluer la conduction nerveuse, la mesure de l'activité électrique musculaire des animaux se fera sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, nous utiliserons trois lignées de souris modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Au vu des phénotypes observés chez les animaux Mtmr KO âgés (et donc montrant un pourcentage plus important des repliements de la myéline), nous n’anticipons pas que nos modulations d'expression des gènes de la voie de signalisation étudiée n'engendre de phénotypes plus grave qu’une diminution de la coordination motrice. Nous effectuerons néanmoins une étude des phénotypes dommageable sur ces animaux. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests phénotypiques sont les suivants : pour la mesure de force musculaire, l’expérimentateur tire progressivement la queue de l’animal agrippé sur la grille du dynamomètre afin d’obtenir la force développée par la souris. Pour la coordination motrice, le fait de se déplacer sur un cylindre rotatif surelevé engenre du stress physique chez l'animal. Pour les tests de sensibilité, la chaleur ressentie par l'animal engendre un stress physique. L’électromyographie sera réalisée sous une anesthésie générale. La chirurgie pour l’injection de virus adéno-associés au niveau du nerf sciatique sera réalisée sous une anesthésie générale, une antalgie en sous-cutané et en local sera réalisée avant et après la procédure.
Devenir
Nous feront une première étude préliminaire où les animaux seront euthanasiés à 6 mois pour étude histologique du nerf sciatique et vérification des phénotypes décrits dans la littérature scientifique. Nous nous formerons à l'injection intracérébroventriculaire et les animaux utilisés seront mis à mort le premier jour (P1) après formation. Nous nous formerons à l'injection intrathécale et les animaux seront euthanasiés 15 minutes après formation. Pour l'évaluation de phénotype dommageable et étude histologique à six mois après modulation de l'expression de Bin1 ou de Dnm2 par injection d'AAV, les animaux seront mis à mort entre 8 et 11 semaines, 2 mois après injection d'AAV pour étude histologique du nerf sciatique (signal GFP). Pour la caractérisation comportementale des animaux après modulation de l'expression de Bin1 ou de Dnm2 par injection d'AAV, les animaux seront mis à mort à 1 an après caractérisation comportementale pour étude histologique du nerf sciatique.
Remplacement
Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquée dans le développement de cette myopathie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptomes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
Réduction
Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 8 souris par groupe pour l'étude de phénotypes dommageables et 15 souris par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats. Une première étude pilote sera réalisée à 6 mois avec un nombre réduit d'animaux. Nous effectuerons ensuite une étude de phénotypes dommageables et une étude histologique (8 animaux par groupe) à six mois. Nous réaliserons finalement une étude comportementale à 6 mois et 1 an tout en effectuant une étude histologique à 1 an (15 animaux par groupe).
Raffinement
Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 5 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. La pesée des animaux sera réalisée 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi). En cas de douleur, et particulièrement après les injections intrathécales et intracérébroventriculaires, un analgésique pourra être administré (buprénorphine à la dose de 0.05 à 0.2 mg/kg selon l'intensité de la douleur) et l’étude pourra être prématurément stoppée. La douleur sera évaluée à l'aide d'un score. Niveau 1 : douleur légère, dans ce cas de la buprénorphine sera administrée quotidiennement par i.p. à dose de 0.05 mg/kg. Niveau 2 : douleur modérée, dans ce cas de la buprénorphine à dose 0.1 mg/kg sera administrée quotidiennement par i.p.. Niveau 3 : douleur intense, dans ce cas de la buprénorphine à dose 0.2 mg/kg sera administrée toutes les 12 heures. L'étude sera stopée prématurément si nécessaire pour éviter des douleurs aiguës pendant de longues périodes.
Choix des espèces
Afin d’évaluer et de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d'autres espèces évolutivement plus éloignées de l’homme car la structure des nerfs est trop différente. D'une part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l'ensemble de l'organisme et l'évaluation sur le bénéfice de la structure des fibres nerveuses, de la coordination motrice, de la sensibilité et de la vitesse de conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l'expression des gènes de la voie de signalisation étudiée dans notre équipe, nous injecterons des virus adéno-associés chez des animaux âgés entre 1 et 21 jours selon la voie d'administration choisie pour cibler les cellules de Schwann avant l'apparition des symptomes. Les défauts de myélinisation s'aggravent avec l'âge des animaux modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Nous voulons donc réaliser une première étude histologique à 6 mois, âge auquel 10% des fibres présentent des défauts de myéline chez les animaux modèles de la CMT. Nous réaliserons ensuite une étude comportementale suivie d'une étude histologique à 12 mois, âge auquel les animaux modèles de la CMT présentent des déficits de coordination motrice et de vitesse de conduction nerveuse.
Rôle de la néoglucogenèse intestinale dans le renforcement comportemental de l’anorexie mentale dans un modèle de souris en restriction alimentaire avec activité physique volontaire.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
240 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises à une restriction alimentaire allant jusqu'à 50 % de leur ration pendant trois semaines avec accès à une roue d'exercice, elles subissent des injections intrapéritonéales et des prélèvements de glycémie, avant une mise à mort par perfusion d'un fixateur sous anesthésie pour prélever les organes. Le porteur reconnaît que la restriction induit une sensation de faim et choisit des femelles jeunes pour mimer l'anorexie mentale humaine. Le bénéfice annoncé, mieux prendre en charge la maladie, reste hypothétique face à ce modèle de privation alimentaire imposée.
Objectifs
L’anorexie mentale (AM) est une maladie qui touche majoritairement les jeunes filles et les femmes, et se caractérise par une prise alimentaire très diminuée, souvent associée à une activité physique exagérée et une préférence pour une alimentation riche en protéines. Beaucoup d’études se focalisent sur les aspects psychiatriques de la maladie, mais il est également intéressant d’en explorer les aspects métaboliques afin de mieux traiter, voire prévenir, cette maladie. En particulier, les patients atteints d’AM maintiennent une glycémie proche de la normale et un poids faible mais constant, malgré un très faible apport calorique et une forte dépense énergétique, ce qui suggère une forte adaptation de leur métabolisme vers la conservation de l’énergie. Nous proposons dans cette étude que la production endogène de glucose par la voie de la néoglucogénèse joue un rôle fondamental dans cette adaptation : il s’agit de la formation de glucose à partir de substrats non glucidiques (phénomène qui entre normalement en jeu au cours d’un jeûne) par le foie essentiellement, mais aussi par les reins et l’intestin. Nous testerons l’hypothèse du rôle « renforçateur comportemental » de la néoglucogénèse intestinale (NGI) dans un modèle de souris femelles qui réplique les aspects métaboliques de l’AM : faible prise alimentaire et exercice physique volontaire, en imposant une restriction alimentaire aux souris et en leur laissant un libre accès à une roue d’exercice.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des mécanismes qui permettent de maintenir le poids et la glycémie de personnes en situation d'anorexie mentale pourrait déboucher sur une meilleure prise en charge tant sur le plan médicamenteux que sur les recommandations nutritionnelles et d'hygiène de vie. En effet un régime riche en protéines stimule la production intestinale de glucose, et nous pensons mettre en évidence également que l'exercice physique stimule cette voie.
Procédures
Procédures 1 à 4 : les animaux subiront une restriction alimentaire, pendant 3 semaines. Procédure 3 : les souris seront mises à mort par perfusion transcardique d'un produit fixateur, le paraformaldéhyde 4%, sous anesthésie générale (le décès survient en 1 à 2 minutes). Procédure 4 : les souris subissent 3 tests fin d 'évaluer l'homéostasie glucidique, ces tests consistent à un suivi de la glycémie (prélèvements sur animaux vigiles) après une injection intrapéritonéale de pyruvate, glycérol ou glutamine, ces différents tests seront réalisés avec au minimum quatre jours d'intervalle. Les tests durent 120 minutes entre l'injection du produit et le dernier prélèvement de sang pour la glycémie.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont essentiellement liées à la restriction alimentaire susceptible de conduire à une sensation de faim. Cependant la restriction se fera de manière progressive avec une restriction de 30% de leur ration calorique pendant 3 jours, puis passage à 50% pendant 3 semaines. Les animaux subiront également des injections intrapéritonéales qui provoqueront une douleur légère et de faible durée, sans conséquences indirectes du produit injecté, puis des prélèvements de sang (microgouttes) pour mesurer la glycémie.
Devenir
mise à mort pour prélèvements d'organes.
Remplacement
Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôlent les flux d'énergie en fonction des besoins. Il est très difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux est encore nécessaire.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé a été calculé pour que les tests statistiques puissent être fiables et robustes, évitant ainsi de réitérer les expériences, tout en utilisant le nombre d'animaux le plus faible possible. Nous réaliserons des ANOVA à 2 facteurs pour les tests avec mesures répétées au cours du temps, avec une analyse post-hoc (Bonferroni). Lorsque les statistiques concerneront 2 moyennes (le poids par exemple, ou la prise alimentaire), nous utiliserons un test de Student après vérification de la normalité de nos échantillons.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans des milieux enrichis (nids végétaux, tubes) ce qui permettra d'améliorer leur bien-être. Ils seront également observés quotidiennement afin d'identifier les animaux en souffrance.
Choix des espèces
Les modèles précliniques de rats et de souris sont des outils complémentaires et essentiels, partageant avec l’humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contrôle de l’homéostasie glucidique. Npus utiliserons ici des souris femelles "jeunes adultes" (8 semaines au début des procédures) afin de mimer la pathologie humaine de l'anorexie mentale qui touche essentiellement des jeunes filles.