Procédures modérées

390 seiches communes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Œufs et juvéniles sont exposés de façon chronique au chlorure d'aluminium, puis soumis à des tests de prédation, le porteur attendant des troubles de l'alimentation, des retards de croissance et, dans les cas sévères, des atteintes des fonctions vitales. Les animaux contaminés sont tués pour mesurer l'accumulation d'aluminium et ne peuvent être relâchés, seuls quelques individus témoins non contaminés étant conservés. L'objectif déclaré est d'évaluer le risque, pour le réseau trophique marin, des métaux libérés par les anodes des parcs éoliens en mer.

Objectifs

Dans un contexte de crise énergétique, la France poursuit l’objectif d’augmenter la part d’énergies renouvelables dans la production d’énergie européenne, et cet objectif passe en parti par l’installation de parcs éoliens en mer. Or, les structures métalliques immergées en milieu marin sont soumises à une forte corrosion du fait de la composition chimique de l’eau de mer. Afin de limiter la dégradation de ces structures, des anodes galvaniques (GACP) et à courant imposé (ICCP) ainsi que des revêtements anti-corrosions sont utilisés pour les protéger. Les anodes galvaniques (dites aussi sacrificielles) sont composées, pour la plupart, d’aluminium et de zinc principalement et d’autres métaux divers. Lors du passage du courant électrique, l’alliage de l’anode va se désagréger libérant ainsi dans l’environnement marin un cocktail d’éléments traces. Etant donné le fort développement à venir des parcs éoliens et en prenant compte les structures déjà en place (ports équipés en anodes ainsi que différents navires), il est essentiel d’apporter une connaissance scientifique précise sur la toxicité du cocktail de métaux découlant de la dissolution des GACP et d’établir une évaluation du risque chimique que présente l’aluminium, métal trop peu étudié en écotoxicologie marine. Ce projet permettra d’évaluer la toxicité de l’aluminium dissous dans la colonne d’eau (à partir d’un sel) et de l’aluminium solubilisé à partir du système de protection cathodique fonctionnant à l’aide d’une anode galvanique (GACP). D’autre part, ce projet mettra en place pour la première fois des manipulations visant à tester les effets des courants imposés (ICCP) sur l’environnement. L’objectif recherché de ce projet est de fournir des éléments scientifiques aux industriels et autres gestionnaires d’infrastructures marines pour leur permettre de choisir les méthodes les moins toxiques pour l’environnement et la santé humaine et d’étudier la possibilité de s’affranchir des protections cathodiques.

Bénéfices attendus

Dans le contexte d'implantion de nouveaux parcs éoliens en mer, ce projet va mettre en lumière le devenir des éléments traces et principalement de l'aluminium dans le réseau trophique marin et de déterminer le danger qu'il représente pour les écosystèmes marins. Plus spécifiquement, pour la seiche commune (Sepia officinalis), ces études vont permettre de déterminer les conséquences sur le développement embryonnaire, le développement des juvéniles et donc sur le renouvellement des populations de la Manche. En effet, dans les eaux de la Manche, les seiches se reproduisent le long des côtes, où l'environnement est le plus soumis aux pollutions métalliques d'origine anthropique, et plusieurs études ont déjà démontré un effet déléterre de certains métaux sur le développement embryonnaire et la survie des juvéniles. D'autre part, la bioaccumulation des éléments traces va également être mise en évidence dans les tissus des organismes, une information primordiale pour une espèce d'intérêt économique comme la seiche.

Procédures

Deux stades de développement seront exposés de manière chronique à différentes concentrations en chlorure d'aluminium : le stade œuf et le stade juvénile (2 jours après l’éclosion). Chaque stade est soumis à 2 actes expérimentaux. Le premier acte concerne l'exposition des organismes à l'élément. Les oeufs sont exposés durant la totalité du développement embryonnaire (51 jours théorique à 17 °C) afin de déterminer un éventuel effet délétère de l'aluminium sur celui-ci. Le temps d'incubation, la taille à la naissance et des tests de prédation (pendant 7 jours après l'éclosion) sont performés sur les animaux arrivant au terme de l'incubation. Le temps d'incubation est également déterminé pour chaque condition. D'autre part, des prélèvements d'oeufs sont effectués au cours de l'exposition pour déterminer la cinétique de bioaccumulation de l'aluminium dans l'embryon et si la capsule est perméable à cet élément. Le deuxième acte concerne des juvéniles provennant d'oeufs non exposés au préalable et exposés pendant 45 jours après la naissance, ce qui correspond à la période pendant laquelle les systèmes nerveux, digestif et immunitaire se mettent en place. Exposer les animaux pendant cette période délicate de leur vie permettra de déterminer un éventuel effet de l'aluminium sur la maturation de ces systèmes. L'alimentation des juvéniles au cours de cette exposition est mesurée et la bioaccumulation est déterminée à la fin de la période d'exposition.

Impact sur les animaux

D'après les précédentes études menées sur l'exposition de seiches à divers métaux, des effets indésirables pourront être observés sur le comportement de prédation des individus induisant des difficultés à s'alimenter, aussi bien résultant d'une altération du système nerveux que du système digestif ; des retards de croissance pourront également apparaître en fonction des conditions testées ; dans les cas les plus sévères, des effets sur les fonctions vitales pourront être observés. D'autre part, sur les oeufs, des effets sur le développement embryonnaire, que ce soit par la durée ou par l'achèvement de celui-ci sont envisagés.

Devenir

Les tissus issus des animaux contaminés seront utilisés pour déterminer la bioaccumulation de l'aluminium au cours des périodes d'expositions. Ils seront donc mis à mort. D'autre part, ces animaux ne peuvent pas être relâchés dans l'environnement du fait des effets éventuels de la contamination sur leur développement et leur survie. Les animaux non contaminés provenant des lots de contrôle et non utilisés pour les études de bioaccumulation peuvent être réutilisés pour d'autres expériementations et sont donc confiés à un laboratoire d'éthologie animale.

Remplacement

L'objectif de ce projet est d'étudier le devenir des éléments traces et principalement de l'aluminium dans le réseau trophique marin. Pour cela, il est nécéssaire de travailler sur des organismes vivants et sur des durées relativement longues (45 jours) afin de déterminer dans quelle mesure ils bioaccumulent dans les organismes et quels sont les effets qu'ils peuvent engendrer sur les fonctions biologiques de ces derniers.

Réduction

Initialement portées à 8, le nombre de concentration à tester a été réduite à 4 afin de limiter le nombre d'animaux à exposer. D'autre part, les animaux seront utilisés pour le plus grand nombre d'analyses possible. En effet, les animaux soumis aux tests comportementaux seront également utilisés pour les prélèvements de tissus visant à déterminer la bioaccumulation de l'aluminium. Par ailleurs, l'impact sur les populations naturelles de seiches de la Manche est limité puisque la quantité d'oeufs prélevés correspond à la ponte d'une ou deux femelles, et que dans le milieu, une petite fraction de ces oeufs arrivent à maturité. Les analyses statistiques seront réalisées à l'aide de tests non paramètriques conçus pour des échantillons de faible effectif. Le test de Kruskal-Wallis est utilisé pour comparer les taux de croissance moyens et les temps d'incubation ainsi que les réponses comportementales mesurées lors des tests de prédation (Temps moyen de détection de la proie, temps moyen avant la première tentative de capture, nombre de tentatives, succès de la tentative). En cas de rejet de l'hypothèse nul, un test post-hoc est utilisé pour une comparaison deux à deux des valeurs. La méthode de Bonferroni est appliquée afin d'éviter l'apparition d'un résultat faussement significatif.

Raffinement

La méthode d'exposition des organismes aux éléments choisis limitent les conditions de stabulation, toutefois, plusieurs éléments sont mis en place afin de limiter des le stress des animaux. Les proies fournies sont exclusivement naturelles, locales et vivantes ; la température et de la photopériode sont réglées de manière à correspondre avec celles observées sur les côtes de la Manche à la période correspondant aux essais. Des cachettes et des zones d'ombre sont placées dans les bacs d'exposition des animaux. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de prévenir un état traduisant un mal-être physique, physiologique ou psychologique : suivi de la prise alimentaire, du contrôle de la flottaison, de la réaction au stress (mouvements désordonnés, rétropropulsion, jets d'encre excessif...), apparition de lésions externes.

Choix des espèces

Beaucoup d’études concernant les métaux se sont intéressées aux espèces marines d’intérêt économique comme les bivalves, les gastéropodes et les téléostéens mais très peu d’études se sont portées sur les céphalopodes qui pourtant deviennent une ressource de plus en plus exploitée pour palier à l’affaiblissement des stocks de poissons. Dans la Manche, la seiche (Sepia officinalis) est l’une des premières espèces de céphalopodes pêchées en termes de quantité. Par ailleurs, la seiche présente une grande capacité d’accumulation des éléments traces par rapport à d’autres espèces marines et a un rôle central dans le transfert des métaux dans le réseau trophique marin. Ces animaux sont en effet des prédateurs exclusifs de plusieurs espèces et également proies de nombreux prédateurs du réseau trophique marin (téléostéens, mammifères marins) mais également terrestre (oiseaux). Des oeufs récoltés le plus rapidement après la ponte seront utilisés afin de déterminer la perméabilité de la capsule à l'aluminium au cours du temps. En effet, au cours du développement embryonnaire des changements des propriétés physiques de la capsule peuvent induire ou non une entrée éventuelle de l'aluminium dans l'embryon, comme c'est le cas pour certains métaux comme le Zinc ou le Mercure . Par la suite, il sera possible d'étudier les effets éventuelles de l'aluminum sur le développement embryonnaire. Les juvéniles seront âgés de 2 jours lors de leur exposition, qui durera 45 jours, afin de déterminer s'il y a un effet de l'aluminium sur le développement du système nerveux et digestif, qui a lieu lors du premier mois après l'éclosion.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issues d'une lignée qui répond à 100 % par une crise convulsive, elles reçoivent une injection d'un médicament anti-épileptique puis une stimulation sonore pouvant déclencher une crise potentiellement mortelle. Le porteur indique que ce modèle sert à mesurer si trois molécules réduisent le risque de mort subite lié à l'épilepsie, et que les souris sont ensuite tuées car le médicament reçu interférerait avec toute autre étude. Le stress provoqué par la stimulation sonore est reconnu, que l'animal réponde ou non par une crise.

Objectifs

Le risque de mort subite chez les patients épileptiques (SUDEP pour SUdden Death in Epileptic Patients ou mort subite chez les patients épileptiques) est trois fois plus élevé que chez les personnes saines. Le meilleur modèle de SUDEP actuel chez la souris correspond à une crise épileptique induite par un stimulus sonore et possiblement suivi du décès. L'objectif du projet vise à évaluer si trois molécules connues pour leurs effets anti-épileptiques et couramment employées chez des patients présentant des épilepsies à fort risque de décès, ont aussi des effets bénéfiques pour directement réduire les risques de décès.

Bénéfices attendus

Une validation d'un bénéfice de ces molécules pour réduire la mortalité devrait permettre d'obtenir une extension de l'AMM (autorisation de mise sur le marché) de ces médicaments pour d'autres formes d'épilepsies à fort risque de décès.

Procédures

Une injection d'un médicament anti-épileptique pratiquées aux 240 souris du projet. Une stimulation auditive d'une durée maximale de 60 sec pratiquées aux 240 souris du projet.

Impact sur les animaux

Un stress induit par la stimulation sonore pour les animaux, qu'ils répondent à la stimulation sonore par une crise ou qu'ils ne répondent pas.

Devenir

Les animaux seront mise à mort puisqu'ils ne peuvent pas être réutilisés pour une autre étude, puisqu'ils ont reçu une injection d'un médicament pouvant interférer avec une quelconque étude.

Remplacement

Ce projet vise à évaluer la capacité de certaines médications avec AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) ou de certaines molécules innovantes en développement, à bloquer ou réduire les risques de décès lors d'une crise d'épilepsie humaine. Les procédures de validation d'une efficacité attendue sont légalement très contraintes et elles reposent sur la capacité objective à supprimer ou réduire le risque de décès mesurée sur un animal vivant modélisant une situation homologue chez l'Humain.

Réduction

Ce projet sera réalisé sur une lignée qui présente 100 % de souris répondeuses au test de la crise audiogène létale. Cette situation permet de minimiser le nombre (n=20) de sujets expérimentés par groupe. Il n’est pas envisageable de descendre en dessous de 20 sujets par groupe car les scores analysés statistiquement sont des moyennes et des pourcentages ; ce dernier représentant le facteur limitant. Enfin, un effet dose à 3 points (puisque 3 doses par AED) correspond au nombre minimal possible de doses, sachant que les laboratoires ont une bonne connaissance des doses à envisager pour évaluer un effet anti-épileptique mais pas pour évaluer un effet ant-létal.

Raffinement

Notre protocole suit des procédures standardisées soucieuses de minimiser le stress et toute souffrance des animaux avec une détermination précise des points limites. Sur le plan de l'élevage et du maintien des souris à l'animalerie, ceci se traduit par une visite quotidienne pour contrôler le bien-être des animaux, l’enrichissement des cages autant que faire se peut, le respect des normes liées aux surfaces/volumes des cages pour éviter la surpopulation ainsi que celles liées aux plages acceptables pour la température et l’hygrométrie. Sur le plan du test lui-même, ceci se traduit par une durée limitée de stimulation auditive (max 60 sec), une utilisation d'une arène circulaire pour éviter des cognements dans les angles. Il faut aussi mentionner que la convulsion en elle-même ne dure pas plus de 8 sec dans 99 % des cas.

Choix des espèces

Les travaux sur l'évitement des décès dans l'épilepsie ne peuvent pas, par essence, s'affranchir de l'expérimentation animale qui nécessitent d'expérimenter l'animal et d'observer possiblement son décès. L'AGS est un modèle de choix pour l'étude de la SUDEP car aucun facteur systémique (chimique ou électrique) n'est pas l'origine de la crise létale, pouvant être co-responsable du décès de l'animal. L'AGS n'est pas létale chez le rat, rendant impossible l'emploi de ce modèle. Enfin il n’est pas envisageable d’instrumenter (ECG, EEG, respiration) sur des animaux plus petits que l’espèce souris. Ces approches ne sont pas envisagées dans ce projet mais elles ne seront dans des projets ultérieurs visant à comprendre comment les AED pourraient réduire les décès dans les modèles expérimentaux. Les animaux seront testés à 30-40 jours d'âge, au moment où ils devraient être sevrés.

10 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un dispositif destiné à remplacer la chirurgie de l'obésité leur est implanté par chirurgie abdominale de deux à trois heures, suivie d'examens radiographiques, de prélèvements sanguins et d'une endoscopie sur un mois. Le porteur décrit des douleurs postopératoires et une série de complications possibles, lésions digestives, infection, obstruction ou déplacement du dispositif. Tous les animaux sont tués à la fin pour inspecter et prélever les organes autour du dispositif, le porteur invoquant la proximité du système digestif du cochon avec celui de l'humain.

Objectifs

L’objectif du projet est de développer un dispositif médical qui serait une alternative à la chirurgie bariatrique (traitant l'obésité) : la solution serait simple, au moins aussi efficace que la chirurgie et minimisant les complications associées, délivrée par la bouche (en endoscopie) et placée dans le tube digestif. Le traitement de l’obésité est un enjeu important de la santé dans le monde. C’est pourquoi trouver une solution aussi efficace et moins invasive que la chirurgie pour le patient permettra une baisse du taux d’obésité. Afin de mener à bien ce projet, l’approche suivante est à l’étude : la première partie de l’intestin grêle est recouverte d’un revêtement non-perméable (la chaussette) qui empêche le mélange gastrique d’être absorbé par les muqueuses intestinales. Cette chaussette a un point d’ancrage entre l’estomac et l’intestin (le pylore). Une première phase de test a été réalisée sur un modèle in vitro. Cette phase animale (tests in vivo) a pour objectif de développer un dispositif avec la simulation des phénomènes physiologiques attendus chez les patients humains : nous testerons dans un premier temps la sécurité en se limitant au positionnement directement dans la région de l’estomac. Cela nous permettra de collecter des données d’utilisation, de prouver l’absence de dangerosité du dispositif et potentiellement de performances (ralentissement de la vidange gastrique) sur l’approche mentionnée ci-dessus.

Bénéfices attendus

L’obésité est définie comme une présence anormale ou excessive de tissu adipeux représentant un risque pour la santé. Ce problème est devenu épidémique avec près de 4 millions de personnes décédant de comorbidités liées au surpoids et à l’obésité chaque année. D’après l’Organisation Mondiale de la Santé, près de 39 % des adultes dans le monde, représentant près de 1,9 milliards de personnes, étaient en surpoids en 2016. On estime aujourd’hui que plus de 700 millions de personnes souffrent d’obésité. Bien que l’efficacité de la chirurgie qui traite l’obésité (bariatrique) ne soit plus à démontrer, seul 1 % des patients éligibles décident de se faire opérer à cause du risque de complications sévères et des modifications anatomiques irréversibles. Et pour les solutions moins invasives, comme les ballons gastriques, elles sont aujourd’hui associées à une perte de poids limitée et temporaire. Ce projet est nécessaire pour le développement d’une solution endoscopique afin de traiter l’obésité de manière aussi efficace que la chirurgie bariatrique tout en minimisant les complications associées. En effet, il permettra de vérifier la sécurité et potentiellement l’efficacité des dispositifs testés.

Procédures

Pour chaque porc et mini-porc : • implantation du dispositif par chirurgie abdominale sous anesthésie générale (2-3 h), 1 fois au total • Pour chaque session de suivi (J2, J7, J15 et J30) sous anesthésie générale : o Réalisation d’un examen radiographique prenant 45 min, soit 4 au total o Réalisation de prélèvement sanguin prenant environ 2-3 min, soit 4 au total o L’examen endoscopique (camera passant par la bouche permettent de visualiser le dispositif +muqueuse de l’estomac) n’est réalisée que pour le suivi à J30 et prend 30 min, 1 fois au total.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus résident surtout dans la douleur suite au placement du dispositif. Néanmoins, la littérature décrit une série de complications éventuelles : • Lésion du système digestif • Infection avec ou sans fièvre ; • Complications associées aux interventions par endoscopie ; • Obstruction gastrique ou intestinale ; • Déplacement ou rotation du dispositif implanté ; • Carence en vitamines et minéraux ; • Trouble du transit ; • Réaction inflammatoire locale des tissus ; Notre protocole prévoit de surveiller et anticiper ces complications.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort. Pour comprendre l’impact du prototype et statuer sur sa sécurité, il est nécessaire d’inspecter, d’examiner et photographier les zones entourant le dispositif incluant les muqueuses et les organes. Suivant le déroulé de l'étude, des prélèvements d’organes pourront être effectués (duodénum et autres organes), pour observations macroscopiques et analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet vise à confirmer l’adéquation du dispositif en cours de développement avec le système digestif. Avant d’initier ce projet, des essais sur cadavres humains et sur carcasses d’animaux ont été effectués afin de simuler la procédure et confirmer l’adéquation des dimensions sélectionnées pour les prototypes en cours de développement De plus, des essais in vitro ont été réalisés en laboratoire afin de simuler le déploiement du dispositif ainsi que son comportement lors de contraintes mécaniques simulant le péristaltisme. Des premiers essais pour valider la sécurité ont été menés sur animaux vivants. Les tests de cette présente demande d'autorisation de projet s’inscrivent dans la continuité de ces tests en évaluant de nouveaux prototypes. Néanmoins, la complexité et l’adaptabilité du système digestif limitent notre capacité à simuler l’environnement exact. Le dispositif étant à visée clinique, il est nécessaire d’obtenir des données dans ses conditions réelles d’utilisation, ainsi l'utilisation d'un organisme complet et vivant est indispensable notamment pour le suivi post-implantation. Notre stratégie prévoit d’utiliser un maximum de 10 porcs ou mini-porcs pour la totalité du projet (phase de preuve de concept). Nous fonctionnons pas à pas, et le projet sera arrêté si chaque session ne permet pas d’obtenir les résultats escomptés.

Réduction

Avant d’effectuer cette étude de preuve de concept, plusieurs études incluant une étude pilote ont été réalisées en utilisant un nombre réduit d’animaux. Ces études précédemment réalisées nous ont permis d’obtenir des estimations de l'effet et de la variation qui peuvent servir à calculer la taille de l'échantillon d'études plus importantes. Cette phase de preuve de concept sera effectuée en utilisant un nombre réduit d’animaux jusqu’à la preuve de concept démontrée. Après chaque étude, la décision sera prise de: • passer à la phase suivante (nécessitant une nouvelle demande de projet), si le dispositif est bien toléré et les données obtenues sont concluantes, notamment : paramètres cliniques acceptables, tolérances locales macroscopique et microscopique acceptables, troubles digestifs acceptables, absence d’obstruction gastrique, absence de déplacement significatif du dispositif médical implanté. OU • relancer une étude afin d’améliorer les caractéristiques du dispositif, si celui-ci ne répond pas aux attentes. Cette étape permettra de réduire le nombre d’animaux utilisé jusqu’à démontrer la preuve de concept.

Raffinement

Porcs/mini-porcs seront hébergés sur litière en copeaux afin de leur permettre d’exprimer leur comportement de fouissage (besoin éthologique propres à l’espèce). Des enrichissements du milieu (jouets en caoutchouc) sont mis à disposition pendant l'étude (incluant la période de mise à jeun pré-chirurgicale). Les animaux auront un patch de fentanyl 3 jours après la chirurgie, ce qui nécessitera un isolement temporaire individuel afin qu’ils ne puissent pas se l’arracher entre eux, voire l’ingérer et risquer une overdose. Pour compenser cet isolement, les animaux seront hébergés dans des box attenants avec contact olfactif et visuel et la température de la salle d’hébergement sera augmentée à 21± 2°C (au lieu de 19°C). Les porcs sont ensuite replacés ensemble pour le reste de l'étude. Les animaux suivront aussi un programme de socialisation : en plus du contact avec leurs congénères, un contact quotidien avec l'humain permettra de les habituer et réduire le stress lors de manipulation/geste technique. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier habilité à travailler avec ces animaux. Tout acte douloureux ou fortement stressant sera réalisé sous sédation/anesthésie (locale ou générale selon les besoins). La douleur sera prise en charge par l'administration de traitements analgésiques adaptés: AINS et/ou morphiniques. En cas de perte de poids importante se rapprochant des 20 %, les rations pourront être enrichies avec une solution de nutrition entérale hyperénergétique. Pour tous, les laparotomies seront systématiquement effectuées sous anesthésie, avec une analgésie per-opératoire et une analgésie post-opératoire. Au cours de l’étude, une série d’examens sera effectuée afin de détecter les signes de douleur.

Choix des espèces

Le Porc est l’espèce animale la plus étudiée dans la littérature pour la chirurgie bariatrique. En effet, elle possède de grandes similarités avec les humains au niveau du système gastro-intestinal en termes de dimensions et de physiologie. Nous utiliserons également le modèle mini-porc qui, contrairement aux porcs fermiers qui sont souvent pris en charge jeunes et donc grandissent jusqu’à des poids et tailles importantes, sont étudiés adultes : leur poids dépassera rarement 70-80 kg et permettra une gestion plus facile si l’étude se poursuit après 1 mois. Ainsi en fonction du dispositif testé, le modèle animal qui sera choisi sera celui qui, par son âge lié à son évolution de poids, sera le plus approprié. Pour les porcs et mini-porcs, le critère de sélection principal sera le poids (environ 60-80 kg pour les porcs et 50-70 kg pour les mini-porcs) afin d’avoir des correspondances anatomiques similaires à celles observées en clinique. Cela correspondra à des animaux adolescents (pour les porcs fermiers) et adultes pour les mini-porcs.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une sécheresse oculaire leur est provoquée par instillation quotidienne de chlorure de benzalkonium pendant sept jours, puis leur douleur est mesurée en appliquant une pression croissante près de l'œil jusqu'au clignement, une gêne que le porteur indique ne pas pouvoir soulager par analgésiques "puisque c'est ce paramètre que nous évaluerons". L'étude porte sur le rôle de canaux ioniques dans la douleur oculaire. Le porteur affirme que ce syndrome multifactoriel "ne peut être remplacé" par des modèles in vitro et exige un organisme entier.

Objectifs

La sécheresse oculaire est l'un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie. Sa prévalence varie de 5 à 35 % chez les sujets de plus de 50 ans. La pathologie peut se déclarer chez des sujets plus jeunes en cas de maladie auto-immune, de pollution environnementale, de prise médicamenteuse répétée, après une chirurgie de la cornée ou suite à l'usage intensif des écrans. En conséquence, la prévalence de la sécheresse oculaire est grandissante. Les symptômes regroupent des troubles visuels et des douleurs d’intensité variable qui peuvent devenir chroniques. Les patients se plaignent également d’une sensibilité accrue à la lumière. La sécheresse oculaire est difficile à traiter et ses mécanismes physiopathologiques sont peu connus. Ce constat impose un approfondissement de nos connaissances fondamentales sur les mécanismes cellulaires impliqués dans la douleur oculaire. Des mutations dans les gènes codant des transporteurs de potassium appelés K2P sont à l'origine de douleur chez les patients humains et chez les rongeurs (exemple: migraine). Leur fonction dans l'oeil n'a pas encore été caractérisée. Nous disposons 1) de différents modèles de souris dans lesquels les K2P sont absents, et 2) de molécules analgésiques mises au point pour moduler l'activité des K2P. Nous souhaitons combiner ces outils pour caractériser le phénotype oculaire de ces animaux et déterminer l'effet thérapeutique de ces molécules dans la physiopathologie de l'oeil. L'étude chez l'animal est un prérequis pour évaluer de manière intégrée les conséquences d'un traitement de la pathologie oculaire. Ce projet utilisera au maximum 1080 souris. Grâce à nos études préalables in vitro, nous connaissons le mode d'action de ces transporteurs (remplacement). Le recours aux séances d'habituation et à l'anesthésie gazeuse légère et rapide permet de limiter le stress des souris (raffinement). Les prévisions obtenues avec les logiciels statistiques nous permettent d'anticiper le nombre maximal de souris pour obtenir des résultats significatifs et nous réduirons ce nombre en cours de projet dès que nos données seront suffisamment robustes (réduction).

Bénéfices attendus

La sécheresse oculaire est à l’origine d’une douleur oculaire chronique pouvant être accompagnée de troubles de la vision, de photoallodynie (sensibilité accrue à la lumière) et de dommages de la surface oculaire, et elle représente l’un des principaux motifs de consultation en ophtalmologie. C’est le plus important signe d’alerte en réaction à une inflammation ou à un traumatisme des structures du segment antérieur de l’oeil (cornée, conjonctive, sclère et structures uvéales). Elle affecte la qualité de la vie et près de 60 % des patients se déclarent gênés dans leurs activités quotidiennes. En outre, 80 % des patients qui souffrent de douleur oculaire ne l’estiment pas suffisamment prise en considération tant par leur entourage que par leur médecin. La douleur chronique oculaire est très difficile à traiter et les mécanismes physiopathologiques, de nature neurogène et/ou inflammatoire, demeurent de nos jours très mal connus. Les traitements actuels sont invasifs, peu efficaces et diminuent la qualité de vie des patients. De ce fait, la sécheresse oculaire est considérée comme un désert thérapeutique malgré son incidence grandissante liée au vieillissement global de la population, l’augmentation du recours à la chirurgie réfractive, l’usage des écrans et la pollution environnementale. Le projet que nous souhaitons développer permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de cette pathologie et éventuellement de proposer une stratégie thérapeutique nouvelle si ce projet donne les résultats escomptés. Les bénéfices suceptibles de découler de ce projet sont une avancée significative dans la prise en charge de la sécheresse oculaire.

Procédures

La procédure 1 dure 2X 1 semaine maximum (à 3 mois et à 12 mois environ), la procédure 2 dure 2 semaines maximum. Dans chaque procédure, la mesure du volume des larmes dure 5 minutes (coton au coin de l’œil); la mesure de la stabilité des larmes dure 10 minutes (anesthésie à l’isoflurane, puis administration d’une goutte de fluorescéine). La mesure de la douleur oculaire par un test qui consiste à appliquer une pression croissante sur la zone péri-orbitale et à mesurer la pression (en grammes) induisant le clignement des paupières et le retrait volontaire de la face par la souris, dure 1h. La séance d'imagerie DOLPLER dure 15 minutes (sous anesthésie légère). Dans la procédure 1, chaque animal subira ces 3 tests 1 fois dans sa vie, et 2 fois dans la procédure 2 (avant et après administration de la molécule régulatrice des K2P). Le modèle de la procédure 2 consiste en une injection quotidienne de BAC (chlorure de benzalkonium) pendant 7 jours. Les molécules régulatrices des K2P ou la solution saline contrôle seront administrées en IP, en 1 injection.

Impact sur les animaux

Chez l'homme, la sécheresse oculaire peut occasionner un ressenti très variable selon les individus allant d'une simple gêne soulagée momentanément par des larmes artificielles à une douleur pouvant être plus inconfortable chez certains patients. Il est vraisemblable que cette variabilité entre individus existe également chez la souris. Les effets indésirables prévus sur les animaux sont associés à la sécheresse oculaire qui sera d'intensité modérée. Elle engendre potentiellement un inconfort voire éventuellement une gêne chronique (comme chez certains patients humains) qui ne pourront être soulagés par des analgésiques puisque c’est ce paramètre (et son soulagement) que nous évaluerons. Les animaux auront 3 et 12 mois environ lors de leur entrée en procédure. La durée des nuisances auxquelles ils seront exposés sera donc de 5 jours pour les souris mutantes pour les transporteurs étudiés: habituation aux tests pendant 2 jours et 3 jours de tests (c'est-à-dire 2 fois 2h de tests à 36h d'intervalle: 1 série de tests pendant la journée, 1 seconde série pendant la nuit). La durée des nuisances sera de 6 semaines maximum pour les souris dans lesquelles nous aurons induit la sécheresse oculaire (habituation aux tests, 7 jours d'établissement du phénotype et entre 1 et 4 semaines de traitement avec une série de tests par semaine). Les effets des traitements seront évalués sur 7, 14 et 28 jours maximum puis les animaux seront mis à mort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort selon la législation en vigueur afin de réaliser des analyses histologiques post mortem.

Remplacement

Le syndrome de sécheresse oculaire est d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Son apparition et sa gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts (neuro-inflammation etc) et les études sur l’animal intact sont essentielles et ne peuvent être remplacées. Ceci ne peut malheureusement pas être modélisé in vitro à ce stade du projet. Néanmoins, nos études préalables et celles de nos collègues ont permis de caractériser in vitro (neurones en culture) et in vivo (rongeurs) les effets des molécules d'intérêt et de déterminer leur mode d'action sur les K2P. Cette phase du projet exige maintenant un système biologique intégré tel qu’un organisme vivant pour caractériser précisément in vivo sur l'oeil et quantifier le phénotype oculaire des animaux déficients pour les gènes codant les canaux K2P d'intérêt et les effets thérapeutiques des molécules que nous avons testées.

Réduction

Le nombre d‘animaux (1080) correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs (calculé par le logiciel GPower). Il sera réduit chaque fois que possible, et toute expérience rendue inutile par des résultats précédents obtenus ne sera pas réalisée. Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. Nos prédictions suggèrent que des lots de 10 animaux par condition permettront une analyse statistique valide permettant d’exclure toute répétition additionnelle. Nous anticipons et choisissons a priori d’inclure 15 animaux/groupe par précaution et en considérant mâles et femelles séparément, et nous réduirons ce nombre dès lors que les résultats seront statistiquement significatifs et en particulier si les deux sexes donnent des résultats similaires.

Raffinement

Notre expertise nous permet de mettre en place des conditions de raffinement adaptées et de réaliser les gestes techniques requis de manière précise et rapide. Nous porterons une attention particulière à limiter au niveau le plus faible le stress occasionné aux animaux. Ceux-ci seront manipulés avec calme dans un environnement limitant toute source de nuisances, dans une salle calme uniquement dédiée à ces tests, dans laquelle nous pouvons moduler l'intensité lumineuse pour limiter la photoallodynie et avec un équipement spécialement conçu pour la bonne réalisation des procédures. Ainsi, nous mettrons en place des séances d'habituation en amont de chaque test, et nous réaliserons la plupart de ces tests sous anesthésie légère à l'isoflurane (15-20 minutes). En cours de procédure, nous suivrons les animaux en nous appuyant sur une grille de score permettant d’évaluer la douleur et de mettre en oeuvre des points limites précoces. Les animaux seront hébergés avec un environnent enrichi, sans isolement, en accord avec la réglementation en vigueur. Enfin, l'utilisation de l'imagerie par échographie-Dopler représente un avantage conséquent dans le respect de la règle des 3R et permet non seulement de réduire le nombre d'animaux mais de diminuer leur manipulation car c'est une technique non invasive et rapide sous anesthésie réalisée par l'expérimentateur principal formé à l'utilisation de l'appareil.

Choix des espèces

Nous avons choisi Mus musculus comme modèle d’étude en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Le modèle murin reproduisant la sécheresse oculaire est un modèle validé et classiquement utilisé dans la littérature. Deux âges seront étudiés: 3 et 12 mois. Ces âges sont choisis de manière à représenter les différentes périodes de la vie adulte : jeunes adultes (matures) et individus âgés. En effet, l’un de nos objectifs est de déterminer si l’âge/le vieillissement pourraient impacter le phénotype observé dans ces animaux.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, une irradiation sous anesthésie et des injections de traitements, dont certaines directement dans la tumeur, avant d'être euthanasiées pour analyse des tissus. L'étude porte sur le rôle des cellules dendritiques dans la réponse immunitaire déclenchée par la radiothérapie associée à une immunothérapie. Le porteur déclare la croissance tumorale et l'irradiation "indolores" et affirme qu'il "n'y a pas de modèles alternatifs" pour cette étude du système immunitaire.

Objectifs

Dans les pays occidentaux, deux tiers des patients reçoivent une radiothérapie au cours de leur cancer. Le but de la radiothérapie est de tuer une tumeur ou une métastase aussi directement que possible. Les recherches expérimentales de ces dernières années ont montré que la radiothérapie peut également induire une réponse immunitaire anti-tumorale dans certaines conditions. Cependant, de fortes réponses immunitaires anti-tumorales après radiothérapie n'ont que rarement été observées dans le traitement des patients. L'objectif de ce projet est d'étudier de nouveaux mécanismes qui peuvent limiter ou améliorer les réponses immunitaires anti-tumorales après radiothérapie. Les cellules dendritiques sont des cellules présentatrices d'antigènes professionnelles capables d'induire une réponse immunitaire. En s’appuyant sur les connaissances déjà acquises selon lesquelles les cellules dendritiques jouent un rôle crucial dans le développement d'une réponse immunitaire anti-tumorale dans le cadre de l'immunothérapie ou de la chimiothérapie, ce projet vise à mieux comprendre le rôle des cellules dendritiques dans l'induction d'une thérapie anti-tumorale après radiothérapie et à développer de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à découvrir de nouveaux mécanismes biologiques qui devraient permettre le développement de nouvelles thérapies à moyen terme. Il devrait ainsi contribuer à soulager la souffrance des patients atteints de cancer grâce à des thérapies améliorées. Cela inclut les nouvelles thérapies basées sur les cellules dendritiques (thérapies cellulaires). De plus, les résultats du projet de recherche devraient jeter les bases de nouvelles thérapies qui effectuent une modulation ciblée des voies de signalisation dans les propres cellules dendritiques de l'organisme (thérapies ciblées).

Procédures

Injection de cellules tumorales une fois par souris, ansethésie locale, durée 1 minute. Irradiation sous anesthésie générale, durée 11 minutes. Injections de traitements sous anesthésie locale tous les 3 jours à partir de J8 jusqu’à J14 ou J20, durée 1 minute. Injections intra-tumeurs dans certains lots: 2x à 3 jours d'intervalle (J7 et J10) Durée : maximum 1 minute, sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Croissance tumorale sous-cutanée : La formation de tumeurs sous-cutanées dans la région du flanc ou de la patte arrière n'est pas associée à la douleur. Elle peut entraîner des restrictions de mouvement chez la souris. . L'injection de traitements induit une réaction systémique très limitée. L'irradiation tumorale locale est indolore, et z très peu de conséquence. Elle peut induire une perte de poids légère et transitoire.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour analyse sur tissus post-mortem et car il seront porteurs de tumeurs.

Remplacement

Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude de l’activation ou l’inhibition du système immunitaire lors de radiothérapies.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, avons déterminé par calcul de puissance le nombre d'animaux nécessaire pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous regrouperons les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Différents tests statistiques seront utilisés pour l’analyse des résultats et l'étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l'hypothèse de travail.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids, de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation. Des mesures seront prises pour limiter le stress: plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux,, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réaliséés sous anesthésie générale ou locale dépendamment de l'intervention à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limite ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Des souris sont nécessaires pour les expériences, car pour l'étude de la radiothérapie ciblée de tumeurs individuelles, selon le recul obtenu, la souris est la seule espèce possible. Les animaux sont utilisés au stade adulte (8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.

810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles sont génétiquement modifiées et gavées pour déclencher une maladie rénale, ou opérées sous anesthésie pour obstruer le conduit urinaire d'un rein, puis reçoivent des injections quotidiennes de composés ou de placebo pendant plusieurs mois, avec passages en cage métabolique et prélèvement sanguin rétro-orbital avant la mise à mort. L'étude évalue trois composés censés ralentir la maladie rénale chronique et éviter la greffe. Le porteur affirme que les organoïdes rénaux ne reproduisent pas un rein vascularisé et qu'aucune approche in vitro ne peut se substituer au modèle murin.

Objectifs

Les maladies rénales chroniques sont des maladies génétiques ou acquises. Le rein va subir de nombreuses modifications qui conduisent au développement de petits kystes, associés à une inflammation du rein aboutissant à sa destruction. A terme, la maladie aboutit à l’insuffisance rénale terminale qui nécessite le recours à la dialyse et la transplantation rénale, deux procédures lourdes et coûteuses. Actuellement, aucun traitement ne permet d’éviter aux patients d’évoluer vers l’insuffisance rénale terminale. L’étude proposée ici a pour objectif de valider l’effet thérapeutique de 3 composés sur le développement de la maladie rénale chronique. Ces composés ont été identifiés et validés dans des cultures de cellules rénales. A cette fin, trois modèles animaux seront utilisés. Le premier utilise des souris génétiquement modifiées qui seront gavées à 1 mois pour induire la maladie humaine puis les souris seront traitées quotidiennement par injection avec les 3 composés et leur placebo jusqu’à 5 mois. Le deuxième modèle utilise d’autres souris génétiquement modifiées pour lesquelles la maladie rénale débute à 5 semaines de vie. Ces animaux seront traités quotidiennement par injection avec les 3 composés à partir de 4 semaines (avant le début de la maladie) et jusqu’à 3 mois. Enfin, le troisième modèle utilise une chirurgie qui permet d’obstruer le flux urinaire d’un des 2 reins. Ce modèle chirurgical développe une maladie rénale 2 semaines après la chirurgie. Les animaux seront traités quotidiennement par injection avec les 3 composés 1 semaine avant la chirurgie et jusqu’à deux semaines après.

Bénéfices attendus

L’ensemble des résultats de ce projet devrait permettre de valider l’efficacité thérapeutique d’un ou plusieurs composés identifiés in vitro permettant ainsi à terme d’éviter la greffe rénale aux patients.

Procédures

L’ensemble des animaux seront injectés tous les jours, avec les médicaments ou leur placebo à compter de 1 mois et pour une durée maximale de 4 mois. Les 360 animaux du premier modèle de souris génétiquement modifiées seront soumis à l’âge de 1 mois à un gavage sur 5 jours consécutifs. La durée de l’acte de gavage est d’environ 1 minute. Les 90 animaux du troisième modèle seront soumis à une chirurgie sous anesthésie générale. La durée de la chirurgie est d’environ 5 minutes. Pour les 2 premiers modèles de souris génétiquement modifiées, chaque mois, les urines seront prélevées par massage ventral pour évaluer le défaut de concentration urinaire. Si ce défaut est observé, les animaux seront placés en cage métabolique pendant 48h. Pendant les 48h, les souris ont accès à l’eau et à la nourriture. Enfin, l’ensemble des animaux sera soumis à un prélèvement de sang rétro-orbital sous anesthésie générale le jour de la mise à mort. A la fin du prélèvement, les animaux sont mis à mort.

Impact sur les animaux

Chez l’homme l’évolution des maladies rénales chroniques est indolore. A un stade très avancé lorsque la fonction rénale est très altérée (nécessitant le recours à la dialyse ou la transplantation rénale), ces maladies induisent une baisse de l’appétit et une diminution de la masse musculaire. Le protocole établit dans ce projet ne va pas jusqu’à ce stade. Les patients atteints de maladie rénale génétique souffrent de polydipsie (consommation excessive d’eau) et de polyurie (volume d’urine augmenté). Les animaux traités avec le placebo sont donc susceptibles de développer ces symptômes alors que ceux traités avec le(s) médicament(s) devraient s’améliorer. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections répétées des médicaments peuvent entraîner une irritation de la zone d’injection. Par ailleurs, la mise en cages métaboliques des animaux pendant 48h peut générer un stress lié à l’isolement. Le modèle chirurgical d’obstruction est « indolore » d’un point de vue rénal puisqu’un seul des 2 reins est obstrué, l’autre rein permettant de maintenir une fonction rénale normale. En revanche, suite à la chirurgie, les animaux peuvent souffrir et la plaie chirurgicale peut présenter des signes d’inflammation ou d’infection.

Devenir

L’ensemble des 810 animaux seront mis à mort afin de collecter les organes postmortem pour analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

La maladie rénale chronique met en jeu des phénomènes complexes faisant intervenir différents types cellulaires (cellules épithéliales, cellules endothéliales, fibroblastes et cellules immunitaires) ainsi que des modifications structurales du tissu rénal. Nous nous intéressons particulièrement à la communication entre les cellules épithéliales rénales, les fibroblastes et les cellules immunitaires. Toutes les expériences préalables à l’élaboration de ce projet ont déjà été réalisées dans des lignées cellulaires de tubules rénaux. Malheureusement, à ce jour, les modèles cellulaires in vitro (y compris les organoides rénaux) ne permettent pas l’étude d’un rein in vitro ayant une vascularisation, un flux urinaire, des fibroblastes et des cellules immunitaires. Compte tenu de l’absence de modèle cellulaire complet, il n’est pas possible du substituer des approches in vitro aux modèles murins impliqués dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé a été établi selon le logiciel InVivoStat pour permettre d’atteindre des résultats statistiquement significatifs. Des souris mâles et femelles seront utilisées et 15 souris par groupe de traitement seront explorées. Pour l’étude statistique, nous utiliserons un test approprié pour comparer les groupes d’animaux deux à deux.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Afin de réduire le traumatisme lié aux gavages et aux injections répétées, des sondes de gavage adaptées à la taille de l’animal et des seringues très fines seront utilisés. Afin de limiter les nuisances liées à la polyurie (volume urinaire élevé), les biberons d’eau et la propreté des cages seront contrôlés régulièrement. Afin de limiter les nuisances induites par la mise en cage métabolique, une période d’adaptation de 24h est réalisée. De plus, la mise en cage métabolique s’effectue dans le calme dans une pièce dédiée afin de diminuer au maximum le stress occasionné. Les souris ont accès à l’eau et à la nourriture. Afin de réduire la douleur associée à la chirurgie, une anesthésie générale est réalisée. Un antalgique et un analgésique seront administrés en pré- et post-opératoire. A l’issue des procédures, les souris seront mises à mort sous anesthésie générale préalable. Des points limites spécifiques à chaque procédure ont été définis. Tout animal en souffrance recevra un antalgique et/ou des compléments alimentaires. Si les points limites établis sont atteints sans possibilité de soulager l’animal, celui-ci sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, à la différence des poissons ou des insectes, la souris partage avec l’homme un nombre de néphrons (unités fonctionnelles du rein) fixés après la fin de la néphrogenèse et développe des maladies rénales très semblables à celles observées chez l’homme. Le développement du rein se termine, chez la souris, aux alentours du 14ème jour après la naissance. Les procédures décrites dans ce projet seront réalisées sur des souris âgées d’au moins 4 semaines donc après la fin du développement rénal. Les souris seront mises à mort à l’âge adulte, temps déjà étudié dans d’autres pathologies rénales.

1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une bronchopneumopathie leur est provoquée par inhalation de fumée de cigarette ou administration d'élastase pancréatique de porc, ce qui induit des douleurs pulmonaires et une perte de poids, puis elles reçoivent des traitements pouvant atteindre 30 administrations et un prélèvement sanguin avant la mise à mort. L'étude teste, pour le compte de laboratoires donneurs d'ordres, de nouvelles molécules anti-inflammatoires contre la BPCO. Le porteur affirme que l'exploration de cette maladie "demande l'étude d'un organisme complet".

Objectifs

La BPCO (Bronchopneumopathie chronique obstructive) est considérée comme la troisième cause de mortalité cette année dans le monde avec le tabagisme comme facteur de risque majeur. Aujourd’hui, très peu de traitements efficaces contre la BPCO sont disponibles. L'objectif de ce projet est de rechercher et de tester de nouvelles molécules thérapeutiques potentiellement inhibitrices de l’inflammation et du développement de l’emphysème dans un modèle in vivo de BPCO. Pour développer un médicament, il faut réaliser des tests de toxicité cellulaire mais aussi tester in vivo sur un animal la/les molécules car aucun médicament ne peut être testé chez l’Homme avant que son profil de sécurité ne soit établi. Les études toxicologiques sont réalisées en amont par le laboratoire pharmaceutique ou de recherche publique donneur d'ordres.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n'y a pas de traitement curatif pour la BPCO, mais les traitements disponibles (broncho-dilatateurs, anti-inflammatoires) visent à ralentir l'évolution, prévenir les complications, réduire les symptomes et améliorer la qualité de vie. Dans les cas les plus sévères de BPCO, l'unique solution est l'intervention chirurgicale (greffe du poumon). Ce projet a pour but d’étudier l’effet de nouvelles molécules à caractère anti-inflammatoire dans un modèle d'inflammation ou d’emphysème induits par l’inhalation de fumée de cigarette ou l'administration d'élastase pancréatique de porc chez la souris. Afin de déterminer si une molécule candidat a un potentiel dans ce modèle, plusieurs prélèvements d'organes/tissus seront ensuite effectués pour des dosages immunologiques, analyses histologiques. Ces différents dosages et quantifications vont permettre de valider le modèle ainsi que l'analyse de l'efficacité des différentes molécules testées (diminution de cytokines inflammatoires dans les tissus, diminution du recrutement cellulaire et étude de la structure pulmonaire au niveau histologique...).

Procédures

Un prélèvement de sang rétro orbital (durée du prélèvement 30 secondes) sous anesthésie sera effectué une seule fois juste avant la mise à mort. En ce qui concerne les traitements (voie d'administration variable en fonction des études): En aigue : entre 1 et 8 injections et en chronique : entre 7 et 30 traitements, durée moyenne : 3 secondes/injection

Impact sur les animaux

Ce modèle induit des douleurs inflammatoires pulmonaires à l'animal liées au développement de la pathologie. Les animaux sont suivis quotidiennement pendant la durée de l'expérimentation. La douleur pourra générer une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques, ainsi de valider notre modèle et d’analyser l’effet des différentes molécules testées.

Remplacement

Les études in vitro ne permettent pas l’étude des interactions systémiques (inflammatoires, immunitaires) intervenant dans la maladie. L’exploration des différentes fonctions physiologiques impliquées dans la BPCO demande l’étude d’un organisme complet.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum (n=10) nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations.

Raffinement

Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter la douleur au moment de l’expérimentation. De plus, si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, de la Buprénorphine pourra être administrée ou ils seront mis à mort selon les points limites décrits dans la procédure. Les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé enrichies avec du Celuron ainsi que du Sizzle-Nest en continu dès leur arrivée. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et suivront un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux pour lesquels les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettant la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. De plus leur génome possède 99% de similitude avec le génome humain, ne présente aucun gène manquant/supplémentaire pouvant modifier l’intensité de l’inflammation obtenu. Notre modèle est développé à partir de données littéraires permettant de réduire le nombre d'études de mise au point. Les animaux sont utilisés au stade adulte (8 à 9 semaines) afin de disposer d’organes avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). Les paramètres étudiés étant l’évaluation du degré de l’inflammation et le développement de l’emphysème après exposition à la fumée de cigarette ou administration d'élastase pancréatique de porc. Un animal juvénile ou trop âgé induira un biais dans l’expérimentation.

50 cailles japonaises vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Comme dans le premier volet du projet, elles subissent une castration chirurgicale sous anesthésie, pour 40 d'entre elles la pose d'implants de testostérone, puis des tests de comportement dont le détail n'est pas précisé, avant le prélèvement du cerveau. L'étude prolonge la recherche sur la régulation des comportements par la photopériode chez cette espèce. Le porteur affirme que ces études comportementales n'ont "pas de système alternatif" et ne se mesurent que sur animal vigile.

Objectifs

En élevage intensif, les volailles de chair sont soumises à des programmes lumineux avec une longue période de jour (18 h de lumière / 6h de nuit). Ces programmes augmentent le temps d’accès de ces animaux diurnes à la nourriture ce qui accélère leur croissance et augmente la productivité. Néanmoins, de tels programmes lumineux ont des effets délétères bien établis sur la santé des animaux. L’exposition continue à des jours longs augmente la fréquence de certaines pathologies, favorise l’apparition de comportements aberrants et apparaît comme une source notable de stress ; de tels programmes lumineux impactent donc négativement le bien-être de l’animal. Dans une précédente étude que nous avons conduite chez la caille japonaise, nous avons pu mettre en évidence que la photopériode a un effet sur des comportements clés de l'adaptation de l'animal à son environnement, tels que la représentation mentale de son environnement, la cognition au sens large, l’agressivité et le contrôle de l’activité sexuelle. Chez les mammifères, tous ces comportements sont fortement régulés par les hormones sexuelles, en particulier la testostérone chez les mâles. La production de ces hormones sexuelles varie chez les animaux saisonnés, dont la caille japonaise, en fonction de la durée du jour. Les cailles sont sexuellement actives en jours longs, mais complètement inactives en jours courts ; chez les mâles la taille des testicules – et donc la production de testostérone - varie d’un facteur 100 selon la photopériode. Bien que la testostérone soit un modulateur hormonal reconnu de nombreux comportements, dont l’agressivité, il est établi que, chez les oiseaux, ce comportement n'est pas nécessairement corrélé au taux de testostérone. Il semble donc que la photopériode impacte certains comportements via des voies indépendantes des stéroïdes sexuels. Ce projet a donc pour but de tester cette hypothèse, en dissociant l'influence de la photopériode de celles des hormones sexuelles. Nous utiliserons pour nos expériences la caille japonaise qui est un modèle d’étude d’intégration du signal photopériodique depuis plus d’un demi-siècle. De ce fait il existe chez cette espèce de robustes outils endocrines et moléculaires qui permettent de suivre précisément l’intégration du signal photopériodique.

Bénéfices attendus

Avoir une meilleure compréhension des mécanismes de régulation des comportements par la photopériode chez la caille japonaise.

Procédures

50 animaux subiront une gonadectomie, dont 40 avec une pose d’implants de testostérone à l’âge de trois semaines sous anesthésie générale et analgésie (environ 10 minutes d'intervention) . 20 animaux seront concernés par un retrait des implants de testostérone à 7 semaines sous anesthésie générale et analgésie ( intervention de 5 min). 40 animaux participeront une fois à chaque test de comportement (5 min par tests).

Impact sur les animaux

La manipulation des animaux par l'expérimentateur peut induire un stress. La mise à jeun pour une nuit la veille de la gonadectomie peut engendrer un stress. La gonadectomie et la pose des implants peuvent entrainer des douleurs viscérales, musculaires et cutanées et peut présenter un risque d'hémorragie, ainsi qu'un stress. Le retrait des implants peut entrainer des douleurs cutanées et un stress. L’isolement lié à l'hébergement et lors des tests de comportements peut entrainer un stress.

Devenir

À la fin de l’expérimentation, tous les animaux seront euthanasiés et leur cerveau prélevé pour être étudié.

Remplacement

Les études de comportement ne sont pas réalisables in vitro ni par modélisation. Les comportements étudiés dans ce projet, comme tous comportements, ne s'expriment et se mesurent uniquement sur animal vigile. Il n'existe pas de système alternatif à ces études.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout en permettant d'observer des différences statistiques éventuelles sur la base de notre expérience préalable quant à la variabilité des réponses comportementales et physiologiques.

Raffinement

Une anesthésie et une analgésie seront mises en place lors des chirurgies, et un suivi post opératoire sera effectué. L'hébergement des animaux se fera en cage individuelle avec enrichissement et contact sociaux visuel et olfactif. En cas de plaie ou de signe de douleur, le responsable du bien-être animal est informé directement afin de traiter l'animal (analgésiques et/ou antiseptiques, ajout de nourriture appétente). Si le traitement ne fonctionne pas et en accord avec les points limites définis, l'euthanasie sera décidée par les responsables du projet pour éviter des souffrances inutiles.

Choix des espèces

La petite taille, la prolificité et le développement rapide de la caille japonaise font de cet oiseau un modèle idéal pour les études réalisées dans le domaine aviaire, avicole. Par ailleurs, la caille japonaise est un modèle d’étude depuis de nombreuses années sur l’intégration du signal photopériodique en lien avec la reproduction. Des outils spécifiques pour examiner l’intégration du signal photopériodique ont donc déjà été développés sur cette espèce. 50 cailles mâles seront utilisées à partir du stade juvénile.