Procédures modérées

1 064 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales, l'implantation chirurgicale de pompes miniosmotiques et des examens cardiaques sous anesthésie, avant d'être euthanasiées pour analyse des tissus cardiaques et musculaires. La destruction ciblée de certains gènes vise à comprendre le remodelage du cœur menant à l'insuffisance cardiaque, dans une recherche fondamentale dont les applications thérapeutiques sont renvoyées à "un deuxième temps". Le porteur affirme qu'il n'est "pas possible de reproduire en culture" la fonction cardiaque de l'animal entier.

Objectifs

Une modification des propriétés contractiles, une altération de l'architecture cellulaire du muscle cardiaque et un changement métabolique conduisent à des phénomènes de remodelage cardiaque (hypertrophie/dilatation) aboutissant dans un deuxième temps à l'insuffisance cardiaque. Au niveau moléculaire, ce phénomène de remodelage est caractérisé par un changement dans l'expression des gènes cardiaques. Ce changement est régulé par une série de protéines appelées facteurs de transcription dont l'effet sera analysé dans le cadre du projet. L'altération du cytosquelette cellulaire conduit aussi à des phénomènes de remodellage cardiaque. Ainsi une anomalie des gènes codant pour les filaments intérmédiares peuvent conduire à des pathologies cardiaques et dont les effets seront analysés. Enfin, la mitochondrie, réservoir d'énergie pour les cellules, est régulée par une série de protéines dont la mutation conduit à des défauts métaboliques. Le rôle d'une de ces protéines sera étudié dans le cadre de ce projet. Enfin, l'obésité étant un facteur de risque majeur dans l'avénement de complications cardiovasculaires, le rôle des différents gènes étudiés sera analysé aussi dans ce contexte. Ainsi, l'objectif de notre étude sera d'analyser les fonctions cardiaques de ces gènes à travers leur inactivation à un temps précis dans un modèle murin.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche fondamental, permettra de mettre en évidence le rôle des gènes étudiés dans le cadre de l'étude et aboutira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires liés au remodelage cardiaque dans un contexte de cardiomyopathie en association avec des facteurs de risques comme l'obésité. La mise en évidence de nouvelles voies de signalisation imliquées dans la progression de la pathologie, permettra d'identifier de potentielles cibles thérapeutiques dans un deuxième temps

Procédures

Les interventions sur les animaux seront 1) Contention et injection en intrapéritonéal: fréquence trois jours successives avec alternence des côtés gauche et droite, durée de l'acte 30sec. 2) Incision (5mm) au niveau dorsal pour implantation des pompes miniosmotiques: intervention (5minutes; 1 fois) réalisée sous anesthésie et analgésique (30 minute avant l'incision). L’injection d'analgésique est répétée à 24 et 48h après la procédure pendant la phase de cicatrisation et adaptation de la souris à la pompe. 3) Echocardiographie: fréquence 3, durée 15 minutes, espacé de 15jours puis un mois, intervention non invasive réalisée sous anesthésie 4) ECG: fréquence 3, espacé de 15 jours puis un mois, durée 5minutes. En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés pour l'analyse histologique et moléculaire des tissus afin de récolter les données.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables consistent en une réduction de la fonction cardiaque chez les souris suite à la délétion des gènes étudiés. La contention pour l'injection en IP et pour l'ECG pourrait générer du stress à l'animal, L'implantation de minipompes osmotiques pourrait occasionner une sensation de gêne et douleurs pendant les deux premiers jours.

Devenir

L'ensemble des souris impliqué dans le protocole sera euthanasié par une méthode réglementaire et ceci afin de récolter les différents tissus (coeur, muscles, vaisseaux) et procéder à l'examen histologique et moléculaire de ces tissus et recueillir ainsi les donnés indispensables pour déterminer le rôle des gènes étudiés dans la progression de la cardiopyopathie.

Remplacement

Pour le présent projet, le choix de l’expérimentation animale se justifie par le fait qu’il n’est pas possible de reproduire en culture la fonction cardiaque, vasculaire et musculaire telle qu’elle se retrouve dans l’animal entier (organisation structurale, régulations neuro-hormonale, influence de la dépense énergétique globale de l’organisme).

Réduction

L’utilisation du même matériel biologique pour 3 types d’analyse (morphologie, ARN et protéine) permet de diviser par trois le nombre de souris nécessaire. Le principe de réduction est appliqué par le calcul de puissance statistique de nos test basés sur des expériences de même type dans d’autres modèles de souris qui nous permettent de réduire à 7-10 souris par groupe, le nombre de souris utilisées. Ce projet nécessitera l’utilisation de 76 souris pour chaque lignée (7 lignées) ainsi qu'un nombre équivalent en souris contrôle. Ainsi 1064 souris sont prévues pour l'ensemble du projet.

Raffinement

Nous réduirons au maximum la souffrance des animaux. En effet, toutes les manipulations chez l’animal durant nos procédures seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie (pour l'imlantation de minipompes osmotiques), garantissant une pénibilité minimale pour celui-ci. Pour réduire les effets indésirable liés à des anesthésies fréquentes, l'injection en IP correspondant en terme de douleur et stress à une piqure sera réalisée sans anethésie. Une grille d’évaluation des points limites est établie. Si une souris présente des signes de stress ou de souffrance sans que le point limite soit franchi, il sera reconnu comme souffrant. L’animal sera mis sous surveillance accrue (avec marquage de cage par carte) et l’administration d’un analgésique sera envisagée en cas de nécessité. Tous les animaux qui ont atteint ces points limites seront euthanasiés précocement. Toutes ces attentions particulières portées au bien-être animal seront complétées par un hébergement adapté, c’est-à-dire avec des congénères (répartis en cages de 5) et avec des éléments d’enrichissement dans les cages (cubes de bois à ronger, abris, substrats pour la construction de nids, nourriture et eau de boisson ad libitum) afin de créer un environnement propice au confort des animaux. Le milieu sera enrichi avec des nids et des maisons en carton.

Choix des espèces

Pour atteindre notre objectif, nous sommes amenés à utiliser un modèle murin car aucun système in vitro et aucun modèle d’organisme plus simple ne permet de reproduire la complexité de la fonction cardiaque. La souris a été sélectionnée pour la possibilité de générer par recombinaison homologue ou transgénèse des modèles d’invalidation ou surexpression du gène Les animaux utilisés auront entre 2 et 4mois d'âge (considéré comme l'âge où le coeur a fini sa croissance et présente les caractéristiques d'un coeur adulte) au début de la procédure. Les souris seront maintenues en cages (5/cages)

1 322 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome sous la peau ou en intraveineuse, des gavages répétés pouvant atteindre 52 séances par animal, des applications cutanées de bactéries et des injections d'immunothérapie, avant d'être mises à mort pour prélever tumeurs et organes lymphoïdes. L'étude cherche à comprendre comment le microbiote influence la réponse au traitement du mélanome. Le porteur affirme que l'interaction entre bactéries intestinales et réponse immunitaire ne peut être étudiée que sur "organisme entier".

Objectifs

Le mélanome est un cancer qui se développe initialement au niveau de la peau (mélanome cutané) ou de l’œil (mélanome uvéal). Le mélanome cutané est le cancer dont le taux d’incidence a le plus augmenté entre 2010 et 2018 (+3,4 %). La mortalité due à ce cancer diminue notamment grâce à des avancées thérapeutiques importantes au cours de la dernière décennie. En effet, les immunothérapies permettant de renforcer l’action anti-tumorale des lymphocytes T constituent la première ligne de traitement du mélanome en France. Cependant 60% des patients résistent à ces traitements. Nous étudions une protéine qui pourrait jouer un rôle majeur dans cette résistance. Notre hypothèse est que cette protéine, surexprimée dans le microenvironnement tumoral, élimine des bactéries indispensables pour la réponse au traitement. Nous proposons d’identifier ces bactéries, puis d’évaluer si ces dernières potentialisent l’efficacité de l'immunothérapie. Alternativement, nous évaluerons l’efficacité thérapeutique d’un inhibiteur de notre protéine d'intérêt. L’objectif fondamental de ce projet est de déterminer l’impact de ces traitements sur les cellules immunitaires au site de la tumeur.

Bénéfices attendus

Nous avons mis en évidence le rôle d’une protéine dans l’agressivité du mélanome. Ce projet permettra de mieux comprendre le mécanisme d’action de cette protéine. Compte tenu d’une part de sa capacité à lyser des bactéries in vitro et d’autre part de sa surexpression lors du développement du mélanome, cette protéine pourrait modifier in vivo la composition des bactéries aux niveaux de l’intestin mais aussi de la peau, site du développement tumoral. Nous émettons l’hypothèse que le retard du développement tumoral chez les souris dont l’expression de cette protéine a été inactivée est dû à la présence de bactéries anti-tumorales et que ces bactéries sont spécifiquement éliminées chez des souris exprimant notre protéine d’intérêt. Nous déterminerons quel est l’impact de telles bactéries sur le développement tumoral et la mise en place d’une réponse immunitaire dans un modèle de mélanome induit par transplantation et dans un modèle de mélanome spontané. Nous déterminerons si ces bactéries anti-tumorales ou un inhibiteur de notre protéine d'intérêt augmentent l’efficacité d’un traitement par immunothérapie. Des essais cliniques récents supportent que des patients atteints de mélanome métastatique, initialement réfractaires à une immunothérapie, répondent au traitement après avoir reçu une transplantation des selles de malades répondeurs à ce traitement. A terme, nos travaux pourraient permettre de proposer deux nouvelles stratégies pour traiter le mélanome cutané chez l’homme. Une première stratégie consisterai à modifier la composition des bactéries, non plus de façon systémique, mais au niveau cutané. Alternativement, nous proposer d’associer à l’immunothérapie de référence un inhibiteur de notre protéine d’intérêt.

Procédures

Prélèvement sur souris vigiles de 15-20 jours de bactéries cutanées par écouvillon et de fèces. Rasage des souris (5 minutes par souris), un jour avant l'injection en sous-cutanée des cellules de mélanome. Injection en sous-cutanée (estimation 5 minutes) ou en intra-veineuse (estimation 6 minutes) de cellules de mélanome. Ceci n'est réalisé qu'une fois par souris. Cinq mesures des tumeurs avec un pied à coulisse suite à la transplantation de cellules de mélanome en sous-cutanée. Cela prend environ 5 minutes par souris maintenues en contention. Gavage oral (5 minutes par souris) tous les 3 jours avec des fèces chez des souris avec un mélanome transplanté. Le gavage sera réalisé maximum 6 fois par souris. Application topique avec une pipette de bactéries sur la peau rasée de souris sous anesthésie. 5 dépots de bactéries sont prévus par souris. L'intervention durera le temps de pénétration des bactéries dans la peau puis le temps de réveil. Cela est estimé à 30 minutes par souris. Plusieurs souris seront traitées simultanément. Administration intra-péritonéale (estimation 3 minutes par souris) d'une immunothérapie tous les 5 jours à partir de J14 et gavage oral (estimation 5 minutes par souris) avec des bactéries tous les 4 jours à partir de J15 dans le modèle de mélanome spontané. Au total 10 injections de l'immunothérapie et 11 gavages par des bactéries sont prévus par souris. Gavage oral bi-quotidien (5 minutes par souris) avec un inhibiteur de notre protéine d’intérêt (100µl) pendant 26 jours. Au total 52 gavages par souris.

Impact sur les animaux

Les injections sous-cutanées, intra-veineuses, intra-péritonéales et par gavage oral peuvent occasionner stress et douleurs lorsque celles-ci sont pratiquées aux animaux. Le dépôt de bactéries sur la peau n'engendre pas de douleur. La croissance tumorale, spontanée ou induite par la transplantation des cellules de mélanome, peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs. Enfin la manipulation pour collecter les fèces chez des souris avant sevrage ou encore mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse peut également induire un stress chez les animaux. La transplantation de cellules tumorales en intra-veineuse peut induire une perte de poids des animaux.

Devenir

Les males reproducteurs seront tous mis à mort à l’atteinte des points limites. Tous les autres animaux seront mis à mort pour prélever des organes lymphoides secondaires (rate et ganglions) et des tumeurs primaires et des métastases.

Remplacement

Des expériences in vitro suggèrent que la protéine que nous étudions empêche la mise en place de réponses immunitaires anti-tumorales. Des expériences sont actuellement réalisées in vitro pour évaluer si cette protéine est également capable de lyser spécifiquement des bactéries fécales cultivées dans des conditions qui miment le flux intestinal. L’objectif est d’identifier des bactéries sensibles à cette protéine. Cela sera complémentaire de la caractérisation des bactéries fécales et cutanées présentes chez les souris exprimant ou non notre protéine d’intérêt. Le recours à l’expérimentation animale est justifié par l’impossibilité de modéliser in vitro ou in silico les interactions entre les bactéries intestinales et les cellules immunitaires associés au mélanome primaire ou aux métastases cutanées. En effet, la complexité de la réponse immunitaire in vivo dans la tumeur et les organes lymphoïdes secondaires des vertébrés ne peut être reproduite par des méthodes alternatives. Le bénéfice d’une réponse à un traitement (réorientation du microbiote ou inhibiteur de la protéine d’intérêt) sur le développement tumoral ne peut être étudié que sur organisme entier en raison de l’organisation et de la coopération des tissus.

Réduction

Pour respecter le principe des 3R, la durée du traitement par l’inhibiteur de la protéine que nous étudions a déjà été optimisée par notre collaborateur qui a développé cette molécule. Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant. L’expérience des manipulateurs permettra d’assurer la reproductibilité de la procédure et d’appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Ainsi les groupes reposant sur le modèle de mélanome spontané nécessitent 40 souris, alors que les procédures de transplantation tumorale requièrent des groupes de 16 souris. Les élevages permettent de générer non seulement des souris transgéniques pour un oncogène développant spontanément un mélanome, mais aussi des souris contrôles non transgéniques de la même portée.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Les souris disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de “maison-abri” en carton. Nous nous efforcerons à chaque instant de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Nous avons défini des points limites pour lesquels les animaux seront mis à mort. L’état général des animaux sera suivi par le personnel qualifié de l’animalerie lors des changes. A partir des traitements, les animaux seront suivis 3 à 5 fois par semaine par le responsable du projet pour suivre le comportement des animaux et la progression tumorale. Les animaux injectés par des cellules tumorales en intra-veineuse seront pesés à J0 et à J7 et J12. Tout état anormal sera transmis au responsable de projet et les mesures pour remédier à la douleur animale seront mises en place (mise à mort et analyse des animaux).

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la réponse immunitaire anti-tumorale, de nombreuses voies étant conservées entre la souris et l'homme. En particulier, le modèle de mélanome spontané est relevant cliniquement par rapport à la pathologie humaine. Nos données préliminaires de co-hébergement de souris,contrôles ou déficientes pour la protéine qui nous intéresse, montrent le rôle du microbiote sur la progression tumorale ce qui justifie d’identifier des bactéries pro- et anti-tumorales chez ces souris. Dans notre modèle comme chez l’homme, le traitement de référence utilisé en clinique pour traiter le mélanome cutané métastatique n’est que partiellement efficace. Nous espérons améliorer son efficacité soit en modifiant simultanément les bactéries présentes aux niveaux intestinal ou cutané, soit en l’associant un inhibiteur de notre protéine d’intérêt. Les souris contrôles et déficientes pour la portéine qui nous intéresse auront entre 6 et 10 semaines au moment de la transplantation tumorale car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral et l’effet de la modulation du microbiote sur celui-ci. Les souris transgéniques que nous utilisons développent un mélanome primaire vers l’âge de 3 semaines qui métastase au niveau cutané vers 4 à 5 semaines. Les fèces seront donc prélevés sur des animaux de 15 à 20 jours, un peu avant la détection macroscopique de la tumeur primaire, dans la mesure où le microbiote influence très tôt le développement tumoral. Ces souris seront également traitées dès J14 pour étudier l’effet de la modulation du microbiote et de l’immunothérapie sur le développement tumoral. Finalement, elles seront traitées avec l’inhibiteur de notre enzyme associé ou non à l’immunothérapie soit à J14 soit à J60 pour étudier l’effet sur le développement tumoral dans des conditions prophylactique et thérapeutique.

75 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par chirurgie un stimulateur cardiaque et un dispositif de télémétrie, puis subissent une stimulation rapide destinée à installer une fibrillation auriculaire persistante, avec IRM, échographies, scanners et biopsies rénales, hépatiques et cardiaques sous anesthésie. Seuls 15 pour cent des animaux stimulés développant le trouble recherché, le porteur prévoit d'inclure jusqu'à 65 brebis pour en obtenir dix exploitables. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité du cœur et que le remplacement est impossible "au stade actuel de la recherche".

Objectifs

La fibrillation auriculaire est l’arythmie la plus répandue, elle atteint 1-3% de la population globale. Sans traitement, la fibrillation auriculaire multiplie le risque de subir un AVC (accident vasculaire cérébral) ou de souffrir d'insuffisance cardiaque. L’objectif de ce projet est d’étudier la fibrillation auriculaire afin de mieux la prévenir et mieux la traiter. Il a été observé que la fibrillation auriculaire modifie spécifiquement le métabolisme cardiaque. Nous avons observé dans des études préliminaires que le tissu cardiaque atteint par la fibrillation subit des effets délétères dû à l’accumulation de certains métabolites, parmi lesquels le succinate. Ce dernier a l’effet de changer la dynamique cardiaque et de favoriser des arythmies. À ce jour, nous ne disposons pas de données sur l'équilibre métabolique effectif du cœur et sur les changements temporels de la signature métabolique. L’objectif de ce projet est d’obtenir des informations sur les facteurs du métabolisme cardiaque qui favorisent l'installation de la fibrillation et sur la façon dont le tissu cardiaque réagit à un remodelage précoce ou chronique dû à l'arythmie. Ces informations pourront être directement testées chez les patients afin d'identifier de nouvelles approches thérapeutiques qui ciblent le métabolisme cardiaque.

Bénéfices attendus

La littérature actuelle et nos travaux les plus récents montrent comment la fibrillation auriculaire produit un changement dans les métabolites tissulaires et circulants. Les connaissances manquantes que ce projet fournira nous permettront de définir quel équilibre métabolique systémique et cardiaque favorise ou s'oppose au développement de la maladie, quels organes et systèmes sont affectés aux stades précoces et avancés, notamment du point de vue métabolique et quels biomarqueurs circulants, dans le plasma ou dans l'urine, sont pertinents pour identifier la pathologie. Ces trois objectifs seront directement applicables en médecine préventive de la fibrillation auriculaire. Les changements métaboliques observés seront utilisés pour définir les risques de l'apparition et de la stabilisation de la fibrillation auriculaire. Ainsi, la caractérisation approfondie de la maladie servira de base à la recherche de la signature métabolique et de biomarqueurs significatifs pour une meilleure prise en charge de la fibrillation auriculaire chez les patients.

Procédures

Les animaux subiront l’implantation, sous anesthésie générale et angiographie, d’un dispositif de monitorage ECG (télémétrie) et d’un stimulateur cardiaque, ce qui nous permet d’appliquer un protocole de stimulation atriale rapide conduisant à une fibrillation auriculaire persistante. Avant l’implantation et pendant le suivi (mais pas plus de trois fois) les animaux subiront, sous anesthésie générale : des protocoles d’imagerie par IRM, échocardiographie et scanner, un protocole de cartographie de contact sous angiographie, des prélèvements de sang, d'urine, et de tissu atriale, rénale et hépatique (par biopsie).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables éventuels peuvent être liés aux anesthésies (hypothermie) réalisées aux différentes phases du projet notamment lors du réveil de l'animal (désorientation, apathie), ces effets disparaissent rapidement car les moyens nécessaires pour faciliter le réveil des animaux (lampe chauffante par exemple) sont mis en place. Les examens d’imagerie (échocardiographie, IRM, scanner et électrophysiologique) sont indolores pour les animaux. Des effets indésirables attendus sont liés à l’implantation des équipements électroniques localisés en sous-musculaire dans la zone du cou pour induire et enregistrer la progression de la fibrillation auriculaire mais ils sont maîtrisés et correspondent à des phases de cicatrisation prolongées. Le modèle de brebis en fibrillation est très bien maîtrisé au laboratoire depuis de nombreuses années et aucune brebis n’est décédée des suites d’une infection ou d’un problème lié à la cicatrisation. L’induction de la maladie chez la brebis peut provoquer une fréquence ventriculaire cardiaque irrégulière mais à noter que l’installation de la fibrillation est asymptomatique chez la brebis. Ainsi les brebis saines et en fibrillation sont indiscernables au niveau du comportement et de l’aspect physique.

Devenir

A la fin de la procédure, l'ensemble des animaux seront euthanasiés pour pouvoir poursuivre les investigations ex-vivo et répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

Au stade actuel de la recherche biomédicale, il n'y a aucune possibilité de remplacer l'utilisation d'animaux vivants pour ce type d'étude cardiaque. Il n'existe aucun modèle in vitro de fibrillation auriculaire et nous ne pouvons pas reproduire la complexité des structures cardiaques, leurs propriétés électromécaniques et l'interaction entre les organes qui soutiennent les changements biologiques que nous voulons étudier. Ce projet est unique car ses résultats seront directement transposables aux patients. Une étude parallèle sur l'homme sera menée pour faire correspondre les résultats obtenus sur plusieurs organes dans le modèle animal avec les données métaboliques que nous pouvons obtenir à partir des métabolites circulants des patients atteints de fibrillation auriculaire qui subissent une restauration du rythme sinusal par ablation par cathéter.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux et pour obtenir un plus grand bénéfice de leur utilisation, lorsque cela est possible, nous ferons en sorte que chaque brebis soit son propre contrôle. Nous avons calculé la quantité minimale d'animaux par groupe en tenant compte de la variabilité biologique observée et en considérant le nombre de répétitions nécessaires pour la robustesse statistique et la significativité des résultats. Pour obtenir 10 animaux résistants, nous devrons inclure 65 animaux dans le groupe de stimulation auriculaire rapide, car seuls 15 pourcent des animaux stimulés développent ce phénotype. Par conséquent, nous prévoyons au maximum 55 animaux dans le groupe de fibrillation auriculaire. Néanmoins, ce nombre sera réduit si nous obtenons en cours du projet un nombre de 10 animaux par groupe.

Raffinement

La télémétrie pour surveiller la température, l’activité et le rythme cardiaque des brebis 24h/24 est une mesure de raffinement. En effet, cette approche permet de réagir très rapidement pour la réalisation de soins. Par exemple, lors du réveil de l’animal nous pouvons agir si nous observons que le retour de la température corporelle est trop lent. Cette surveillance renforcée permet de mieux gérer les traitements antibiotiques et/ou analgésiques suite à une augmentation de température significative sans modification du comportement ce qui est souvent le cas chez la brebis. Ainsi, cette méthode permet de récolter des données sans induire de stress supplémentaire et nous communiquons également les données à l’équipe de l’animalerie dans le but de rassurer d’une part mais également d’accroître la réactivité en cas de problèmes suite à la réalisation d’une chirurgie par exemple. Nous entrainerons les animaux à rentrer dans le box d’isolement pour l’allumage, de 5 à 7 jours après la chirurgie, du boitier de stimulation et pesage de la brebis, mais également lors des visites régulières à l’animalerie ou dans l’annexe de l’animalerie. L’utilisation d’une récompense alimentaire sous forme de granulés fonctionne très bien chez la brebis. Cet entrainement sera réalisé par les animaliers qui s’occupent quotidiennement des animaux pour optimiser le processus d’apprentissage. Il est important de noter que la présence des animaliers lors des procédures est indispensable pour limiter le stress des brebis mais également pour faciliter la réalisation des différentes étapes du projet. Le personnel s’occupant des animaux possèdent les compétences nécessaires et ont une très bonne expérience de cette espèce. L’entrainement des brebis permettra de réduire l’angoisse/stress lors des phases d’injections. Les brebis entraînées ont un rythme cardiaque moins élevé lors de l’arrivée dans le box d’isolement que des brebis qui découvrent cet exercice pour la première fois. L’animal est placé en d’hébergement initial avec les méthodes de raffinement adéquat à son espèce : groupe social-pierre à sel-foin-paille, ils sont suivis quotidiennement par le personnel. Si une étape du protocole affecte l’état de santé au point d’atteindre un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal alors le protocole sera interrompu.

Choix des espèces

Le cœur de la brebis a une anatomie, une électrophysiologie et une géométrie proche de celles du cœur humain. Ainsi, les méthodes cliniques d’imagerie et d’électrophysiologie peuvent être directement appliquées dans cette espèce. Le modèle de fibrillation auriculaire persistante utilisé dans cette étude a été mis au point sur le mouton. Le modèle est donc bien décrit et caractérisé dans cette espèce et est une référence dans la communauté scientifique. Nous utilisons ce modèle depuis plusieurs années et nous maîtrisons la réalisation des étapes nécessaires à sa mise en place avec un taux de succès proche de 100 pour 100. Les brebis utilisées seront adultes car les dimensions du cœur permettent l’utilisation des outils cliniques notamment les cathéters. Etant donné que la fibrillation auriculaire est une pathologie majoritairement représentée chez les personnes âgées des brebis âgées de 8 minimums seront incluses.

384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire la leucodystrophie métachromatique, une maladie neurodégénérative infantile, elles reçoivent par chirurgie un implant sous-cutané de cellules encapsulées et jusqu'à six prélèvements sanguins mensuels, puis sont euthanasiées pour analyses post-mortem. L'étude évalue une enzymothérapie visant les patients déjà symptomatiques, pour lesquels il n'existe à ce jour aucun traitement. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro et que la souris est la "seule espèce" pour laquelle un modèle de cette maladie a été créé.

Objectifs

La leucodystrophie métachromatique (MLD) est une maladie neurodégénérative héréditaire conduisant à une perte de myéline (isolation de la gaine nerveuse) qui s’accompagne de signes cliniques très sévères cognitifs et moteurs chez le jeune enfant avec une aggravation très rapide et un décès des patients. De nos jours la majorité des patients atteints de MLD sont diagnostiqués lorsque leurs symptômes sont déjà bien installés (patients symptomatiques). Les traitements actuels, présentent de bons résultats pour les enfants traités en présymptomatique mais restent inefficaces une fois les symptômes présents. L’enjeu pour cette maladie est donc de trouver des traitements pouvant agir sur les patients symptomatiques et notamment sur l'inflammation cérébrale, une composante majeure de la maladie. Nous proposons d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle thérapie pour le traitement de la pathologie via une sécrétion continue de la protéine (mode d'administration confidentiel) dans le modèle murin de la maldie déjà bien caractérisé.

Bénéfices attendus

À l’heure actuelle il n’existe aucun traitement pour les patients atteints de MLD ayant des symptômes déjà bien installés (patients symptomatiques). Ce projet a pour but d'identifier une nouvelle voie thérapeutique chez les patients déjà symptomatiques pour la LDM.

Procédures

- prelevement sanguin une fois par mois soit 6 au maximum, durée d'environ 5min sous anesthésie - une chirurgie d'implantation une fois à 6 mois avec une procédure par animal d'une durée maximale de 20min sous anesthésie et analgésie - euthanasie à la fin du projet

Impact sur les animaux

Le principal effet indésirable concerne le stress que pourrait engendrer les prises de sang mensuelles sur l’animal. Enfin, l'implant de ce projet a une taille minimale comparé à notre étude précédente avec des implants rectangulaires de 25mmx12mmx13mm d'épaisseur, qui était déjà bien tolérés. Il y a de plus un risque anesthésique et un risque de douleur post chirurgical.

Devenir

En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires post-mortem.

Remplacement

À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle In vitro ou de système cellulaire pour étudier les symptômes et marqueurs moléculaires associés à la Leucodystrophie métachromatique (MLD). Nous avons donc besoin de modèles animaux pour reproduire et étudier cette maladie et surtout évaluer l’effet thérapeutique de l'implantation en sous cutanée des cellules encapsulées permettant une sécrétion continue d'arylsulfatase A. Le modèle de choix pour étudier la MLD est la souris car seule espèce pour laquelle un modèle de MLD a été créé.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire. De ce fait un nombre de 12 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Un nombre total maximal de 384 souris (comprenant 2 répétions des expériences par groupe) sera nécessaire pour ce projet.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises en œuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress (anesthésie pour les prises de sang, manipulation en amont de la procédure pour une habituation au manipulateur, prise de poids mensuelle). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne (points limites) et de soins adaptés. Enfin, en terme de raffinement nous avons réduit la taille de notre dispositif. Les animaux seront hébergés dans des conditions standard avec mise à disposition d'enrichissement

Choix des espèces

Nous avons besoin d’un modèle animal pour reproduire et étudier la MLD et surtout pour évaluer l’effet thérapeutique de la sécrétion en continu d'ARSA par des cellules encapsulées. Le modèle de choix pour étudier la MLD est la souris car seule espèce pour laquelle un modèle de MLD a été créé. Nous prévoyons de conduire notre étude sur un modèle murin déjà connu de MLD déficient pour l’enzyme ARSA, le modèle murin de la pathologie, génétiquement modifié est très proche de ce que l’on retrouve chez les patients. Les souris développent tardivement à partir de 15-18 mois, un phénotype ataxique et moteur. Ce phénotype tardif n’est pas dommageable, sachant que nos souris seront euthanasiées à 12 mois soit avant l'apparition des anomalies motrices. Les animaux entreront en procédure à 5mois et 2 semaines (acclimatation à la zone A1 de l’animalerie, et habituation au manipulateur) avec un début du traitement à 6 mois, âge auquel débutent des premiers symptômes chez la souris (souris symptomatiques). La fin de la procédure aura lieu lorsque les souris auront 8 ou 12 mois selon la durée du traitement et selon les différents groupes.

130 cailles japonaises vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 50 d'entre elles subissent une castration chirurgicale sous anesthésie, dont 40 avec pose d'implants de testostérone, avant de participer à des tests de comportement dont le porteur ne précise pas le détail. L'étude vise à dissocier l'effet de la photopériode de celui des hormones sexuelles sur des comportements comme l'agressivité, avec en perspective déclarée un meilleur contrôle du stress et de l'agressivité des volailles d'élevage soumises aux programmes lumineux intensifs. Le porteur affirme qu'il n'existe aucun système alternatif à ces études, les comportements ne se mesurant selon lui que sur animal vigile.

Objectifs

En élevage intensif, les volailles de chair sont soumises à des programmes lumineux avec une longue période de jour (18 h de lumière / 6h de nuit). Ces programmes augmentent le temps d’accès de ces animaux diurnes à la nourriture ce qui accélère leur croissance et augmente la productivité. Néanmoins, de tels programmes lumineux ont des effets délétères bien établis sur la santé des animaux. L’exposition continue à des jours longs augmente la fréquence de certaines pathologies, favorise l’apparition de comportements aberrants et apparaît comme une source notable de stress ; de tels programmes lumineux impactent donc négativement le bien-être de l’animal. Dans une précédente étude que nous avons conduite chez la caille japonaise, nous avons pu mettre en évidence que la photopériode a un effet sur des comportements clés de l'adaptation de l'animal à son environnement, tels que la représentation mentale de son environnement, la cognition au sens large, l’agressivité et le contrôle de l’activité sexuelle. Chez les mammifères, tous ces comportements sont fortement régulés par les hormones sexuelles, en particulier la testostérone chez les mâles. La production de ces hormones sexuelles varie chez les animaux saisonnés, dont la caille japonaise, en fonction de la durée du jour. Les cailles sont sexuellement actives en jours longs, mais complètement inactives en jours courts ; chez les mâles la taille des testicules – et donc la production de testostérone - varie d’un facteur 100 selon la photopériode. Bien que la testostérone soit un modulateur hormonal reconnu de nombreux comportements, dont l’agressivité, il est établi que, chez les oiseaux, ce comportement n'est pas nécessairement corrélé au taux de testostérone. Il semble donc que la photopériode impacte certains comportements via des voies indépendantes des stéroïdes sexuels. Ce projet a donc pour but de tester cette hypothèse, en dissociant l'influence de la photopériode de celles des hormones sexuelles. Nous utiliserons pour nos expériences la caille japonaise qui est un modèle d’étude d’intégration du signal photopériodique depuis plus d’un demi-siècle. De ce fait il existe chez cette espèce de robustes outils endocrines et moléculaires qui permettent de suivre précisément l’intégration du signal photopériodique.

Bénéfices attendus

Avoir une meilleure compréhension des mécanismes de régulation des comportements par la photopériode chez la caille japonaise, ce qui pourrait permettre de mieux contrôler le stress et l'agressivité des volailles d'élevage soumises aux traitements lumineux.

Procédures

Une gonadectomie sera réalisée sur 50 animaux, dont 40 avec une pose d’implants de testostérone à l’âge de trois semaines sous anesthésie générale et analgésie (environ 10 minutes d'intervention). 20 animaux seront concernés par un retrait des implants de testostérone à 7 semaines sous anesthésie générale et analgésie (intervention de 5 min). 120 animaux participeront une fois à chaque test de comportement (5 min par tests).

Impact sur les animaux

La manipulation des animaux par l'expérimentateur peut induire un stress. La mise à jeun pour une nuit la veille de la gonadectomie peut engendrer un stress. La gonadectomie et la pose des implants peuvent entrainer des douleurs viscérales, musculaires et cutanées et peut présenter un risque d'hémorragie, ainsi qu'un stress. Le retrait des implants peut entrainer des douleurs cutanées et un stress. L’isolement lié à l'hébergement et lors des tests de comportements peut entrainer un stress.

Devenir

À la fin de l’expérimentation, tous les animaux seront euthanasiés et leur cerveau prélevé pour être étudié

Remplacement

Les études de comportement ne sont pas réalisables in vitro ni par modélisation. Les comportements étudiés dans ce projet, comme tous comportements, ne s'expriment et se mesurent uniquement sur animal vigile. Il n'existe pas de système alternatif à ces études.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout en permettant d'observer des différences statistiques éventuelles sur la base de notre expérience préalable quant à la variabilité des réponses comportementales et physiologiques (photopériode).

Raffinement

Une anesthésie et une analgésie seront mises en place lors des chirurgies, et un suivi post opératoire sera effectué. L'hébergement des animaux se fera en cage individuelle avec enrichissement et contact sociaux visuel et olfactif. En cas de plaie ou de signe de douleur, le responsable du bien-être animal est informé directement afin de traiter l'animal (analgésiques et/ou antiseptiques, ajout de nourriture appétente). Si le traitement ne fonctionne pas et en accord avec les points limites définis, l'euthanasie sera décidée par les responsables du projet pour éviter des souffrances inutiles.

Choix des espèces

La petite taille, la prolificité et le développement rapide de la caille japonaise font de cet oiseau un modèle idéal pour les études réalisées dans le domaine aviaire, avicole. Par ailleurs, la caille japonaise est un modèle d’étude depuis de nombreuses années sur l’intégration du signal photopériodique en lien avec la reproduction. Des outils spécifiques pour examiner l’intégration du signal photopériodique ont donc déjà été développés sur cette espèce. 50 cailles mâles seront utilisées à partir du stade juvénile et 80 autres cailles mâles seront utilisées au stade adulte.

1 016 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent une injection pour activer leur système immunitaire, leur descendance est isolée trois semaines puis reçoit une injection stéréotaxique dans le cerveau, avant une batterie de tests de locomotion, d'anxiété, de sociabilité, de dépression et de cognition dont le RNT ne précise pas le détail. Le porteur étudie comment l'infection pendant la grossesse et l'isolement précoce affectent le cerveau et le comportement. Il affirme que ces effets dépendent du développement cérébral de l'embryon à l'adulte et ne peuvent être reproduits in vitro.

Objectifs

L'infection virale pendant la grossesse et l'isolement chronique pendant l'enfance ont un impact sur le développement du cerveau et peuvent entraîner des problèmes de comportement à long terme. Ce projet vise à mesurer l'impact de l'activation immunitaire maternelle couplé à l’isolement social juvénile sur l'expression génétique dans les plexus choroïdes et le cortex préfrontal chez la souris adolescente et adulte. Ce projet vise également à analyser les différences liées au sexe et à la résilience. Le profilage des cytokines dans le sérum des souris juvéniles et adultes permettra d'établir une corrélation entre le stress et le comportement. L'analyse du comportement des souris adultes permettra d'évaluer la socialisation, la stéréotypie, la régulation sensorimotrice, la cognition et les phénotypes liés à l'anxiété. Afin de réparer les effets négatives de ces stress, nous allons modifier des facteurs provenant du plexus choroide pour induire de la plasticité cérébrale chez l’adolescent et permettre un ajustement positif du cortex préfrontal en réponse à l'expérience sociale. La réussite de la réparation sera évaluée par le comportement et l'expression génétique chez l’adulte.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes à l'origine des symptômes liés à l'anxiété, le stress et les infections virales subis pendant le dévelopement embryonaire et la petite enfance. Il fournira de nouvelles cibles moléculaires pour le traitement des troubles du développement neurologique caractérisés par une maturation et un fonctionnement défectueux des interneurones corticaux.

Procédures

Une injection intrapéritoneale sera réalisée sur animaux gestantes et vigiles; la procédure dure environ 1 minute en moyenne et sera effectuée une seule fois. Certains animaux seront hébergés en isolement pendant 3 semaines. Une prise de sang sera effectuée sur des animaux anesthésiés; la procédure dure environ 1 minute en moyenne et sera effectuée une seule fois. Certains animaux seront soumis à un seul test de locomotion qui dure 30 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test qui évalue le niveau d'anxiété et dure 10 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test d’interaction social qui dure 20 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test qui évalue le niveau de dépression et dure 8 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test de stéréotypie qui dure 20 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test cognitif qui dure 6 minutes. Une injection stéréotaxique intracérébrale sera effectuée sur des animaux anesthésiés; cette procédure chirurgicale dure environ 1 heure et sera effectuée une seule fois.

Impact sur les animaux

Les injections intrapérioneales d’acides nucléiques sur des femelles gestantes entraînent généralement une perte de poids qui dure 24 heures. Les animaux reprennent un poids normal par la suite. Suite à la chirurgie, il est possible que les animaux soient stressés après réveil, sujets à des fluctuations de poids ainsi que de la douleur locale. Les animaux issus d'une mère soumise à une activation immunitaire peuvent présenter des effets [attendus] sur leur comportement adult (anxiété, dépression, stéréotypie, troubles de la perception sensori-motrice). L’isolement des animaux peut avoir des effets [attendus] tel que la néophobie, des troubles de la perception sensori-motrice, l’agressivité, et des troubles de socialization.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort et leur cerveau et sang seront collectés afin de permettre des analyses histochimiques et biochimiques.

Remplacement

Nos recherches sur les effets du stress sur la plasticité du cerveau nécessitent des modèles de souris pour comprendre comment l'environnement juvénile affecte le comportement adulte. Ces expériences ne peuvent être reproduites in vitro car elles dépendent du développement du cerveau de l’embryon jusqu’à l'âge adulte.

Réduction

Nos travaux antérieurs sur des animaux soumis à des injections cérébrales suivies de plusieurs analyses comportementales nous ont permis de démontrer qu'un nombre de 12 souris par condition expérimentale est nécessaire. Ceci nous permet d'obtenir une puissance statistique satisfaisante même si 1 ou 2 souris sont perdues lors de la chirurgie. Pour les procédures avec analyses comportementales mais sans chirurgie, nous utiliserons 10 souris par condition. Nous allons faire plusieurs analyses (sang, comportement, histologie, biochimie) sur chaque souris afin de minimiser le limiter le nombre d’animaux.

Raffinement

Toutes les expériences invasives sont réalisées sous anesthésie générale, associée à un traitement analgésique. Après la chirurgie, les animaux sont transférés dans une cage chauffée avec un tapis chauffant jusqu'à leur réveil. Ils sont ensuite hébergés dans leur groupe d'origine pour éviter le stress de l'isolement, puis observés et pesés quotidiennement pendant 2 jours. Pour évaluer les points limites, les souris seront inspectées quotidiennement afin de détecter les signes d'infection et de douleur (changement de posture, de pelage, d'expression faciales), et des mesures de poids seront prises au moins deux fois par semaine. En cas d'infection ou de signes de douleur, les animaux recevront un traitement approprié. En cas de perte de poids, les animaux seront placés dans des cages chauffées et recevront un régime alimentaire enrichi. Les animaux seront euthanasiés si aucune amélioration n'est constatée après 2 jours de traitement ou si la perte de poids dépasse 20% du poids de départ.

Choix des espèces

La génétique de la souris est très bien connue et proche de celle de l'homme, ce qui en fait un modèle privilégié pour l'étude de la plasticité cérébrale et des effets du stress en début de vie. C'est un animal avec lequel nous avons l'habitude de travailler et pour lequel nous avons une bonne expertise pour réduire les conditions de stress, d'inconfort et de douleur. Il nous permet également de créer des modèles pour l'étude des pathologies humaines. Ce projet implique un stress postnatal précoce, un sauvetage moléculaire pendant l'adolescence et l'analyse des phénotypes adolescentes et adultes. Des injections stéréotaxiques dans les ventricules cérébraux seront effectuées sur des souris agées de 45 à 50 jours, lorsque cette région du cerveau est plastique. Le comportement sera évalué chez l’adolescent (agées de 45 à 55 jours) et chez l’adulte (agées de 70 à 110 jours), lorsque les phénotypes se manifestent.

171 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie abdominale pour créer un anévrysme puis l'implantation d'une endoprothèse revêtue, avec prélèvements sanguins à la joue et imagerie sous anesthésie, avant analyse des tissus une semaine ou quatre mois plus tard. Le porteur teste un revêtement censé améliorer l'intégration des stents aortiques posés chez l'humain. Il affirme qu'aucune simulation fiable d'anévrysme de l'aorte n'existe et juge l'étude sur animal indispensable.

Objectifs

Actuellement, les anévrysmes de l'aorte abdominale sont traités par implantation de stents aortiques. Il existe cependant des complications nécessitant de nouvelles opérations liées à un phénomène de rejet de ces stents. En effet, ils ne sont pas complétement intégrés dans le tissu du patient. L’objectif de l’étude est de concevoir un revêtement applicable sur ces stents aortiques pour améliorer leur intégration et donc diminuer le risque de rejet. Cette étude est une étude expérimentale chez l'animal (rat) dont les résultats pourraient permettre de transposer la technique chez l'homme.

Bénéfices attendus

Un anévrysme est une déformation pathologique d'un segment vasculaire. Le risque d'un anévrysme est sa fragilisation et sa rupture, entrainant une hémorragie souvent grave. Chez l’homme, les anévrysmes de l’aorte abdominale (AAA) sont traités avec des endoprothèses (stents aortiques). Ce traitement est toutefois grevé d’un nombre significatif de fuite et de migrations d’endoprothèses au cours du suivi. Ces complications pourraient être liées à un défaut d’intégration de l’endoprothèse L’objectif du projet est de développer une endoprothèse fonctionnalisée avec un revetement permettant sa meilleure intégration dans le tissu aortique. Le bénéfice translationnel est majeur avec une potentielle diminution des complications évolutives du traitement endovasculaire des AAA chez l’homme.

Procédures

Les animaux recevront de l’aspirine tout au long de la procédure pour éviter la formation de caillots (thromboses). Les animaux auront une implantation d’endoprothèses comportant des revetements anti-inflammatoires. Ces endoprothèses seront implantées chez des rats dont l’aorte est saine (pour étudier la biocompatibilité de ces endoprothèses) ou chez des rats chez qui des anévrysmes auront été créés préalablement 3 semaines plus tot pour mimer la pathologie humaine. Ces procédures d’implantation se feront par incision au niveau de l’abdomen sous anesthésie générale et antalgiques et durent 30 minutes. La procédure de création d'anévrysme est également faite par une incision au niveau de l'abdomen sous anesthésie générale et antalgiques et dure 1h. Afin de mesurer l’inflammation, des examens de sang (prélèvement veineux au niveau de la joue) et d’imagerie (echographie abdominale, TEPscanner) seront réalisés sous anesthésie générale. Ces examens d'imagerie seront réalisés dans un autre établissement utilisateur et serviront à mesurer objectivement l'inflammation et donc à comparer les groupes d'étude. Dans l'axe I, les deux examens d'imagerie (echographie et TEPscanner) auront lieu 1 semaine après implantation des endoprothèses. Pour l'axe II, ces examens d'imagerie auront lieu à 1 et 4 semaines après implantation. Concernant les prélévements sanguins, dans l'axe I il aura lieu après euthanasie. Pour l'axe II il auront lieu à 1 semaine après implantation des endoprothèses (sous anesthésie générale) et après l'euthanasie à 3 mois après implantation des endoprothèses.

Impact sur les animaux

Les effets nuisibles attendus sont la présence d'un inconfort ou d'une douleur modérée de courte durée après les procédures chirurgicales. D'autres effets peuvent survenir comme une perte de poids, une deshydratation, une diminution de la mobilité ou encore la survenue de caillots sanguins (thrombose).

Devenir

Dans l'étude I, les animaux sont euthanasiés 7 jours après implantation des endoprothèses pour analyse des tissus (étude microscopique de l'intégration des endoprothèses). Dans l'étude II, les animaux sont euthanasiés 120 jours après implantation des endoprothèses pour analyse des tissus (étude microscopique de l'intégration des endoprothèses).

Remplacement

Il n’est actuellement pas possible de simuler de facon précise l’action d'un revetement anti-inflammatoire dans un tissu aortique. Il n’existe pas non plus de simulation fiable d’anévrysmes de l’aorte abdominale (AAA). L'étude chez l'animale reste indispensable. Toutefois, des expérimentations préliminaires ont permis une séléction précise du revetement anti-inflammatoire à tester chez l'animal et d’établir un protocole robuste.

Réduction

Nous avons volontairement choisi d'utiliser des examens d'imagerie non douloureuses et reproductibles dans le temps (échographie abdominale). Cela permet de suivre sur la durée les mêmes animaux sans les euthanasier. Nous avons également calculé préalablement à l'expérimentation le nombre d'animaux à inclure dans l'étude. Cela permet d'obtenir des résultats statistiques robustes tout en évitant d'inclure trop d'animaux.

Raffinement

-Les conditions d’hébergement seront optimisées au maximum : limitation des transports au strict nécessaire, enrichissement de l'environnement (mise en place de coton pour comportement de nidification, mise à disposition de baton à ronger), respect du rythme jour/nuit -Nous veillerons à réaliser un transport doux en limitant les mouvements brusques pour réaliser les procédures d'imagerie sur le site dédié. -Nous avons prédéfinis la liste d'élements de surveillance du bien-etre des animaux: tous les animaux seront surveillés quotidiennement à l'aide d'une grille standardisée de surveillance. Les animaux seront inspectés (poids, présence d'un inconfort/douleur, état de la cicatrice) et des soins adaptés comprenant des anti-douleurs seront administrés. Si une trop souffrance est constatée (présence de points limites), l'animal sera immédiatement euthanasié. -Nous utiliserons une procédure d’imagerie non invasive : l’echographie abdominale a été préférée à l’angiographie invasive. -Nous aurons recours à l’anesthésie et à l’analgésie pour toutes les procédures. - Concernant le transport entre site d'hébergement et site d'imagerie, une acclimatation avec transport la veille sur le site d'imagerie aura lieu avec manipulations douces.

Choix des espèces

-Le modèle animal (rat) a été soigneusement choisi d’après les publications internationales les plus pertinentes sur le sujet (implantation d’endoprothèses dans l’aorte saine et dans des anévrysmes). Les dimensions de l’aorte du rat Wistar permettent son analyse en imagerie (echographie et TEP scanner). Les rats seront utilisés à un stade adulte car la population humaine présentant des anévrysmes de l'aorte abdominale est adulte et agée. Les animaux utilisés seront des males car il existe une nette prédominance masculine dans la population humaine présentant des anévrysmes de l'aorte abdominale.

254 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une minipompe implantée par chirurgie, une autre est isolée sept jours en cage à métabolisme avec de l'eau acidifiée, et des prélèvements sanguins sont réalisés au coin de l'œil, geste que le porteur reconnaît traumatisant. Le porteur étudie le rôle d'un récepteur membranaire dans les cellules du rein qui sécrètent de l'acide. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit le canal collecteur du rein et juge le recours à la souris indispensable, avant prélèvement des reins et de la rate.

Objectifs

Le rein contrôle la composition en ions et en eau de l'organisme. Cette fonction est rendue possible grâce à des cellules qui forment de longs segments en forme de tubes dans le rein. Il existe plusieurs types de cellules tubulaires qui ont chacune des fonctions particulières. Certaines cellules appelées cellules intercalaires sécrètent des acides dans l’urine en formation. Ces dernières sont importantes lorsque l’organisme est surchargé en acide comme dans plusieurs situations : diabète, régime riche en protéines, troubles du métabolisme. Le nombre des cellules du canal collecteur varient en fonction des apports en ions. Par exemple, une charge acide (induite par un produit introduit dans l’eau de boisson) provoque l’augmentation du nombre de cellules intercalaires. Cette augmentation a un rôle important puisque son défaut entraine une perturbation de la régulation de l’état acido-basique pour autant sa régulation n’est pas bien comprise. Ce projet propose d’étudier le rôle d’une protéine située sur la surface des cellules intercalaires A sur la fonction de ces cellules. Il aura pour objectifs de déterminer l’importance de cette protéine pour 1/ la sécrétion acide par le rein, 2/ le comportement des cellules intercalaires, 3/ la régulation du nombre de ces cellules. Il n’existe pas de modèle alternatif de cellules intercalaires en culture au laboratoire qui reproduisent l’ensemble des cellules tubulaires du canal collecteur. Ce projet nécessite l’utilisation de souris dont la composition cellulaire rénale est proche de l’homme. Chez des souris, la protéine étudiée dans ce projet sera inactivée par une molécule chimique ou par inactivation d’un gène. Nous mesurerons la fonction du rein chez ces souris ainsi que le contenu en ions du sang de ces animaux. La composition cellulaire des reins de ces souris sera également explorée.

Bénéfices attendus

La régulation du nombre de cellules dans le canal collecteur rénal est mal connue. Pourtant, il joue un rôle fondamental dans le maintien bien équilibré d’un organisme pour son contenu en eau et en ions, pour le maintien du pH sanguin et une pression artérielle constante. Ce projet permettra de mieux connaitre certains mécanismes du rein qui sont modifiés lors de maladies comme l’hypertension ou de troubles métaboliques comme le diabète. La protéine étudiée dans ce projet est également la cible de molécules anticancéreuses dont certains effets secondaires concernent le rein. Ce projet permettra donc également de préciser le mécanisme de ces molécules anticancéreuses et leurs effets sur le rein.

Procédures

Une minipompe osmotique sera placée sous la peau du dos de souris et nécessite une procédure chirurgicale faite sous anesthésie générale. La chirurgie dure moins de 15 minutes et les animaux se réveillent de l’anesthésie au bout de 45 minutes. La minipompe administrera une molécule inhibitrice du récepteur étudié pendant 14 jours. La pose d’une minipompe concernera au maximum 174 souris. Un prélèvement sanguin (durée du prélèvement inférieure à 10 secondes) sous anesthésie gazeuse sera imposé à 42 de ces souris pour mesurer les taux circulants de monocytes et neutrophiles. Pour étudier la fonction rénale, 132 souris seront installées individuellement dans des cages spéciales (cages à métabolisme) pendant 7 jours consécutifs permettant de récolter leurs urines. Le poids des souris, la quantité de nourriture ingérée ainsi que le volume de boisson seront mesurées dans ces cages. L’eau de boisson des souris sera acidifiée permettant de solliciter les cellules intercalaires rénales, Un prélèvement sanguin après application d’un collyre anesthésiant pour chacune des 132 souris permettra de mesurer les concentrations en ions du sang (durée du prélèvement inférieure à 10 secondes). Un autre lot de 80 souris dont un gène a été inactivé sera également placé dans ces cages à métabolisme permettant de suivre la composition de leurs urines lorsque ces souris sont soumises à une charge en acide. Elles auront deux prélèvements sanguins après application d’un collyre anesthésiant avant et après leurs placements en cages à métabolisme (durée de chaque prélèvement inférieure à 10 secondes). L’ensemble des souris seront mises à mort sous analgésie et sous anesthésie générale profonde par une perfusion d’un liquide fixateur des tissus.

Impact sur les animaux

Une molécule sera administrée par minipompe osmotique implantée sous la peau de la souris nécessitant une chirurgie sous anesthésie générale. Pour mesurer plusieurs composés du sang, des prélèvements sanguins sont nécessaires. Ces prélèvements seront réalisés au niveau du coin de l’œil ce qui peut être traumatisant pour la zone autour de l’œil. Certaines souris seront placées dans une cage adaptée pour recueillir leurs urines. Dans cette cage, les souris sont placées sur une grille. L’hébergement dans ces cages se fait de manière individuelle en isolant chacune des souris. Le séjour en cages à métabolisme durera 7 jours consécutifs. Dans ces cages, l’administration d’un traitement acide dans l’eau de boisson testera la fonction rénale des souris. Le traitement acide entraine une modification transitoire du pH sanguin mais qui est compensée au bout de 7 jours. Dans ce projet, une nouvelle souche de souris sera générée pour inactiver un gène dans certaines cellules rénales et ceci n’a jamais été fait ni décrit dans la littérature. Il n’est pas anticipé d’effets indésirables de cette inactivation.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour récupérer les tissus (reins et rate) et d’en analyser le contenu en cellules et de quantifier l’abondance de plusieurs transporteurs ioniques.

Remplacement

Les modèles de cellules rénales en culture ne permettent pas d’obtenir les informations souhaitées ; ce projet nécessite un systèmes intégré multi-cellulaire reproduisant fidèlement le canal collecteur. Ce modèle n’existe pas à l’heure actuelle. Le recours aux modèles animaux s’avère donc indispensable. De plus, nous avons besoin dans ce projet d’une souche de souris génétiquement modifiée. Cette souche permettra l’inactivation ciblé du gène du récepteur dans un nombre restreint de cellules du rein. L’inactivation permettra de déterminer le rôle du récepteur sur le fonctionnement des cellules intercalaires rénales.

Réduction

Dans toutes les procédures, le nombre d’animaux par lot a été défini a minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables. Pour les mesures du contenu sanguin en ions, les protocoles ont été élaborés pour réduire au minimum le volume de sang prélevé et ainsi faire deux mesures sur les mêmes animaux à 2 semaines d’intervalle. Cela permet de réduire le nombre total de souris d’une procédure. L’administration du traitement acide dans l’eau de boisson et l’utilisation des cages à métabolisme pour mesurer la fonction rénale ont été déjà validés par plusieurs publications permettant d’anticiper parfaitement le nombre souris minimum nécessaire au projet. Le nombre de souris a également été calculé pour détecter des différents significatives entre les différents mesures histologiques et biochimiques faites sur les reins prélevés après mises à mort des animaux. Deux doses de la molécule inhibitrice seront testées et une seule dose sera utilisée dans la suite du projet en fonction des premiers résultats.

Raffinement

Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée entre l’arrivée des souris dans l’animalerie et le début des expérimentations sur celles-ci. Les animaux bénéficieront tous d’une surveillance rapprochée dès le début des procédures. La mise en place du dispositif d’injection sous la peau est fait sous anesthésie générale et analgésie locale. Pour limiter les effets indésirables de ce dispositif, le plus petit modèle a été sélectionné. Les prélèvements sanguins seront faits sous anesthésie générale lorsque cela sera possible sans fausser les mesures. Pour la mesure des concentrations ioniques dans le sang, le prélèvement sera fait avec analgésie locale avec un collyre anesthésiant. Les animaux seront observés après les prélèvements avec l’utilisation de points limites. Le protocole d’utilisation des cages à métabolisme comporte un suivi quotidien des animaux avec une grille de différentes mesures. Des points limites ont été établis ayant pour conséquence la sortie du protocole pour l’animal. Une habituation des souris à la cage et à la nourriture en poudre. Un abri opaque est également installé dans la cage permettant à l’animal de s’y réfugier. Le séjour dans les cages à métabolisme a été réduit au minimum. En cas de comportement agressif d’un animal envers ses congénères dans une cage de stabulation, les animaux seront isolés dans des cages individuelles pour éviter le risque de sur-blessure. Les cages de stabulation seront également enrichies avec des boules d’ouate, des bâtonnets de bois, du carton.

Choix des espèces

La souris représente un modèle de choix car elle présente une organisation du rein très semblable au rein humain. Nous savons déjà que le récepteur étudié dans ce projet est présent à la surface des mêmes cellules chez la souris adulte et chez l’homme adulte. Nous avons également des résultats préliminaires qui montrent que ce récepteur est fonctionnel chez la souris. Les souris utilisées dans ce protocole seront des souris adultes car le projet porte sur l’étude de la fonction rénale d’un organisme adulte.