Procédures modérées

36 coqs vont être utilisés, tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont hébergés individuellement pendant deux ans, placés quatre jours par semaine dans une cage à surface réduite pour collecter leurs fientes et mis à jeun vingt-quatre heures à chaque bilan, le porteur reconnaissant l'hébergement individuel prolongé comme la nuisance majeure. Les coqs sont tués à la fin de cette période. Le porteur mesure la valeur nutritionnelle d'aliments pour volailles et affirme que le recours à l'espèce d'élevage est "indispensable".

Objectifs

L'unité met en place des essais de digestibilité sur coqs afin d’évaluer de la manière la plus précise possible la valeur nutritionnelle des matières premières, coproduits ou aliments destinés aux volailles. Les matières premières et coproduits ne cessent d’évoluer, par les changements des itinéraires techniques plus respectueux de l’environnement, l’apparition de nouvelles sources de protéines locales et l’optimisation des procédés qui génèrent des co-produits valorisables par les animaux. Les mesures de digestibilité permettent de faire le bilan entre les nutriments consommés par l’animal, ceux réellement absorbés et utilisés pour les fonctions physiologiques et de croissance, et ceux rejetés dans les déjections. Les résultats ainsi obtenus permettent aux fabricants d’aliments et aux éleveurs d’adapter au mieux la qualité nutritionnelle des aliments aux besoins des animaux. Cela contribue au maintien d’une flore digestive équilibrée (moins de fermentations indésirables) et à la bonne santé des animaux, mais aussi à réduire les rejets (azoté, phosphore, …) dans l’environnement. Dans ce type de protocole, l’utilisation de l’espèce d’élevage est indispensable, puisqu’il s’agit de la cible directe de la thématique. Le coq est utilisé en tant que référence pour les volailles, puisqu’il s’agit d’un animal adulte dont les besoins ne sont liés qu’à l’entretien et non pas à des fonctions physiologiques particulières comme la croissance, la ponte etc…

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de continuer l’acquisition de données de digestibilité fécale chez le coq nécessaires afin de formuler au mieux les aliments d’élevage pour limiter les désordres digestifs liées à un déséquilibre nutritionnel mais aussi les rejets dans l’environnement tout en développant les connaissances sur des matières premières notamment locales. Les essais de digestibilité permettent d’évaluer des hypothèses de manière fine et donner des valeurs de référence de la valeur nutritionnelle d’une matière première ou d’un aliment avec un nombre d’animaux très réduit. Les résultats contribuent à alimenter les bases de données disponibles pour la filière et à développer des équations de prédiction utilisées par les formulateurs. Les mesures in vivo (quelques équipes en France à les réaliser), permettent le maintien de la validité et l’adaptation continue de ces équations, et au développement d’autres pour des matières premières et co-produits qui ne cessent d’évoluer. Le coq est un modèle pour les volailles, les mesures sont rapides et plus facilement réalisables que sur poulets pour notamment évaluer de nouvelles matières premières.

Procédures

Les coqs sont hébergés en individuel. A chaque série (7 jours), ils sont placés 4 jours en cage avec une surface au sol diminuée pour permettre de collecter les fientes. Le reste du temps, ils sont dans une cage plus grande leur permettant une plus grande liberté de mouvement. Les coqs sont mis à jeun 24 heures en début et en fin de collecte de fientes.

Impact sur les animaux

La nuisance majeure reste l’hébergement en cage individuelle pendant une période prolongée, qui réduit les comportements potentiels dans un environnement plus riche, et cela malgré les améliorations faites depuis 2017 qui ont beaucoup contribué au bien-être des animaux (plus de surface, perchoir, surface de grattage). D'autres nuisances, mais dans une moindre mesure, sont les mises à jeun de 24 h autour de la phase de bilan. Néanmoins, les coqs (souche légère) adultes ayant peu de dépenses énergétiques à ce stade, réagissent bien à ce stress de courte durée et aucune dégradation de leur état n’a jamais été observée. Aucun effet indésirable des aliments distribués, bien adaptés à leur état physiologique, n’est attendu.

Devenir

Les coqs issus de la procédure d'hébergement individuel et de mise à jeun sont euthanasiès après 2 ans d’hébergement au sein de la station avec des périodes de mesures et des périodes de repos. Les animaux sont en cage réduite 4 jours par semaine de bilan. Par an, il y aura un maximum de 20 bilans, avec 4 jours consécutifs en cage réduite par bilan. Les bilans sont étalés sur l'année. Dans cette surface réduite, les animaux passent donc un maximum de 80 jours par an, non consécutifs.

Remplacement

Les matières premières, coproduits et additifs utilisés en alimentation animale ont une « valeur biologique » variable. Ils peuvent varier avec l’espèce végétale, la variété, le procédé appliqué, l’ajout d’additifs, etc. La modélisation et les équations de prédiction ne peuvent donner que des valeurs moyennes qui ne rendent pas compte de cette variabilité et surtout pas de la variabilité entre animaux eux-mêmes. Seule l’évaluation sur animaux permet de mesurer avec précision la valeur nutritionnelle et le niveau de rejets d’un aliment.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé a été réduit au minimum de répétitions, pour être capable de mettre en évidence un écart de 1 à 2 % de valeur énergétique, niveau suffisant d’un point de vue biologique et zootechnique. L’adaptation facile du coq à l’environnement et l’homogénéité des réponses entre individus, permet de générer un grand nombre de données avec un nombre réduit d’animaux.

Raffinement

Les animaux ont une perception visuelle, auditive et olfactive des congénères (cages accolées et grillagées). La surveillance journalière, la manipulation des mangeoires et des abreuvoirs, permettent une habituation des animaux à la présence humaine. Un perchoir est installé dans chaque cage ainsi qu'une surface de grattage. Les cages disposent d’un fond coulissant permettant la réduction de surface pour les bilans, sans manipulation stressante pour les animaux. Les perchoirs ne seront pas accessibles pendant les collectes de fientes car il y a un risque que les fientes tombent dessus, ne soient pas totalement récupérées ou soient souillées, et que cela ait un impact sur la collecte totale.

Choix des espèces

Seule l’évaluation sur animaux permet de mesurer avec précision la valeur nutritionnelle et le niveau de rejets d’un aliment. La mesure chez l’espèce d’intérêt agronomique, "poules" (Gallus gallus), permet d’approcher au mieux les réponses en élevage. Le coq est un modèle utilisé classiquement. Les valeurs obtenues sur coqs permettent d’estimer la valeur nutritionnelle chez les animaux en croissance et la poule pondeuse, au moins de manière comparative. Ce sont des animaux adultes, donc en phase d’entretien (pas de croissance), ce qui facilite le bilan et donne des résultats très homogènes au sein du même traitement (forte puissance expérimentale).

277 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des tests de tolérance au glucose associant gavage et huit micro-prélèvements de sang, un test de reconnaissance d'objet et un test de préférence entre deux boissons, ainsi qu'un "test comportemental" que le porteur ne précise pas. Les mâles sont isolés après accouplement, ce qui peut induire un stress modéré, et tous les animaux sont tués pour prélever organes et tissus. Le porteur inscrit ce travail dans un consortium international sur l'effet de l'alimentation du père sur la descendance.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier les effets de l’alimentation paternelle sur la santé et le comportement de la descendance chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’étudier l’impact du régime alimentaire paternel sur sa santé ainsi que sur celle de sa descendance. Ce projet fait partie d’un consortium international qui a pour but d’étudier les modifications d'expression des gènes duent à l’alimentation du père sur la génération suivante dans différentes espèces animales et chez l’Homme afin de déterminer comment le mode de vie peut impacter la santé de la descendance.

Procédures

Les pères auront 1 test de tolérance au glucose et la descendance 2 tests de tolérance au glucose, soit par test : 1 gavage (20s) ; 8 micro-prélèvements de sang (20s/micro-prélèvements). Chaque animal aura 1 test de reconnaissance d’objet nouveau (20 min d’habituation + entrainement et 10 min de test) ; 1 test comportemental (10 minutes) et un test de préférence entre deux boissons (sucrés ou non) (4 jours).

Impact sur les animaux

Un stress de courte durée peut être généré par les tests comportementaux. Une douleur modérée de courte durée associée au prélèvements de sang lors du test de tolérance au glucose. Les mâles F0 seront isolés afin d’éviter les bagarres après la mise en accouplement et pourront donc subir un stress modéré (contact visuel avec leurs congénères toujours possible).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de récupérer organes et tissus d’intérêts pour analyses.

Remplacement

Le but de ce projet est d'étudier l'effet de l'alimentation sur le comportement et le métabolisme d'un individu ainsi que sur celle de sa descendance. Pour cela nous ne pouvons nous passer d'un organisme vivant qui nous permettra d'obtenir plusieurs générations. Aucun modèle in vitro ou ex vivo ne peut remplacer l'animal dans ce projet.

Réduction

Le nombre de pères (n=9/régime) a été déterminé de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables. Le nombre d'animauxde la descendance découle du nombre de pères.

Raffinement

Les conditions d’hébergement et de soins et les méthodes utilisées ont été choisies et conçues de manière à réduire au maximum toute douleur, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Pour les tests comportementaux, des périodes d’adaptation à la salle et au matériel sont prévues ainsi que des entrainements. Le bien-être des animaux sera évalué par l’observation quotidienne des signes cliniques et la pesée hebdomadaire des animaux après la période d’acclimatation. Des points limites gradés précis et adaptés ont été défnis et seront appliqués à partir des observations faites sur les animaux. En cas d'atteinte d'un point limite, les animaux seront sortis de l'étude.

Choix des espèces

La souris a été choisie dans ce projet pour la facilité d’obtention d’une descendance (maturité sexuelle jeune et obtention de portées importantes). De plus les tests comportementaux et métaboliques étant très bien décrits pour cette espèce, la souris est un modèle de choix pour ce projet. Tous les tests seront réalisés sur des animaux adultes.

86 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des chirurgies vasculaire et intracérébrale, l'injection d'un ARN interférent dans le cerveau et l'auto-administration intraveineuse d'héroïne pendant vingt jours. Les animaux sont tués pour prélever leurs cerveaux. Le porteur présente comme bénéfice attendu la possibilité de répondre aux relecteurs d'un manuscrit déjà soumis, ce qui situe l'enjeu au niveau d'une publication.

Objectifs

Notre objectif est mettre en évidence un rôle fonctionnel de Sez6 dans la mise en place d’un comportement compulsif de prise d’héroïne chez le rat, en diminuant son expression et en étudiant le comportement des rats vis-à-vis de la prise de drogue.

Bénéfices attendus

Notre objectif est mettre en évidence un rôle fonctionnel de Sez6 dans la mise en place d’un comportement compulsif de prise d’héroïne chez le rat. Ce résultat nous permettra de répondre aux experts qui ont évalué le manuscrit que nous avons soumis.

Procédures

Les chirurgies vasculaires (qui durent 30 min) et les chirurgies intracérébrales (qui durent 15 min) seront réalisées sous anesthésie générale. Les injections des ARN interférents se feront par voie intracérébrale, et la mise en place du comportement d’auto-administration par voie intraveineuse d'héroïne. Le comportement des animaux sera enregistré pendant 20 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont essentiellement liées à la procédure chirurgicale. L’administration d’antalgiques est prévue en pré et post opératoire.

Devenir

A l'issue des 2 procédures, les animaux sont mis à mort pour prélèvement des cerveaux.

Remplacement

Ce projet ayant pour but d’étudier le rôle fonctionnelle d’une protéine sur le comportement d’auto-administration de drogue, aucune méthode alternative n’existe. Il s'agit en effet d'étudier le comportement spontané et volontaire des animaux après apprentissage, ce qui ne peut être réalisé sur des modèles alternatifs (approches in silico, in vitro ou ex vivo).

Réduction

Pour réduire au miminum le nombre de rats utilisés, nous avons estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace grâce aux données obtenues lors de projets précédents. Pour les études d’éfficacité de l’ARN interférent à diminuer la quantité de notre protéine d’intérêt nous aurons 5 rats par condition. Pour les études comportementales, chaque groupe sera constitué de 14 animaux pour révéler des différences inter-individuelles comportementales.

Raffinement

L’hébergement s’effectuera dans un environnement enrichi (présence de nids végétaux et de tunnels opaques). Les rats seront également logés à deux par cage d’habitation permettant un enrichissement social tout en assurant un espace d’hébergement suffisant. L’angoisse des animaux sera réduite par une manipulation quotidienne par l'expérimentateur. Les chirurgies sous analgésie et anesthésie générale seront réalisées par une personne compétente ayant suivie la formation réglementaire de chirurgie. De plus les animaux seront observés quotidiennement, et pesés tous les 2 jours. Ces observations permettent de graduer les points limites pour l'apparence et la perte de poids. En fonction du degré de gravité, les animaux seront isolés et mis sous antibiotiques (perte de poids 15%; apparence avec dos rond, agitation ou immobilité importante).

Choix des espèces

L’investigation d’une pathologie telle que l’addiction nécessite d’étudier une espèce animale phylogénétiquement voisine de l’homme pour pouvoir reproduire la maladie. Le rat est un modèle de référence dans le domaine des addictions. Il possède une organisation anatomique et structurelle du cerveau comparable à celle de l’Homme. De plus, il est idéal pour les études comportementales. Le rat est capable d’apprendre des tâches complexes et peut réaliser des comportements élaborés. Les animaux testés seront de jeunes adultes. Ils arriveront au laboratoire à l’âge de 7 semaines environ et ne sont pas testés avant leur 8ème semaine, ce qui correspond à une phase où ils sont sexuellement mâtures. Il est important que nous réalisions ces expériences chez l’animal adulte pour pouvoir éviter le facteur confondant de l’âge sur les facteurs comportementaux mesurés. En effet, l’âge peut influencer de manière significative l’état émotionnel et le comportement de l’animal.

380 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de cellules tumorales dans le cerveau ou le cœur, un inhibiteur administré par la bouche, une irradiation cérébrale et la pose répétée de cathéters, le porteur anticipant perte de poids, de motricité et de sensibilité liées aux métastases cérébrales. Les animaux sont tués à un stade défini ou après une étude de survie. Le porteur évalue un traitement des métastases cérébrales pour une application clinique lointaine, et affirme que le microenvironnement tumoral rend le remplacement in vitro impossible.

Objectifs

Au vu des échecs des thérapies standard existantes en ce qui concerne les MC, ce projet vise à évaluer l’intérêt de nouveaux traitements pour ces MC en ciblant spécifiquement leur microenvironnement tumoral hypoxique. En effet, l’hypoxie est connue pour être un facteur de mauvais pronostic dans de nombreuses tumeurs. Elle est à l’origine de l’expression des facteurs de transcriptions Hypoxia Inducible Factors (HIFs), principaux facteurs de résistance à la radio- et chimiothérapie. Ce projet visera donc à évaluer l’intérêt d’un inhibiteur de HIF-2 dans les MC, qui s’avère déjà être prometteur dans le traitement des carcinomes rénaux. Ce projet permettra également de mieux caractériser le microenvironnement tumoral des MC dans différents modèles chez le rongeur.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de connaître l'efficacité d'un inhibiteur de HIF-2 en combinaison ou non à la radiothérapie externe pour le traitement des métastases cérébrales, ce qui pourrait être appliqué à long terme par la suite en clinique. Il apportera également des connaissances complémentaires sur le microenvironnement tumoral de ces tumeurs et permettra de trouver des cibles thérapeutiques supplémentaires potentielles contre ces métastases cérébrales.

Procédures

Implantation, réalisée sous anesthésie générale (isoflurane) : - Implantation intracérébrale : une seule fois par animal, durée de l’acte = 30 minutes maximum, 240 animaux (rats nudes) - Implantation intracardiaque : une seule fois par animal, durée de l’acte = 20 minutes maximum, 140 animaux (souris nudes) Administration per os d’une solution contrôle ou de l’inhibiteur : durée du geste = 1 minute maximum, 2 fois par jour par cycle de 21 jour ON/7jours OFF, 320 animaux (180 rats nudes et 140 souris nudes) Irradiation : Elles auront lieux sous anesthésie générale à l’isoflurane comme décrit précédemment. L’irradiation sera réalisée à une dose de 4 Gy pendant 3 jours. Le protocole complet d’irradiation dure 30 minutes par animal sur 120 rats nudes. La pose de cathéter sera réalisée sous anesthésie générale comme décrit précédemment et anesthésie locale au niveau de l’incision. La pose de cathéter dure maximum 10 minutes et sera réalisée 4 fois maximum sur chaque animal, 300 animaux sont concernés par cet acte.

Impact sur les animaux

Suivant l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de métastases cérébrales au bout d’une vingtaine de jours. Nous nous attendons également à une fatigue et une dégradation de l’état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, pelades sur la tête) induit par l'irradiation cérébrale dans la première semaine suivant la fin de l’irradiation. Nous avons adapté en conséquence le suivi des animaux, le raffinement des conditions expérimentales et le scoring afin d’anticiper et d’éviter l’exclusion des animaux par atteinte du point limite.

Devenir

Les animaux seront soit mis à mort à un temps défini ou à un volume tumorale défini, en fonction des résultats obtenus en procédure 1, 3 et 5, afin de réaliser des analyses post-mortem, soit ils seront gardés en vie pour une étude de survie jusqu’au point limite puis mis à morts.

Remplacement

Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, à savoir qu'en plus de la simple cellule cancéreuse, les tumeurs sont composées d’un microenvironnement tumoral. Celui-ci comprend une composante hypoxique, inflammatoire et vasculaire, toutes connues pour avoir un effet majeur sur la réponse aux traitements tels que la radiothérapie et la chimiothérapie. Ici, l'utilisation de modèles in vivo, permet de travailler sur des modèles de métastases cérébrales entièrement intégré à l'organisme. Ces modèles, à la différence des modèles in vitro, permettent l'intégration de ces différentes composantes, qui sont indispensables pour la compréhension des mécanismes de développement tumorale et de réponses aux différents traitements. Par conséquent, ce projet ne peut pas s’effectuer sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.

Réduction

L'utilisation de méthodes d’imagerie non invasive telle que l’imagerie IRM permet de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur sans nécessité de mettre à mort plusieurs animaux à chacun de ces temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle dans chaque point de l’étude et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Des simulations statistiques en ligne ont été réalisées à l’aide des données précédemment acquises au sein de l’équipe. . Concernant les modèles d’injection intracérébrale et intracardiaque, ces simulations ont mis en évidence un nombre minimum de 4 animaux par sous-groupe. Connaissant la littérature et l’expérience du laboratoire pour ces modèles, le nombre d’animaux doit être augmenté à 10 animaux maximum par sous-groupes. Le nombre maximum d’animaux sera de 10 mais il pourra cependant être revu à la baisse. Dans la mesure où ce nombre de 10 animaux par groupe n’est pas réalisable en même temps pour toutes les procédures, 2 cohortes de 5 animaux seront réalisées. Les résultats de la première cohorte nous permettront de réaliser des statistiques séquentielles et ainsi de décider du nombre d’animaux à inclure dans la deuxième cohorte pour obtenir des résultats significatifs et ainsi de réduire le nombre d’animaux au total.

Raffinement

La présence quotidienne de personnels formés et expérimentés permettra le suivi du bien-être des animaux et la mise en place des différentes procédures du projet. L’apparence physique, mais aussi le poids des animaux sera suivi, par ce même personnel 3 fois par semaine et permettra d’évaluer l’inconfort des animaux. Les animaux seront scorés 3 fois par semaine via différents item, lorsque l’un des items atteindra un score de 1, l’animal sera scoré quotidiennement et différentes mesures seront mises en place en fonction de l’item pour éviter à l’animal d’atteindre un score de 2. Le score établi en amont comme point d’arrêt des expériences sera lorsqu’un des items possède un score de 2, ou que l’ensemble des items donnera un score un score supérieur à la moyenne. Si malgré les mesures en place, le score limite est dépassé pendant plus de 48h, l’animal sera mis à mort. En raison de l'utilisation de modèles animaux immunodéprimés, les animaux seront hébergés en zone EOPS, ils seront placés dans des cages individuelles, ventilées et mis sur des portoirs ventilés. L’entrée dans l’animalerie se fait via un sas et un protocole de désinfection est mis en place. Le port d’une combinaison intégrale, avec masque chirurgical, charlotte et sur-chaussures est nécessaire pour accéder à l’animalerie. Ils seront hébergés en groupes sociaux permettant une stimulation sociale (2 animaux par cage pour les rats et 5 animaux par cage pour les souris). Ils bénéficieront également d’enrichissement dans la cage : roue d’activité, stimulation sensorielle par différents objets. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriées et par le choix de points limites cohérents.

Choix des espèces

Pour les deux espèces utilisées, l'utilisation de souches nude est nécessaire en tant qu’hôte pour des modèles de développement de tumeurs humaines afin d’éviter leur rejet. Le modèle de développement des MC par voie intracérébrale chez le rat est pertinent car il possède un cerveau dont la taille est supérieure à celui de la souris. Cela nous permet d’utiliser des appareils permettant une irradiation encéphalique ciblée, une imagerie de haute résolution mais aussi l’utilisation de la TEP, qui, à cause de sa résolution spatiale, nous contraint à imager des cerveaux plus volumineux comme celui du rat. Le modèle de développement de MC chez la souris, injectées par voie intracardiaque est le modèle se rapprochant le plus pour inclure les phases précoces d’apparition et développement des MC chez l'Homme. Ce modèle est bien décrit et validé dans la littérature ainsi que dans notre laboratoire. Les animaux seront âgés de 8 à 10 semaines en début de protocole. A ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l'évolution des animaux sur des temps longs. De plus, dans le but de réduire le nombre d'animaux, ce projet scientifique est une poursuite de travaux antérieurs réalisés dans l'équipe et cela nécessite que nous puissions compléter les expériences avec des animaux du même âge. En effet, toute modification de l'âge nécessiterait de nouvelles mises au point.

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une intervention chirurgicale sur la trachée leur injecte un composé qui déclenche une fibrose pulmonaire, précédée d'injections d'anticorps ou d'aspirine visant les plaquettes, avec un risque de gêne respiratoire. Les animaux sont tués au bout de quatorze jours pour des lavages des bronches et le prélèvement des poumons. Le porteur affirme que la culture cellulaire ne reproduit pas la complexité d'un "organisme entier" et qu'il est "nécessaire" d'utiliser des animaux vivants.

Objectifs

Les plaquettes sont des éléments du sang connus pour leurs rôles dans la coagulation et la cicatrisation. Ce rôle cicatriciel est accompli par liaison des plaquettes au collagène via des molécules de liaison appelées récepteurs. Or, la fibrose peut se définir par une accumulation pathologique excessive de fibres de collagène. Le but du projet est donc d'étudier l'implication des plaquettes dans le développement de la fibrose pulmonaire et pouvoir identifier les récepteurs favorisant ce développement afin d'en faire des cibles thérapeutiques potentielles.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de pouvoir fournir des éléments supplémentaires sur les mécanismes des plaquettes impliquées dans la fibrose pulmonaire, qui est une pathologie pour laquelle il n'existe encore aucun traitement curatif. Nous allons utiliser des souris dont certains récepteurs plaquettaires ont été modifiés. Nous pourrons comparer les résultats obtenus dans les différentes lignées de souris afin de pouvoir mettre en évidence l'implication d'un récepteur en particulier dans cette pathologie, ce qui permettra peut-être de trouver un traitement.

Procédures

Les animaux, sous anesthésie et analgésie subiront une légère intervention chirurgicale d'une durée totale de 15 minutes consistant en une petite incision au niveau de la trachée qui permet d'y injecter un composé chimique induisant une fibrose pulmonaire. Avant cette chirurgie, certains animaux auront une injection intraveineuse d'anticorps ciblant les plaquettes sanguines, qui sera répétée 2 ou 4 fois en fonction de l'anticorps, ou auront de l'aspirine dans l'eau de boisson en continu afin d'inactiver les plaquettes. Juste avant la chirurgie et à la fin de la procédure qui dure 14 jours , les animaux auront également un prélèvement sanguin sous anesthésie et analgésie.

Impact sur les animaux

Des projets menés au laboratoire sur le thème du développement de la fibrose pulmonaire nous indique que le bien être de l'animal n'est pas altéré, les souris sont alertes et dynamiques. Cependant, il est possible dans de rares cas que la souris ressente une légère gêne respiratoire. Les injections intraveineuses répétées et la suture (3 points) au niveau de la trachée peuvent également engendrer une gêne modérée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de laprocédure s'ils n'atteignent pas les points limites défini dans ce projet avant. Cela est nécessaire pour effectuer les prélèvements (sang, lavages broncho-alvéolaires et poumons) qui vont permettre d'analyser la fibrose pulmonaire et les marqueurs plaquettaires et inflammatoires .

Remplacement

Nous n'avons pas la possibilité de remplacer les animaux dans ce projet. En effet, même si la culture cellulaire nous permet, au sein de ce projet, d'étudier les molécules inflammatoires produites par les cellules pulmonaires impliquées dans la pathologie que nous étudions, elle ne permet pas de reproduire la complexité de fonctionnement d'un organisme entier en cas de développement d'une fibrose pulmonaire. Il n'existe pas de dispositif aujourd'hui permettant de mimer tous les paramètres conduisant à la maladie. Il est nécessaire d'utiliser des animaux vivants pour étudier le rôle des plaquettes dans cette pathologie.

Réduction

Nous ferons appel à des techniques permettant l'analyse de plusieurs paramètres sur un même prélèvement. En effet, nous réaliserons un lavage des bronches et des alvéoles puis nous récupèrerons les poumons afin de procéder à différents marquages plaquettaires ainsi qu'un dosage du collagène. Nous pourrons donc réaliser des analyses histologiques et des dosages sur le poumon d'une même souris afin de limiter le nombre de souris à utiliser. Le nombre d’animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grace aux données disponibles dans la littérature et au sein de notre laboratoire lors d'études précédentes. Des tests statistiques pour connaitre le nombre de souris minimum nécessaire ont aussi été réalisés.

Raffinement

Les animaux seront suivis tout au long du protocole et tout sera mis en oeuvre pour éviter toute souffrance (anesthésie, analgésie). La douleur post-opératoire est traitée préventivement grâce à l’administration d'un antidouleur. Les jours suivant la chirurgie, l'apparence des souris (cicatrisation de la plaie, posture de la souris, souris prostrée ou pas, déplacements ou pas, vitesse de respiration) et leur poids seront suivis quotidiennement et des points limites précoces ont été mis en place pour leur éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Notre modèle de fibrose pulmonaire chez la souris est le plus utilisé et le mieux décrit dans la littérature scientifique. En effet, il est utilisé depuis plusieurs décennies et permet de retrouver des caractéristiques proches de la pathologie humaine . Les animaux sont utilisés à l'âge adulte entre 8 et 12 semaines, la pathologie étant trop sévère chez des souris âgés. De plus, l'utilisations de souris jeunes permet de diminuer le risque de mortalité dû au développement de la fibrose.

36 macaques crabiers vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'ouverture de l'abdomen pour poser un implant de télémétrie, des injections d'un candidat vaccin et jusqu'à vingt-et-un prélèvements sanguins et écouvillonnages sur treize mois. À l'issue de cette phase ils ne sont pas tués mais transférés vivants vers un second établissement pour une épreuve infectieuse par les virus des fièvres hémorragiques. Le porteur affirme que le macaque est le "seul modèle pertinent" et qu'il est impossible de mener ce projet avec une autre espèce.

Objectifs

Cartains virus spécifiques à l’Amérique Latine sont à l’origine de fièvres hémorragiques comme les virus Guanarito, Machupo, Sabia, Chapare et Junin. Un vaccin existe seulement pour ce dernier alors que les autres virus sont aussi responsables d’émergences sporadiques avec un taux de mortalité élevé (jusqu’à 30%). Un nouveau vaccin a déjà prouvé son efficacité en protégeant des macaques cynomolgus contre les virus Machupo et Guanarito. Il reste à prouver son efficacité contre les autres virus cité ci-dessus pour valider la protection contre tous ces virus spécifiques à l’Amérique du Sud responsable de fièvres hémorragiques. L’objectif de ce projet est de démontrer le potentiel de protection de ce nouveau vaccin contre 4 autres virus non testés à ce jour et vise donc à : - Montrer la protection acquise grâce au vaccin contre tous ces virus spécifiques à l’Amérique du Sud provoquant des fièvres hémorragiques - Etudier le niveau de protection et les mécanismes de protection - Tester la protection à court et à long terme du vaccin Le projet utilisera 36 macaques cynomolgus et se déroulera chronogiquement dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Un tel vaccin pourrait permettre de proposer une protection contre toute cette famille de virus et ainsi être préparé pour lutter contre l’émergence possible de l’un de ces virus à fort potentiel épidémique. En effet, étant donné la faible fréquence des épidémies occasionnées par chacun de ces virus et le faible nombre de cas impliqués, il n’est pas raisonnable de développer des vaccins individuels contre chacun d’entre eux. La seule méthode rationnelle et pragmatique qui permet d’envisager un développement industriel d’un tel vaccin est de proposer un candidat qui permet de protéger contre l’ensemble des fièvres hémorragiques par cette famille de virus. De plus, le large spectre de ce vaccin pourrait conférer une protection contre d’éventuels autres virus émergents. Si l’efficacité de ce vaccin est prouvée contre les virus d’intérêt chez le macaque cynomolgus, les études réglementaires pour la mise sur le marché de ce candidat vaccin pourront être réalisées.

Procédures

Concernant la phase d’immunisation et de vérification de l’innocuité et de l’immunogénicité du candidat vaccin, les animaux seront soumis à une chirurgie d’implantation abdominale d’un dispositif permettant de mesurer la température corporelle en temps réel (environ 30 min), 1 à 2 injections intramusculaire du vaccin, puis 1 à 21 prélèvements sanguins et écouvillons nasaux et buccaux sur 1 à 13 mois (environ 15 min à chaque session de prélèvements).

Impact sur les animaux

Toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie générale. L’inocuité du vaccin utilisé ayant déjà été démontré dans ce modèle, il n’est attendu aucun effet secondaire du produit testé. La chirurgie d’implantation du dispositif de télémétrie (ouverture de l’abdomen) peut engendrer des douleurs opératoires prises en charge médicalement jusqu’à cicatrisation. Les anesthésies et prélèvements sanguins répétés peuvent générer de l’inconfort ainsi que des hématomes aux sites de prélèvements.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie à la fin du projet afin de continuer le projet dans l’EU 2/2 pour la phase de challenge infectieux. Ils sont examinés par un vétérinaire pour vérifier leur aptitude au transport avant d’être transférés.

Remplacement

Ce vaccin a déjà été testé et validé in vitro contre certains virus responsables de fièvres hémorragiques. Cependant, seul un test sur primates non-humains sera à même de prouver l’efficacité et l’innocuité de cette vaccination ciblant plusieurs virus. Ce projet est une phase pré-clinique en amont des études réglementaires de mise sur la marché de candidats médicaments.

Réduction

A un stade pré-clinique en amont de la phase réglementaire, l’utilisation de 3 animaux par groupe est suffisante pour répondre aux objectifs du projet. Pour la phase réglementaire, un nombre plus important d’animaux sera nécessaire mais cette phase ne sera pas lancée avant de s’assurer du caractère prometteur du vaccin en question, ceci afin de réduire le nombre d’animaux globaux. Le présent projet utilisera 12 groupes de 3 animaux chacun : 4 virus à tester x 2 conditions (vaccin vs contrôle) + 4 conditions temporelles.

Raffinement

- Hébergement : les animaux seront hébergés au minimum par paire. Pour une question de taille d’hébergement dans l’établissement 2/2 et d’optimisation de l’étude, les groupes seront composés en trio socialement compatibles. Un programme d’enrichissement spécifique à l’espèce et à l’âge des animaux utilisés est mis en place sur tout le site, et supervisé par le responsable du bien-être animal. Les enrichissements sont structurels (perchoirs, balançoire…), alimentaires (graines pour fourragement, fruits, friandises…) ou consistent en l’apport d’objets de manipulation changés régulièrement. - Suivi de la température corporelle : les animaux seront équipés d’un implant de télémétrie permettant de suivre en temps réel la température corporelle considérée comme donnée d’entrée essentielle renseignant sur l’état d’infection des animaux. Malgré une chirurgie pour la mise en place de l’implant, le fait d’équiper les animaux avec un tel dispositif représente un raffinement en tant que mesure non invasive et paramètre de surveillance dans le cadre des points limites. - Procédures : les animaux seront anesthésiés pour chaque intervention et la chirurgie d’implantation est réalisée sous couverture antalgique. Afin de limiter l’impact des prélèvements sanguins répétés, les sites de prélèvements seront alternés. En cas d’hématome, un autre site de prélèvement sera utilisé et de la pommade sera appliquée sur l’hématome. Une grille de points limite est mise en place pour détecter tout problème inattendu

Choix des espèces

Il n'existe pas de modèles rongeurs capables de reproduire les symptômes et les réponses immunitaires retrouvées chez l'Homme au cours des fièvres hémorragiques. Certaines espèces de cobayes et certaines souris génétiquement modifiées reproduisent en partie les symptômes et les réponses immunitaires ayant lieu chez l'Homme. Les macaques cynomolgus représentent le seul modèle pertinent : Ils développent un tableau clinique similaire à celui observé chez l’Homme ainsi que les mêmes issues. Il est impossible de réaliser ce projet en utilisant un autre modèle animal que les macaques cynomolgus. Ce projet ne nécessite pas d'exigences particulières concernant le stade de développement des animaux utilisés hormis le fait de former des groupes homogènes en âge et poids pour pouvoir analyser les résultats sans biais. Les animaux utilisés seront des juvéniles sevrés d’au moins 12 mois et de moins de 3 ans. En effet, en raison de la taille des hébergements de l’établissement 2/2 et afin de pouvoir garder les groupes en trio d’animaux socialement comptabibles, ces derniers doivent être âgés de moins de 3 ans.

1 500 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une société prestataire greffe des tumeurs sous la capsule du rein pour améliorer la prise tumorale, puis administre des traitements par de multiples voies, avec imagerie, irradiation possible et prélèvements répétés, certaines tumeurs pouvant provoquer des métastases pulmonaires et des difficultés respiratoires. Les animaux sont tués parce qu'ils portent des tumeurs. Le porteur propose ces modèles comme prestation commerciale pour la sélection de molécules anticancer, et présente les méthodes de remplacement comme "marginales".

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveaux composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Les modèles de ce projet sont des modèles orthotopiques rénaux ou des modèles dont la prise tumorale est faible dans des tissus communément utilisés (sous cutané par exemple) et dont la greffe en sub-capsulaire rénale améliore la prise tumorale, grâce à la forte vascularisation du rein. Pour certains modèles, les masses tumorales primaires greffées peuvent disséminer et créer des métastases. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme dans le cas des tumeurs de rein greffées par voie orthotopique, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tumorale tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

L’induction tumorale est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie avec administration d’un anesthésique local et d’un anti inflammatoire (

Impact sur les animaux

Il pourra être nécessaire de mettre en place un implant sous cutané de diffusion hormonale pour les tumeurs hormonodépendantes, lors d’une chirurgie stérile sous anesthésie avec analgésie. Cela pourra entrainer une douleur modérée et un stress léger sur 1-2 jours. La greffe tumorale en sub-capsulaire rénal (réalisée sous anesthésie générale et analgésie) pourra engendrer une douleur modérée sur 1-2j et un stress modéré. L’évolution de la tumeur pourra entraîner un développement de métastases pulmonaires causant des difficultés respiratoires, une perte de poids. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress de 1-2j. Les animaux pourront recevoir des traitements par voie IM (avec analgésie), ID (avec analgésie) , SC, IV (bolus), orale, IN, IT, IP et / ou seront exposés à des rayons ionisants à visée thérapeutique. Ces traitements pourront entrainer un stress léger et une douleur légère. Dans le cas des rayons ionisants, les animaux seront transportés dans leur cage d’origine vers la plateforme d’irradiation. Cela pourra entrainer un stress léger. Dans le cas de l’imagerie, les animaux seront transportés dans leur cage d’origine vers la plateforme d’imagerie et imagés sous anesthésie générale. Cela pourra entrainer un stress léger. Les prélèvements de sang peu invasifs (veine faciale, jugulaire, caudale) seront effectués sous anesthésie générale à l’Isoflurane. Cela pourra entrainer un stress léger. Dans certains cas, comme par exemple pour le prélèvement à la veine caudale ou à la veine saphène, le geste pourra être effectué sans anesthésie, uniquement sous contention. Cela pourra entrainer un stress modéré pendant le prélèvement. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation.

Devenir

Etant porteurs de tumeurs les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (volume tumoral et/ou poids). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et aux paramètres étudiés : en général un groupe non traité et/ou traité par le véhicule utilisé pour la molécule à évaluer, puis un groupe par schéma de traitement (différentes doses, voies, molécules etc). Au minimum, une étude comportera un groupe avec tumeur, non traité et/ou traité avec le véhicule, et un groupe avec tumeur traité avec le composé à tester. Toutefois, dans la mesure du possible, le maximum de composés seront testés au cours de la même étude afin de ne pas démultiplier les animaux contrôles ainsi que les animaux surnuméraires non randomisés. Compte tenu de taux de prise tumorale variable et afin de pouvoir former des groupes homogènes en poids et/ou en volume tumoral, il sera en général nécessaire d’inclure au moins 10% d’animaux non randomisés. Le nombre d’animaux par groupe (en général 6 à 15 animaux) est choisi sur la base des précédentes études réalisées dans nos laboratoires pour les modèles connus afin de sélectionner le nombre d’animaux minimum pour observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et volume tumoral). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal pour remplacer des analyses terminales en cours d’étude.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine. Un gel nutritif et de l’eau gélifiée seront placés au fond de toutes les cages dès qu’une perte de poids >15% sera observée sur certains animaux en étude. La greffe sub-capsulaire rénale, la pose d’implants hormonaux ou la thoracotomie seront réalisés sous anesthésie profonde avec injection pré-opératoire d’un opiacé et un alpha2 agoniste. Suite à la greffe du matériel tumoral en sub-capsulaire rénal ou suite à la pose d’un implant, les animaux recevront 2 injections d’opiacépendant 48, et éventuellement sur 24 heures supplémentaires si besoin. Les autres administrations et prélèvements seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (IV, prélèvement d’urine) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Les administrations douloureuses (IM, ID) seront réalisées avec analgésie préalable, et sous anesthésie si besoin. Les points limites concernant le poids sont adaptés en cas de tumeurs cachectiques. Dans les modèles connus pour induire des métastases pulmonaires, ou les modèles inconnus pouvant causer des métastases pulmonaires, une attention particulière sera portée à la respiration des animaux (posture, fréquence respiratoire). Les difficultés respiratoires marquées constitueront un point limite. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans la procédure. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites est observé, l’animal est mis en observation et un traitement est si possible mis en place. Par exemple, en cas de douleur constatée, le vétérinaire prescrira un traitement antalgique. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus suite à l’induction de pathologie cancéreuse et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux. En cas de toxicité sur l’animal, un arbre décisionnel validé par la SBEA sera utilisé. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie pour sortir l’animal de la procédure.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou induites) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation).

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une greffe de cellules cancéreuses sous la peau leur fait développer une tumeur, dont la croissance est suivie au pied à coulisse, puis elles reçoivent jusqu'à six injections d'un vaccin à ARN messager sous anesthésie. Les animaux sont tués pour prélever les tumeurs et les organes. Le porteur renvoie le bénéfice, une nouvelle stratégie anticancer chez l'humain, au conditionnel et au long terme, et affirme que la réponse immunitaire complexe rend l'étude in vitro impossible.

Objectifs

Chaque année, les cancers provoquent le décès de plusieurs dizaines de milliers de personnes. Jusqu'alors, les traitements classiques (chirurgie, chimiothérapie, radiothérapie) ciblent directement la tumeur, offrant de bonnes chances de survie aux malades présentant des cancers localisés. Cependant, ces traitements ne sont pas assez efficaces, pour les cancers généralisés. C’est pourquoi, les chercheurs se penchent vers une nouvelle approche : l’immunothérapie. Cette approche permet de traiter le cancer en utilisant le propre système immunitaire du patient. Les vaccins de type ARN messager (ARNm) sont devenus des outils prometteurs pour l'immunothérapie du cancer. Ce projet de recherche a pour but d'évaluer les capacités thérapeutiques d'un vaccin ARNm nouvelle génération dans un modèle de tumeur de côlon. L’idée principale est donc d’induire une réponse immunitaire grâce à l’injection intramusculaire de ce vaccin ARNm nouvelle génération, afin de lutter contre le développement de la tumeur chez la souris.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est de contribuer à valider une nouvelle stratégie thérapeutique anti-cancer en santé humaine. Ce projet permettra d’évaluer le bénéfice d'une approche par un vaccin à ARNm, sur le développement de tumeurs cancéreuses. Cet outil pourrait être applicable à différents types de cancer.

Procédures

Des cellules cancéreuses sont injectées sous la peau des souris. Pour effectuer ce geste, la souris est maintenue environ 15 sec, une seule injection de 0.1ml. A la suite de cette injection, la souris développera une tumeur sous-cutanée. La croissance tumorale est suivie par des mesures au pied à coulisse 3 fois par semaine, l’animal est maintenu immobile environ 25 sec. Les composés sont administrés par voie intra-musculaire sur animal anesthésié au maximum 6 anesthésies sur une période de 2 semaines. Le volume d'injection est de 0.05 ml dans le muscle de la cuisse, temps 1 min (anesthésie comprise).

Impact sur les animaux

La greffe de cellules par injection sous-cutanée est réalisée sur animal vigile. La tumeur pourrait entrainer dans de très rare cas une gêne à la locomotion. L'immunisation est réalisée par une injection intra-musculaire dans le muscle de la cuisse. Au maximum, 6 immunisations sur une période de 2 semaines. Une inflammation au site d'injection ou une réaction à l'injection est très peu probable.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs et des organes pour analyser les réponses immunitaires.

Remplacement

L'efficacité d'un vaccin contre le cancer dépend de sa capacité à induire une réponse immunitaire permettant de réduire le taux de croissance de la tumeur, avec un mécanisme d’action spécifique. C'est un phénomène biologique complexe faisant intervenir différents types de cellules immunitaires et une organisation particulière qui rend impossible son étude dans des tests in vitro.

Réduction

Une étude préliminaire pour vérifier la capacité des cellules à développer une tumeur est conduite sur un nombre restreint de souris. Si le résultat est concluant, l'étape 2 sera mise en oeuvre pour déterminer l'efficacité d'une vaccination préventive par un vaccin ARNm nouvelle génération sur le ralentissement de la croissance tumorale. Si et seulement si un ralentissement significatif de la croissance tumorale est constaté, alors l'étude d'un traitement curatif sera mise en oeuvre (les cellules cancéreuses sont injectées puis le traitement débute).

Raffinement

Les analyses de croissance des tumeurs seront non-invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requièrent pas d'injection d'anesthésiant ou d'antalgique. De l'aliment humidifié en fond de cage sera disposé si un animal présente une gêne de la mobilité due à la croissance de la tumeur (très rare). Les immunisations (injection intra-musculaire ) se feront sur animal anesthésié. L'injection intra-musculaire est la voie la plus utilisée pour les vaccins à ARNm, permettant la stimulation de la réponse immunitaire. Certains animaux pourront recevoir jusqu'à 6 immunisations maximum. Ce nombre pourra être réduit à 5 en fonction de la croissance tumorale. Ces injections intramusculaires pourront être administrées alternativement sur la patte droite et la patte gauche. Des points limites adaptés sont définis de manière objective pour chaque procédure, incluant des critères d'arrêt de l'expérience en cas de souffrance.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l’analyse de greffes de lignées cellulaires en oncologie. Les expérimentations sont réalisées sur des souris immunocompétentes car l'objectif de l'exprimentation est d'activer le système immunitaire en vue de réduire la croissance de la tumeur. Les souris seront âgées de 7 à 12 semaines. Le système immunitaire est décrit comme mature à partir de cet âge-là et non veillissant.

30 gymnophiones vont être utilisés, dont 10 tués à l'issue et 20 relâchés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces amphibiens capturés dans la nature subissent l'obstruction d'une narine à la pâte dentaire ou le blocage de leurs tentacules à la colle chirurgicale, encadré de deux tests de performance olfactive, ce que le porteur associe à un stress modéré. Dix individus sont tués pour des analyses génétiques et morphologiques, les autres étant remis sur leur lieu de capture. Le projet relève de la recherche fondamentale sur le rôle du tentacule dans la détection des odeurs, sans application décrite.

Objectifs

Les gymnophiones sont le troisième ordre des lissamphibiens (après les anoures et les urodèles). Leur corps longiforme ressemble à celui des vers de terre. La plupart des espèces sont fouisseuses et ne sortent à l’air libre que dans de très rares occasions. Quelques espèces sont totalement aquatiques. L’ensemble des espèces connue est carnivore ou charognard. Toutes les espèces ont une vision très réduite voir pour certaines, sont totalement aveugles. Du fait de leur vie souterraine et de leur aspect « non attrayant » les gymnophiones restent très peu étudiés. Tous les gymnophiones possèdent un tentacule, organe longiligne parfois mobile et rétractable, présent au niveau de la tête des individus. Cet organe est une innovation écologique qui n’a probablement aucun analogue parmi les vertébrés. De nombreuse spéculations ont été apporté quand au rôle potentiel de cet organe cependant cela n’a pas été testé expérimentalement. L'objectif de ce projet de recherche est de comprendre le rôle du tentacule chez les gymnophiones, et notamment de savoir s’il intervient dans la détection des odeurs, comme cela a été proposé.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche permettra une grande avancée dans notre compréhension du rôle du tentacule chez les gymnophiones ainsi que de l'importance de l´odorat chez ces espèces. En effet, grâce à ce projet nous pourrons savoir si ce "nouvel organe" intervient dans le processus de détection des odeurs et permet ainsi à ces animaux de détecter des proies dans le milieu aquatique et souterrain. Un premier article sera focalisé sur les résultats des expérimentations in-vivo. Au moins un deuxième article combinera les résultats expérimentaux avec les données morphologiques (3D ct-scan) issues des spécimens de muséums. Afin de pouvoir diffuser nos résultats à un public varié, nous réaliserons des communiqués de presse vulgarisés avec l´organisme de recherche ainsi que localement avec des associations.

Procédures

L’unique procédure (modérée) appliquée à tous les animaux se déroulera sur des animaux vigiles. Il se déroulera environ 1 mois entre la capture de l’animal et sa mise à mort ou sa remise en liberté. Ainsi, la procédure comprendra (1) la capture du gymnophione, (2) sont placement en élevage, (3) la réalisation d’un test de performance olfactive (durée du test: 25min), (4) le bouchage d’une narine (à l’aide de pâte pour dentiste) ou le blocage des tentacules (à l’aide de colle chirurgicale qui se détache au bout de trois jours), (5) la réalisation d’un test de performance olfactive, (6) la remise en liberté de l’animal ou sa mise à mort.

Impact sur les animaux

La capture et le transport de l'animal jusqu'à son terrarium d'élevage devraient générer un stress modéré. L'applicationde colle chirurgicale sur les tentacules des gymniophones devrait générer un état de stress modéré chez les animaux. La colle se détache de la peau au bout de 3 jours. L'obstruction d'une narine à l'aide de pâte pour dentiste devrait générer un léger stress chez l'animal jusqu' à la fin de l'expérimentation (inférieur à 30 minutes). Ces deux procédures suivent un protocole standardisé.

Devenir

Un maximum de 10 individus par espèce sera mis à mort afin de réaliser des analyses génétiques et morphologiques (e.g. immuno-histologie) qui ne peuvent être réalisées avec les spécimens de muséums.

Remplacement

Le principe de remplacement est ici déjà appliqué à ce projet puisque l'ensemble des études morphologiques sur l'appareil olfactif des gymnophiones sera réalisé à l'aide de spécimens de musées disponibles notamment au muséum d ́histoire naturelle de Paris et au muséum d'histoire naturelle de Stuttgart (Allemagne). Cependant, les tests de performances olfactives ne peuvent être réalisés autrement. De même, quelques individus devront être mis à mort pour des études morphologiques (immuno-histologie) et génétiques (réalisation de génomes) ne pouvant être réalisés avec des spécimens de musées.

Réduction

Le principe de réduction sera ici appliqué en utilisant une espèce principale (Typhlonectes compressicauda, 30 individus) comme référence, puis selon les résultats préliminaires obtenus nous ferons une nouvelle demande pour les autres espèces. Au vu de l'importante variabilité inter-individuelle des tests de performances, il ne sera pas possible de réduire davantage le nombre d'individus testés pour des raisons de puissance statistique. La limite principale de ce projet reste le nombre d´individus que nous parviendrons à capturer. Cependant, au vu de la quasi absence d'études traitant de manière expérimentale la question de l´olfaction et du tentacule des gymnophiones, tout résultat sera trés utile.

Raffinement

Les gymnophiones capturés seront rapidement logées à la plateforme expérimentale qui possède les infrastructures adaptées au bon maintien de ces espèces. Les espèces aquatiques seront logées dans des conteneurs de 80 à 100L avec un filtre interne adapté (maintien similaire à celui de nombreuses espèces de poissons). Les installations et les filtres auront été mis en route avant le démarrage de l’expérimentation afin que la colonisation bactérienne puisse convenablement se faire dans les masses poreuses des filtres. L’ensemble des installations sera placé en extérieur (= même température et humidité extérieur que leur milieu de vie) à l’abris de la pluie et de tout soleil direct. Une surveillance accrue sera portée aux animaux afin de savoir s'ils s'alimentent dès la première semaine de captivité: En absence de prise alimentaire correcte (traduisant d'un état de stress), les animaux seront relâchés sur le lieu de leur capture.

Choix des espèces

Afin de réaliser une étude comparative sur les capacités olfactives des gymnophiones, nous souhaitons d´abord tester Typhlonectes compressicauda (30 individus), puis selon les résultats préliminaires obtenus nous ferons une nouvelle demande pour les autres espèces. Juvéniles ou adultes selon ce que nous parvenons à capturer.

300 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie du crâne pour injecter un virus dans l'hippocampe, des contentions prolongées avec incisions de la queue et prélèvements sanguins répétés pour mesurer le stress, et un test de mémoire en labyrinthe aquatique où l'animal nage pour retrouver une plateforme immergée. Les cerveaux sont prélevés après mise à mort. Le porteur étudie le rôle des nouveaux neurones dans les troubles de mémoire liés à l'âge, et affirme qu'une approche in vitro ou in silico ne pourrait convenir.

Objectifs

Il est maintenant bien établi qu’il existe une formation de nouveaux neurones tout au long de la vie dans l’hippocampe des mammifères (y compris l’Homme), et que ce phénomène joue un rôle dans la mémoire. L’hippocampe est une structure clé impliquée dans les processus de mémoire. Les nouveaux neurones nés à l’âge adulte s’intègrent aux réseaux des neurones formés au cours du développement. Ces nouveaux neurones, appelés néo-neurones, sont cruciaux pour l’apprentissage et la mémoire. Au cours du vieillissement, certains individus présentent un déficit de mémoire beaucoup plus précocement que d’autres. Ces individus sont dits vulnérables alors que d’autres individus sont dits résilients car ils conservent une bonne mémoire au cours du vieillissement. La compréhension de ces différences inter-individuelles est une étape clé pour le développement de stratégies innovantes visant à prévenir les troubles de mémoire liés à l'âge. L’une des explications pourrait être la capacité des nouveaux neurones créés à l’âge adulte à s’intégrer totalement (individus résilients) ou partiellement (individus vulnérables) dans le réseau de neurones au cours des processus de mémoire. L’objectif de ce projet est de regarder si l’intégration totale ou partielle de ces nouveaux neurones est à l’origine de déficits mnésiques.

Bénéfices attendus

Le déclin cognitif associé au vieillissement, dont la maladie d'Alzheimer est la forme la plus extrême, représente un problème de santé majeur auquel la société occidentale est confrontée. Compte tenu de l'augmentation du nombre de personnes âgées, le fardeau économique de ces troubles est élevé ; il s'agit actuellement du problème de santé le plus coûteux dans l'Union européènne. Il est donc de plus en plus important de comprendre les changements cognitifs qui accompagnent le vieillissement aussi bien normal que pathologique. L’une des plaintes les plus courantes chez les personnes âgées est l'altération de la mémoire. Aussi, comprendre pourquoi certains individus conservent de bonnes capacités de mémoire, alors que d'autres présentent une perte de mémoire impactant leur vie quotidienne, est essentiel pour développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre les troubles cognitifs liés à l'âge. Notre stratégie de recherche consiste à tirer parti de ces différences interindividuelles pour identifier de nouveaux mécanismes de préservation du fonctionnement mnésique au fil du vieillissement. Ce projet nous permettra de mieux comprendre le rôle des nouveaux neurones dans la préservation des capacités de mémoire et d’apprentissage au cours du vieillissement. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux maladies neurodégénératives touchant la mémoire, comme la maladie d’Alzheimer, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

7 gestes techniques seront réalisés : *Composition corporelle : Après une acclimatation de 30 minutes dans la zone d’analyse, les animaux vigiles sont placés dans un tube de contention en plastique durant le temps de l’examen qui dure 3 min (180 rats). *Réactivité au stress : les animaux vigiles sont placés dans un tube de contention pendant 30 min pour induire un stress. Immédiatement après, le bout de la queue (~0.3cm) est incisé à l’aide d’une lame de scalpel, la queue est massée et un volume de sang d’~200μl est prélevé. L’opération est renouvelée 30, 60 et 120 minutes plus tard. Les animaux sont remis dans leur cage après le second prélèvement (à 30 min) et sont replacés dans les tubes (2x2min) pour les deux derniers prélèvements afin d'éviter qu’ils ne se retournent. 180 rats sont concernés à 3, 8, 12 et 18 mois. *Injections intra-hippocampiques : Geste réalisé sous anesthésie gazeuse durant toute la chirurgie (~40 min), consistant en une incision du scalp, une craniotomie pour l’injection de virus et la suture de la peau. La totalité des animaux est concernée. *Injections sous-cutanées : Elles sont réalisées sur animal vigile. Les animaux reçoivent au total 4 injections (contention + injection : 4x2min=8 min) sur 4 jours consécutifs (4x8min=32min) (180 rats). *Labyrinthe aquatique : les rats nagent dans une piscine et apprennent à localiser une plateforme immergée en s’aidant des indices disposés dans la pièce. Lors de l’habituation, ils passent 2x60s dans la piscine sans la plateforme. Lors de l’apprentissage, ils font chaque jour 4 essais consécutifs, pendant 6 jours. Pour chaque essai, les animaux passent 90s maximum dans l’eau (temps maximum passé dans l’eau au cours d’une session = 4 x 90s = 360s). Au fil des jours, les animaux apprennent et le temps passé dans l’eau diminue. Les groupes Apprentissage et Plateforme visible sont concernés (207 rats). *Injection d’anesthésie : Dans la partie I, les animaux sous anesthésie gazeuse sont euthanasiés (induction 5min + maintien 3-4min jusqu’à confirmation euthanasie) par injection intrapéritonéale d’une dose létale d’Exagon. (180 rats). Dans la partie II, les animaux vigiles reçoivent une injection intrapéritonéale d’un mélange d’analgésique/anesthésique (2min) (120 rats)*Perfusion intracardiaque : Après obtention d’une anesthésie profonde, une perfusion intracardiaque d’une solution enrichie en sucrose est réalisée (3min). Tous les animaux de la partie II sont concernés (120 rats).

Impact sur les animaux

Comme tout projet incluant des contentions, des injections et des gestes chirurgicaux (stéréotaxie, incision de la queue), Il est possible que des effets indésirables surviennent malgré notre vigilance et la mise en place de procédures adaptées. Tout d’abord concernant la contention dans l’appareil à Résonnance Magnétique Nucléaire (RMN), celle-ci sera la plus légère possible et de durée relativement courte (3min) de manière à induire le moins de stress possible. S’agissant de la contention afin d’étudier la réactivité de l’axe corticotrope en réponse à un stress, nous savons que cela sera forcément générateur de stress puisqu’il est nécessaire à l’étude. Ensuite, même si cela est relativement rare, il est possible que les sites d’injection (intra-péritonéale, sous-cutanée) ou les plaies chirurgicales (stéréotaxie, incision de la queue) s’infectent ou deviennent douloureux. De même dans les 2 jours suivants la chirurgie stéréotaxique, il est possible que les animaux perdent du poids (~10/20g pour un rat de 400g au moment de la chirurgie) ou présentent des signes de douleur. Enfin, au sujet de l’isolement certes les animaux seront hébergés en cage individuelle pendant 14 jours mais les nuisances liées à cela seront limitées. En effet l’hébergement ne se fait pas en portoir isolé ainsi les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore.

Devenir

A l’issue de ces expériences, les animaux seront mis à mort et les cerveaux récupérés en vue de leur analyse.

Remplacement

Dans ce projet, nous souhaitons étudier in vivo l’impact du vieillissement sur l’intégration des nouveaux neurones dans le cerveau, et ce en fonction du vieillissement des capacités de mémoire. Il s’agit d’une approche intégrée nécessitant les capacités cognitives de l’animal. Un tel travail ne pourrait être effectué par une approche in vitro, ou in sillico, et nous ne pouvons donc recourir à des techniques de remplacement.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrions rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (problèmes au cours de la chirurgie, variations anatomiques inter-individuelles, des expériences d’électrophysiologie), ainsi que des problèmes de santé inhérents au vieillissement (les animaux développant arthrites, tumeurs, cécités, cataractes étant exclus). Les effectifs ont été déterminés de façon à pouvoir effectuer des tests statistiques sur un nombre de rats suffisant pour obtenir des résultats cohérents. De plus, notre schéma expérimental prévoit la possibilité de réduire le nombre de lots d’animaux générés en fonction des premiers résultats obtenus, les effectifs pourront ainsi être revus à la baisse si les objectifs sont atteints plus précocement que prévu.

Raffinement

Hébergement : Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés par 2 en cages collectives (grande taille) enrichies (sizzle pad : lanières de papier kraft vierge) afin de réduire l’ennui et le stress. Les rats seront observés quotidiennement par le personnel zootechnique (motricité et réactivité, aspect général et aspect du pelage) et manipulés hebdomadairement jusqu’à leur sacrifice. Ils seront stabulés dans une animalerie avec une température maintenue constante, une hygrométrie contrôlée et cycle lumière-obscurité de 12h. L’accès à la nourriture et à l’eau sera illimité et un changement de litière sera effectué chaque semaine. Gestion de la douleur : La chirurgie se fait sous anesthésie et analgésie. Après chirurgie et durant 3 jours, les rats seront individuellement et quotidiennement manipulés afin de détecter tout problème post-opératoire (comportement, plaie, pesée). Si un animal présente des signes de douleur, nous lui administrerons un analgésique par voie sous-cutanée. En cas de signes d’infection de la plaie chirurgicale (rougeur, oedème, écoulement, saignement), nous la désinfecterons et administrerons un analgésique. Nous utilisons des grilles d’évaluation de la douleur permettant de scorer de façon objective le bien-être de l’animal. Ces grilles sont remplies par l’expérimentateur jusqu’au sacrifice des animaux. Plus le score est élevé plus le bien-être de l’animal est menacé et des points limite ont été définis. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en l’absence d’amélioration sous 48h, l’animal sera euthanasié par inhalation de gaz carbonique.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est le rat. La complexité du système nerveux des mammifères et des comportements qu’il sous-tend rend impossible leur reproduction in vitro ou chez des organismes d’une plus faible complexité neurophysiologique (invertébrés par exemple). Le rat est un modèle classiquement utilisé en neurosciences, notamment pour des études comportementales telles que celles réalisées auparavant au sein du laboratoire. De plus, la néo-neurogenèse hippocampique est un phénomène conservé au sein des mammifères, chez le rat, chez le singe et chez l’Homme. Enfin, cette étude vient compléter nos investigations menées depuis plus de 20 ans sur cette espèce, permettant ainsi de s’appuyer sur une solide expertise et une base de données importante (continuité et contrôle des résultats). Les rats seront réceptionnés à l’âge de 10 semaines afin d’être âgés de 12 semaines au moment des chirurgies stéréotaxiques. Ensuite, comme indiqué dans le paragraphe 3.3.2, les différentes études seront réalisées 5 à 15 mois après les injections intra-cérébrales. Nous utiliserons ainsi des animaux adultes à différents stades de vieillissement : 8 mois :1) adulte : 8 mois ; 2) milieu de vie : 12 mois ; 3) fin de vie : 18 mois. Ces âges ont été choisis car ils permettent une étude longitudinale du rôle des néo-neurones nés à l’âge adulte dans l’apparition de déficits mnésiques.