Procédures modérées

110 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent pendant trois semaines un régime contenant de la viande, puis passent jusqu'à 72 heures seuls en cage à métabolisme pour le recueil de leurs urines et fèces, une phase que le porteur reconnaît comme génératrice de stress. Les animaux sont tués pour prélever leur côlon et y mesurer l'oxydation et l'inflammation. Le porteur teste des antioxydants censés contrer l'effet cancérigène du fer héminique de la viande rouge, et affirme qu'aucune étude in vitro ne rend compte d'un "organisme entier".

Objectifs

Les études épidémiologiques réalisées chez l’Homme montrent une association entre la consommation importante de viande rouge et de charcuteries et le développement du cancer colorectal. Les études réalisées chez le rat ou la souris confirment cette association et montrent que le fer héminique (le rouge de la viande), contenu en grande quantité dans ces aliments pourrait être responsable de leur effet néfaste. Le fer héminique est un agent pro-oxydant qui provoque l’oxydation, dans la lumière intestinale, de composés du régime alimentaire, comme les lipides, aboutissant à la formation de composés toxiques. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet d'extraits végétaux antioxydants, ajoutés directement dans la viande (volet 2), ou bien indirectement dans la ration des bovins (volet 1), sur leur capacité à contrecarrer l’effet délétère du fer héminique de la viande. Les antioxydants ajoutés directement dans la viande (volet 2) seront choisis pour leur capacité antioxydante intrinsèque mais aussi pour leur capacité à moduler une voie importante impliquée dans le dialogue entre différents types cellulaires au niveau colique (études in vitro sur lignée cellulaire en amont de ce projet). Les antioxydants ajoutés dans la ration des bovins seront choisis pour répondre à un triple objectif : avoir non seulement un effet antioxydant, destiné à contrecarrer l’effet du fer héminique chez le consommateur de viande (volet 1), un effet de réduction d’émission de méthane lors de la digestion des bovins (étude sur digesteurs artificiels en amont de ce projet), mais aussi une absence de modification ou une amélioration de la qualité organoleptique (évaluation gustative par un jury de testeurs humains). La viande issue de ces bovins (8 bovins, 2/lots, 1 lot témoin/élevage, 3 lots/rations enrichie en antioxydant) sera testée en l’ajoutant à la ration des rats dans le volet 1. Dans ce projet, nous proposons deux volets où 110 rats Fisher F344 mâles seront nourris avec un régime contenant de la viande pendant 3 semaines. Leur urine et leur fèces seront récupérées lors d’un passage de 2 jours et demi en cage à métabolisme et leur côlon post mortem sera prélevé à la fin de l’expérimentation. Ces échantillons permettront des mesures des produits d’oxydation des lipides et de l’inflammation et permettront des analyses pour la compréhension mécanistique au niveau du tissu colique.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus dans chacun de ces 2 volets permettront l’identification de molécules prometteuses afin d’élaborer des stratégies de prévention nutritionnelles visant à limiter l’effet de la viande rouge sur le risque de cancer colorectal. La première stratégie (volet 1) constitue un levier de prévention nutritionnelle dès la production du bétail qui outre la limitation du risque de cancer colorectal devra provoquer une diminution des émissions de gaz à effet de serre par le bétail tout en maintenant une bonne qualité organoleptique des viandes. La seconde stratégie (volet 2) devra permettre de proposer un levier de prévention nutritionnelle du risque de cancer colorectal défini sur la base d’une étude mécanistique innovante.

Procédures

Tous les prélèvements in vivo, sur rat vigile, se feront sans contention de l'animal (animal posé sur le bras ou maintenu dans la main). Les fèces à l’anus seront prélevées 1 fois à J21 pour des analyses du microbiote. Une crotte sera prélevée par rat. Ce prélèvement dure environ 1 à 3 min par rat. Pour les prélèvements des fèces et urines de 24 h séparées, les rats seront hébergés en cage à métabolisme maximum 48h en continues. Les prélèvements sont en fait des recueils dans des réceptacles sous la cage à métabolisme. Nous recueillons toutes la production de 24h en féces et en urine séparément, 2 fois, au bout de 24 et 48h. Les rats n’ont pas besoin d’être manipulés. Les rats seront également manipulés sans contention pour les identifié par tatouage à l'oreille (pince Aramis spécifique aux rongeurs avec une aiguille type insuline, encre spécifique pour rongeurs, un point par rat).

Impact sur les animaux

Le projet comporte un passage en cage à métabolisme pendant au maximum 72h ce qui peut générer du stress pour les animaux qui sont hébergés seuls.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin que le côlon soit prélevé pour analyses.

Remplacement

Les études sur digesteurs artificiels mimant le rumen des bovins ont permis de choisir les extraits végétaux antioxydants qui réduiront le plus les émissions de méthane par les bovins (amont du volet 1). Des études in vitro sur des cellules permettront de choisir les antioxydants les plus à même d’avoir un effet intéressant sur le dialogue entre les différents types cellulaires du côlon (volet 2). Ces études en amont de ce projet permettent de limiter le nombre d’animaux en testant beaucoup de molécules in vitro puis de ne tester que les plus pertinentes chez l'animal. Cependant, aucune étude in vitro ne permet d'évaluer les répercussions de ces composés antioxydants, sur la physiologie et le métabolisme d'un organisme entier. L'utilisation d'animaux permet d’examiner des atteintes dans les voies intestinales et coliques (inflammation, atteinte tissulaire). Seule une approche in vivo permet de prendre en compte la complexité de l'épithélium colique sur la physiologie intestinale et le rôle des antioxydants dans l'inflammation et l'apparition de dommages à l'ADN dans l'épithélium ainsi que les modifications possibles du microbiote intestinal.

Réduction

Dans l'objectif de réduire au strict minimum l'utilisation d'animaux de laboratoire, le nombre d'animaux a été limité au maximum à 10 animaux par lot. Pour ces études nutritionnelles de 22 jours, notre expérience et nos publications montrent qu'un nombre minimal de 10 animaux par lot est nécessaire pour une modulation des marqueurs biologiques analysés. Par exemple, un nombre de 10 animaux par lot suffit à obtenir des résultats significatifs sur un marqueur urinaire tel que le DHN-MA (composé issue de la dégradation physiologique d'un acide gras lors de l'oxydation des lipides). Afin d'obtenir des résultats interprétables et statistiquement fiables, et d'être dans des conditions expérimentales équivalentes, nous prévoyons d'utiliser le même nombre d'animaux dans ce projet, soit 10 rats par lot

Raffinement

Les conditions d'expérimentation font l'objet d'une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis et surveillés quotidiennement ou deux fois par jour lorsqu’ils passeront 48h dans une cage à métabolisme (animal isolé). La surveillance sera réalisée à l'aide d'une fiche de suivi sanitaire où sont listées et scorées différentes observations spécifiques au rat F344 utilisé dans cette étude. Cela concerne globalement le comportement alimentaire/social et l’état général. Si l'état sanitaire des animaux se révèle modérément modifié (exemple de score 2 : poils non toilettés, prise de poids modéré, …), la surveillance sera augmentée en conséquence (action préétablie à suivre). Si les observations montrent un état général ou un comportement classé sévère (exemple de score 3 : baisse de la prise de poids ou comportement non curieux) ou très sévère (exemple de score 4 = point limite : baisse du poids à 15% par rapport à la dernière mesure), alors le vétérinaire référent sera sollicité pour vérifier que l’action préétablie suffise (score 3) ou l’animal sera euthanasié et autopsié (score 4).

Choix des espèces

Des travaux précédents ont montré que le rat Fisher F344 était un bon modèle pour étudier la modulation de la cancérogenèse colorectale associée à la consommation d’un régime riche en viande rouge. Les mâles sont privilégiés pour analyser le développement des pathologies à l’âge adulte afin d’éviter les effets hormonaux liés aux cycles de la femelle (observés sur l’inflammation et la cancérogenèse). Les études se feront sur des rats adultes. Ils seront âgés de 5 à 6 semaines à leur arrivée et leurs organes seront matures en particuliers ceux de l'appareil digestif. L'ensemble des études précédentes ont été menées sur des rats adultes du même âge dont la fonction digestive est totalement fonctionnelle. Afin de rester en accord avec les résultats précédents, il est important de rester au même stade de développement.

840 poulets vont être utilisés, dont 735 tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par voie orale par des coccidies, ce qui provoque diarrhée, plumes ébouriffées et lésions intestinales que le porteur cherche à obtenir à un niveau élevé sur son échelle. Les oiseaux sont tués pour observer les lésions du tube digestif, seuls 105 individus écartés pour leur poids étant réutilisés. Le projet vise à valider un parasite du poulet comme modèle de substitution au toxoplasme pour évaluer des traitements des aliments, le porteur indiquant qu'on ne peut se passer "totalement" de modèle animal.

Objectifs

Parmi les coccidies, Toxoplasma gondii est un parasite zoonotique dont une partie du cycle de développement se déroule chez le chat. Les oocystes (formes de résistance émises dans l'environnement avec les matières fécales, qui sont également les éléments infectieux) produits par le chat sont une source de contamination s'ils sont ingérés par un animal ou l'Homme (avec essentiellement le risque chez la femme enceinte de transmission au foetus, avec des conséquences graves sur le développement de ce dernier, notamment cérébral et oculaire). L'étude des mesures de maîtrise appliquées au cours de la production alimentaire pour éliminer et/ou inactiver ces oocystes est essentielle pour réduire le risque d'infection par voie alimentaire. Néanmoins, il est difficile d'obtenir ces oocystes en quantités suffisantes pour réaliser les tests d'inactivation et ces études sont également contraintes en raison de la pathogénicité de T. gondii pour l'Homme. Des modèles utilisant des oocystes d'autres parasites sont donc à l'étude dans ce projet pour pouvoir répondre à la problématique d'évaluation de l'exposition à T. gondii dans les aliments. Des oocystes d'Eimeria acervulina, parasite du poulet, ont été sélectionnés car ils ont des caractéristiques proches de celles des oocystes de T. gondii. Le but est de comparer les résultats préalablement obtenus avec Toxoplasma et différents produits de traitement avec ceux qui seront générés dans ces essais avec les oocystes d'Eimeria. Si les oocystes d'Eimeria répondent pareillement ou sont plus résistant à ces traitements, le modèle sera validé et nous pourrons envisager d'utiliser Eimeria comme modèle de Toxoplasma pour évaluer des traitements pertinents dans le domaine alimentaire et leur efficacité comme mesure de contrôle. Le projet vise à tester la viabilité des oocystes traités de différentes manières par rapport à des oocystes non traités, en infectant des poulets avec ces oocystes traités et non traités. Afin de valider les oocystes d'Eimeria comme modèle de T. gondii,les résultats seront comparés avec ceux obtenus avec les oocystes de T. gondii.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l'efficacité de différents traitements sur les oocystes d'Eimeria acervulina, dans le but de valider Eimeria comme modèle d'étude de l'inactivation des oocystes de Toxoplasma gondii afin d'évaluer par la suite les traitements applicables sur les aliments potentiellement souillés par des oocystes de T. gondii afin de réduire le risque d'infection chez l'Homme avec ce parasite. L'intérêt majeur d'un tel modèle est de pouvoir disposer d'oocystes plus facielemnt et en plus grande quantité qu'avec Toxoplasma pour l'évaluation des mesures de maîtrise et de pouvoir utiliser un parasite non pathogène pour l'Homme, ce qui est essentiel si on envisage des essais sur site indiustriel (impossibilité de tester une procédure de traitmeent sur site avec un pathogène). Parallèlement, il fournira des informations sur les procédés envisageables en élevage de volailles pour réduire la pression coccidienne environnementale afin de réduire le risque associé à Eimeria acervulina, la coccidie la plus fréquente et la plus dommageable économiquement chez le poulet.

Procédures

Inoculation d'oocystes de coccidies par voie orale à l'âge de 16 jours : une seule inoculation par animal, avec contention de l'animal par un agent et inoculation par un autre agent. La durée de l'intervention n'excède pas une minute, préhension et contention incluses.

Impact sur les animaux

Signes cliniques et lésions intestinales proportionnels à l'intensité de développement des coccidies. Les doses envisagées doivent permettre d'obtenir des signes cliniques modérés avec les oocystes non traités (diarrhée et plumes ébouriffées pendant trois à quatre jours) et des lésions intestinales d'intensité 3 sur une échelle comportant quatre niveaux d'intensité. Les lésions d'intensité 3 sont caractérisées par des points blancs de nécrose nombreux sur la muqueuse du duodénum et du jéjunum, causés par les cellules détruites par les parasites. Baisse de gain de poids et augmentation de l'indice de consommation pendant cette période.

Devenir

Tous les oiseaux utilisés dans les essais (720) sont mis à mort pour observation des lésions du tube digestif causées par le développement des coccidies. Lors de la mise en place des poussins d'un jour, 5 sujets sont mis à mort pour analyses vétérinaires, ce qui fait que 15 des 840 sujets sont mis à mort dès leur arrivée. Les 105 sujets ne servant pas aux essais, à cause de leurs poids extrêmes, pourront être réutilisés dans d'autres procédures.

Remplacement

Un des buts du projet est de renoncer à l'utilisation de chats et de souris pour produire des oocystes de T. gondii et pour tester l'efficacité des traitements sur ces oocystes respectivement. Le chat n'est pas un bon modèle animal car il n'est pas habitué à vivre en claustration, contrairement aux volailles. La coccidie Eimeria acervulina a des oocystes dont les caractéristiques morphologiques et de composition sont proches de celles des oocystes de T. gondii. Les tests in vitro de mesure de viabilité des oocystes sont très difficiles à maîtriser et ils ne permettent pas de suivre la totalité du développement des parasites, seuls les premiers stades étant possibles. Ils ne permettent donc pas de suivre des effets qui se manifesteraient sur des stades de développement tardifs dans le cycle parasitaire, comme l'étape de reproduction sexuée. On ne peut pas actuellement se passer totalement de modèle animal.

Réduction

Les effectifs ont été réduits à vingt sujets par lot, ce qui permet d'obtenir des différences significatives pour une baisse de gain de poids moyen d'environ 15 à 20% par rapport à des animaux non infectés (ou infectés avec une dose n'entraînant pas de baisse de gain de poids). Un lot de référence sera constitué de 20 sujets subdivisé en cinq sous-lots de quatre sujets recevant des doses croissantes d'oocystes non traités, afin d'établir une échelle indicative des indices lésionnels. L'utilisation de quatre sujets par dose au lieu de vingt est envisageable car les lésions sont dose-dépendantes et même si l'échelle sera moins fiable que les résultats des différents lots expérimentaux, il sera possible d'estimer un pourcentage de destruction ou d'inactivation des oocystes traités. Les tests statistiques pour comparer les gains de seront des analyses de variance suivis d’un test de Newman-Keuls, après vérification de la normalité des distributions des poids au sein de chaque lot (test de Shapiro-Wilk) et égalité des variances (test F ou Bartlett). En cas d’absence d’égalité des variances ou de distributions anormales, des tests non paramétriques (test de Kruskall-Wallis et tests de Wilcoxon) seront utilisés. Tous ces tests seront réalisés avec le logiciel R.

Raffinement

Les poulets seront hébergés dans des cages conformes aux conditions exigées en expérimentation animale, en groupes homogènes, avec un éclairage naturel complété par un éclairage artificiel en période de jours courts, avec maîtrise de la température et de la pression et suivi de l'hygrométrie. Des cordelettes seront suspendues dans les cages ainsi que des CD afin que les oiseaux puissent interagir avec. Le système d'abreuvement est constitué d'une rampe de pipettes qui peut être utilisé comme perchoir. Des points limites ont été définis dans la procédure expérimentale.

Choix des espèces

Le modèle sélectionné pour l'étude sur les oocystes est la coccidie Eimeria acervulina, qui est un parasite strictement inféodé à l'espèce Gallus gallus. Cette coccidie ne se développe que chez le poulet. Les oiseaux seront mis en place à l’âge d’un jour, après éclosion et récupération au couvoir, afin d’éviter toute contamination accidentelle avec des coccidies. Ils seront élevés en animalerie protégée jusqu’à l’âge de 15 jours. Ils seront inoculés le lendemain et le suivi d’infection sera effectué pendant 8 jours. Ces âges correspondent aux périodes d’apparition les plus fréquentes de cette coccidie dans les élevages, et la durée du cycle parasitaire n’excédant pas sept jours, il n’est pas nécessaire de les garder au-delà de ce délai pour pouvoir mesurer les effets des parasites sur les animaux.

1 600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent par gavage quotidien des composés perturbateurs de la thyroïde, et leur descendance subit un test auditif par clic mécanique dès l'âge de dix jours ainsi qu'un test de retournement sur le dos. Les animaux sont ensuite tués pour prélever sang, foie, thyroïde et cerveau. Le porteur présente le projet comme un effort de mise au point de méthodes sans animaux, tout en affirmant que des données in vivo chez le rat restent "nécessaires" pour valider ces méthodes.

Objectifs

Les études conduites chez le rat, en parallèle d’essais sur cultures d’hépatocytes et de thyrocytes, auront pour objectifs d’augmenter la connaissance des mécanismes d’action notamment quantitativement de perturbateurs thyroïdiens, directs ou médiés par le foie, sur le neurodéveloppement. Le projet sera utilisé pour étudier précisément le mode d’action de produits déjà étudiés et référencés, connus dans la littérature, agissant comme perturbateurs thyroïdiens. Plusieurs types d’études seront conduites dans le cadre de ce projet. Ces études seront conduites chez la femelle gestante pour étudier l’effet toxique des produits sur la femelle et sur sa descendance. Ainsi trois types de procédures expérimentales sont détaillées : 1. Etudes préliminaires pour la validation des choix des doses et de choix de dose de toxicité du développement chez le rongeur gestant et juvénile. 2. Etudes définitives pour l’étude du développement neuronal et de la fonction de la thyroïde chez les rats femelles et leurs descendances exposés à des composés ayant une action de perturbation thyroïdienne lorsqu’ils sont administrés à une dose élevée unique à la mère pendant la période de gestation et de lactation (validation qualitative des évènements clefs impliqués dans le mode d’action de ces perturbateurs). 3. Etudes d’évaluation du développement neuronal et de la fonction de la thyroïde chez les rats femelles et leurs descendances lorsque les composés sont administrés à des doses croissantes pendant la période de gestation et de lactation (validation quantitative des seuils de dérégulations des évènements clefs impliqués dans le mode d’action de ces perturbateurs).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples : tout d'abord une meilleure connaissance phénotypique et moléculaire d’une altération du neurodéveloppement médié par une baisse d’hormones thyroïdiennes. D'autre part, une démonstration d’un effet dose et d’un effet seuil. Enfin, le but ultime du projet : la création d'un modèle mathématique capable de prédire à partir des résultats d'essais in vitro notamment sur hépatocytes la quantité de baisse d'hormones thyroïdiennes chez le rat et d'en déduire des possibles effets sur le développement cérébral.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures incluant: Un gavage journalier sur femelles adultes vigiles, se faisant en 15 secondes environ, tout au long de l'étude à l'aide de sondes souples adaptées à la taille et à l'âge des animaux. Afin d’évaluer si le développement des petits est normal: les petits seront isolés quelques minutes et soumis à un son extérieur (clic mécanique) à partir de l’âge de 10 jours pour tester le développement du système auditif, chaque jour jusqu’à l’obtention d’une réponse positive au test. L’animal sera également déposé sur le dos pour évaluer sa capacité à se retourner.

Impact sur les animaux

Les effets toxiques attendus seront modérés car aux doses testées des 2 produits de référence connus, peu d’effets cliniques sont attendus. Les femelles gestantes sont hébergées individuellement pendant la gestation (14 jours), ce qui peut induire un stress léger. Afin d’évaluer si le développement est normal: pour le système auditif, les petits seront isolés quelques minutes et soumis à un son extérieur (clic mécanique) à partir de l’âge de 10 jours, chaque jour jusqu’à l’obtention d’une réponse positive au test. L’animal sera également déposé sur le dos pour évaluer sa capacité à se retourner. La nuisance engendrée est un stress léger car les tests sont peu invasifs et non douloureux. Les produits sont administrés une fois par jour par gavage aux mères (procédure inférieure à 15 sec). Cette procédure à l’aide de sonde souple n’est pas douloureuse mais peut induire un stress léger.

Devenir

Les animaux seront mis à morts afin de prélever du sang et des organes (foie, thyroïde et cerveau) qui seront utilisés pour de multiples analyses (dosage d'hormones, évaluation histopathologique et moléculaire notamment).

Remplacement

Le projet s’inscrit totalement dans le R de Remplacement de « la règle des 3 R » en recherche animale, inscrite dans la Directive 2010/63/UE. Ce projet a justement pour objectif la mise au point de méthodes dites alternatives ou nouvelles approches méthodologiques (NAMs) pour remplacer les études utilisant des animaux par des méthodes de culture cellulaire (ici hépatocytes et thyrocytes, 2D et 3D) combinées à des méthodes informatiques (in silico). Elles permettront de prédire l’effet sur les hormones thyroïdiennes en fonction de l’impact des produits sur les enzymes hépatiques mesurées in vitro et sans recourir à l’animal. Pour valider ces nouvelles méthodes et cette extrapolation entre méthodes in vitro et méthodes in vivo, des données sont nécessaires in vitro mais aussi in vivo chez le rat que concernent cette demande d’autorisation de projet.

Réduction

Le nombre d’animaux est le nombre minimum nécessaire et suffisant pour répondre de manière robuste aux questions posées. Les études seront conduites de manière séquentielle avec un nombre d’animaux croissants. Ainsi la première étude se fait avec un nombre d’animaux par groupe réduit (4) pour valider le choix des doses et les techniques moléculaires innovantes. Par la suite le nombre d’animaux est augmenté pour avoir une puissance statistique suffisante concernant les paramètres étudiés. Ce projet participe à l'effort de mise en place et de validation de méthodes alternatives pour réduire globalement le nombre d’animaux utilisés en Toxicologie. En effet, l’objectif est de promouvoir les produits au profil le plus favorable et le moins risqué dans les phases avancés (celles qui nécessitent toujours l’utilisation d’animaux d’un point de vue réglementaire), en testant d’abord les produits à travers ces nouvelles méthodes alternatives. De ce fait, un nombre plus restreint de produits resteront à être testés chez l’animal et avec de plus grandes chances de donner des résultats favorables, ce qui réduirait de facto le nombre d’études nécessaires et donc d’animaux.

Raffinement

Les paramètres étudiés sont beaucoup plus nombreux que ceux classiquement testés dans les lignes directrices de l’OCDE, notamment en incluant des biomarqueurs moléculaires au niveau cérébral, comme des spatial OMICs, ce qui permet d’obtenir un plus grand nombre d’informations pour le projet. Ces études sont réalisées avec des produits de référence connus à des doses choisies pour perturber l'homéostasie de l'axe hypothalamo- thyroïdien tout en minimisant les nuisances sur le bien-être animal. Dans ces études les animaux sont hébergés dans des cages appropriées avec un enrichissement du milieu adapté à leur âge et à leur espèce. Les animaux sont alimentés par une nourriture contrôlée et adaptée, les certificats concernant cette nourriture sont archivés par le laboratoire. Les animaux sont observés quotidiennement y compris les week-ends. Ils sont pesés à intervalle régulier pour vérifier leur croissance ou leur bien-être. Toutes ces mesures sont réalisées par des techniciens confirmés qui suivent des périodes régulières de maintien des compétences. Des points limites ont été identifiés qui peuvent nécessiter la mise à mort précoce de l’animal.

Choix des espèces

Le rat est le modèle de référence en toxicologie. On s'appuie sur des données scientifiques publiées chez le rat. Les mécanismes de développement du système neurologique du rongeur sont souvent similaires à ceux de l’homme et, ainsi, les données générées chez le rongeur peuvent être extrapolées à l’homme. Ces études seront conduites chez la femelle gestante et allaitante et sa descendance. En effet, la fenêtre d’exposition encadrant la naissance jusqu’à la fin de la lactation a été montrée comme étant la plus sensible aux traitements pouvant impacter le neurodéveloppement.

Une partie des 134 souris de ce projet porte la mutation d'un gène que l'équipe soupçonne d'être en cause dans le syndrome de Hermansky-Pudlak, une maladie rare qui associe albinisme et tendance aux hémorragies, et risque de saigner longtemps à chaque prise de sang. Mutantes et témoins vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour deux prises de sang sans anesthésie, à 6 et 8 semaines, un groupe étant aussi étudié à 7 mois sans que les actes prévus à cet âge soient décrits. Le porteur juge la souris "indispensable et nécessaire" pour étudier ce gène "à l'échelle de l'organisme entier". Toutes doivent ensuite être transférées dans le laboratoire d'un collaborateur pour compléter l'étude immunologique, sans que le porteur précise ce qu'elles y subiront ni leur sort final.

Objectifs

L’étude des maladies rares d’origine génétique permet aujourd’hui de décrire les gènes, des protéines et des mécanismes biologiques fondamentaux pour la compréhension du vivant et celle de maladie plus fréquente. Nous avons identifié chez des patients atteints du syndrome de Hermansky-Pudlak (SHP) qui est une maladie multisystémique caractérisé par un albinisme oculo-cutané et un terrain hémorragique. Une mutation d'un gène qui pourrait être à l’origine du déficit immunitaire global ainsi que d’anomalies sanguines principalement thrombopénie (déficit des plaquettes) avec des dysfonctionnements de la fonction plaquettaire. Notre projet et l’étude de la modification de ce gène impliqué dans la pathologie complexe observée chez les patients, grâce au modèle de souris portant la mutation de notre gène d'intêret. Plus précisément, nous souhaiterions étudier les paramètres hématologiques et particulièrement les plaquettes et leur physiologie. Pour cela des prélèvements de sang seront réalisés chez des souris contrôles et mutantes, afin d’être analysés. Au total 134 souris seront nécessaires pour valider notre question biologique et obtenir des résultats statistiquement valides.

Bénéfices attendus

L'objectif de notre projet et l'étude de systeme immunitaire et la fonction plaquettaire dans le cadre d'une maladie rare le syndrome de Hermansky-Pudlak , nous souhaiterons comprendre les mecanismes biologiques qui découlent de la mutation de notre gène et son effet sur la thrombopenie (deficite plaquettaire)

Procédures

Les souris seront soumises à 2 prelevements sanguins (vigiles) à l'age de 6 et 8 semaines. Nous avons également un groupe de 7 mois.

Impact sur les animaux

Comme la mutation chez l’homme induit une dysfonction de la fonction plaquettaire et de la thrombopénie, un risque de saignement prolongé au moment de la prise de sang pourrait être observé sur notre modèle de souris mutantes.

Devenir

Tous les animaux seront transferés dans le laboratoire de notre collaborateur pour completer l'étude immunologique.

Remplacement

Une partie importante de l’étude de caractérisation du gène ne nécessite pas l’utilisation d’animaux vivants et est étudié in vitro sur des lignées cellulaires modifiées génétiquement. Cependant, le modèle animal (souris) reste indispensable et nécessaire pour identifier l’effet de la modification du gène à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multisystemique ; le système in vitro ne pouvant apporter un même niveau d’information.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en gardant s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Etant donné le manque de donnée concernant cette nouvelle lignée, l’analyse de puissance sera revue en fonction des données générées. En effet, en fonction du phénotype observé, on pourrait être amené à réduire le nombre d'animaux tout en cherchant à atteindre une puissance statistique de 80%. Un maximum de 134 souris sera nécessaire. Le test statistique utilisés sera student-test (comparaison des mutants Vs contrôles). Comme on s'attend à avoir le même phénotype chez les mâles et les femelles, nous utiliserons pour chaque série l'un des 2 sexes (selon la production), ce qui éviterait de dédoubler les effectifs.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation et son euthanasie. Les animaux seront observés toutes les semaines avec une grille de suivi du bien-être, en plus du suivi quotidien habituel. Afin d’éviter toute perte de sang excessive (hémorragie), le site de ponction sera comprimé avec un hémostatique local afin d’atteindre l’hémostase.

Choix des espèces

Le modèle souris est très pertinent et est necessaire pour étudier de la modification de notre gène d'intêret à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multisystemique ; de plus, le modèle de souris est très étudié et largement utlisé pour analyser la fonction plaquettaire. Les animaux seront étudiées à l'âge de 6 et 8 semaines à fin d'étudier les 2 stades avant l'age adulte et à l'age adulte. Nous avons également un groupe de souirs de 7 mois afin comparer l'effet de l’âge dans ce groupe.

Un dispositif de contention fixé sur le crâne lors d'une chirurgie d'une heure au plus permet ensuite de faire tourner 110 rates pour enregistrer leurs mouvements oculaires. 242 rates Long Evans vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 140 enfermées 6 heures par jour, cinq jours de suite, pendant une ou quatre semaines, dans des enceintes où elles respirent du styrène ou des isomères du xylène, et 80 témoins à l'air filtré, puis toutes tuées par perfusion intracardiaque pour l'histologie de l'oreille interne. Aux concentrations élevées, le porteur prévoit un effet dépresseur sur le système nerveux central et des effets narcotiques, qui ne devraient pas persister plus d'une heure après la sortie des enceintes. L'étude doit confirmer une toxicité pour l'équilibre suggérée in vitro sur des cultures d'organes issus de rats nouveau-nés. Le porteur annonce aussi deux tests comportementaux de l'équilibre, passés trois fois par 110 rates, sans les nommer.

Objectifs

Cette étude qui consiste à comparer la toxicité de solvants aromatiques sur les récepteurs de l’audition et de l’équilibre tous deux localisés au niveau de l’oreille interne apportera pour la première fois des données sur la dangerosité éventuelle des solvants sur l’équilibre au niveau périphérique. Par ailleurs, cette étude permettra de valider des données obtenues in vitro suggérant un potentiel effet toxique de certains solvants aromatiques sur le récepteur de l’équilibre et permettra de proposer ce test comme test de criblage.Cette étude qui consiste à comparer la toxicité de solvants aromatiques sur les récepteurs de l’audition et de l’équilibre tous deux localisés au niveau de l’oreille interne apportera pour la première fois des données sur la dangerosité éventuelle des solvants sur l’équilibre au niveau périphérique. Par ailleurs, cette étude permettra de valider des données obtenues in vitro suggérant un potentiel effet toxique de certains solvants aromatiques sur le récepteur de l’équilibre et permettra de proposer ce test comme test de criblage.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de valider des résultats obtenus précédemment avec un test in vitro obtenu à partir de cultures d’organes récepteurs de l’équilibre de rats nouveau-nés et exposées aux mêmes solvants. Si les résultats in vivo confirment les résultats obtenus in vitro alors ce test pourra être proposé comme test de criblage afin d’identifier les produits industriels rencontrés par les salariés lors d’exposition professionnelles et susceptibles perturber l’équilibre. Par ailleurs, cette étude permettra de comparer la toxicité de solvants aromatiques sur les récepteurs de l’audition et de l’équilibre tous deux situés dans l’oreille interne et apportera des informations nouvelles sur la toxicité potentielle des solvants aromatiques sur le récepteur de l’équilibre, sujet non traité dans la littérature jusqu’alors.

Procédures

Chirurgie crânienne: 110 rates sont équipées d’un dispositif de contention sur le crâne, pour enregistrer le mouvement oculaire (nystagmus post-rotatoire) après stimulation du système vestibulaire par mise en rotation de l’animal. Cette intervention chirurgicale est réalisée sous anesthésie gazeuse et n’excède pas une heure par animal. Elle est réalisée 1 seule fois. Mesures du nystagmus post-rotatoire : Ces mesures sont effectuées sur les 110 rates ayant subi une chirurgie. Elles sont réalisées avant exposition par inhalation au solvant ou à l’air filtré (T0), après une semaine d’exposition (T1) et après 4 semaines de récupération (T2). Ces mesures nécessitent une mise en contention. Cette procédure ne dure pas plus de à 10 minutes par rate. Tests comportementaux : A T0, T1 et T2, 110 rates sont soumises à 2 tests comportementaux permettant une mesure de la fonction vestibulaire. Moins de 10 minutes sont requises pour effectuer ces tests. Une fois effectués, les rates sont soumises aux mesures des produits de distorsion acoustique. Mesure des produits de distorsion acoustique : 110 rates sont soumises à une anesthésie médicamenteuse légère pour enregistrer les produits de distorsion acoustique après avoir placé une sonde au niveau de l’oreille. Ces mesures sont effectuées à T0, T1 et T2. Quinze minutes par rate sont nécessaires. Exposition par inhalation au solvant ou à l’air filtré dans des enceintes d’inhalation : Les rates sont disposées dans des enceintes 6 heures/jour pendant 5 jours consécutifs durant 1 semaine voire 4 semaines (4 x 5 jours) et sont exposées soit aux solvants (140 rates) soit à de l’air filtré (80 rates). Prélèvement sanguin à la veine caudale : 56 rates sont soumises à un prélèvement sanguin à la veine caudale sous anesthésie gazeuse. Le prélèvement est réalisé 1 seule fois à l’issue de l’exposition au solvant ou à l’air filtré. La procédure ne dure pas plus de 5 minutes par animal. Au terme des expérimentations, les animaux sont mis à mort par perfusion intracardiaque pour réaliser l’histologie de l’oreille interne.

Impact sur les animaux

Certains animaux seront exposés à des concentrations élevées de solvant 6 heures/jour, 5 jours par semaine durant 4 semaines. Ces concentrations élevées pourront avoir un effet dépresseur sur le système nerveux central et des troubles sensori-moteurs comme des effets narcotiques pourront alors être observés. Néanmoins, ces troubles ne devraient pas persister dans l’heure qui suit la sortie des chambres d’inhalation.

Devenir

Tous les animaux de la procédure 1 (Evaluation de la fonction vestibulaire par la mesure du nystagmus post-rotatoire chez des rates exposées par voie inhalatoire aux solvants) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements et l’histologie des tissus biologiques. Tous les animaux de la procédure 2 (Evaluations des fonctions vestibulaire et auditive des rates exposées par voie inhalatoire aux solvants par l’utilisation de tests comportementaux et par la mesure des produits de distorsions acoustique) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements et l’histologie des tissus biologiques.

Remplacement

La toxicité de certains solvants industriels sur la cochlée a été démontrée par de nombreuses études expérimentales (rat, cobaye) mais aussi par des études épidémiologiques en entreprise. A l’inverse, les effets de ces substances sur le vestibule, qui partage de nombreuses similitudes avec la cochlée, n’ont jamais été étudiés in vivo. Il est à noter, cependant, qu'un modèle de culture d’explants vestibulaires, développé au laboratoire, a suggéré une toxicité de ces solvants sur le vestibule. Ces données in vitro doivent être confirmées par une étude in vivo avant d’alerter les services de santé au travail de la dangerosité de ces subtances sur cet organe. L’étude in vivo se propose d’exposer des rates au styrène et aux différents isomères du xylène (ortho, méta et para) par voie inhalatoire 6 heures par jour, 5 jours par semaine pendant 5 jours (ou 4 semaines à raison de 5 jours par semaine). L’évaluation de la toxicité se fera par le biais de mesures fonctionnelles, comportementales et histologiques qui devront permettre une comparaison fiable et objective des effets cochléotoxiques et vestibulotoxiques. Ces techniques auront été préalablement validées et calibrées à l’aide d’une molécule, l’iminodipropionitrile, reconnue être à la fois cochléo-et vestibulotoxique. Cette pré-étude a fait l’objet d’une demande d’autorisation de projet. Les méthodes utilisées dans le cadre de cette étude évaluent les fonctionnements physiologiques de ces deux systèmes sensoriels ainsi que diverses réponses réflexes. Ces méthodes ne peuvent être testées que sur des organismes vivants. Ces tests sont des mesures de produits de distorsion acoustique pour l'audition et la mesure du nystagmus post-rotatoire ainsi que des tests comportementaux pour l'équilibre. Des analyses histologiques seront également réalisées. D’autre part, pour évaluer la toxicité de ces agents chimiques, il est nécessaire que ces derniers soient métabolisés par des organismes vivants.

Réduction

La démarche consiste à tester dans une première phase expérimentale (phase 1) les effets vestibulaires d’une forte concentration de styrène pendant une exposition courte (5 jours). Si celle-ci ne génère pas d’effet vestibulaire, une nouvelle exposition à la même concentration sera réalisée pendant 4 semaines (phase 2). Si aucune vestibulotoxicité n’est observée, la recherche de seuil d’effet (phase 3) ne sera bien évidemment pas réalisée, et les expérimentations seront stoppées. Dans le cas contraire, la phase expérimentale 3 sera menée en exposant les animaux à des concentrations de styrène plus faibles (la durée dépendra des résultats des phases 1 et 2). Enfin, la phase 4 s’attachera à évaluer la vestibulotoxicité de chacun des isomères du xylène (la durée de l’exposition dépendra une nouvelle fois des résultats des phases 1 et 2). Le dispositif crânien des rates destinées aux mesures du nystagmus-post rotatoire ne permettant pas les mesures des produits de distorsion acoustique, des lots de rates dédiés spécifiquement à ces tests seront prévus. Ainsi pour chaque solvant et concentration, 2 groupes expérimentaux seront prévus, l’un pour la mesure du nystagmus-post rotatoire et l’autre pour les mesures de comportement suivies des mesures des produits de distorsion acoustique (idem pour les contrôles). Lors de chaque campagne, un maximum de conditions expérimentales seront testées simultanément afin de limiter le nombre de groupes contrôles associés. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par un calcul de puissance (logiciel G-Power). Le résultat de ce calcul est de 10 animaux par groupe. 22 animaux surnuméraires (soit 10% de l’effectif prévu) seront nécessaires en cas de mortalités (anesthésie, perte de casques...). L’étude nécessitera au maximum 242 rates (dont les 22 surnuméraires). Ce nombre pourrait être réduit si les résultats des phases 1 et 2 sont négatifs.

Raffinement

Dès leur arrivée à l’animalerie, les rates seront placées dans les conditions standard d’hébergement pour cette espèce (température, hygrométrie, surface des cages). Par ailleurs, les rates, animaux nocturnes, seront placées en cycle inversé jour-nuit de 12h / 12 h afin de respecter leur rythme. Elles seront stabulées à 2 ou 3 par cage. Seuls les animaux ayant subi une intervention chirurgicale, afin de les équiper d’un dispositif de contention, seront hébergés seuls pendant une semaine afin d’assurer une bonne cicatrisation. L’utilisation de cages ouvertes et transparentes leur permettra de créer des liens sociaux et des contacts visuels, olfactifs et auditifs nécessaires à leur bien-être. La litière utilisée sera constituée de carrés de cellulose et leur environnement sera enrichi par des tunnels en carton ou du « sizzle nest » pour constituer des nids. Selon les procédures du projet, les animaux seront habitués à leur nouvel environnement et à être manipulés. Les animaux soumis à une intervention chirurgicale recevront une médication adaptée à savoir une analgésie pré-opératoire avant de réaliser l’anesthésie et des anti-inflammatoires seront administrés en post-opératoire. Après l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés et pesés quotidiennement afin de détecter des signes de souffrance ou une perte de poids trop importante nécessitant une prise de décision immédiate. Pendant les phases d’exposition par inhalation aux solvants, les rates seront également surveillées toutes les deux heures afin de déceler d’éventuels signes cliniques traduisant un mal-être de l’animal qui nécessiterait d’isoler immédiatement l’animal. Des fiches de suivi seront renseignés à cet effet.

Choix des espèces

Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études de toxicologie et, est un modèle sélectionné dans les lignes directrices de l’OCDE portant sur les essais in vivo de toxicité des produits chimiques. Par ailleurs, le métabolisme des solvants par le rat est proche de celui de l'Homme. De plus, les expérimentations doivent être menées sur des souches de rat pigmentées comme les rats Long Evans puisque la mélanine est présente au niveau de l'oreille interne, comme chez l'Homme. Les souches albinos sont dépourvues de mélanine ce qui les rend plus sensibles aux solvants. Par ailleurs, la plupart des études expérimentales portant sur les systèmes sensoriels de l'audition et de l'équilibre ainsi que les études comportementales ont été menées avec cette souche de rat ce qui facilitera la comparaison avec nos résultats obtenus au sein du laboratoire. Les rates seront utilisées, pour les mesures fonctionnelles, à l'âge adulte entre 16 et 18 semaines car l'oreille interne ainsi que les cytochromes intervenant dans le métabolisme des toxiques doivent être matures.

36 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs d'une forme de myopathie de Duchenne, ils reçoivent des injections intramusculaires sous anesthésie et une mesure de force musculaire, avant d'être tués pour analyses histologiques. Le porteur décrit une dystrophie spontanée avec perte de masse et comportement de "freezing", et présente le rat comme un modèle plus fidèle que la souris. Il situe à long terme l'usage de la protéine testée chez les enfants atteints, en complément de la thérapie génique.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Le pronostic de la DMD est très sombre et les jeunes patients meurent prématurément d'insuffisance cardiorespiratoire, en raison de l'absence de la protéine dystrophine dans les muscles striés. Cette maladie entraîne une dégénérescence de l’ensemble des muscles (squelettique, cardiaque ou lisse). Il n’existe pas à ce jour de traitement pour la DMD mais des stratégies de thérapie génique prometteuses sont en cours d’évaluation dans des essais cliniques. Néanmoins, nous savons aujourd’hui que la restauration de la dystrophine devra s’accompagner d’une stratégie permettant un meilleur maintien de l’intégrité musculaire qui favoriserait la croissance musculaire. En effet, chez les patients DMD, les fibres dépourvues de dystrophine se cassent et dégénèrent. La force musculaire diminue et le tissu musculaire laisse la place aux tissus conjonctif et graisseux. Les stratégies thérapeutiques utilisant les vecteurs viraux sont confrontées à des limites comme leur disparition consécutive aux cycles répétés de nécrose-régénération des fibres musculaires dystrophiques. La protéine-médicament testée dans ce projet a été décrite comme étant un acteur clé du maintien de la masse musculaire en inhibant la dégradation et en stimulant la synthèse protéique. Nous avons donc comme objectif d’évaluer le supposé bénéfice de sa supplémentation dans le muscle dystrophique de rats modèles de la DMD, avec pour objectif de renforcer le dossier préclinique préparatoire au montage d’un essai clinique chez les enfants attteints de DMD.

Bénéfices attendus

Nos laboratoires cherchent à identifier des traitements combinés pour optimiser la restauration fonctionnelle des muscles dystrophiques. La protéine testée joue un rôle dans le maintien de la masse musculaire en maintenant plus longtemps actif le processus de régénération des fibres musculaires. A court terme, nous attendons chez les rats DMD traités un bénéfice avec une amélioration du phénotype histologique et fonctionnel du muscle dystrophique traité. A moyen terme, nous envisageons en cas de succès de combiner l’utilisation de cette protéine avec une restauration de dystrophine, induite par un vecteur viral codant la microdystrophine, une forme raccourcie de la dystrophine utilisée aujourd’hui dans des essais cliniques. A long terme, nous projetons d’utiliser cette protéine comme traitement utilisable chez le patient DMD en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.

Procédures

Les animaux anesthésiés seront injectés par voie intramusculaire une fois dans le muscle de la patte gauche puis une fois dans celui de la patte droite. Cette intervention est rapide (moins de 10 minutes). La durée d'un enregistrement de la force musculaire est de 90 minutes, anesthésie comprise (une injection sous cutanée avec une aiguille hypodermique très fine). Il n'y a pas de chirurgie prévue. Les animaux seront également prélevés une fois pour récupérer un millilitre de sang, en vue de quantifier des biomarqueurs de la maladie. Ce prélèvement sera réalisé pendant l’anesthésie de la mesure de force, le prélèvement lui-même dure moins de 30 secondes). La séquence d'enregistrement de la force musculaire dure au total 1 heure (jusqu'au réveil).

Impact sur les animaux

Les rats DMD développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle. On assiste par ailleurs à un comportement de "freezing" chez les animaux, caractérisé par une absence de mouvements chez les animaux qui semblent se reposer plus que leurs congénères non atteints. Ce "freezing" survient par exemple lorsqu'on prend un animal dans les mains et qu'on le remet dans sa cage. Nous connaissons bien cette évolution de la maladie et ces comportements parfois atypiques, ce qui nous permet de les repérer immédiatement quand ils surviennent. Cela garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. Par expérience des derniers mois, nous n'avons pas à intervenir sur des animaux avant l'âge de 6 mois. L’injection intramusculaire pouvant être douloureuse, des analgésiques seront utilisés avant et poursuivis après l’intervention.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires nécessaires à l'évaluation complète du produit testé.

Remplacement

Le but de notre projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour le maintien de l’intégrité musculaire dans le muscle dystrophique. Nous avons préalablement contrôlé que les voies de la protéine testée étaient bien activées en utilisant in vitro des cellules stimulées avec cette protéine et nous avons réalisé les premières expériences in vivo chez un modèle de souris de la DMD. Nous souhaitons aujourd’hui, tester son efficacité sur un modèle plus sévère et plus proche de l'affection humaine. L’utilisation du rat DMD nous parait donc indispensable pour évaluer un éventuel bénéfice de cette protéine sur des processus tels que la régénération et le maintien de la masse musculaire pendant plusieurs semaines au cours de la phase active du processus pathologique.

Réduction

Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Pour certaines de ces études, nous sommes en train de rédiger les conclusions et avons déjà réalisé les analyses statistiques. Il apparaît que pour chacun des groupes, traiter 6 rats (2 muscles traités indépendamment par rat) permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Pour réaliser cette estimation, nous utilisons des tests statistiques en prenant en compte des paramètres tels que la différence à mettre en évidence entre les différents lots, la puissance et le risque du test. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et DMD traités avec un placebo, nous avons accumulé des données nombreuses qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il est donc possible de réduire les cohortes de ces animaux. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 6 animaux. Pour l’analyse des résultats, nous utiliserons des logiciels qui permettent de comparer deux groupes ou plusieurs groupes entre eux.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage à l'âge d'un mois. Puis nous réduisons ce nombre progressivement jusqu'à atteindre un maximum de 3 rats par cage. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (maladie irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux par l'utilisation d'agents anesthésiques et analgésiques.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle historique de la souris, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle du chien dystrophique. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format).

175 animaux, lapins, souris, rats et hamsters dorés, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils servent à la formation continue du personnel aux gestes techniques, prélèvements sanguins, injections et parfois chirurgie sous anesthésie, sans autre finalité que l'entraînement. Le porteur indique que ces animaux seront tués faute de pouvoir être inclus dans un autre protocole et qu'une partie provient d'animaux de réforme ou surnuméraires. Il reconnaît l'existence de simulateurs en plastique mais affirme qu'une formation sur "animal entier vivant" reste nécessaire.

Objectifs

Conformément à la réglementation, tous les personnels impliqués en expérimentation animale, quelle que soit leur fonction, doivent suivre une formation continue, afin d'assurer le maintien et l’actualisation de leurs compétences, et ce, tout au long de leur carrière. L’objectif de ce projet est de décrire tous les gestes techniques utilisés dans le cadre de formation et d’entraînement. Dans le but d'assurer une traçabilité complète de l'apprentissage des gestes techniques réalisés sur des animaux de réforme ou animaux commandés, le présent projet vise à décrire des méthodologies et des gestes techniques. Ces formations, réalisées en interne au sein de l’établissement utilisateurs seront validées par le Responsable du suivi des compétences de l’établissement utilisateur.

Bénéfices attendus

L'entraînement continu des personnels développe une pratique plus sûre des actes sur les animaux, permettant de réaliser ces actes avec le minimum de douleur et de stress pour les animaux. Les résultats obtenus lors des expérimentations suivantes seront donc fiables.

Procédures

Il n’y a pas de dommage escompté dans le cas de prélèvement sanguin unique. Dans le cas de prélèvements sanguins répétés, une attention particulière sera apportée au niveau des sites de prélèvement afin d’éviter tout point de nécrose pouvant entrainer une douleur chez l’animal. Un seul type de prélèvement sera effectué par animal afin de limiter au maximum le stress chez l'animal. Pour chacun des gestes techniques d'administration ou de prélèvement, le temps est estimé à 5 minutes par animal dans le cas d'une manipulation vigile. Dans le cas où l'animal devrait être anesthésié, ce temps est estimé à 15 minutes.

Impact sur les animaux

Le tuteur veille au respect des règles de contention des animaux et à la bonne exécution des manipulations/gestes réalisés ; le stress et la souffrance sont donc très limités. La surveillance de l'animal par le tuteur durant la manipulation/gestes exécutés permet le cas échéant d'interrompre ceux-ci s’ils induisent un stress ou une souffrance chez l'animal. Les administrations et les prélèvements (fréquences et volumes) seront effectués selon les recommandations en vigueur pour respecter le bien-être animal et sont détaillés dans chaque procédure. Il n’y a pas de dommage escompté dans le cas de prélèvement sanguin unique. Dans le cas de prélèvements sanguins répétés, une attention particulière sera apportée au niveau des sites de prélèvement afin d’éviter tout point de nécrose pouvant entrainer une douleur chez l’animal. Les manipulations les plus invasives (exemple : administration intradermique, pose de cathéter, prélèvement de biopsies seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture antalgique en cas de nécessité. Une surveillance particulière sera portée sur l’état général de l’animal en cas de réveil, des tapis chauffants peuvent être utilisés durant la phase de révail. Certains actes nécessitent la pratique d’une chirurgie et portent atteinte à l’intégrité physique par l’incision. Elle requière des compétences particulières qui s’acquièrent par des connaissances de base et un apprentissage des gestes auprès de personnes compétentes et habilitées à la chirurgie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des étapes de formations car ils ne pourront pas être inclus dans un autre protocole scientifique.

Remplacement

Un modèle d'expérimentation artificiel a été conçu utilisant un matériau de type plastique permettant à l’expérimentateur d'acquérir les compétences préliminaires nécessaires pour manipuler un rat ou une souris de manière éthique, sans la nécessité d'utiliser un animal vivant. Néanmoins, il n’existe pas de méthode de remplacement permettant de se substituer à la totalité des gestes techniques, une formation sur animal entier vivant reste nécessaire avant la réalisation des procédures expérimentales incluant des animaux.

Réduction

Dans la mesure du possible, ces formations / maintien des compétences sont réalisées dans la mesure du possible sur des animaux surnuméraires ou issus d’un projet précédent avec avis favorable du vétérinaire, ce qui contribue à la réduction du nombre d'animaux nécessaires. Le nombre d'animaux utilisés est réduit au maximum tout en permettant la répétition des actes expérimentaux dans le respect des volumes et du nombre d’administration tolérés.

Raffinement

Evaluation des points finaux quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal, état des sites d'injection...), enrichissement du milieu dans les cages (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Lors des gestes sur les animaux, des anesthésiques et analgésiques seront employés en fonction du geste pratiqué. Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, une grille de score permettant d'évaluer les points limites est établie en concertation avec le Comité de Suivi du Bien Être Animal (SBEA) de notre établissement: - Changement du poids corporel (Normal : 0, perte de poids 20 % du poids normal maintenue sur 72h : 3) - Apparence physique (Normale : 0, manque de toilettage : 1, pelage terne et écoulements nasaux et lacrymaux : 2, pilo érection, dos arrondi :3) - Abreuvement et alimentation (Normal : 0, incertain: 1, diminution: 2, aucune prise d'aliment et de boisson: 3)- Examen clinique (Normal : 0, Faibles modifications de la température, de la fréquence cardiaque et respiratoire : 1 , modifications modérées de la température, de la fréquence cardiaque et respiratoire : 2, modifications importantes de la température, de la fréquence cardiaque et respiratoire : 3). Grille allant de 0 à 12 points. De 0 à 3 : observation attentive des animaux, de 4 à 8 : souffrance, prévoir un mode de soulagement et observer régulièrement l'animal et demander un deuxième avis, de 9 à 12 : souffrance sévère considérer que les points limites sont atteints entrainant une mise à mort de l'animal. A cela il faudra également veiller aux points suivants : plaie nécrosée, purulente ou exsudative, animaux voutés, yeux mi-clos, faiblesse de membres.

Choix des espèces

Les rats, souris, hamsters et lapins sont les animaux les plus utilisés dans notre société pour réaliser des études chez l'animal. Nos projets d'étude utilisant des animaux adultes, les gestes techniques s'effectueront sur des animaux de 6 semaines minimum.

60 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie étant tuée pour analyse et le reste réutilisé ou gardé en vie selon l'avis du vétérinaire. Chaque animal subit sous anesthésie jusqu'à dix injections intradermiques et dix biopsies de peau, après tonte des flancs, pour évaluer la tolérance cutanée de composés candidats médicaments. Le porteur indique que les composés testés peuvent provoquer irritations, inflammations et gonflements. Il rappelle que les dossiers réglementaires exigent au moins deux espèces dont une non-rongeur et retient le mini-porc pour la proximité de sa peau avec celle de l'humain.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer la tolérance de composés au niveau du derme de la peau. Les informations apportées permettent de modéliser le comportement de la molécule dans l’organisme, et contribuent au choix de la voie d’administration et/ou des doses pour les études réglementaires soumises aux autorités de santé pour l’enregistrement de tout nouveau médicament. Elles participent à la sélection de molécules en vue d’une future administration chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Les études réalisées dans le cadre de ce projet ont pour but d’évaluer la réaction cutanée suite à l'injection de molécules avant le passage au stade clinique afin d’anticiper les éventuels effets indésirables. Le bénéfice attendu est une meilleure connaissance du comportement biologique des molécules testées, ce qui permettra d’adapter si besoin les conditions d’administration pour permettre d’améliorer la sécurité en vue d’une future administration chez l’Homme.

Procédures

Tonte sous anesthésie : maximum 30 minutes si les 2 flancs sont tondus Injections intradermiques sous anesthésie : maximum 1min pour une injection intra dermique de 100µl Biopsies sous anesthésie et analgésie : environ 5 sec par prélèvement Au total chaque animal recevra au maximum : 10 injections intradermique et sera soumis à 10 biopsies de peau.

Impact sur les animaux

Les tontes, les administrations intradermiques et les biopsies devant être réalisées sur un animal parfaitement immobile, les animaux seront anesthésiés afin d’éviter une contention prolongée, et de limiter au maximum leur stress et d’éviter toutes lésions/irritation après la tonte par exemple. Les prélèvements pouvant potentiellement induire une certaine douleur, une analgésie est prévue. Les composés testés pourront induire des irritations, inflammation, gonflement et feront donc l’objet d’un suivi quotidien des animaux.

Devenir

Les animaux surnuméraires ou les animaux de l’étude pourront être réutilisés dans une autre procédure expérimentale si aucun effet sévère n’est observé à la fin de l’étude, qu’ils ont recouvré leur bien-être général et après avis favorable du vétérinaire désigné. Certains animaux pourront éventuellement être replacés après accord du vétérinaire désigné. D’autres seront euthanasiés afin de prélever des tissus en vue d’analyses histologiques.

Remplacement

Un organisme entier est nécessaire pour caractériser la réaction cutanée de molécules présentant un potentiel thérapeutique, en effet aucun modèle non animal à l’heure actuelle ne peut modéliser la complexité de la réponse immunitaire locale des différentes couches de la peau.

Réduction

Les molécules évaluées auront auparavant été testées dans des tests sur des cellules en laboratoire in vitro afin de n’évaluer que des molécules présentant un potentiel thérapeutique élevé et ainsi réduire le nombre de mini porcs utilisés dans ce projet. Des groupes de 8 animaux au maximum seront utilisés pour évaluer chaque molécule (4 males et 4 femelles). Cependant 4 animaux seront préférentiellement utilisés pour chaque molécule dans le cas où les effets potentiels du produit sont indépendants du sexe de l’animal, ce qui permet d’obtenir des analyses statistiques robustes et une interprétation scientifique des données. Afin de réduire le nombre d’animaux, un effort sera porté sur la réutilisation d'un même animal, après avis favorable du vétérinaire désigné, pour tester une autre voie d’administration, une autre formulation, ou un autre candidat médicament. Dans ce cas, un délai sera respecté pour que l’animal puisse récupérer et pour garantir l’élimination de la molécule de l’organisme.

Raffinement

A l’arrivée, une période d’acclimatation d’au moins 15 jours sera appliquée afin qu’ils s’habituent à l’environnement, aux conditions d’hébergement et aux interactions avec le personnel. La première semaine, les interactions seront limitées à la présence humaine, y compris dans les box avec possibilité de contact physique (palpation des oreilles, cou, dos, pattes…) et habituation à la pesée. A partir de la semaine2, l’habituation aux situations auxquelles les animaux pourront être soumis dans l’étude pourra commencer avec l’habituation aux techniques de contention (préhension, mise en place dans le hamac, …) afin de limiter le stress des animaux pendant l’étude. Aucun geste invasif ne sera pratiqué pendant cette période. Si cela ne nuit pas à l’expérimentation, un morceau de fruit pourra être donné en récompense, et le milieu environnemental pourra être enrichi par l’apport de jouets adaptés (balles, mordillots…). De la musique peut également être présente dans les salles d’hébergement. Afin de limiter le stress, les animaux pourront être légèrement anesthésiés par anesthésie gazeuse au masque de courte durée avant les tontes, administrations et les prélèvements, à condition que cela n’interfère pas avec les objectifs de l’étude. Cette anesthésie restera de courte durée et sera réalisée en plaçant l’animal sur un tapis chauffant afin d’éviter toute hypothermie. Une analgésie est prévue pour les biopsies de peau. Afin de s’assurer du bien-être animal, les animaux seront observés quotidiennement. En particulier, ils seront observés après chaque geste technique (administration, prélèvement), afin de s’assurer de l’absence d’effet indésirable inattendu. Après les biopsies, un pansement sera appliqué sur la plaie, En cas d’altération de l’état de l’animal, la surveillance sera rapprochée et il sera soigné selon les recommandations du vétérinaire et en accord avec le directeur d’étude.

Choix des espèces

Les dossiers réglementaires nécessaires à l’enregistrement de nouveaux médicaments requièrent des données d’études sur au moins deux espèces animales mammifères dont une non-rongeur. Le mini porc est une des espèces non-rongeur qui peut être utilisée. En particulier, le mini porc est souvent utilisé pour les études concernant les réactions cutanées en raison des similarités physiologiques et morphologiques avec la peau humaine, décrites dans la littérature. Les mini porcs utilisés sont âgés au minimum de 6 semaines à réception (animaux sevrés) et au maximum de 12 mois. D’une manière générale, le poids est un facteur déterminant pour la quantité de médicament administré à l’animal (souvent en faible quantité à ce stade de développement) mais également en termes de manipulation de l’animal. Aussi l’âge maximal est fixé à 12 mois pour limiter les difficultés de contention qui peuvent être préjudiciables au bien-être animal. Les animaux seront préférentiellement utilisés à partir de 9 semaines. En effet, c’est à cet âge que l’épaisseur des différentes couches de la peau se rapproche de celle de l’Homme adulte.