Procédures modérées

300 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont sédatés, reçoivent une injection unique de fer dans le muscle, puis sont tués pour prélever et analyser ce muscle, dans le cadre d'un test exigé par la Pharmacopée Chinoise pour commercialiser des produits vétérinaires en Chine. Le porteur affirme qu'aucune méthode substitutive n'existe, tout en indiquant qu'un objectif du projet est de démontrer que les contrôles physico-chimiques français suffiraient à s'affranchir de ces lapins. Le protocole prévoit deux lapins par lot testé, soit 300 animaux sur cinq ans.

Objectifs

Les injections de fer sont très souvent utilisées chez les jeunes animaux de rente (porcins, ovins, caprins, bovins…) dans le cadre de la prévention et du traitement de l’anémie ferriprive après la naissance. Dans le cadre de l’élevage porcin, les injections de fer sont presque systématiquement réalisées dans les 3 jours suivant la naissance. La Chine est le 1er producteur de porcs au monde et un marché important pour les industries pharmaceutiques vétérinaires. Ce projet est réalisé dans le cadre de demande d’Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) en Chine de produits vétérinaires injectables composés de fer, possédant déjà des AMM en France. A chaque libération d’un nouveau lot de ces produits en France, un contrôle qualité est réalisé à l’aide de différents tests physico-chimiques décrits dans la Pharmacopée Européenne. Pour la commercialisation sur le marché chinois, les autorités chinoises demandent la réalisation d’un test in vivo d’absorption du fer au point d’injection chez le lapin. Ce test fait partie des tests de contrôle qualité réalisés lors de la libération de lots de produits contenant du fer en Chine. Il permet de valider la qualité du lot en analysant l’absorption du fer après une injection unique et de s’assurer que la quantité de fer non absorbée au niveau du point d’injection ne dépasse pas 20% de la quantité injectée. Le but de cette vérification est de s’assurer que chaque lot commercialisé est conforme, et que le produit est sûr, aussi bien pour la santé animale que pour la consommation humaine. Ce projet a donc 2 objectifs : 1) la réalisation du test d’absorption de fer au point d’injection demandé par les autorités chinoises dans le cadre d’une demande d’AMM. 2) démontrer que les contrôles physico-chimiques réalisés en France sont suffisants pour pouvoir s’affranchir de l’utilisation de lapins lors de la libération de chaque lot de produit commercialisé sur le marché chinois.

Bénéfices attendus

1) Obtenir l’autorisation de mise sur le marché en Chine des produits testés. Ainsi, chaque lot commercialisé et autorisé sera conforme et sûr, aussi bien pour la santé animale que pour la consommation humaine. En effet, ce projet va permettre de valider en Chine des produits permettant de lutter contre l’anémie ferriprive rencontrée dans les élevages. 2) Prouver que les contrôles physico-chimiques réalisés en France sont suffisants pour pouvoir s’affranchir de l’utilisation de lapin lors de la libération de chaque lot de produit commercialisé sur le marché chinois.

Procédures

Les animaux utilisés seront sédatés avant de recevoir une injection unique de produit testé. La sédation va permettre de diminuer le stress de l’animal et faciliter sa contention. Ceci facilitera également l’injection qui doit être réalisée précisément dans le muscle vaste médial. Après euthanasie des animaux, des prélèvements du muscle étudié seront réalisés afin d’analyser ce muscle et obtenir les résultats du test d’absorption. Les interventions seront de courte durée et ne seront réalisées qu'une seule fois par animal puisqu'ils seront in fine euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la mise à jeun la veille de la sédation et stress dû à la contention pour la réalisation de la sédation.

Devenir

Les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort afin de pouvoir prélever et analyser le muscle injecté étudié. Ces prélèvements de muscle sont primordiaux pour répondre aux objectifs de ce projet.

Remplacement

Le test d’absorption du fer au point d’injection est une procédure expérimentale in vivo demandée par la réglementation chinoise, dans le cadre de la commercialisation sur le marché chinois de produits vétérinaires composés de fer. L’absorption de fer est un processus dynamique nécessitant le passage de la molécule étudiée du site d’absorption vers le sang pour pénétrer dans la circulation systémique. Ce type d’étude doit se réaliser sur animaux. Cependant, l’un des buts de ces études est de démontrer que les contrôles qualité réalisés en France sont suffisants pour permettre à terme de s’affranchir de l’utilisation d’animaux pour chaque nouvelle libération de lot. Afin de démontrer ceci, l’utilisation d’animaux est ici nécessaire et aucune méthode substitutive n’existe. En effet, l’utilisation des animaux dans le cadre de ce projet, ne peut pas être remplacée par des méthodes alternatives n’impliquant pas l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été calculé à partir des directives mentionnées dans la Pharmacopée Chinoise, dans laquelle il est stipulé qu’il faut utiliser 2 animaux par lot testé, et à partir des besoins pour le projet (estimation du nombre de lots à tester sur la durée du projet). Sur 5 ans, il a été estimé que 150 lots seraient testés (environ 30 par an) soit 300 lapins au total.

Raffinement

Méthodes de raffinement: 1) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Afin de les maintenir, les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, afin d’augmenter leur bien-être, les animaux seront hébergés collectivement dès que possible et disposeront d’un environnement enrichi (foin/paille, bois à ronger, chaînette, de quoi se cacher et grimper...). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils auront un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères. 2) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 3) Pour diminuer le stress de l’animal et faciliter la contention pour l’injection, l’animal sera sédaté avec un produit adapté. Il est primordial dans ce projet que l’injection soit réalisée précisément au niveau du muscle vaste médial et pour cela l’animal ne doit pas bouger durant l’injection. 4) Surveillance accrue de l’animal durant la sédation et l’injection. Grâce à ces différentes méthodes, le bien-être de l’animal sera respecté et sa douleur, souffrance et angoisse seront d’abord réduites puis supprimées. Ainsi, la manipulation sera réalisée dans les meilleures conditions possibles.

Choix des espèces

Le lapin a été choisi pour ce projet car c’est cet animal qui est demandé et décrit dans la Pharmacopée Chinoise pour la réalisation de tests d’absorption du fer au site d’injection. Conformément à la Pharmacopée Chinoise, les animaux utilisés seront des adultes pesants entre 1,5 et 2,5 kg.

Sur 402 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 384 sont mises à mort pour prélever leur cerveau, et les 18 autres, des femelles reproductrices, peuvent être gardées à l'animalerie pour d'autres portées. Les souriceaux sont identifiés entre 5 et 7 jours par l'ablation d'une phalange au bout d'un ou deux doigts, les futures adultes par tatouage des phalanges et biopsie de la queue, puis une hypothyroïdie est provoquée par un aliment au goût amer, donné trois semaines aux adultes ou aux mères gestantes du 10e jour de gestation à 15 jours après la mise bas. Les souriceaux de ces mères accusent un retard de croissance de 10 à 15 %, des adultes et des petits reçoivent une injection d'hormone thyroïdienne, et toutes ces souris sont tuées sous anesthésie après une prise de sang dans la veine cave ou une injection de fixateur dans le cœur. Le porteur affirme que ce traitement n'a "pas d'effet flagrant" chez les adultes, puis prévoit une perte de poids, une baisse d'activité mesurable par des "tests comportementaux dédiés" qu'il ne décrit pas, et écrit qu'"on peut supposer une fatigue générale".

Objectifs

L'hormone thyroïdienne est primordiale pour le bon fonctionnement de l'organisme, autant pendant le développement foetal que pendant la vie adulte. Elle régule notamment le neurodéveloppement durant la vie foetale, et le maintien de fonctions vitales, comme la production de chaleur par le corps, à l'âge adulte. L'ormone thyroïdienne agit dans presque tous les tissus de l'organisme. Les perturbations de cette signalisation entraînent des conséquences délétères sur la santé des individus : hypothyroïdie, problèmes de développement cérébral, déficit intellectuel... L'hormone thyroïdiennes agit en activant ou en inhibant la transcription de gènes cibles. Toutefois, ces gènes-cibles sont globalement mal connus et ne sont pas les mêmes d’un tissu à l’autre. Le manque de compréhension des mécanismes d’action de l'hormone thyroïdienne freine le développement de traitements adaptés aux différentes pathologies associées. Ce projet consiste à déterminer les gènes cibles de l'hormone thyroïdienne dans l’hypothalamus chez la souris, à la fois chez le jeune et chez l'adulte. Cette aire cérébrale représente un élément essentiel du contrôle des fonctions physiologiques. L’influence qu’y exerce l'hormone thyroïdienne est importante, mais la façon dont cette influence s’exerce, c’est-à-dire la nature des gènes-cibles de l'hormone, est très peu connue.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à faire avancer les connaissances fondamentales dans un domaine dans lequel beaucoup d’inconnues persistent. Il devrait permettre d’effectuer une distinction fondamentale entre les processus développementaux et les régulations physiologiques contrôlés par l'hormone thyroïdienne dans l’hypothalamus. À terme on peut en attendre les bénéfices suivants : - une compréhension des liens qui existent entre différents phénomènes qui dépendent de l'hormone thyroïdienne dans l’hypothalamus : le déclenchement de la puberté, la perception des saisons, la régulation de l'activité de la glande thyroïde... - des hypothèses innovantes pour des traitements pharmacologiques de l’obésité. L'hormone thyroïdienne donnée en excès est capable d’augmenter la dépense calorique et de provoquer une perte de poids. Un tel traitement reste cependant inenvisageable en raison de ses effets secondaires majeurs (fonte de la masse musculaire et tachycardie). Si nous parvenons à identifier un type cellulaire de l’hypothalamus dans lequel l'hormone thyroïdienne exerce un effet favorable, il sera possible de cibler ces cellules pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques de lutte contre l'obésité, en évitant les effets indésirables sur d'autres organes.

Procédures

Les souris utilisées à l'âge adulte seront identifiées individuellement par tatouage des phalanges à l'âge de 10-12 jours (geste < 1 minute). Une biopsie de queue (< 20 secondes) sera réalisée le même jour sur ces animaux pour pouvoir réaliser des analyses génétiques. Les souris utilisées à l'âge de 15 jours seront identifiées entre 5 et 7 jours d'âge par prélèvement d'une phalange distale sur un ou deux doigts (< 1 minute). Ces prélèvements permettront également de réaliser des analyses génétiques. Des souris adultes seront nourries pendant 3 semaines avec un aliment contenant un médicament qui bloque la fonction de la glande thyroïde et induit une hypothyroïdie. Ce traitement pharmacologique prolongé n’a pas d’effet flagrant chez les adultes, mais peut causer une légère perte de poids. Des mères gestantes seront également nourries avec cet aliment, à partir du 10ème jour de gestation et jusqu'à 15 jours après la mise bas. Ce traitement provoque chez les souriceaux en développement un net ralentissement de la croissance pondérale après la naissance. Des souris adultes et des souriceaux âgés de deux semaines précédemment rendus hypothyroïdiens recevront une injection unique d'hormone thyroïdienne (< 20 secondes). En fin de procédure, les souris seront profondément anesthésiées (par injection de médicaments, < 20 secondes), après injection d'un analgésique (< 20 secondes). Sur une partie d'entre elles, nous réaliserons un prélèvement sanguin à la veine cave (2-3 minutes), puis elles seront mises à mort sous anesthésie. Sur les autres souris, une procédure chirurgicale sera employée (durée < 10 minutes) pour injecter dans le coeur un produit qui permet d'assurer une bonne conservation de la structure du cerveau, pour la réalisation d'analyses histologiques. Ces souris seront également mises à mort sous anesthésie après la procédure chirurgicale.

Impact sur les animaux

Les actes liés à l'identification des souris et aux biopsies pour analyses génétiques (tatouage des phalanges, biopsie de queue ou de phalange) induisent une douleur aigüe temporaire. Chez la souris adulte, nous induirons une hypothyroïdie temporaire, qui a un effet modéré et réversible. Cela se traduit par une perte de poids modérée (inférieure à 10% du poids initial) et une légère baisse d’activité, qui n'est pas détectable de façon évidente, mais qui peut être mesurée en utilisant des tests comportementaux dédiés. Par analogie avec les données médicales humaines, on peut supposer une fatigue générale. Le médicament utilisé donne un goût amer à l'aliment, ce qui limite la prise de nourriture par les souris. L’induction d'une hypothyroidie au cours de la gestation a des effets significatifs sur le développement des petits. Toutefois, notre expérience passée montre que le degré d’hypothyroïdie atteint dans nos conditions expérimentales ne compromet pas la survie des souriceaux, le seul effet notable étant un retard de croissance (10-15 % de retard pondéral par rapport aux souris témoins). L'injection d'hormone thyroïdienne induit une douleur temporaire liée à l'injection mais ne provoque pas d’inflammation ni d'altération notable du bien-être animal. Le prélèvement d'un grand volume de sang sous anesthésie générale, ainsi que l'injection d'un produit fixateur dans le coeur, également sous anesthésie générale, n'induisent pas de douleur et sont systématiquement suivis de la mise à mort des souris.

Devenir

384 souris de ce projet seront mises à mort pour prélèvement de leur cerveau. Les femelles utilisées pour mettre au monde des souriceaux pourront être gardées et réutilisées comme reproductrices au sein de l'animalerie, après une période de récupération d'au moins 2 semaines pour les femelles qui auront reçu l'aliment induisant une hypothyroïdie.

Remplacement

L’hypothalamus est une structure neurale pour laquelle il n’existe aucun modèle in vitro pertinent. Le recours aux cultures primaires n'est possible pour quelques types cellulaires. Nous avons mesuré la réponse à l'hormone thyroïdienne de cultures primaires de certaines cellules de l’hypothalamus, mais il n’est pas encore démontré qu’elle soit comparable à leur réponse in vivo. Il n’existe pas de situations qui permettraient de prélever des tissus provenant de patients hypothyroïdiens ayant reçu un très court traitement hormonal pour évaluer les modifications d'expression de gènes induites par l'hormone thyroïdienne dans l'hypothalamus.

Réduction

Les méthodes prévues pour l'analyses du tissu cérébral ont été optimisées pour être applicables avec des quantités minimes de matériel. Pour les études impliquant un séquençage des ARN , notre expérience passée montre que des lots de 6 animaux minimum (3 mâles + 3 femelles) sont requis pour garder une marge de sécurité. L’analyse statistique est effectuée à l’aide d’une méthode dédiée capable de mettre en évidence des différences mineures avec des effectifs très faibles en prenant en compte une interférence possible entre la réponse hormonale et le sexe des animaux. Toutefois, ces méthodes peuvent conduire à l’élimination occasionnelle d’un échantillon en raison de problèmes techniques. Des animaux surnuméraires permettent également de réaliser des expériences de confirmation (analyse ciblée sur certains gènes identifiés comme intéressants par l'analyse globale). Le nombre de femelles nécessaire pour générer les souriceaux pour l'étude du développement du cerveau a été déterminé sur la base de l'obtention d'environ 6 souriceaux par portée. Nous réutiliserons les femelles pour plusieurs portées. Notre estimation prévoit également de possibles problèmes de reproduction (interruption de gestation, mortalité des souriceaux...).

Raffinement

Les souris adultes et juvéniles seront observées et pesées régulièrement pendant toute la durée des procédures. En cas d'approche d'un point limite par l'un des animaux, la surveillance sera réalisée quotidiennement. Chaque femelle sera utilisée au maximum pour 2 gestations sous traitement hypothyroïdien, avec une période de repos d'au moins 15 jours (alimentation normale) entre la mise à mort des petits et la nouvelle mise en reproduction. En fin de procédure, les souris seront profondément anesthésiées pour éviter toute douleur liée au prélèvement sanguin ou à la perfusion intracardiaque de fixateur. Elles recevront également un analgésique 30 minutes avant induction de l'anesthésie.

Choix des espèces

Le recours à des outils génétiques performants et la spécificité du métabolisme énergétique des espèces homéothermes impose le choix de la souris comme modèle. Le mode d’action de l'hormone thyroïdienne, ainsi que la structure des récepteurs, sont similaires chez l’homme et la souris. Des adultes âgés de 2 à 4 mois seront utilisés pour étudier le rôle de l'hormone thyroïdienne dans l'hypothalamus chez l'adulte. La maturation de l’hypothalamus est considérée comme terminée à l’issue de la puberté. Des juvéniles traités indirectement (via la mère) dès le 10ème jour de vie foetale et âgés de 15 jours en fin de procédure seront utilisés pour étudier le rôle de l'hormone thyroïdienne au cours du développement de l'hypothalamus.

370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau et des injections répétées, avec imagerie et prélèvement sanguin, pour étudier un gène impliqué dans l'infiltration lymphocytaire des tumeurs du sein triple-négatives. Le porteur décrit le modèle murin comme "incontournable" et affirme que l'étude de ces infiltrations immunitaires ne peut se faire que dans un "animal entier". Toutes les souris sont euthanasiées pour analyse du sang et des tissus.

Objectifs

Un traitement par des agents chimiothérapeutiques, notamment les anthracyclines, est souvent utilisé pour réduire la taille des tumeurs avant chirurgie ou radiothérapie chez les patients atteints de cancer du sein. Récemment, il a été montré dans notre laboratoire que la présence de lymphocytes infiltrants les tumeurs après chimiothérapie est associée à un meilleur pronostic chez les patientes atteintes de cancer du sein de type triple-négatif (TNBC) qui est particulièrement agressif. Des publications récentes montrent que le traitement des patientes par chimiothérapie, notamment par les anthracyclines, pourrait favoriser la réponse immunitaire en provoquant la mort des cellules cancéreuses et permettre ainsi la présentation d'antigènes tumoraux induisant l'activation d'une réaction immunitaire spécifique, qui se traduit notamment par l’infiltration de la tumeur par les cellules immunitaires. Une analyse génomique récente menée dans notre laboratoire sur des échantillons provenant de patients TNBC après chimiothérapie a conduit à l'identification d'une combinaison de quatre gènes liés au système immunitaire et dont le niveau d'expression est corrélé au niveau d’infiltrats lymphocytaires intratumoraux. Un des gènes appartenant à cette signature génomique, a été trouvé en relation négative avec la présence de TILs. En d’autres termes, une expression élevée de ce gène inhibe l’infiltration des cellules du système immunitaire dans la tumeur.

Bénéfices attendus

Amélioration de la prise en charge de certains cancers du sein (triple-négatifs) dans le cas ou l'attraction lymphocytaire est inhibée, si l'hypothèse est vérifiée.

Procédures

Injections: 5 par souris, durée 1 minute, sous anesthésie locale. Imagerie in vivo sous anesthésie générale: 1 fois, durée 15 minutes. Prélèvement de sang sous anesthésie 1 fois, durée 5 minutes.

Impact sur les animaux

Nuisances liées à la présence de tumeurs greffées sous la peau.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour analyses post-mortem sur le sang et les tissus.

Remplacement

Le but de ce projet est de déterminer l’implication du gène HLF (pour Hepatic leukemia factor) dans l’inhibition de l’infiltration des tumeurs du sein par les lymphocytes. Des études biostatistiques ont montré que lorsque ce gène est surexprimé dans les cellules tumorales de patientes souffrant de cancer de type TNBC, une inhibition de l’attraction lymphocytaire est constatée et corrélée à un mauvais pronostic. L’étude in vivo de l’infiltration lymphocytaires de tumeurs du sein induites chez la souris exprimant ou non HLF est indispensable afin de confirmer le rôle joué par ce gène dans ce processus et qui pourrait devenir une cible pour de nouvelles stratégies thérapeutiques. En effet, l'étude de ces infiltration en rapport avec l'immunité ne peut se faire que dans un animal entier.

Réduction

les lots d'animaux nécessaires seront réduits au nombre minimal nécessaire afin d'obtenir des résultats statistiquement valables. Un nombre minimum de 30 souris dans chaque lot a été déterminé comme nécessaire pour avoir des données fiables. Cependant, si les résultats obtenus avec une première série de 10 souris dans chaque série donnent des résultats significatifs et robustes, le nombre de souris utilisées sera diminué. Les résultats seront analysés statistiquement par analyse de variance.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales seront faites sous anesthésie générale (injections des tumeurs, imagerie in vivo) ou locale. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La lignée tumorale murine 67NR établie à partir d’une tumeur du sein spontanée chez la souris BALB/c est largement utilisée dans la littérature comme modèle d’étude des cancers de type TNBC. Cette lignée exprime le gène HLF et nous avons réussi à supprimer son expression par la technique CRISPR/Cas9. Le modèle murin est par conséquent incontournable dans notre projet pour l’étude in vivo du rôle joué par ce gène dans la réponse immunitaire antitumorale et en particulier dans l’infiltration des tumeurs par les lymphocytes. A partir de 6 semaines, pour que les souris aient un système immunitaire mature.

76 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent deux chirurgies, un amincissement du crâne et une injection d'un vasoconstricteur dans le cerveau pour provoquer un accident vasculaire, puis quatre à cinq anesthésies consécutives pour des séances d'imagerie. Le porteur reconnaît un risque de dépression respiratoire lié à cette succession d'anesthésies et d'hémorragie lors de l'amincissement du crâne. Les rats sont gardés vivants trois à quatre jours puis tués pour prélever le cerveau.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral ischémique (AVCi) est une maladie fréquente et invalidante. Disposer de modèles animaux bien caractérisés est nécessaire à l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques en neuroprotection. De plus, leur utilité en recherche translationelle est renforcée lorsque l’effet thérapeutique peut être mesuré par la même méthode d’imagerie chez l’animal et le patient. L’objectif global du projet est de caractériser par imagerie in vivo le modèle d’AVCi expérimental consistant en une injection intra-cérébrale d'un vasoconstricteur (endothelin-1) chez le rongeur. Plus précisement, il s’agit d’étudier la dynamique de la formation de la lésion ischémique lors de l’injection intra-cérébrale du vasoconstricteur ainsi que la réaction neuroinflammatoire qui s’ensuit. Pour cela seront mises en œuvre différentes méthodes d’imagerie, i) récemment développées, ii) en voie de transfert clinique, et iii) susceptibles d’apporter un nouvel éclairage sur la physiopathologie de ce modèle animal : ultrasons fonctionnels (fUS), permettant de visualiser l’activité cérébrale grâce aux variations de volume sanguin cérébral, et IRM moléculaire ou cellulaire, utilisant un agent de contraste à base de particules d’oxyde de fer, respectivement spécifique d’un récepteur sur-exprimé en condition inflammatoire (sur la paroi des vaisseaux) ou d’un type cellulaire (macrophages/microglies). Ces deux méthodes sont donc particulièrement adaptées à ce modèle où l’infarct ischémique dérive d’une réaction vasculaire (vasoconstriction) induite localement par l’endothelin-1. En résumé, ce projet consiste en une caractérisation renouvelée d’un modèle d’AVCi chez le rat grâce à de nouvelles méthodes d’imagerie. Il comprend 3 procédures de sévérité modérée, et a une durée de 4 ans.

Bénéfices attendus

L’accident vasculaire cérébral est une maladie invalidante chez l’adulte. Ce projet permettra de mieux comprendre la dynamique de formation de l’infarct, et la réaction inflammatoire associée, dans un modèle animal plus simple à mettre en œuvre et à standardiser que le modèle classique d’occlusion artérielle mécanique avec un filament. Ces aspects inexplorés du modèle animal permettront ensuite de définir des biomarqueurs d’imagerie utiles pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques. Ces biomarqueurs seront à terme utilisables chez l’homme puisque le transfert en clinique des techniques d’imagerie utilisées dans ce projet est à l’étude.

Procédures

Deux chirurgies : amincissement du crâne (30 min) et injection stéréotaxique (45 min), sous anesthésie générale. Deux à trois sessions d'imagerie (ultrasons et IRM), de durée moyenne

Impact sur les animaux

Les animaux subissent deux chirurgies (amincissement du crâne et injection stéréotaxique intracérébrale), ainsi que des sessions d’imagerie (ultrasons et IRM). Cette succession d’anesthésies générales sur 4 à 5 jours consécutifs comporte des risques de dépression respiratoire et peut affecter leur état général. L’emploi systématique d’un anesthésique gazeux (isoflurane) et une surveillance étroite au réveil permet de contrôler ces effets. Suite à la chirurgie permettant de réaliser le modèle d’ischémie cérébrale, une perte de poids minime (

Devenir

Euthanasie pour prélèvement post-mortem du cerveau et analyses complémentaires.

Remplacement

Ce projet consiste en une étude à l’échelle du cerveau entier, dont les mécanismes physiopathologiques (ischémie et inflammation associée) et les méthodes d’imagerie sélectionnées (US & IRM) ne peuvent être actuellement adaptés et étudiés sur un système in vitro. Ce projet vient compléter notre connaissance d’un modèle animal utilisé depuis les années 90. L’utilisation du modèle animal adéquat conditionne la validité de l’évaluation des traitements et la possibilité de transfert en clinique. L’utilisation d’animaux est également justifiée par le rôle central de l’imagerie in vivo dans ces procédures. Le projet utilisera des rongeurs, plutôt que des mammifères de plus grande taille (cochon, primate) grâce à l’utilisation d’appareils d’imagerie dédiés aux petits animaux.

Réduction

Le nombre minimal et suffisant d'animaux a été estimé par une étude bibliographie de la variabilité du modèle. Des groupes expérimentaux de 10 animaux (5 mâles et 5 femelles) seront typiquement utilisés, avec une analyse intermédiaire à 6 animaux. Si la variabilité est faible, notamment dans les groupes contrôles (injection sans endothelin-1), alors l’inclusion sera stoppée. Il n’y a pas de mortalité directement liée à l'infarct ischémique, qui est de taille limitée en comparaison du modèle d‘AVC le plus utilisé (occlusion artérielle mécanique). L’imagerie longitudinale permet de réduire le nombre d’animaux car chaque animal est son propre contrôle (on peut rapporter la taille de lésion au cours du suivi à la taille de l’atteinte initiale chez chaque individu). Enfin, lors des prélèvements finaux, d'autres tissus pourront être prélevés et conservés en concertation avec nos collaborateurs au moment de la mise en place du projet afin de limiter, optimiser et valoriser au mieux les prélèvements et le nombre d'animaux utilisés dans cette étude.

Raffinement

Plus spécifiquement dans ce projet, des méthodes d’imagerie innovantes vont permettre de mieux décrire la cascade physiopathologique dans ce modèle d’AVC. Si la variabilité du modèle s’avère plus importante que décrite dans la littérature, celle-ci pourra être mieux contrôlée car à l’imagerie réalisée très précocement (pendant ou juste après l’occlusion). Les chirurgies sont réalisées sous traitement anti-douleur adapté (buprénorphine), avec thermorégulation continue, et hydratation intra-péritonéale. Une grille de score dédiée permet de juger objectivement les déficits sensori-moteurs, et le codage des expressions faciales permet de quantifier la souffrance post-opératoire. La salle d’évaluation neurofonctionnelle a été installée dans un endroit dédié et calme avec une lumière rouge afin de ne pas agresser les yeux des animaux albinos. En soins post-opératoires, nourriture et boisson sous forme gélifiée sont mises à disposition de l'animal en plus de la nourriture et boisson habituelles, et les groupes sociaux sont conservés (isolement limité au réveil complet de l’animal, sauf en cas d’aggressivité constatée).

Choix des espèces

L’utilisation du rat est optimale car l’organisation neurochimique du cerveau du rat est proche de celle de l’homme. Ce modèle est aussi pertinent car la taille du cerveau est suffisante pour la mise en place de l’imagerie ultrasonore et IRM de manière efficace et le modèle ET-1 est très bien défini chez le rat. Les animaux auront entre 6 et 8 semaines (adultes) : maturité cérébrale atteinte.

1940 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans la veine caudale, parfois complétée d'injections intrapéritonéales, pour développer des tumeurs du foie liées à des mutations de la protéine p53. Le porteur affirme que le foie, peu innervé, rend le développement tumoral peu douloureux et que les tumeurs sont collectées avant qu'elles n'affectent l'animal. Toutes les souris sont euthanasiées pour prélever le foie et analyser les tumeurs.

Objectifs

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est le principal cancer primitif du foie, dont l'incidence est en croissance constante. Il constitue la troisième cause de mortalité due au cancer dans le monde, du fait notamment d’une rareté d’options thérapeutiques efficaces. Le CHC se caractérise par une importante hétérogénéité entre les tumeurs, que l’on doit mieux comprendre afin d’envisager de nouvelles options thérapeutiques adaptées à chaque patient. Notre projet de recherche vise à caractériser le rôle de mutations d’une protéine dans le développement des tumeurs de cancer du foie. Ces mutations, qui sont fréquemment retrouvées dans les tumeurs de patients, seront étudiées dans un modèle préclinique animal permettant d’évaluer les interactions entre la tumeur et le tissu environnant.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront d’améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans le cancer du foie (800 000 morts / an), étape requise pour le développement de stratégies thérapeutiques adaptées aux différences entre patients. Ils pourront d’ailleurs être étendus à d’autres cancers, p53 étant le gène le plus fréquemment muté dans cette pathologie.

Procédures

La grande majorité des animaux seront soumis à une seule injection dans la veine caudale (15 secondes). Pour certains groupes expérimentaux, ils seront soumis à la même injection dans la veine caudale, puis à deux injections intrapéritonéales (5 secondes).

Impact sur les animaux

Les effets sont, pour certains animaux, le développement de tumeurs du foie. Elles se développent sans affecter de manière importante l’animal car nous collectons les tumeurs lorsqu’elle sont encore de taille réduite. De plus, le foie est un tissu peu sensible (peu innervé), et le développement tumoral n’affecte pas le fonctionnement de l’organe. Les animaux sont évalués quotidiennement (avec une grille d’évaluation) pour, si besoin, arrêter l’expérience avant toute apparition de nuisance pour l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de collecter les foies et analyser le développement de tumeurs dans cet organe.

Remplacement

Nous avons effectué le maximum d’expériences sur des lignées cellulaires surexprimant les différents mutants de p53, il est désormais nécessaire de réaliser les expériences in vivo, notamment pour l’étude de l'environnement immunitaire des tumeurs. Nous tenterons d’établir des lignées dérivées des tumeurs afin de réaliser une partie de l'étude en culture.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé avec notre service de statistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant une taille de groupe pertinente pour répondre à notre hypothèse biologique. De plus nous avons réduit le nombre d’animaux pour certains groupes contrôles.

Raffinement

Nous avons optimisé les procédures expérimentales afin de minimiser les contraintes pour les animaux. Les expériences précédentes montrent que les procédures expérimentales proposées préservent le bien-être animal. Une grille de score a été mise en place pour l’observation quotidienne des animaux afin d’euthanasier les animaux et collecter le foie avant le développement éventuel d’une gêne liée à la présence de tumeurs.

Choix des espèces

La souris est l'espèce animale de choix pour l'étude des cancers du foie. Le modèle proposé est le plus proche de la maladie humaine, permettant d’analyser les premières étapes du développement de tumeurs. La souris est également un modèle d’étude classique pour tester de nouveaux médicaments dans les cancers. Ces approches sont soutenus par de nombreuses publications scientifiques dans des revues internationales, et ont conduit à de nombreux essais cliniques chez l’homme, et, au final, à l’approbation de nouveaux traitements. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (7-8 semaines). Nous voulons modéliser au mieux le fonctionnement de l’organe et la pathologie humaine (cancer de l'adulte).

15 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans un autre projet après une période de repos. On leur injecte à plusieurs reprises une cytokine par voie intraveineuse pour provoquer délibérément des démangeaisons, filmées pendant deux heures, afin de tester un anticorps monoclonal contre la dermatite atopique. Le porteur indique que l'objectif final est la commercialisation d'un nouveau produit et décrit le chien comme l'espèce cible, un test sur une autre espèce ne serait pas informatif selon lui. Les démangeaisons provoquées poussent les chiens à se gratter, se mordiller et se frotter, effets présentés comme transitoires.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité chez le chien d’un anticorps monoclonal sur les démangeaisons induites par une cytokine. L’objectif final étant la commercialisation d’un nouveau produit permettant de traiter la dermatite atopique qui est la plus fréquente des maladies cutanées allergiques du chien. Un objectif secondaire de ce projet est de comparer l’efficacité de deux cytokines, produites sur deux systèmes cellulaires différents, sur l’induction du prurit chez le chien.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la production d’un nouveau produit dans le cadre de développement de nouvelles options thérapeutiques dans la prise en charge de la dermatite atopique chez le chien. La dermatite atopique est une maladie inflammatoire chronique qui réduit significativement la qualité de vie de l’animal.

Procédures

La première phase expérimentale se déroulera sur 24 jours de prétests incluant les interventions suivantes pour 12 chiens : 1. Trois injections intraveineuses d'une cytokine sur animaux vigiles (avec pose d’un cathéter ou micro-perfuseur) à 6 ou 7 jours d’intervalles pour induire le prurit et filmer pendant 2 heures (J-20, J-14 et J-7) 3. Un prélèvement sanguin sur animaux vigiles pour la réalisation d’analyses sanguines (J-7). Puis la seconde phase expérimentale se déroulera sur 62 jours pour 8 à 12 chiens et incluant les interventions suivantes : 1. Une injection sous cutanée d'anticorps monoclonal sur animaux vigiles au démarrage de l’étude (J0). 2. Trois injections intraveineuses d'une cytokine sur animaux vigiles (avec pose de cathéter ou micro-perfuseur) pour induire le prurit et filmer pendant 2 heures à 30 ou 31 jours d’intervalles (J1, J30 et J61). 3. Quatre prélèvements sanguins sur animaux vigiles à 30 ou 31 jours d’intervalles (J0, J14, J30 et J61) pour analyses sanguines.

Impact sur les animaux

L’injection de la cytokine par voie intraveineuse provoque délibérément une démangeaison transitoire chez le chien qui se dissipe naturellement en 1 à 2 heures. Le chien peut se gratter, se lécher, se mordiller les pattes, le flanc ou la région anale, trottiner, secouer la tête et se frotter le corps. Aucune lésion durable n'est attendue. Un érythème au niveau des zones léchées ou grattées plus intensément est cependant possible et réversible très rapidement, soit en moins de 24 heures. Les effets indésirables potentiellement attendus suite à l’administration du produit d’essai ou de référence sont mini¬mes. Des troubles gastro-intestinaux et une réaction locale au site de l’injection peuvent être observés dans de rares cas. Au moment des prélèvements sanguins ou injections de produit par voie intraveineuse ou sous-cutanée, les animaux subissent une nuisance limitée liée au stress de la contention et de l’introduction de l’aiguille sous la peau entraînant une sensibilité légère et transitoire au point d’introduction.

Devenir

A l’issue du projet tous les animaux seront disponibles pour une autre projet, suite à un repos suffisant.

Remplacement

L'utilisation de chiens sur ce projet est justifiée car ils représentent l’espèce cible du produit et qu'il n’existe pas de méthode alternative pour ce type de test. Le produit d’essai est un anticorps monoclonal caninisé, tester son efficacité sur une autre espèce que l'espèce cible ne serait pas informatif. D’autre part, aucune étude alternative ne peut à ce stade remplacer l’étude sur l’espèce cible. Il s'agit d'une étude pilote "preuve de concept" avant de s’engager sur la voie des études d’enregistrement.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet correspond au minimum requis pour réaliser une preuve de concept. Ce nombre ne permet pas une analyse de non-infériorité mais permet d'une part de démontrer que le produit test réduit le prurit chez les chiens recevant le challenge avec la cytokine et d'autre part que cette réduction est comparable à celle du produit de référence, appliqué à la même dose.

Raffinement

La salle de test est séparée de la salle d’hébergement habituelle des animaux. Les chiens, par groupe de 3 individus, seront habitués à l’environnement de cette salle de test pendant minimum 14 jours avant le début de l’étude pour limiter leur stress. Des enrichissements seront présents dans les box (jouets, radio…). Durant l’étude, les volumes administrés respecteront les recommandations du Gircor en fonction de la voie d’administration. Après l’injection de la cytokine, les animaux seront filmés et suivis pendant 2 heures afin de détecter tout signe de prurit très intense. Dans ce cas, l’animal concerné sera pris en charge immédiatement. Les mesures mises en place dépendront de la gravité et la nécessité de l’exclusion de l’étude sera évaluée au cas par cas. Si les résultats du produit d’essai sont statistiquement inférieurs au produit de référence lors du premier test de la seconde phase expérimentale, l’étude sera stoppée. Il ne sera pas nécessaire de faire les 2 tests suivants. Durant toute la durée du projet l’état clinique des chiens sera suivi et documenté (poids, état de la peau, condition générale, appétit, état des selles). Des analyses hémato biochimiques sont prévues pour surveiller les paramètres physiologiques des animaux.

Choix des espèces

Le chien est l’espèce cible du produit testé. Le produit d’essai est un anticorps monoclonal caninisé, tester son efficacité sur une autre espèce que l'espèce cible ne serait pas informatif. Les animaux seront des adultes de 8 à 15 kg, correspondant au stade de développement indiqué pour le traitement.

2660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nouveau-nées, elles subissent sous anesthésie une injection chirurgicale dans l'oreille interne pour tester des thérapies géniques contre la surdité d'origine génétique. Le porteur renvoie les bénéfices au long terme, un éventuel passage en clinique après démonstration d'efficacité sur les modèles cellulaires et animaux. Il décrit le recours à l'animal comme "nécessaire", faute selon lui de méthode alternative validée pour prédire l'efficacité in vivo.

Objectifs

La surdité est le déficit sensoriel le plus fréquent ; il touche 1 enfant sur 1000 à la naissance, un enfant sur 700 avant l’âge adulte et un pourcentage important de la population adulte. On estime actuellement à 80 % les origines génétiques des surdités de l’enfant. La part génétique des surdités apparaissant à l’âge adulte reste à déterminer mais sera probablement importante. Plus de 100 formes génétiques différentes sont actuellement identifiées dans les surdités isolées. Les thérapies actuelles pour les pertes d’audition sont pour l’essentiel des dispositifs médicaux, qui amplifient le son ou stimulent directement les neurones de la cochlée. Ces deux approches présentent des limites en termes d’efficacité particulièrement pour la perception du son dans un environnement bruyant, car tous les sons vont être amplifiés de façon quasi identique. Les thérapies géniques, sont des solutions pour restaurer la fonction auditive perdue ou altérée, dans le cas de surdité d’origine génétique. Une des difficultés de la thérapie génique est de trouver une solution pour atteindre la cochlée. Il y a plusieurs obstacles à franchir pour atteindre cette cible en raison des particularités anatomiques et physiologiques de l’oreille interne. Ce projet a pour but de proposer un modèle vivo qui permettra de valider l’efficacité de thérapies géniques afin de traiter les pertes auditives.

Bénéfices attendus

A court terme, valider ou non la poursuite d’un programme de développement de thérapie génique pour traiter les troubles de l’audition. A long terme, permettre le passage en phase clinique de thérapies géniques qui auront démontré une efficacité dans les modèles cellulaires et vivo des troubles de l’audition.

Procédures

L’injection unique par chirurgie d’une durée de 30 minutes, dans l’oreille interne des nouveau-nés est réalisée sous anesthésie générale. Aucun prélèvement ne sera effectué sur l’animal vivant. Les tissus de l’oreille pour des analyses histologiques, seront prélevés post mortem.

Impact sur les animaux

Une anesthésie et une injection avec un abord chirurgical, chez le nouveau-né, pour l’administration des substances d’essais directement au niveau de la cochlée. Ceci pouvant engendrer une douleur et/ou inflammation/suppuration post-opératoire. Une euthanasie en fin d’étude pour collecter les tissus frais de l’oreille pour des analyses histologiques.

Devenir

Tous les animaux des procédures 1, 2 et 3 sont euthanasiés en fin d’étude. L’ immunohistologie est nécessaire pour confirmer l’efficacité des produits, et ne peut se faire que post mortem.

Remplacement

Le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe pas, à ce jour, de méthodes alternatives validées pour prédire l’efficacité in vivo les thérapies géniques en développement. Les atteintes des cellules ne peuvent pas être étudiées uniquement via la culture cellulaire ou les modèles informatiques car nous ne pouvons pas reproduire la complexité des mécanismes conduisant aux troubles de l’audition. Les candidats médicaments qui sont testés auront, lorsque c’est possible, préalablement démontré une activité sur des modèles vitro ou ex vivo afin de poursuivre les projets in vivo avec les candidats les plus prometteurs.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires a été évalué selon les résultats de la bibliographie. Entre 6 et 10 nouveau-nés sont nécessaires pour tester chaque vecteur (AAV).

Raffinement

Dans nos études, les impératifs éthiques associés tels que les modalités d’administration et de prélèvement, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique, la prévention de toute douleur, détresse ou inconfort chez l’animal seront intégrées. Les animaux disposent d’éléments participant à l’enrichissement de leur environnement et à l’améliorer des conditions d’hébergement. Apres administration intracochleaire, les nouveau-nés réveillés sont replacés avec les autres nouveau-nés de la portée. Des points limites spécifiques et adaptés sont mis en place afin de prévenir toute dégradation de l’état de santé des animaux. Un raffinement des techniques d’anesthésie est prévu dans la procédure N°1 afin d’obtenir la meilleure couverture anesthésique possibile.

Choix des espèces

La souris est l’espèce phylogénétiquement inférieure et est un modèle établi dans la littérature pour les études auditives. Les modèles de thérapie génique cochléaire sont développés chez le nouveau-né. Ceci en raison de l’abord chirurgicale qui est simplifié et d’autre part les nouveaux nés ne développent pas de pertes d’audition après l’acte chirurgical contrairement aux animaux adultes. C’est pourquoi ce stade de développement est le plus pertinent pour ce type de modèle. Les modèles de thérapie génique cochléaire sont développés chez le nouveau-né. Ceci en raison de l’abord chirurgical qui est simplifié et d’autre part les nouveau-nés ne développent pas de pertes d’audition après l’acte chirurgical contrairement aux animaux adultes. C’est pourquoi ce stade de développement est le plus pertinent pour ce type de modèle.

2880 poulets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont hébergés en cages individuelles avec restriction de mouvement puis soumis à un jeûne de dix-sept heures, pour mesurer la digestibilité d'aliments destinés à l'élevage de volailles. Le porteur décrit l'utilisation de l'espèce d'élevage comme "indispensable" puisqu'elle est la cible directe des résultats, et affirme qu'aucun modèle in vitro fiable n'existe. Les oiseaux sont tués en fin d'essai pour prélever les caecums, le porteur précisant qu'il est impossible de les donner ou de les commercialiser.

Objectifs

L'équipe met en place des essais de digestibilité sur poulets afin d’évaluer de la manière la plus précise possible la valeur nutritionnelle des matières premières, coproduits ou aliments destinés aux volailles. Les matières premières et coproduits ne cessent d’évoluer, par les changements des itinéraires techniques plus respectueux de l’environnement, l’apparition de nouvelles sources de protéines locales et l’optimisation des procédés qui génèrent des co-produits valorisables par les animaux. Les mesures de digestibilité permettent de faire le bilan entre les nutriments consommés par l’animal, ceux réellement absorbés et utilisés pour les fonctions physiologiques et de croissance, et ceux rejetés dans les déjections. Les résultats ainsi obtenus permettent aux fabricants d’aliments et aux éleveurs d’adapter au mieux la qualité nutritionnelle des aliments aux besoins des animaux. Cela contribue au maintien d’une flore digestive équilibrée (moins de fermentations indésirables) et à la bonne santé des animaux, mais aussi à réduire les rejets (azoté, phosphore, …) dans l’environnement. Dans ce type de protocole, l’utilisation de l’espèce d’élevage est indispensable, puisqu’il s’agit de la cible directe dans l’utilisation des résultats.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de poursuivre l’acquisition de données de digestibilité fécale chez le poulet nécessaires afin de formuler au mieux les aliments d’élevage pour limiter les désordres digestifs liées à un déséquilibre nutritionnel mais aussi les rejets dans l’environnement tout en développant les connaissances sur des matières premières, notamment locales. Les essais de digestibilité permettent d’évaluer des hypothèses de manière fine et donner des valeurs de référence de la valeur nutritionnelle d’une matière première ou d’un aliment avec un nombre d’animaux très réduit. Les résultats contribuent à alimenter les bases de données disponibles pour la filière, utilisables en France mais aussi à l’étranger ou l’accès à l’expérimentation est plus difficile (Tables d'alimentation). A long terme, les données issues de ce projet permettront d’affiner le développement déjà initié de méthodes de prédiction dans le proche infra-rouge de la digestibilité, directement en remplacement partiel ou total des essais en cage (et éventuellement des mesures sur fientes fraîches à terme et en élevage).

Procédures

Sans objet.

Impact sur les animaux

Les animaux subissent un hébergement collectif en cages puis en cages individuelles avec restriction de mouvement et enfin une période de jeûne de 17H. Les régimes alimentaires évalués ne sont pas de nature à produire des désordres digestifs ni perte de poids particuliers.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés. Des prélèvements pourront être faits sur les poulets selon les thématiques. Il est impossible des les donner ou commercialiser.

Remplacement

Les matières premières, coproduits et additifs utilisés en alimentation animale ont une « valeur biologique » variable. Ils peuvent varier avec l’espèce végétale, la variété, le procédé appliqué, l’ajout d’additifs, etc. La modélisation et les équations de prédiction ne peuvent donner que des valeurs moyennes qui ne rendent pas compte de cette variabilité et surtout pas de la variabilité entre animaux eux-mêmes. Seule l’évaluation sur animaux permet de mesurer avec précision la valeur nutritionnelle et le niveau de rejets d’un aliment et de tester des hypothèses dans la compréhénsion des phénomènes digestifs. De plus, à ce jour aucun modèle in vitro fiable n’existe.

Réduction

Tous les essais donnent lieu à des analyses statistiques. Le dispositif permet d’utiliser le plus petit nombre d’animaux (9 à 12) pour obtenir des différences statistiques ayant un sens biologique (3 % d’écart de digestibilité ou de performances) entre traitements (6 à 8 traitements). Les différences entre traitements sont le plus souvent étudiées avec une analyse de variance à un ou plusieurs facteurs, suivie d’un test en post-analyse, différent selon les besoins.

Raffinement

Plusieurs éléments contribuent à l’enrichissement du milieu. Les animaux ont une perception visuelle, auditive et olfactive des congénères (cages accolées et grillagées), même pendant les périodes en individuel. Un objet d’enrichissement (chaine) est installé dans chaque cage pour leur donner la possibilité de s’occuper, même si ce sont des animaux dont les activités principales restent le repos (50-70 % du temps) et l’alimentation (avec très peu d’activité exploratoire, qui diminue avec l’âge même dans un environnement d’élevage (en groupe et avec litière) surtout pour les poulets à croissance rapide. Cela peut différer pour les poulets à croissance lente, avec des périodes d'exploration plus importantes. Les périodes d’isolement sont réduites au maximum afin de laisser les interactions possibles (facteur d’enrichissement) pendant les périodes d’hébergement en groupe. Dans nos essais, les poulets à croissance rapide bougent peu du fait de leur tempérament, mais il est très rare d’observer des troubles locomoteurs dans nos installations. Nous travaillons sur une souche de poulet à croissance rapide car ce type d’élevage représente 80 % de la production française de poulet (et cette proportion avoisine les 95 % pour le reste de l’Europe). Comme nous produisons des références et des résultats qui sont utiles pour les éleveurs (à travers les fabricants d’aliments), il est normal de travailler sur la production majoritaire sur le territoire.

Choix des espèces

L’espèce utilisée est le poulet, et plus précisément des animaux des souches commerciales, retrouvées en élevage (à croissance rapide ou croissance lente). L’utilisation digestive des nutriments est spécifique à chaque espèce. Les données issues de ces essais permettent d’alimenter les matrices de formulation qui servent à calculer les apports nutritionnels des aliments, afin de les adapter au mieux aux besoins des volailles, sans rejets. Ce sont des animaux en croissance, le stade physiologique où les besoins des animaux sont les plus importants et variables.

Bloquées jusqu'à quatre fois, éveillées, au fond d'un tube en plastique pour mesurer leur masse grasse, 1 392 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. 384 d'entre elles subissent une neurochirurgie sous anesthésie pour recevoir un implant ou un virus qui modifie leurs microglies, 128 une seconde chirurgie, 704 un test de tolérance au glucose après cinq heures de jeûne, et jusqu'à 448 passent deux semaines isolées en cage de calorimétrie. L'équipe nourrit des souris d'un régime hypercalorique riche en graisses pour étudier le rôle de ces cellules immunitaires du cerveau dans l'inflammation de l'hypothalamus et la prise de poids, avec l'ambition, à terme, de pistes contre l'obésité. Le porteur annonce six procédures mais ne liste que les "principaux gestes techniques", sans préciser combien de temps dure ce régime.

Objectifs

Afin d’envisager de nouvelles thérapies pour lutter contre l’obésité et ses comorbidités, il est nécessaire de mieux connaître les phénomènes biologiques qui régulent la prise alimentaire et le poids corporel. Une région du cerveau appelé hypothalamus regroupe des neurones sensibles aux signaux des autres organes du corps, les renseignant sur l’état énergétique de l’organisme. La consommation d’un régime hypercalorique riche en graisses (High fat diet, HFD) entraîne une inflammation de l’hypothalamus. On sait que les microglies, qui sont les cellules immunitaires du cerveau (qui protègent le cerveau des attaques extérieures), sont aussi impliquées dans la régulation du poids corporel. En effet, elles participent à l’inflammation hypothalamique suite à la consommation d’un régime HFD. Leur activation est variable en fonction de la période d’exposition au régime HFD (entre les premiers jours et plusieurs semaines). On sait que limiter l’activation des microglies en réponse au HFD limite l’inflammation. Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués dans ces cellules restent mal connus. Nous faisons l’hypothèse que certaines molécules microgliales, qui sont impliquée dans les fonctions inflammatoires, participent aussi à la régulation de la prise de poids. Dans ce projet, nous souhaitons présicer le rôle des microglies dans le développement de l’inflammation hypothalamique en réponse à un régime hypercalorique afin de mieux les contenir et ainsi de prévenir la prise de poids. Notre ambition à terme est de permettre l’ouverture de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints d’obésité. Pour cette étude, nous allons utiliser des approches pharmacologiques et génétiques (utilisation d’animaux transgéniques). Nous utiliserons un modèle animal d’obésité, c’est-à-dire des animaux nourris avec une alimentation hypercalorique obésogène. Nous réaliserons un suivi métabolique chronique des animaux (prise alimentaire, tests métaboliques), ainsi que de nombreuses études moléculaires à partir des cellules cérébrales isolées. Ce projet comprend six procédures.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre le rôle de la microglie dans le développement de l'obésité et les dérèglements métaboliques en réponse à un régime riche en calories, ainsi que les changements inflammatoires sous-jacents dans le cerveau. Dans une perspective thérapeutique à plus long terme, ces données seront utiles pour des tentatives de modulation de la microglie afin de contrer les troubles métaboliques, dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse.

Procédures

Voici la liste des principaux gestes techniques réalisés sur les animaux. 1) Analyse de la composition corporelle : cette analyse nécessite que la souris vigile soit maintenue en contention, pour une durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris subiront 1 à 4 analyses de ce type au cours de ce projet, espacées au minimum de 3 semaines (1392 animaux). 2) Neuro-chirurgie : cette technique permettra soit de mettre en place un implant permettant d’injecter des traitements pharmacologiques, soit un virus qui permettra un changement génétique des microglies. Elle est réalisée sous anesthésie générale. Une seule neuro-chirurgie sera effectuée dans la vie de l’animal (384 animaux). Une partie des 384 animaux subiront une seconde chirurgie de courte durée (10 minutes, 128 animaux) pour le remplacement d’un implant sous-cutané. 3) Test de tolérance au glucose : ce test nécessite de réaliser, après un jeûne de 5 heures, une injection de gluocose dans l’abdomen des souris, puis de mesurer leur glycémie à différents temps post-injection. Les 5 mesures de glycémie sont espacées d’au moins 15 minutes chacune. Ce test est réalisé sur souris vigiles. Un seul test sera réalisé durant toute l’étude (704 animaux). 4) Tests de calorimétrie indirecte (448 animaux concernés au maximum) : ces cages spéciales permettent d’enregistrer en temps réel la consommation de nourriture, d’eau, d’oxygène et la dépense énergétique. Elles nécessitent d’isoler l’animal en cage individuelle (pendant deux semaines), qui sont enrichies avec un nid de coton et un bâtonnet de bois à ronger.

Impact sur les animaux

Dans notre étude, les animaux seront parfois isolés à l’âge adulte (suite à une chirurgie ou lors des sessions de cages métaboliques). Cet isolement est nécessaire pour quantifier la consommation de nourriture de chaque animal ou limiter la dégradation des implants. Au-delà du stress d’isolement social, ces animaux subiront un stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle, qui se déroule dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. Les nuisances les plus importantes sont attendues lors de la neuro-chirurgie. L’incision de la peau du crâne et la déshydration induite par l’anesthésie peuvent provoquer des douleurs post-opératoires.

Devenir

À l’issue de toutes les procédures, tous les animaux seront euthanasiés pour récupérer des tissus, afin de réaliser des analyses in vitro supplémentaires, qui nous apporteront des informations cruciales sur les conqéquences des changements moléculaires microgliaux.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre le rôle de la microglie hypothalamique sur un ensemble de variables métaboliques intégrées, telles que le poids, la composition corporelle et la régulation de la glycémie. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu adipeux…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude. A noter, ce projet a d’abord fait l’objet d’études réalisées in vitro (cultures cellulaires) afin de mieux cibler les voies de signalisation impliquées dans notre hypothèse. De plus, les modèles génétiques nécessaires pour répondre à notre question scientifique ont été développés chez la souris.

Réduction

Nous avons utilisé un test de puissance statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil spécifique qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 3 ou 7 semaines et seront habitués pendant 1 semaine. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux en réponse à l’expérimentateur. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite parfois la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier, un tunnel en carton pour se cacher et de bâtonnets en bois pour ronger. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Notre étude nécessite une chirurgie stéréotaxique, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès l’induction, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis : ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et le métabolisme glucidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. De nombreux modèles génétiquement modifiés existent et permettent l’étude de mécanismes moléculaires précis. De plus, la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, l'inflammation hypothalamique et la réactivité microgliale induite par un régime obésogène est retrouvé à la fois chez la souris et chez l’Homme. Toutes les souris de cette étude seront adultes, elles arriveront entre 3 et 7 semaines d’âge dans notre animalerie, mais nous ne commencerons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est celui auquel on estime que le crâne a fini sa croissance, ce qui nous permet d’utiliser des atlas de référence pour la réalisation de la neuro-chirurgie.

384 souris, 192 mâles et 192 femelles, porteurs ou non d'une mutation du récepteur Rarb, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès 4 semaines d'âge, elles sont gavées une fois par jour pendant quatre semaines avec l'un de trois traitements ou une solution saline, puis passent cinq tests : locomotion face à la nouveauté, coordination des membres, activité locomotrice enregistrée sur 32 heures, réflexes et mémoire, avant que la moitié soit tuée par perfusion intracardiaque sous anesthésie générale. Le porteur espère prévenir ainsi les symptômes d'une maladie neurologique rare, la MCOPS12, un bénéfice qu'il formule au conditionnel. Il qualifie ces tests de "non aversifs" et écrit en capitales que la souris "N'EST PAS REMPLAÇABLE".

Objectifs

Des mutations ponctuelles du recepteur à l’acide rétinoique beta (Rarb) sont à l’origine d’une maladie neurologique rare (MCOPS12) responsable de symptomes cognitifs et moteurs importants et progressifs. En effet, cette pathologie possède un caractère neurodeveloppemental ainsi qu’un caractère neurodégénératif (perte progressive de mobilité, perte de la coordination des membres), avec un pronostic vital ne dépassant pas l’adolescence. Des modèles murins de cette pathologie ont été générés et nous permettront d’étudier les mécanismes associés à ces mutations ponctuelles. Les souris mutantes présentent des symptomes moteurs similaires (n’affectant pas fondamentalement la vie des animaux qui peuvent marcher et se redresser sans aucun problème) à ceux observés chez les souris porteuses d’une mutation invalidant complètement l’activité du récepteur. Nos études antérieures ont permis d’identifier le rôle du récepteur dans le dévelopement et dans la fonction du striatum, la structure cérébrale impliquée dans le contrôle moteur et la cognition. Nous avons montré que pendant le développement embryonnaire RARb contrôle le développement d’une sous-population de neurones (appelés neurones de type 1) dans le, alors que à l’âge adulte nous avons identifié son rôle dans la neuroprotection d’une autre sous population de neurones (appelés neurones de type 2). Notre objectif est de prévenir et/ou de normaliser les symptomes moteurs et cognitifs en modulant l’activité des neurones de type 1 et 2 afin de prévenir leur mort et/ou leur dysfonctionnement pour éviter l’apparition des symptomes. Les effets liés au mode d’administration des traitements seront contrôlés grâce à un traitement supplémentaire avec une solution saline, pour s’assurer qu’aucun effet observé ne soit en réalité que le résultat du stress causé par l’administration des composés. Nous avons donc 4 traitements différents à tester.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait apporter de nouvelles pistes de traitements pour la maladie sur laquelle nous travaillons. En effet, notre objectif est de prévenir l’apparition des symptomes moteurs et cognitifs grâce aux différents traitements que nous allons utiliser en empêchant la perte de certains neurones responsables de ces symptomes. Si un ou plusieurs traitement(s) montre(nt) des effets bénéfiques, nous pourrions envisager une nouvelle stratégie thérapeutique pour les patients.

Procédures

Les trois traitements pharmacologiques et le traitement contrôle avec de la solution saline (4 traitements différents) se feront sur des cohortes différentes provenant de 4 groupes distincts d’animaux porteurs, ou non, d’une mutation et agés de 4 semaines. Tous les traitements se feront par voie orale (gavage des animaux, 15 secondes par traitement) pendant 4 semaines, à raison d’un traitement par jour. Nous utiliserons 12 animaux par groupe et par traitement (12 x 4 x 4), soit 192 mâles et 192 femelles = 384 animaux au total. Les 4 semaines de traitement seront suivies d’une batterie de tests comportementaux non aversifs que chaque animal passera une seule fois : test 1 = 30 minutes, évaluation de la locomotion induite par la nouveauté, test 2 = 3 x 5 minutes, évalution de la coordination des membres, test 3 = 32h, évaluation de l’activité locomotrice, test 4 = 30 minutes, évaluation des reflexes, test 5 = 30 minutes, évaluation de lé mémoire. Un delai minimum de 1 jour sera respécté entre chaque test comportemental, afin de diminuer l’effet du stress sur les résultats obtenus. La moitié des animaux de chacun des 4 traitements = 192 animaux (96 mâles et 96 femelles), sera ensuite euthanasiée par perfusion intracardiaque après anesthésie générale. Une vérification de la perte des reflexes au niveau des membres et palpébral est réalisée avant tout acte chirurgical.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables ne dépasseront pas la gêne occasionnée par le gavage des animaux. En effet, les tests comportementaux effectués ne sont pas sujet à causer de la souffrance. Une légère modification de l’activité motrice et cognitive est à prévoir après les traitements, sans toutefois causer d’effets indésirables. Ces effets légers seront perceptibles jusqu’à deux heures après le traitement.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisé seront mis à mort afin de récolter le matériel biologique pour des analyses cellulaires et moléculaires qui compléteront les résultats obtenus en comportement.

Remplacement

Le modèle murin N’EST PAS REMPLAÇABLE et reste indispensable afin d’évaluer l’impact des mécanismes biologiques sur le comportement moteur ainsi que pour étudier les réseaux neuronaux dans leur ensemble. En effet, la complexité biologique de la signalisation calcique et de la neurotransmission ne permet par de remplacer les animaux par des modèles mathématiques ou in vitro, parce qu’il ne reflettent pas la diversité des mécanismes biologiques observés in vivo.

Réduction

Afin de REDUIRE au maximum le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d'animaux utilisé (groupe de 12) correspond au nombre minimal d'animaux à inclure pour obtenir des données statistiquement exploitables selon les impératifs de réduction. Ces effectifs ont été déterminés d'après les données de la littérature et les procédures en vigueur à l'animalerie. Nous nous sommes basés sur des données obtenues à la suite du test Openfield (le moins discriminant des tests effectués ici) ainsi que sur des données comportementales obtenues à la suite d’injection de composés pharmacologiques. Une différence significative entre les groupes (de même sexe) sera recherchée. De plus, nous n’utiliserons qu’un seul groupe d’animaux traités avec le vehicule (contrôle). En effet, les différents traitements seront préparés et administrés de la même manière, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux contrôle. Enfin, la réalisation de la procédure numéro 2 dépendra des résultats obtenus dans la procédure numéro 1. En effet, nous n’utiliserons la seconde procédure uniquement si les résultats de la première procédure ne sont pas concluants. En effet le caractère moins séléctif de la seconde molécule, permettra de moduler la signalisation calcique plus largement.

Raffinement

En vue de RAFFINER les procédures, les animaux sont hébergés dans des conditions optimales et ils font l’objet d’un suivi adapté et de soins vétérinaires au besoin. Les expériences réalisées ici ne sont pas douloureuses et effectuées par des personnes compétentes et qualifiées (formations conception et chirurgie des rongeurs). Elles consistent uniquement en des études comportementales, effectuées avec ou sans traitement préalable de composés pharmacologiques à des doses faibles. Les molécules pharmacologiques permettent de révéler des dysfonctionnements ou de limiter/supprimer le phénotype. Les traitements par gavage seront réalisés par des expérimentateurs formés à l’aide de canules souples afin d’éviter toute lésion interne. Un suivi du poids des animaux sera mis en place deux fois par semaine (le mardi et le vendredi), afin de detecter rapidement un signe de mal être. Les animaux seront aussi analysés méticuleusement tous les jours à l’occasion des traitements afin de vérifier leur état général.

Choix des espèces

Pour étudier le rôle des mutations d’un gène dans la mise en place et la progression d’une maladie neurologique progressive rare, les performances comportementales et les fonctions de la signalisation calcique, la souris est un modèle optimal du fait de la similitude des génomes murin et humain et de la disponibilité de différentes lignées porteuses de mutations géniques ciblées permettant de couvrir l’ensemble des processus physiopathologiques : neurodégénérescence et neurodéveloppement. Pour les tests programmés nous utiliserons dans la plupart des cas des animaux de 4 semaines afin d’oberver les changements de comportements des animaux à la suite des traitements, avant même l’apparition de des symptomes.