Procédures modérées

Traitées par l'alimentation, par gavage ou par injection intrapéritonéale, pendant un à trois jours ou chaque jour de leur 25e à leur 90e jour de vie, des souris porteuses d'un variant du gène Kcnq2 font des crises d'épilepsie spontanées et passent des tests d'apprentissage et de mémoire que le résumé ne nomme pas. 960 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur système nerveux central. L'équipe prévoit de tester 20 molécules, et un résultat favorable servirait de base à une demande d'essai clinique chez l'enfant. Le porteur écrit qu'aucun "effet indésirable particulier n'est attendu", puis qu'une crise spontanée peut conduire "à la mort de l'animal".

Objectifs

Des variants pathogènes dans le gène KCNQ2 provoquent une épilepsie dans l'espèce humaine. Cette épilepsie se manifeste par de fréquentes crises survenant durant les tous premiers mois de vie (avant l'âge de 3 mois). Cette activité épileptique est accompagnée d'une détérioration des fonctions cognitives et motrices. Il n'existe pas de traitement et les anti-épileptiques classiques sont inefficaces. Nous étudions une souris modèle knock-in porteuse d'un variant récurrent du gène KCNQ2 (T274M). La souris hétérozygote pour ce variant reproduit les caractéristiques principales de la maladie humaine. Ce modèle permet de mieux comprendre la pathophysiologie de la maladie et de tester de nouvelles approches thérapeutiques. Ce modèle est le premier (et le seul pour le moment) qui puisse permettre de tester des approches thérapeutiques sur organisme entier dans un contexte valide par rapport à la pathologie humaine. Le projet comporte la stabulation d'animaux à phénotype dommageable, leur traitement par des candidats médicaments et l'évaluation de leur phénotype sur le plan des crises d'épilepsie et des capacités cognitives. A l'heure actuelle, il existe des molécules qui vont atténuer les crises d'épilepsie chez les enfants présentant une épilepsie liée au gène KCNQ2 (par exemple la carbamazépine). La multiplicité des traitements subis par ces enfants et leur hétérogénéité (clinique et génétique) ne permet cependant pas d'établir clairement si les traitements efficaces sur les crises le sont aussi sur le développement neurologique. Il s'agit pourtant d'une question essentielle. Pour l'ensemble de ce projet, nous envisageons de tester 20 molécules. Nous avons pour objectif d'identifier des molécules qui apporteront un bénéfice en terme de neurodéveloppement. Si le traitement est efficace, nos souris modèle devront présenter moins de crise mais aussi avoir un neurodéveloppement le plus normal possible.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments dans un modèle unique d'encéphalopathie épileptique. Si un candidat médicament s'avère efficace pour diminuer les crises d'épilepsie et pour améliorer les déficits cognitifs dans le modèle, les résultats serviront de base à une demande d'essai clinique dans l'espèce humaine.

Procédures

Traitements pharmacologiques par l'alimentation, par gavage ou injection intrapéritonéale en fonction des candidats médicaments. Traitements aigus (1 à 3 jours) ou chroniques (entre P25 et P90) en fonction de la pharmacocinétique des composés testés. Prélèvements sanguins en fin de protocole pour estimer la biodisponibilité des composés ou de leurs métabolites et confirmer l'exposition.

Impact sur les animaux

Etant donné que les molécules administrées sont censées avoir un effet antiépileptique, nous attendons une amélioration du phénoptype des anilmaux (moins de crises, meilleures capacités d'apprentissage). Aucun effet indésirable particulier n'est attendu. Dans le pire des cas, les candidats médicaments n'auront pas d'efficacité. S'ils aggravent le phénotype (voir suivi des animaux ci-dessous), les traitements seront alors immédiatement interrompus. Dans ce modèle, il est également possible que les animaux présentent une crise spontannée conduisant à la mort de l'animal.

Devenir

Les animaux sont conservés pendant la durée de la procédure (traitement, évaluation des améliorations phénotypiques, prélèvement sanguin) puis euthanasiés en fin de procédure afin de prélever le système nerveux central pour réaliser des analyses histologiques, transcriptomiques et protéomiques.

Remplacement

Les épilepsies sont provoquées par des décharges inadaptées de cellules excitables en réseau. Les crises ainsi générées se traduisent, le plus souvent, par des mouvements anormaux. Pour étudier la pathologie dans toutes ses dimensions et espérer pouvoir produire des résultats qui seront transférables à l'espèce humaine, il est nécessaire d'avoir recours à un modèle animal car les cellules isolées ne récapitulent pas ce qui se passe dans un cerveau entier. Le gène Kcnq2 est très conservé entre la souris et l'Homme. Les tests phénotypiques sont bien développés dans cette espèce. Le modèle que nous utilisons est le premier et le seul disponible pour le moment pour cette pathologie. Avant que le modèle vivant ne soit utilisé, les médicaments candidats ont été testés sur des modèles cellulaires in vitro et dans des neurones dérivés de modèles iPS avant d'en préciser les caractères de d'efficacité et de toxicité éventuelle. L'étude des capacités d'apprentissage et de mémorisation ne peut être effectuée que sur l'animal vivant.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé sera optimisé et calculé de façon à ce que les effets attendus puissent être détectés avec un niveau de significativité suffisant tout en garantissant la sécurité des résultats s'ils doivent être utilisés ultérieurement pour justifier un essai clinique pédiatrique.

Raffinement

L'hébergement est adapté aux besoins physiologiques des animaux et permet l'expression de leur gamme normale de comportements. La méthode d'administration des traitements la moins contraignante possible sera utilisée (dans les croquettes servant d'alimentation à chaque fois que cela est possible). Des points limite clairs sont définis et les animaux seront euthanasiés lorsqu'ils atteindront les critères d'interruption.

Choix des espèces

Les souris génétiquement modifiées sont un modèle qui permet de modéliser une pathologie humaine car il s'agit de mammifères disposant d'un répertoire génétique très similaire à celui de l'espèce humaine. La technologie de recombinaison homologue utilisée pour générer le modèle utilisé est parfaitement au point dans cette espèce et a permis de générer des centaines de modèles pertinents pour étudier les maladies humaines et pour développer des traitements spécifiques. Les souris seront traitées au moment où apparaissent les crises d'épilepsie spontanées dans ce modèle et uniquement chez des animaux sevrés (entre P25 et P30). La suppression des crises d'épilepsie est le premier critère de jugement d'efficacité de la molécule testée. Le traitement pourra se poursuivre quotidiennement jusqu'à P90 où l'évaluation finale de leur comportement sera effectuée (tests d'apprentissage et mémorisation). Dans l'espèce humaine, la maladie est sporadique (sans histoire familiale) et n'est donc détectée chez un nourrisson qu'au moment où les premières crises apparaissent. Nous nous placerons donc dans ce même cas de figure avec les animaux modèles étudiés ici, traités au moment où leur pathologie se manifeste.

94 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du sein triple négatif leur sont greffées dans la glande mammaire sous anesthésie, puis la tumeur est mesurée trois fois par semaine, pour cette étude pilote sur le rôle de l'enzyme IL4I1. Le porteur indique que 20 à 30 % des souris peuvent développer une ulcération ou une nécrose de la tumeur, et fixe un volume de 1 500 mm³ comme point limite. Il justifie la mise à mort par une croissance tumorale "inéluctable" et affirme que le contrôle de la tumeur par le système immunitaire ne peut pas être modélisé in vitro.

Objectifs

Rationnel : IL4I1 est une enzyme immunosuppressive (elle empêche le système immunitaire de fonctionner). Sa production dans les tumeurs est associée à des paramètres de mauvais pronostic ou une survie diminuée des patients atteints de différents types de cancers. Nos données préliminaires montrent qu’elle est présente dans les cancers du sein dits « triple-négatifs », une forme agressive de cancer mammaire, pour laquelle les traitements actuels sont peu efficaces, y compris les nouvelles immunothérapies. L’inhibition d’IL4I1 (par invalidation du gène qui code l’enzyme ou administration d’un inhibiteur chimique de l’activité enzymatique) réduit la croissance tumorale dans différents modèles murins, en particulier, l’inhibition d’IL4I1 freine la croissance de modèles de cancer du pancréas et de mélanome. Objectif : Dans cette étude pilote, nous souhaitons vérifier la pertinence de l’invalidation d’IL4I1 pour améliorer le contrôle de la croissance tumorale des cancers du sein triple-négatifs, en utilisant une lignée tumorale murine modèle de ces tumeurs (EO771). Stratégie envisagée : Nous allons greffer des cellules tumorales EO771 dans la glande mammaire de souris syngéniques afin de développer un modèle orthotopique immunocompétent. Nous testerons l’effet de l’invalidation d’IL4I1 sur la croissance tumorale en comparant les courbes de croissance des tumeurs développées chez les souris de la souche naturelle (WT) à celles des tumeurs développées chez les souris déficientes en IL4I1 (IL4I1-/-).

Bénéfices attendus

L’étude pilote permettra de valider l’intérêt d’étudier le rôle d’IL4I1 dans le développement du cancer du sein triple négatif. Dans un deuxième temps (saisine future), une fois cette preuve de concept obtenue, le projet permettra de mettre au point chez la souris un modèle de traitement reposant sur l’inhibition d’IL4I1 avec un composé chimique et d’étudier les mécanismes immunitaires sur lesquels repose l’effet thérapeutique.

Procédures

Injection lente et continue d’une suspension cellulaire en tampon salin dans la glande mammaire (volume = 100 microlitres) sous anesthésie à l’isoflurane. L’injection dure moins d’une minute. Mesure de la tumeur (croissance superficielle) avec un pied à coulisse sur animal vigil, 3 fois par semaine pendant 2 semaines. La mesure dure moins d’une minute par animal.

Impact sur les animaux

L’anesthésie limite le stress lié à la contention et améliore la précision de l’injection. Une injection précise permet une croissance harmonieuse et localisée de la tumeur et ainsi limite le risque de souffrance. Malgré ces précautions, dans 20 à 30% des effectifs, il peut apparaitre une ulcération, une nécrose ou un suintement localisé au niveau de la tumeur qui représente un point limite. Un volume tumoral de 1500 mm3 (atteint habituellement 3 semaines après injection) est également considéré comme un point limite.

Devenir

La croissance tumorale est inéluctable, les animaux doivent donc être mis à mort en fin d’expérimentation.

Remplacement

Le contrôle de la croissance tumorale par le système immunitaire ne peut pas être modélisé in vitro, car il implique de très nombreuses interactions cellulaires et moléculaires coordonnées au cours du temps dans l’organisme entier. Bien qu’imparfait, le modèle murin reste d’utilisation courante pour ce type d’étude.

Réduction

Nous souhaitons observer une réduction d’au moins 20% de la croissance tumorale dans le groupe de souris IL4I1-/- (souche invalidée pour l’expression d’IL4I1) par rapport au groupe contrôle (souche naturelle), de façon à pouvoir considérer cette diminution comme biologiquement significative. Si on considère que cet effet devra être visible lorsque la tumeur du groupe contrôle aura atteint un volume de 500 mm3 (environ 18 jours après injection de 0,25x10E6 cellules), la variance habituelle à cette date étant de 150 mm3, le nombre de souris à tester par groupe est de 36. Les animaux qui seraient mis à mort avant la fin de l’expérimentation ne pourraient pas être pris en compte. Sachant que jusqu’à 30% des animaux auront atteint un point limite avant J18 du fait de lésions au niveau de la tumeur, il faut prévoir 30% d’animaux supplémentaires par groupe, soit 0,3x36 + 36 = 47 animaux par groupe. Des courbes d’incidence de l’apparition des tumeurs et de survie (Kaplan-Meier) seront réalisées en parallèle. L'estimation du nombre d'animaux nécessaires sur la base d'une différence de 30% de la survie est de 45 animaux par groupe en tenant compte des 30% d'animaux non évaluables. Dans le cas où cette différence atteindrait 40%, 28 animaux par groupe seraient suffisants. La totalité de cet effectif ne sera pas inclus dans une seule expérimentation, permettant d'adapter le nombre d'animaux inclus aux résultats obtenus. Habituellement, nous incluons 8 à 12 animaux par groupe et par expérimentation. Ainsi, la procédure sera arrêtée dès qu'une différence statistique entre les deux groupes sera obtenue.

Raffinement

Les animaux bénéficient de mesures d’enrichissement du milieu. L’injection des cellules tumorales sera faite sous anesthésie (isoflurane, 4% pour induction, 2% pour maintien), ce qui limite le stress pour les animaux et augmente la précision de l’injection dans la glande mammaire. Le suivi des souris sera réalisé 3 fois par semaine par le même opérateur, à partir du huitième jour après injection. La taille des tumeurs sera mesurée avec un pied à coulisse. Le comportement et l’aspect général des animaux ainsi que l’aspect de la tumeur seront évalués de façon à détecter précocement des signes de souffrance (tels que ralentissement des mouvements, tremblements, perte de poids) ou un point limite (tel que nécrose de la tumeur) qui nécessiteraient d’interrompre l’expérimentation pour cet animal.

Choix des espèces

Notre projet s’intéresse au contrôle de la croissance du cancer du sein triple négatif par le système immunitaire (précisément par l’enzyme IL4I1 qui joue un rôle de frein de la réponse immunitaire contre le cancer). Seule la souris permettra d’étudier la croissance d’une lignée murine reconnue comme modèle de cancer du sein triple négatif. Souris adultes (plus de 6 semaines). Le cancer du sein est une tumeur de l’adulte.

720 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans une procédure impliquant un niveau de souffrance modéré, 120 tuées pour des prélèvements et 600 remises dans un circuit d'élevage. Après douze semaines de nutrition, ces alevins subissent un stress de confinement de dix minutes destiné à mesurer leur réponse physiologique, pour définir le ratio d'acides gras essentiels de leur aliment. Le porteur indique que le confinement fait monter le cortisol et la consommation d'oxygène, et affirme que le retour à de bonnes conditions limite les nuisances. Il conclut que l'étude porte sur le métabolisme et la résistance au stress et ne peut être menée ni sur lignée cellulaire ni par modélisation, l'objectif affiché étant de remplacer la farine et l'huile de poisson dans les aliments d'aquaculture.

Objectifs

La composition optimale des acides gras alimentaires est une condition préalable à la réussite de l'élevage des alevins de poissons. Un apport adéquat d'acides gras essentiels au cours des premiers stades de développement des alevins de poisson est essentiel pour la progression normale de la neurogenèse (formation de neurones fonctionnels) et ainsi le développement du cerveau. Pour les alevins de poisson, la substitution de l'huile de poisson par des huiles végétales peut potentiellement entraîner des déficiences ou des déséquilibres en acides gras essentiels chez les alevins de poissons, qui ont été impliquées dans une variété de troubles, telles qu'une réponse retardée et accrue au stress, une réduction de l'activité phagocytaire contre les pathogènes, la réduction de la réactivité aux stimuli auditifs et de l'acuité visuelle, une altération du développement cérébral. Dans ce contexte, il est nécessaire de déterminer les besoins en acides gras essentiels des alevins de truite arc-en-ciel dès leur premier repas pour pouvoir établir les effets sur la physiologie métabolique du poisson ainsi que sur leur capacité de tolérance au stress pour à terme pouvoir remplacer, de la manière la plus adaptée aux besoins du poisson, la farine et l’huile de poisson dans les aliments aquacoles. Pour répondre à cela, un essai d’alimentation de 12 semaines comprenant 8 traitements sera conduit en triplicat sur des truites arc-en-ciel dès leur premier repas élevées dans des conditions optimales. Au total, 7200 poissons seront utilisés pour cet essai d'alimentation soit 900 poissons par traitement. Les 8 traitements correspondront à 8 aliments présentant des profils en acides gras différents. Les aliments sont formulés sur la base de la composition des aliments actuellement commercialisés chez la truite, de façon à couvrir l’ensemble des besoins nutritionnels de l’animal. Après 12 semaines de nutrition, afin d’évaluer la capacité des alevins à tolérer un stress, en d'autres termes la robustesse des alevins, en fonction de l’aliment reçu, un sous-groupe de 720 poissons (n=90 par traitement) sera soumis à un stress de confinement pendant 10min puis remis dans de bonnes conditions. Le reste des poissons mis en élevage ne sera pas stressé.

Bénéfices attendus

Cette expérimentation permettra de définir le ratio optimal en acides gras essentiels dans l’aliment à destination des alevins de truite arc-en-ciel dès leur premier repas pour déterminer l’influence de différents apports en acides gras essentiels par la nutrition sur la sensibilité et la résilience à un stress chez la truite arc-en-ciel et donc des indications sur sa robustesse. Malgré le contrôle des conditions d’élevage, les poissons sont soumis à de multiples perturbations liées aux systèmes de production ou aux variations de leur milieu. Ces perturbations peuvent être à l’origine d’une augmentation de la fragilité des animaux et d’une dégradation de leur bien-être et de leur état de santé. Favoriser la robustesse des poissons est donc une solution pour lutter contre ces perturbations. L'expérimentation permettra d’établir chez la truite arc-en-ciel le lien entre la nutrition en acides gras (stockage, mobilisation et transfert des acides gras), et la réponse physiologique face à un stress (paramètres liés au bien-être, aux systèmes immunitaire et inflammatoire). Cette expérimentation servira de base pour la définition de formules alimentaires durables (sans huile et farine de poisson) adaptées le plus possible aux besoins nutritionnels des alevins de truite dès leur premier repas afin de favoriser la robustesse du poisson.

Procédures

Un sous-groupe de poissons (720) sera soumis après 12 semaines d'élevage à un stress de confinement de 10 min suivi par un retour dans de bonnes conditions d'élevage.

Impact sur les animaux

L'élevage ne créera aucune nuisance ou effet indésirable sur les animaux car c'est un protocole classique d'élevage avec des aliments qui répondent entièrement aux besoins nutritionnels des poissons. Le stress de confinement (procédure expérimentale réalisée sur 720 poissons) a été réduit au temps minimal permettant de voir une réponse physiologique au stress. Il entrainera une hausse de l'hormone de stress (cortisol) qui entrainera une hausse de la consommation en oxygène. Le retour à de bonnes conditions dès la fin du stress entrainera dans un premier temps une augmentation de l'activité de nage du poisson puis ensuite le poisson reviendra progressivement à son état physiologique avant stress (dans les 2h suivant le stress), cela permettra donc de limiter au maximum les nuisances chez le poissons.

Devenir

120 poissons stressés seront euthanasiés 40 minutes après le stress de confinement pour des prélèvements biologiques en vue d'analyses biologiques. Le confinement est généralement considéré comme un défi stressant pour les poissons, mais, contrairement aux facteurs de stress tels que les changements de température, la disponibilité de l'oxygène ou les infections parasitaires, le confinement ne remet pas directement en cause l'état de santé du poisson donc n'impactera la future vie du poisson. Ainsi, les 600 poissons restants stressés par confinement non utilisés pour les prélèvements biologiques seront remis dans un circuit classique d'élevage mais ne serviront plus à des expérimentations animales.

Remplacement

L'étude porte sur l'impact d'un régime alimentaire sur le métabolisme et la résistance au stress des animaux, elle ne peut donc pas être appréhendée sur lignée cellulaire ou par modélisation.

Réduction

Pour une espèce comme la truite, il est nécessaire d’avoir une biomasse d’élevage minimale d’élevage pour optimiser le bien-être de l’animal et éviter tout comportement agressif (relation dominant/dominé). Une faible densité d’élevage altère la survie, la croissance et l'efficacité alimentaire de la truite arc-en-ciel avec une altération de ses réponses physiologiques. Afin de réduire au maximum le nombre de poisson mis en élevage tout en maintenant une densité d’élevage optimale, les poissons seront élevés lors des premiers jours dans des petits paniers (20x20cm) placés dans des bassins avec un renouvellement d’eau important. Ensuite, les poissons, lorsqu’ils auront atteint la taille de 0.5 gramme, seront transférés dans des cages plus grandes (60 x 60 cm) toujours dans une optique de préserver une biomasse d’élevage optimale. Les effectifs ont donc été calculés à partir de données d’expérimentations précédentes et de la littérature pour maintenir des densités d’élevage optimales qui ne modifient pas le comportement des poissons ainsi que ses réponses physiologiques. Le nombre d’individus à utiliser a ainsi été réduit le plus possible (en adaptant la taille des paniers à celle des poissons) mais calculé pour obtenir des résultats statistiquement fiables. En effet, des études antérieures sur la nutrition des alevins de la truite arc-en-ciel nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux nécessaires pour ce projet. La croissance, ainsi que le métabolisme des alevins de truite arc-en-ciel, est sujette à une très forte variabilité. Ainsi, le nombre d'animaux utilisés a été calculé au plus juste pour permettre de détecter des différences pour les paramètres physiologiques, biochimiques et moléculaire étudiés. Pour la mise en place du stress par confinement, nous avons prévu un nombre d'animaux minimal en réalisant le stress dans une petite épuisette permettant de réaliser le stress de confinement dans les meilleures conditions possibles

Raffinement

Les mesures de raffinement viseront à assurer des conditions optimales d’hébergement des animaux : volume d'eau adapté avec renouvellement en continu, rythme jour/nuit naturel, et de suffisamment de congénères pour exprimer un répertoire comportemental riche. Au début de l'élevage, les jeunes alevins seront élevés dans des paniers pour pouvoir obtenir une densité d'élevage suffisante au démarrage au vu de la petite taille des animaux. Le panier sera directement plongé dans le courant d’eau. La cuve sera nettoyée tous les jours avec un tuyau siphonnant. Dès que les poissons auront atteint une densité correcte, ils seront relâchés dans un bac d’élevage plus grand. Le stress de confinement a été réduit au temps minimal (10min) permettant de voir une réponse physiologique au stress, le retour à de bonnes conditions dès la fin du stress permettra de limiter au maximum les nuisances chez le poissons. Les animaliers en charge des élevages contrôleront le comportement et les mortalités des animaux au cours du stress mais aussi de l'élevage. En cas de dépassement des points limites, les animaux concernés seront anesthésiés puis euthanasiés par surdose d'anesthésiant.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel est choisie en raison de son importance agronomique et commerciale (première production piscicole française). L'essai démarrera avec des alevins de truite dès le 1er repas.

810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées à 8 grays, greffées avec de la moelle osseuse et des lymphocytes T sous anesthésie, puis reçoivent des injections quotidiennes d'anticorps et des prélèvements de sang dans le sinus rétro-orbital, pour tester des traitements de la maladie du greffon contre l'hôte. Le porteur indique que les souris développent perte de poids, poil terne, atteintes cutanées et posture voûtée, qu'aucun antalgique n'est administré car il modifierait le système immunitaire, et que les animaux atteignant un score clinique de 5 sont mis à mort. Sur le remplacement, il affirme que les expériences in vitro ne peuvent pas répondre à son hypothèse in vivo.

Objectifs

Les lymphocytes T régulateurs sont des cellules immunitaires avec un rôle d’inhibition de la réponse immune. Dans le cas de la maladie du greffon contre l’hôte ces cellules peuvent jouer un rôle important en freinant la réponse immune contre le greffon et diminuant le rejet de greffe par conséquence. Ainsi cibler ces cellules est une des stratégies développées par notre équipe dans l’objectif d’améliorer le traitement de la maladie du greffon contre l’hôte. Dans ce sens l’objectif de ce projet sera de tester l’efficacité clinique d’anticorps thérapeutiques ciblant cette population spécifiquement. Nous utiliserons des anticorps dirigés contre le CD25 et le TNFR2, des molécules exprimées par les lymphocytes T régulateurs et ayant un rôle dans leur fonction. Nous étudions également l’effet de ces anticorps directement sur les cellules responsables de la maladie qui peuvent temporairement et sous certaines conditions d’activation exprimer les mêmes molécules ou d’autres comme le CD38.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’améliorer le traitement de la maladie du greffon contre l'hôte chez l'homme, une maladie qui requiert aujourd'hui de nouveaux traitements permettant la prise en charge des patients réfractaires aux traitements classiques et de soulager ainsi la souffrance des patients. Dans ce projet, nous allons valider des molécules thérapeutiques pour lesquelles nous avons obtenu des résultats importants.

Procédures

Les souris seront irradiées en 2 fois 5 minutes chacune à raison de 0,8 Gy/min pour un total de 8 Gy. Elles seront ensuite injectées sous anesthésie gazeuse isofluorane avec de la moelle osseuse seul ou de la moelle osseuse avec des lymphocytes T provenant de souris donneuses dans un volume total de 100ul par souris. Ces souris seront traitées selon le schéma choisi (traitement curatif ou préventif) avec 5 injections quotidiennes pendant 5 jours suivi de 5 injections répartis sur 10 jours avec des molécules thérapeutiques dans un volume final de 100ul d’anticorps dilués dans une solution saline et administré par injection intrapéritonéale. Des prélèvements sanguins dans le sinus rétro-orbital seront réalisés sous anesthésie gazeuse isofluorane à raison d'une à deux fois maximum par expérience. Le premier prélèvement sera effectué 14 jours après le début de l’expérience, le deuxième au moment du sacrifice qui tombe en moyenne à 60 jours après le début de l’expérience. Le volume maximale prélevé sera de 100ul.

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer des signes cliniques de la maladie du greffon contre l'hôte caractérisés par une perte de poids associée à un pellage terne, possiblement mais pas systématiquement à des atteintes cutanées voire à une posture voutée de l’animal. Les signes cliniques seront classés suivant un score établi de 1 à 5 avec 5 les signes les plus graves. L’évaluation clinique des animaux (score) se fait de la façon suivante : un score de 1 correspond à la présence d’un des signes suivants et qui peuvent apparaître sans ordre précis : une perte de poids de 10%, une posture voutée, une atteinte des poils, une desquamation de la peau, une diarrhée. Les scores s’additionnent pour arriver à un maximum de 5. Si les souris atteignent un score de 5, elles seront euthanasiées. Il est à noter que quand la perte de poids atteint 20% et en absence d’autre signe clinique, les souris seront aussi euthanasiées. Les animaux seront suivis 3 fois par semaine pour établir le score, mais seront surveillés tous les jours pour vérification de leur état par rapport au jour d’avant. Les souris ayant une aggravation de situation seront alors euthanasiées. Ce score a été évalué par nos pairs spécialiste de la greffe de moelle osseuse, publié dans une revue internationale.

Devenir

Les animaux dont la perte de poids aura atteints 20% du poids initial ou bien un score clinique de 5 seront euthanasiés ainsi que les animaux qui n'auront pas atteints les points limites deux mois après l'irradiation. Les animaux restant à la fin des 2 mois d'expériences seront mis à mort car nous savons par expérience que leur état n'évoluera plus.

Remplacement

Le but de ce projet est d'étudier l'effet de molécule thérapeutique sur le développement de la maladie du greffon contre l'hôte in vivo. Dans ce cadre, les expériences in vitro ne pourront pas remplacer l'utilisation des animaux et ne pourront pas répondre à l'hypothèse émise. Toutefois, toutes expériences pouvant donner des informations sur le mode d'action de la molécule en question sans avoir recours à l'expérimentation in vivo sera réalisée.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés au maximum, les expériences seront regroupé dans le maximum possible. Ainsi, nous testerons par exemple les traitements en préventif et en curatif dans une seule expérience, ceci nous permettra de réduire le nombre d'animaux contrôles nécessaires pour chaque expérience.

Raffinement

Afin d’éviter la souffrance des animaux, les souris ayant atteint un score de 5 soit une perte de poids de 20% seront sacrifiées. Cette méthode impose une analyse fine 3 fois par semaine de chaque animal afin d’établit le score clinique associée à un suivi quotidien de l’état général des souris dans le but d’abréger toute sorte de souffrance. Les drogues antalgiques peuvent agir directement sur le système immunitaire et modifier les résultats, elles ne seront donc pas utilisées dans nos expériences. Toutefois, les animaux seront sacrifiés quand leur état ne permet pas d'envisager une amélioration. Enfin il existe une surveillance quotidienne des animaux greffés par les zootechniciens de la plateforme, lesquels sont informés de la nécessité d'une surveillance accrue des animaux du fait de leur engagement dans une expérience. Des enrichissements sont placés dans les cages à raison de 3 par cage afin de réduire l’angoisse des animaux. Lors de l’injection des cellules et du prélèvement sanguin dans le sinus rétro-orbitale, les souris seront anesthésiées sous isofluorane réduisant ainsi la douleur.

Choix des espèces

La maladie du greffon contre l'hôte a été étudié depuis longtemps dans plusieurs milliers d'études publiées. La disponibilité de modèle génétiquement modifié représente un atout non présent dans les autres espèces et qui nous permet de mieux étudier la réponse immune et de se rapprocher au plus de la maladie chez l'homme. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte préférentiellement entre 8 et 12 semaines. A cet âge, il possèdent un système immunitaire bien développé et sont suffisamment matures pour supporter les doese d'irradiations auquelles ils seront soumis.

10 chiens vont être utilisés, gardés vivants et réutilisés d'une période à l'autre, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une arthrite est provoquée à répétition par injection de cristaux d'urate dans le genou sous anesthésie, six fois en alternant les pattes, puis les chiens marchent sur une plateforme de mesure et subissent des prélèvements sanguins, pour évaluer un produit vétérinaire. Le porteur indique que la principale nuisance attendue est la boiterie et décrit un modèle "totalement réversible" en 24 heures. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode ne permet de reproduire la diffusion d'un produit dans "l'organisme entier" ni d'évaluer l'efficacité sur ce modèle d'arthrite chez le chien.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer, de comparer les paramètres pharmacocinétiques de l'élément d'essai à deux doses différentes et d'évaluer l'efficacité du produit test . Ce produit test sera mis en comparaison avec un contrôle positif ( la référence) et un contrôle négatif ( le véhicule du produit test à administrer).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir démontrer l'efficacité du produit test en le comparant aux contrôles positif et négatif et de relier l'efficacité à la dose administrée.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations intraveineuses ou orales du produit test à 2 doses différentes ( faible et forte dose), administration du contrôle négatif et du contrôle positif. Au total 6 administrations sur 6 périodes différentes avec un minimum de 14 jours de récupération entre chaque période. Durée par administration: inférieur à la minute. Réalisation de l'induction par administration de cristaux d'urates (durée de l'administration: inférieure à la minute): nombre total: 6 alternance grasset droit et gauche. Animaux sous anesthésie générale (durée anesthésie: environ 10min, animal réveillé au bout de 30 minutes) Durée du modèle arthrite: 24h Modèle totalement réversible. Réalisation de prélèvements sanguins: seront réalisés aux temps suivants T24h, jour 7, jour 14, jour 21, jour 28, jour 31, jour 38, jour 45, jour 52, jour 59, jour 61, jour 68, jour 75 et jour 90. Tous les animaux seront prélevés sauf lors de l'administration du produit référence ou du contrôle négatif où seuls les passages sur la force plate seront réalisés. Tous prélèvement de sang sera fait selon les bonnes pratiques vétérinaires et conformément à la réglementation en vigueur. Durée d'un prélèvement sanguin: inférieur à la minute. Enfin les animaux seront tenu en laisse et passeront à la marche sur un système de balance (force plate). Les animaux auront eu un entrainement de 3 semaines pendant la période d'acclimatation. Durée d'un passage : environ 5 minutes. Nombre de passages: 6 pour chacune des périodes, 6 périodes au total.

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendu dans ce projet est la boiterie. Par ailleurs, les animaux seront soumis à différentes manipulations pouvant entrainer d'autres nuisances éventuelles: 1) l'administration des éléments tests par voie intraveineuse ou orale. Cela necessite une contention legère des animaux. Pas d'effets indésirables attendus. 2) Induction des animaux avec les cristaux d'urates. Animaux à jeun, sous anesthésie générale, administration des cristaux d'urate. Les animaux seront placés en conditions individuelles pour un reveil de l'anesthésie en douceur et pour le bien être des animaux. les animaux seront observés tout le long de la phase de reveil pour une prise en charge rapide si besoin. 3) animaux seront observés à l'arrêt et à la marche pour évaluer l'appui du membre induit. Un entrainement à la marche aura été réalisé à minima 3 semaines à l'avance afin de familiariser l'animal avec ce type de test. 4) Les prélèvement sanguins seront réalisés. Les sites de prélèvements seront alternés autant que possible. Les prélèvements seront réalisés par un personnel formé et conformément à la réglementtation en vigueur. On ne s'attend pas à d'effet indésirable particulier.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure. Le modèle arthrite est réversible au bout de 24h.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier. Aucune méthode alternative ne permet d'évaluer l'efficacité d'un produit test sur le modèle arthrite chez le chien.

Réduction

10 animaux seront inclus dans ce projet. Ils seront réparti en 2 groupes de 5 animaux. Les 2 groupes auront les éléments contrôle positif et contrôle négatif puis un groupe aura la forte dose sur 4 periodes succéssives et l'autre groupe aura la faible dose. C'est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats représentatifs et interprétables.

Raffinement

Pendant la période d'acclimatation, les animaux auront une phase d'entraînement d'au moins 3 semaines. Cette phase sert à familiariser les animaux à ce type de test. Les animaux seront hébergés par groupe de 2 ou 3. Puis ils seront hébergés en condition individuelle à partir de l'induction jusqu'à 24h aprés. Cet hebergement en individuel est necessaire pour mettre l'animal dans de bonnes conditions pour la phase de réveil et pour faciliter l'observation des animaux. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires. De l'enrichissement ( exemple: balle, corde) sera présent autant que possible dans les boxes.

Choix des espèces

Espèce cible pour ce produit vétérinaire Adultes. Animaux adultes necessaire pour ce type de projet. Animaux qui ont fini leur croissance.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses post mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection unique de vecteur viral AAV par voie intraveineuse ou intramusculaire sous anesthésie, un prélèvement sanguin et des séances hebdomadaires d'imagerie par bioluminescence, pour tester des capsides modifiées ciblant le foie. Le porteur indique n'attendre qu'une légère douleur au point d'injection. Sur le remplacement, il affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas la complexité des interactions in vivo, une réduction des doses chez le patient étant renvoyée au conditionnel.

Objectifs

La thérapie génique consiste à introduire un gène thérapeutique dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés (AAVr) constituent des outils de choix. Une seule injection d’AAVr permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Néanmoins, malgré de récents succès, plusieurs facteurs majeurs pouvant limiter l’efficacité du transfert de gène proviennent de la large biodistribution des AVV après injection mais également de la réponse immunitaire dirigée contre ce vecteur pouvant engendrer la destruction des cellules transduites. Cette réponse immune délétère s'explique, en partie, par le fait que les humains sont naturellement infectés au cours de leur vie par des virus AAV sauvages. Ces limites nécessitent d’injecter de fortes doses chez le patient. L’objectif de ce projet repose sur le potentiel de la chimie organique pour améliorer « l’activité spécifique » et « l’index thérapeutique » d'une particule AAV recombinante choisie. Ces améliorations, non explorées jusqu'à présent, vont être obtenues par l’emploi de ligands ayant des propriétés de ciblage. Ces modifications chimiques accentueront le ciblage vers un organe ou un tissu spécifique, comme le foie, ce qui en retour permettra une réduction de la quantité d’AAV à administrer au patient. Différents ligands ayant un ciblage spécifique des hépatocytes présents au niveau du foie, seront couplés sur la surface de la capside d’AAV. Au-delà de l’augmentation du tropisme cellulaire, ces capsides modifiées chimiquement pourraient également diminuer l’effet de la réponse immunitaire. Ces mêmes vecteurs chimiquement modifiés seront également injectés en intramusculaire afin d’évaluer le pouvoir de diffusion de ces vecteurs. Cette voie d’injection pourrait permettre le développement de futurs vaccins utilisant ce mode d’administration.

Bénéfices attendus

Les modifications apportées à ces vecteurs pourraient permettre d’augmenter « l’activité spécifique » ou encore « l’index thérapeutique » de la particule virale recombinante. Parmi les conséquences souhaitées, ces particules virales modifiées par voie chimique pourraient favoriser la transduction spécifique du foie et celle du muscle. Cette dernière propriété, s’il elle était démontrée, ouvrirait notamment des possibilités de réduction des doses administrées.

Procédures

Les souris recevront une injection unique de PBS ou d’AAV en Intra Veineuse ou en Intra musculaire. Les animaux seront anesthésiés. La durée totale d’intervention est d’environ 5 à 10 mn. Un prélèvement sanguin sera réalisé la semaine avant les injections. Les animaux seront anesthésiés. Le temps d’intervention est d’environ 5 mn. L’imageur photon utilisé pour réaliser les imageries par bioluminescence nous permettra de réaliser des images sur 5 souris simultanément. Les animaux seront injectés en Intrapéritonéale avec de la luciférine. Au bout de 5 mn, les souris seront anesthésiées. Le temps d’acquisition est de 1 minute. L’imagerie de bioluminescence sera réalisée une fois par semaine sur 6 semaines.

Impact sur les animaux

Les différents produits ont tous déjà été administrés chez la souris à des doses supérieures ou égales à ce qui est envisagé dans ce projet, sans observation de signe clinique. Pour les injections en intra veineuse, en intra musculaire et le prélèvement sanguin, la souris sera sous anesthésie gazeuse. Une légère douleur au point de prélèvement due à la piqure peut être ressentie après le réveil. L’injection en intra péritonéale engendre une légère douleur due à la piqure. Pour l’euthanasie, les souris seront sous anesthésie gazeuse que ce soit pour la dislocation des cervicales (point limite) ou la décapitation.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post mortem.

Remplacement

Les modèles in vitro ne peuvent s'approcher de la complexité des interactions entre le vecteur et l’environnement biologique in vivo et rendent donc difficile la reproductibilité de ces résultats in vivo. L’utilisation de la souris est donc justifiée pour évaluer la biodistribution de ces vecteurs une fois injectés ainsi que la possible réponse immunitaire.

Réduction

Des premiers tests d’efficacité seront effectués in vitro sur différents types de cellules en culture pour évaluer l’effet de la modification chimique sur le vecteur, le nombre d’animaux à utiliser en sera donc réduit. La technique de l’imagerie par bioluminescence nous permettra d’avoir rapidement de premiers résultats. Ainsi, le nombre d’animaux utilisé pourra être réduit si certains résultats se montrent négatifs, notamment dans les groupes avec injections en IM.

Raffinement

Le bien-être animal et le raffinement des procédures passera par de bonnes conditions d’hébergements, un suivi quotidien des animaux, l’instauration de points limites pertinents et précoces ainsi que la mise en place de mesures adaptées (anesthésie, analgésie etc.).

Choix des espèces

Comme dans la majorité des études portant sur la thérapie génique, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. L'utilisation de la souris est justifiée à la fois par l'existence de plusieurs modèles murins ainsi que par la possibilité de constituer des groupes d'animaux suffisamment larges (n=5 par groupe) pour pouvoir effectuer des calcul statistiques (test statistique non paramétrique Mann-Whitney). Le modèle murin envisagé (Balb-c) est couramment utilisé dans le domaine de la thérapie génique et plus particulièrement dans celui des AAVr. Il s’agit d’un modèle souvent utilisé pour étudier la biodistribution de différents vecteurs. Ce modèle nous apparaît donc comme étant pertinent pour ce projet. Nous évaluerons nos vecteurs sur des animaux ayant fini leurs croissances. Afin d’être en corrélation avec des études similaires, notre protocole démarrera donc chez des souris adultes âgées de 8 semaines.

1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur pulmonaire leur est greffée puis suivie par imagerie répétée sous anesthésie, jusqu'à 39 manipulations par animal, une plateforme réalisant ces études "à la demande de chercheurs extérieurs". Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer une perte de poids et une gêne respiratoire, et que les organes sont prélevés après la mort "à la demande du client". Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer "l'animal entier" et écarte le poisson zèbre, jugé peu adapté à ses appareils d'imagerie.

Objectifs

Au niveau mondial, le cancer pulmonaire représente le type de cancer avec la plus forte mortalité. Parmi les sous-types de cancer du poumon, le cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules (ou CPNPC) représente 87% des cas de cancer du poumon avec un pronostic des plus sombres parmi tous les cas de cancers pulmonaires. La majorité des patients avec ce type de cancer sont malheureusement diagnostiqués à un stade avancé, voire très avancé. Notre lanoratoire est une plateforme de services et de R&D spécialisée dans l'imagerie préclinique. Sa mission est de répondre aux besoins d'imagerie de la communauté scientifique, particulièrement dans le domaine de l'oncologie expérimentale. Ce projet a pour but de réaliser, à la demande de chercheur extérieurs à notre laboratoire, des études sur des modèles murins de cancer pulmonaire afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la progression tumorale ou d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

En fonction des études clients, les bénéfices attendus sont: - Une meilleure connaissance des cancers pulmonaires. - L'étude de nouveaux traitements contre le cancer pulmonaire.

Procédures

Dans le cas des souris induites en sous-cutanée (procédure 1) : Les animaux seront anesthésiés lors de l’induction par piqure d’aiguille. Ensuite, chaque animal aura au maximum, un suivi hebdomadaire par imagerie de bioluminescence suivi d’une mesure au pied à coulisse de la tumeur et d’une imagerie échographique. (soit 3 manipulations/sem x 12 semaines = 36 manipulations). Les autres imageries (photoacoustique, radioisotopique) pourront être mises en oeuvre ponctuellement en fonction des résultats obtenus en cours d'étude soit 3 manipulations supplémentaires. Au maximun 1 souris sera soumise à 39 manipulations sous anesthésie sur 12 semaines. Dans le cas des souris induites par dépôt pulmonaire, les inductions se font sous anesthésie chimique et sur animal vigile pour l’induction par voie intraveineuse (Procédure 2). Chaque animal aura au maximum, un suivi hebdomadaire par imagerie de bioluminescence auquel peut s'ajouter 2 scanners espacés de minimum 2 semaines, 2 imageries radioisotopiques espacés de minimum 2 semaines. ((soit 2 manipulations/sem x 12 semaines) +4 =28 manipulations sur 12 semaines)12 BLI + 2+2 = 16 manipulations sous anesthésie sur 12 semaines Procédure 1 et 2 : Dans le cas où il faudrait injecter des candidats médicaments, suivant la voie d’administration il y aura au maximum 5 traitements par semaine sur souris vigiles (pour IP IV, SC, per Os) ou anesthésiées (pour intranasale ou intratrachéale) sur 12 semaines d’étude Ces administrations seront réalisées par du personnel formé et entraîné Nous pourrons être amené à prélever du sang sur animal vigile au niveau sub mandibulaire: du sang sera prélevé 3 fois en 24h.

Impact sur les animaux

Les nuissances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont: - La perte de poids. - La gène respiratoire occasionnée par les tumeurs se développant au niveau de la trachée.

Devenir

Procédure 1: Modèle sous-cutané: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort. Les tumeurs sous cutanées ainsi que différents organes seront prélevés à la demande du client pour des études histologiques complémentaires qui complèteront les résultats d'imagerie. Procédure 2: Modèle orthotopique: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort. Les tumeurs pulmonaires ainsi que différents organes pourront être prélevés à la demande du client pour des études histologiques complémentaires qui complèteront les résultats d'imagerie.

Remplacement

Aucun modèle in vitro n'est à même de remplacer l'animal entier étant donné la complexité des processus mis en jeu, notamment les interactions avec le microenvironnement tumoral. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’étudier la biodistribution d'un composé dans tous les organes d'un individu. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable. Avant de débuter les études chez l’animal, des tests d’efficacité in vitro seront effectués par nos clients sur des cellules de cancer pulmonaire en culture. Ainsi, les molécules qui ne présentent pas d’effet in vitro ne seront pas testées in vivo.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous mettons en œuvre des techniques d’imagerie qui permettent de réaliser un suivi longitudinal des animaux et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Des tests non paramétriques seront utilisés pour comparer les valeurs obtenues pour les différents lots de souris. Nombre d’animaux utilisé dans ce projet : Sur 5 ans nous prévoyons 20 études qui seront réparties ainsi : -Pour le modèle sous-cutanée (procédure 1), 10 études, 800 souris sur 5 ans. -Pour le modèle orthotopique (procédure 2): 10 études, soit par induction en intraveineuse, soit par dépôt pulmonaire 800 souris sur 5 ans. Soit un total de 1600 animaux pour ce projet sur 5 ans. Ce nombre pourra être revu à la baisse en fonction des études clients.

Raffinement

Pour ces procédures expérimentales, la stratégie d’observation des animaux retenue est l’étude comportementale des animaux. La bonne connaissance de l’état clinique normal de la souche de souris utilisée nous permettra d’observer précisément et d’interpréter rigoureusement les signes cliniques de souffrance des animaux. Les souris seront suivies par inspection visuelle chaque jour de la semaine et les critères comportementaux, et tumoraux pris en comptes pour l’évaluation du palier de douleur. Lorsqu’un des points limites est atteint, l’animal est mise à mort afin d’arrêter sa souffrance car elle ne peut être ni diminuer ni stopper. Ces point limites sont présentés dans chacune des procédures. Les animaux seront étudiés par imagerie in vivo non invasive qui n'induit pas de douleur supérieure à celle d’une piqure d’aiguille et permet de réduire le stress infligé au cours de l’expérimentation puisque les animaux sont anesthésiés durant les examens d'imagerie.

Choix des espèces

Les modèles de cancer humain et murins sont classiquement mis en oeuvre chez la souris pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique. Les modèles orthotopiques de carcinome pulmonaire H460, LL-2, A549, 4T1 et mélanome B16 sont uniquement disponibles chez cette espèce animale. Le modèle zebrafish utilisé en cancérologie pour les xénogreffes pourrait être intéressant car de moindre degré de douleur mais le poisson reste peu adapté aux modalités d'imagerie mises en oeuvre dans notre établissement qui ne dispose pas d'un agrément pour ce modèle . Par ailleurs, la transplantation orthotopique n'est pas possible chez le poisson pour des cellules issues de cancer du poumon et du sein. (Raby et al., "Bulletin du cancer", Vol 107, janv 2020) Modèle de cancer réalisable chez le jeune animal (6 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale. Ce modèle est validé au laboratoire depuis 10 ans.