Procédures modérées

8 500 animaux non-humains vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 3 000 souris et 5 500 rats. Ils reçoivent chaque jour une substance par gavage pendant des périodes allant jusqu'à quatre-vingt-dix jours, avec prélèvements de sang et d'urine, puis sont tués pour analyse des organes. Le projet évalue la toxicité de composés dans le cadre d'études réglementaires. Le porteur indique que les essais in vitro et in silico ne renseignent ni sur les effets à long terme ni sur la gravité, et présente le rat et la souris comme les espèces les plus appropriées.

Objectifs

Ce projet comprend une série d’études permettant d’évaluer la toxicité, et de fournir des informations sur les dangers pour la santé qui peuvent résulter d’une exposition à une substance d’essai par voie orale pendant une période courte ou moyenne. En effet l’exposition à un composé est souvent multiple (doses répétées) et peut produire des effets immédiats ou plus tardifs (par accumulation de la substance d’essai ou par sa biotransformation par exemple). Le projet est utilisé pour fournir des informations sur le potentiel toxique d’un produit lors de son développement. Ces études d’une durée inférieure ou égale à 90 jours permettent de définir les doses qui pourront être utilisées dans des études chroniques sans induire d’effets sévères.

Bénéfices attendus

Les bénéfices et objectifs de ces études sont de déterminer et d’évaluer le potentiel toxique d’un composé pour chercher des effets ou constater l’absence d’effets toxiques, déterminer la concentration sans effet nocif observé, identifier des organes cibles et évaluer les changements biologiques provoqués par l'administration du produit, évaluer la concentration plasmatique du produit et de ses métabolites, et de certains biomarqueurs (tyrosine par exemple), évaluer le profil de bioaccumulation du produit dans certains organes, apporter des informations sur la sélection des doses pour les études ultérieures. Il permet également d'obtenir des informations importantes sur le mode d'action de la molécule. Les études les plus précoces permettent de mettre en évidence le profil toxicologique du produit et de pouvoir arrêter le développement de molécules qui pourraient présenter des alertes importantes et ainsi éviter des études plus longues avec plus d'animaux. Les études de 90 jours sont des études réglementaires demandées par les autorités.

Procédures

Un seul prélèvement d'urine en cage à diurèse pendant un maximum de 16h par étude. Un Gavage journalier tout au long de l'étude à l'aide de sondes souples adaptées à la taille et à l’âge des animaux. Des pPrélèvements sanguins d’un volume réduit sur la première journée (en général 4) et un volume plus important en une seule fois sur la dernière journée. Les volumes des prélèvements sanguins ne dépasseront pas les limites calculées en fonction du volume de sang circulant en laissant respectivement 1, 2 ou 3 semaines de récupération en cas de prélèvements multiples ou 15% en cas de prélèvement unique ) soit un maximum de 1.2ml par semaine pour un rat de 250g ou 100µl pour une souris de 25g.

Impact sur les animaux

Les effets toxiques attendus sur les animaux sont modérés car des études préliminaires de tolérabilité et de choix de doses ont déjà été réalisées. Certains signes de toxicité peuvent néanmoins apparaitre en cours d'études. Afin de les mettre en évidence, les animaux sont observés quotidiennement y compris le week-end et au moins une fois par semaine ils font l'objet d'une observation clinique détaillée, leur poids, consommation alimentaire sont mesurés. Deux types de points limites ont été définis et sont détaillés dans les procédures internes : les signes cliniques nécessitant la surveillance rapprochée des animaux et les signes cliniques sévères ou critères majeurs nécessitant une action immédiate et justifiant à eux seuls l’euthanasie de l’animal (critères d’arrêt). La présence d’un seul de ces critères d’arrêt nécessite de prévenir immédiatement le directeur d’étude et doit conduire à l’euthanasie de l'animal. En cours d’étude, plusieurs échantillons de sang peuvent être prélevés au cours d'une période de 24h pour l’analyse des concentrations de la substance à tester. Les prélèvements peuvent être faits via la veine caudale ou la veine saphène. Ces derniers peuvent induire de petits hématomes, qui disparaissent rapidement. Lors des prises d'urine les animaux sont isolés une nuit. Pour certains prélèvements les rats peuvent être soumis à un jeune de 16h maximum.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin d'étude pour évaluer l’effet de la molécule sur les organes en particulier grâce aux analyses histologiques. Les animaux excédentaires exclus de l'étude après randomisation peuvent être gardés en vie et être replacés ou seront intégrés dans le processus de formation du personnel aux gestes techniques.

Remplacement

De nombreux essais in silico et in vitro sont utilisés pour identifier/confirmer des mécanismes d’action préalablement au recours aux études animales. Mais ils ne peuvent prendre en compte l’intégralité des mécanismes conduisant ou pas à l’apparition d’effets toxiques et ils ne peuvent pas donner d’informations concernant les effets à long terme ni la gravité des effets qui suit l'exposition au produit. De même, pour comprendre le mode d'action d'une toxicité spécifique, un enchaînement d’évènements biologiques au niveau moléculaire et tissulaire doit être identifié et caractérisé.

Réduction

Ces études se font dans le respect des 3Rs avec un nombre restreint d'animaux. L'utilisation du microsampling permet de mesurer sur un nombre restreint d'animaux des taux de biomarqueurs et la concentration plasmatique en matière active. Le nombre d'animaux est justifié par les recommandations des guidelines internationales, ils doivent permettre une analyse statistique suffisante. Les tests statistiques utilisés ont été définis par un statisticien interne ou par un consultant externe spécialisé en analyse statistique et correspondent aux tests classiquement utilisés et acceptés en toxicologie.

Raffinement

Dans ces études, les animaux sont hébergés en groupe (ou individuellement, temporairement ou si nécessaire dans le cas des études inférieure à 90 jours) avec un enrichissement du milieu adapté à leur âge et leur espèce. Les animaux sont alimentés par une nourriture contrôlée et adaptée, les certificats concernant cette nourriture sont archivés par le laboratoire. Les animaux sont observés quotidiennement y compris les week-ends. Ils sont pesés à intervalle régulier pour vérifier leur croissance ou leur bien-être. La consommation de nourriture est également mesurée à intervalle régulier. Toutes ces mesures sont réalisées par des techniciens confirmés qui suivent des périodes de reformation régulière. Des points limites ont été identifiés qui peuvent nécessiter la mise à mort précoce de l’animal qui sera demandée par le directeur d’étude. En cas de problème un vétérinaire est présent sur le site pour assurer un traitement. En cours d’étude si besoin des prélèvements sanguins seront réalisés en fonction des recommandations du NC3R National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research). A la fin de chaque étude, un résumé est réalisé et une évaluation du bien-être animal est réalisée par la structure du bien-être animal et le comité d’éthique.

Choix des espèces

Les études sur les animaux décrites précédemment ont été validées chez le rongeur (mâle et femelle) et font l’objet de lignes directrices internationales. Il y a par conséquent, suffisamment de données pour indiquer que le rat et la souris sont les espèces les plus appropriées pour étudier les aspects abordés dans le projet actuel. Les données générées chez ces espèces peuvent être extrapolées à l’homme. Toutes les études décrites dans ce projet utilisent en général de jeunes adultes conformément aux recommandations pour les études de toxicité réglementaire. Pour les études non réglementaires des animaux jeunes ou adultes de 6 à 13 semaines sont utilisés.

1 070 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Exposés dès l'adolescence à l'alcool et à des cannabinoïdes, ils sont soumis à des sessions de consommation d'alcool puis à une craniotomie pour implanter une électrode mesurant la dopamine. Le projet étudie la comorbidité entre schizophrénie et troubles de la consommation d'alcool sur un modèle induit dès la période embryonnaire. Le porteur affirme que ces mécanismes psychiatriques complexes ne sont pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in silico.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'impact d'expositions précoces aux drogues sur les troubles de la consommation d'alcool à l'âge adulte dans un modèle animal de schizophrénie. En effet il existe une prévalence élevée de patients atteints de schizophrénie qui présentent un trouble de la consommation d'alcool. Les consommations d'acool et de cannabis sont fréquentes à l'adolescence aussi bien dans la population générale que chez les sujets qui risquent de présenter la maladie. Nous chercherons donc à étudier le rôle de ces expositions précoces d'alcool et d'agent cannabinoides sur les comportements des animaux modèles de schizophrénie mais également sur la neurotransmission dopaminergique. En effet la dérégulation de ce système de neurotransmission est directement impliquée aussi bien dans les troubles de la conosmmation d'alcool que dans ceux associés à la schizophrénie.

Bénéfices attendus

L'exposition précoce à l'alcool durant l'adolescence est nécessaire pour l'observation à l'âge adulte d'une consommation exagérée d'alcool. Nous n'avons pour le moment aucune information concernant la co-exposition avec des agents cannabinoides, drogues très fréquemment consommée par les adolescents et les jeunes adultes atteints de schizophrénie ou non. Grâce à ces expériences, nous pourrons obtenir des données importantes concernant les mécanismes neurobiologiques qui sous-tendent les troubles de la consommation d'alcool dans un modèle pertinent pour l'étude de la schizophrénie. L'aspect neurobiologique de ce projet aidera la communauté scientifique à mieux comprendre l'impact d'une exposition précoce à des drogues couremment utilisées sur les systèmes dopaminergiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à des sessions de consommation d'alcool volontaire soit dans la cage de stabulation (24 heures 1 jour sur 2 pendant 8 à 15 semaines), soit dans des cages d'auto-administration opérante (sessions de 15 minutes, 5 jours par semaine sur une période de 4-5 mois). A l'âge adulte une partie des animaux seront soumis à une craniotomie (30 à 40 minutes) dont l'objectif est d'implanter une micro-électrode d'enregistrement de la libération de dopamine, neurotransmetteur crucial aussi bien dans les troubles observés dans la schizophrénie que dans les troubles de la consommation de drogues.

Impact sur les animaux

Douleurs post-opératoires de palier 1 l'âge adulte suite à l'implantation des canules par craniotomie. Durée prévue : 2-3 jours

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de cette procédure pour nous permettre de collecter les cerveaux pour des analyses histologiques, biochimiques ou génétiques nécessaires pour finalser le projet.

Remplacement

Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme la schizophrénie ou l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Le modèle que nous avons choisi fait partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à chacune des expériences a été estimé sur la base d'expériences précédentes utilisant un autre modèle animal de schizophrénie et en prenant en compte la variabilité interindividuelle observée aussi bien dans les modèles animaux que dans les différents paradigmes comportementaux utilisés. Nous utiliserons au maximum les mêmes animaux entre les différentes procédures pour limiter le nombre total d'animaux utilisés dans ce projet. De plus nous réaliserons les expériences aussi bien sur les mâles que sur les femelles pour ne pas avoir à éliminer les animaux surnuméraires mais également, dans le but d'une réduction, ne pas à avoir à refaire tout ce projet ultérieurement uniquement sur les femelles (et donc euthanasier les ratons mâles surnuméraires à ce moment).

Raffinement

Tout au long du projet les animaux seront surveillés quotidiennement et des points limites adaptés à chaque procédure expérimentale ont été établis avec une prise en charge de la douleur et de la souffrance potentielles adaptée à chaque procédure. Les animaux seront stabulés dans des cages enrichies grâce à une buchette en bois et un tunnel en carton.

Choix des espèces

Le modèle MAM est un modèle décrit chez le rat et nous développons ce projet dans le cadre d'une collaboration multicentrique qui a très largement décrit ce modèle en France. Pour poursuivre nos études en commun, nous devons utiliser le même modèle que nos collaborateurs. Le rat est un modèle idéal pour l'étude de la comorbidité troubles de la consommation d'alcool/schizophrénie en particulier en ce qui concerne certaines études comportementales comme l'auto-administration d'alcool qu'il est plus difficile d'observer chez les souris. Les animaux seront utilisés tout au long de leur vie. La mise en place du modèle MAM se déroule au cours de la période embryonnaire et les animaux issus des cette première procédure seront utilisés jusqu'à l'âge adulte. Tous les petits seront soumis à la procédure d'exposition aux drogues pendant la période d'adolescence (entre les jours 28 et 50). Les rats seront conservés jusqu'à l'âge adulte pour évaluer les effets d'une telle pré-exposition précoce sur les comportements et la neurobiologie à l'âge adulte.

192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection de streptozotocine dans les deux ventricules cérébraux sous anesthésie, puis passent une batterie de tests comportementaux évaluant activité motrice, anxiété et mémoire, avant que leur cerveau soit prélevé. Le projet compare deux souches de rats pour étudier la résilience cognitive face à la maladie d'Alzheimer. Le porteur affirme qu'aucun remplacement in vitro ou in silico n'est possible et que la mémoire ne peut s'évaluer que dans un organisme entier.

Objectifs

En vieillissant, il apparait que les patients atteints de la maladie d’Alzheimer et présentant des lésions cérébrales constituées de peptide amyloïde représentent une population très hétérogène. En effet, certains malades souffriront de troubles de la mémoire tandis que d’autres présenteront des performances mnésiques préservées, ce que l’on appelle la résilience cognitive. Une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux impliqués dans cette résilience cognitive permettrait d’identifier de nouvelles stratégies d’intérêt pour lutter contre la maladie d’Alzheimer. Notre projet vise donc à étudier, chez l’animal, les mécanismes cérébraux protecteurs impliqués dans la résilience cognitive face à la maladie d’Alzheimer. Notre objectif est de reproduire une situation pathologique mimant cette maladie chez deux souches de rats (Wistar et LOU/c/jall) afin d’étudier les mécanismes cérébraux protecteurs associés à la résilience cognitive. Le modèle de maladie d’Alzheimer choisi consiste en une injection, dans chaque ventricule cérébral, de streptozotocine chez le rat adulte. Ce modèle entraine une augmentation des concentrations en peptide bêta-amyloïde et en protéine tau phosphorylée dans l’hippocampe, deux marqueurs caractéristiques de la maladie d’Alzheimer. De plus, ce modèle présente une neurodégénérescence associée à l’apparition de déficits cognitifs. Ce modèle permettra d’étudier les mécanismes neuroprotecteurs impliqués dans la résilience cognitive. La maladie d’Alzheimer sera ainsi induite chez les rats de souches Wistar et LOU/c/jall (notées WIS et LOU), dont on suppose qu’elles vont présenter des niveaux de résilience cognitive faible et élevé, respectivement. Par rapport au rat WIS, le rat LOU a déjà été décrit comme présentant un vieillissement réussi et, d’après des études préliminaires, présente des performances de mémoire préservées suite à l’administration intra-cérébrale de peptide amyloïde, mimant de façon très imparfaite la maladie d’Alzheimer. Ces études nous ont amené à proposer le rat LOU comme modèle de résilience cognitive. Notre projet vise à confirmer cette hypothèse en reproduisant, par utilisation du modèle d’injection de streptozotocine, une situation neuronale pathologique plus représentative de la maladie d’Alzheimer. Après caractérisation de la résilience cognitive par une batterie de tests comportementaux, des analyses post-mortem seront réalisées pour identifier les substrats neuronaux protecteurs sous-jacents.

Bénéfices attendus

Grâce à l’utilisation de deux souches de rat dont on suppose qu’elles vont présenter des niveaux de résilience cognitive différents face à une situation mimant la maladie d’Alzheimer, cette étude permettra d’étudier les mécanismes et les processus cérébraux permettant de lutter, sur un plan cognitif, contre la maladie d’Alzheimer. Des études de corrélations entre les performances cognitives, les lésions histopathologiques et certains marqueurs de plasticité synaptique et cérébrale seront réalisées. L’identification des processus cérébraux protecteurs permettra de mettre en lumière de nouvelles stratégies à visée thérapeutique pour lutter contre le déclin cognitif associé à la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Tous les rats (n=192) subiront une injection intra-cérébro-ventriculaire bilatérale de streptozotocine ou de liquide céphalo-rachidien artificiel au cours d’une chirurgie cérébrale menée sous analgésie et anesthésie profonde. Les deux injections cérébrales (une par ventricule) seront réalisées au cours d’une seule opération chirurgicale d’une durée de 30 minutes par animal. L’analgésie sera induite par injection sous-cutanée de buprénorphine 30 min avant l’anesthésie (avant l’acte chirurgical), et renouvelée 6 heures après la procédure chirurgicale. Cette dernière injection réalisée sur animaux vigiles requiert une contention de l’animal et durera environ 1 minute par rat. L'anesthésie se fera par une induction à 5% d'isoflurane puis maintien à 2% d'isoflurane en mélange O2/N2O 30%/70%. Après une période de récupération d’un mois, les animaux seront exposés à une batterie de tests comportementaux visant à évaluer l’activité motrice, le comportement de type anxieux et les performances de mémoire des animaux en situation libre. Ces tests dureront 3 semaines. Certains rats recevront également une injection (n=32 rats) ou deux injections (une injection par jour pendant deux jours ; n=32 rats), par voie intrapéritonéale, d’un agent intercalant de l’ADN permettant de marquer les neurones en formation (étude de la prolifération et de la survie neuronale par injection de BrdU). Chaque injection intra-péritonéale, qui nécessite une contention de l’animal, durera environ une minute par rat.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux seront ceux provoqués par l’induction de la maladie d’Alzheimer suite à l’administration intra-cérébro-ventriculaire de streptozotocine. D’après les données préexistantes issues de la littérature, une diminution des intéractions sociales et des performances de mémoire, ainsi qu’une élévation du comportement de type anxieux sont attendues, à l’image des symptômes cognitifs observés chez les patients atteints de la maladie d’Alzheimer. Nous nous attendons à observer ces effets qui représentent justement les altérations comportementales étudiées dans notre projet. D’après la littérature, ce protocole d’injection de streptozotocine ne modifie en revanche pas le poids corporel, ni l’activité motrice et exploratoire spontanée des rats traités.

Devenir

A l’issue de l’unique procédure présentée dans ce projet, tous les animaux seront mis à mort (n=192). Les cerveaux de tous les animaux seront prélevés afin d’étudier les conséquences cérébrales de l’injection de streptozotocine. Ces prélèvements permettront de réaliser des études de corrélation entre le niveau de résilience cognitive des animaux (études comportementales) et leur atteinte cérébrale (études post-mortem).

Remplacement

Ce projet vise à favoriser le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre de pathologies neurologiques telles que la maladie d’Alzheimer. Or la recherche de nouveaux médicaments nécessite (scientifiquement et règlementairement) l’utilisation d’espèces animales. De plus, l’évaluation des performances de mémoire ne peut être réalisée que sur un organisme capable d’effectuer une tâche cognitive. L’objectif final est de pouvoir tester de nouveaux candidat-médicaments dans le nouveau modèle animal développé. Ainsi, aucun remplacement par des modèles in vitro ou "in silico" (modèles mathématiques, bio-informatique) ne peut être réalisé. De plus, l’objectif de notre projet est de caractériser différents niveaux de résilience cognitive suite à l’induction d’une situation mimant la maladie d’Alzheimer. Ceci sera réalisé chez le modèle LOU/c/Jall, connu pour représenter un modèle supposé de résilience cognitive élevée. L’existence d’un tel modèle de vieillissement réussi chez d’autres espèces telles que la souris n’a encore jamais été décrite, justifiant ainsi l’utilisation de cette souche de rat, et de la comparer au rat Wistar, dont le rat LOU/c/Jall dérive génétiquement.

Réduction

Un total de 192 rats est envisagé, soient 96 rats Wistar et 96 rats LOU/c/Jall. D’après l’expertise de l’équipe, des groupes de n=16 sont nécessaires pour assurer la puissance des analyses statistiques tout en raffinant notre nombre d’animaux utilisés. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement analysables (Tests ANOVA à un ou deux facteur(s), selon les conditions d’expérimentation réalisées, suivis d’un test post-hoc tel que le test de Tukey ou de Bonferroni). De plus, les études comportementales et cérébrales seront réalisées chez les mêmes animaux pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, souffrance et angoisse infligées, les animaux seront maintenus dans des conditions d’hébergement optimales et stables : température, cycle de lumière, hygrométrie. Ils seront surveillés quotidiennement par un personnel qualifié et une attention particulière sera apportée à l’apparence physique externe des animaux, aux variations éventuelles de poids ainsi qu’aux changements de comportements. Les injections intra-cérébro-ventriculaires (streptozotocine) et intra-péritonéales (Buprénorphine, BrdU) seront réalisées exclusivement par un personnel qualifié. Afin de diminuer le stress de nos animaux, un protocole de familiarisation des animaux à l’animalerie et à l’expérimentateur sera mis en place dès l’arrivée des animaux au sein de notre animalerie. Afin de réduire la douleur et la détresse de nos animaux, nous avons choisi un point limite précoce et compatible avec les objectifs scientifiques de notre recherche.

Choix des espèces

L’espèce choisie est le rat (Rattus Norvegicus). Le rat est très utilisé en pharmacologie car il présente des caractéristiques biologiques en nombreux points comparables à l’Homme. Son comportement est bien décrit et il est possible d’en mesurer les modifications. Par ailleurs, le modèle de maladie d’Alzheimer que nous souhaitons reproduire est basé sur l’injection de streptozotocine, déjà décrit et mis au point dans la littérature chez le rat Wistar. Enfin, nous souhaitons évaluer l’influence du niveau de réserve cognitive sur la résilience suite à l’induction de la maladie d’Alzheimer. Ceci sera réalisé chez le rat LOU/c/Jall, connu pour présenter un vieillissement réussi et donc représentant un modèle supposé de résilience cognitive élevée. L’existence d’un tel modèle de vieillissement réussi chez d’autres espèces telles que la souris n’a encore jamais été décrite, justifiant ainsi l’utilisation de cette souche de rat, et de la comparer au rat Wistar, dont le rat LOU/c/Jall dérive génétiquement. Sur la base de la littérature, des rats adultes (2 mois d’âge) seront utilisés dans ce projet. C’est en effet à cet âge que le modèle d’injection à la streptozotocine est décrit et connu pour induire des déficits comportementaux chez le rat Wistar.

9 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie stéréotaxique d'environ trois heures pour implanter une canule cérébrale, puis reste maintenu en chaise de contention pendant environ six heures lors des séances de microdialyse. Le projet évalue la capacité d'un médicament à franchir la barrière hémato-encéphalique. Le porteur justifie le recours à ces primates non-humains par leur proximité phylogénétique avec l'humain.

Objectifs

Le présent projet a deux objectifs liés entre eux : le premier objectif est d’évaluer la capacité d'un médicament à traverser la barrière hémato-encéphalique après son administration (par voie intraveineuse, sous-cutanée ou orale), le second objectif est d’évaluer la capacité du médicament à induire une réponse pharmacodynamique dans le cerveau. Le premier objectif est donc de démontrer la pénétration cérébrale, pour cela, il est nécessaire d’évaluer la concentration tissulaire libre du médicament dans le cerveau à l’aide de la microdialyse. Le second objectif est de démontrer que le médicament permet d’activer le récepteur cérébral cible.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d’évaluer la capacité d’un médicament à traverser la barrière hémato-encéphalique et sa capacité à induire une réponse pharmacodynamique dans le cerveau. En cas de réussite, le médicament pourra être testé chez l’homme.

Procédures

Après une période d'acclimatation suffisante (un mois minimum), les animaux subiront une chirurgie d'implantation de canule cérébrale. Ces canules de guidage seront implantées sous anesthésie générale et analgésie lors d'une chirurgie stéréotaxique d'une durée approximative de 3 heures. Les animaux bénéficieront d'une période de récupération de 7 jours afin notamment que la barrière hémato-encéphalique se reforme. A la fin de cette période de récupération, les animaux seront placés en chaise à contention pour laquelle ils auront été entraînés précédemment. La sonde de microdialyse sera insérée, via la canule de guidage dans le cerveau. Le microdialysat à la sortie de la sonde sera collecté et la sonde stabilisée le temps nécessaire. Après l'administration du médicament, la collecte des microdialysats sera poursuivie avec des aliquots prélevés toutes les 20 minutes. Des prélèvements sanguins seront réalisés à intervalle régulier. La perfusion et collecte cérébrale sera poursuivie pendant 6h. Une semaine après cette première microdialyse cérébrale, les animaux seront à nouveau placés en chaise à contention. la sonde de microdialyse sera insérée, via la canule de guidage, dans le cerveau. Le microdialysat à la sortie de la sonde sera collecté et la sonde stabilisée le temps nécessaire. Après l'administration du médicament (par une autre voie ou à une autre dose que la première fois), la collecte des microdialysats sera poursuivie avec des aliquots prélevés toutes les 20 minutes. Des prélèvements sanguins seront également réalisés à intervalle régulier. La perfusion et collecte cérébrale sera poursuivie pendant 6h. Les volumes et les doses administrés aux animaux seront en accord avec les recommandations éthiques en vigueur et validés par les sponsors. Les volumes prélevés et le temps de repos accordé aux animaux entre chaque prélèvement seront en accord avec les recommandations éthiques. Les administrations et prélèvements sont donc très ponctuels, la contrainte principale étant le séjour d'environ 6 heures en siège à contention. Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de la procédure afin de détecter tout signe clinique de douleur ou de détresse. En fin de protocole, les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés pour récolte de liquide céphalorachidien et de différents organes pour analyses.

Impact sur les animaux

Pendant et après la chirurgie d’implantation de la canule, comme toute chirurgie et malgré les moyens mis en place, il subsiste un risque de douleur ou d’inflammation. Des signes cliniques au niveau du site chirurgical et des sites d'administration (intraveineux ou sous-cutané, liés ou non à la molécule) peuvent apparaître (hématome, œdème léger, etc.). Pour les besoins de la microdialyse cérébrale, les animaux seront maintenus en siège à contention plusieurs heures d’affilée. Malgré les mesures mises en place, il est possible, du fait des différences intra-individuelles, qu’un animal présente toujours des signes de stress pendant les contentions en siège.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour récolte et analyse des organes.

Remplacement

Les études de preuve de concept chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de démontrer la faisabilité ou de valider un nouveau procédé. Ici, l’objectif est de prouver que la molécule est capable à la fois de passer la barrière hémato-encéphalique et d’agir sur les cibles du cerveau, le modèle animal est donc indispensable.

Réduction

Dans ce projet, un nombre maximum de 9 animaux (3 animaux par étude) sera utilisé afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant d'atteindre les objectifs scientifiques.

Raffinement

Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de l’étude afin de détecter tout signe clinique de douleur ou de détresse (grille d’observation du bien-être). Des périodes de récupération suffisantes seront accordées aux animaux après la chirurgie et entre les prélèvements ainsi qu’entre les administrations. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress seront déterminées au préalable de la procédure. Les animaux bénéficieront du programme d’enrichissement défini par la structure du bien-être animal de l'installation, notamment la mise disposition de jouets dans les hébergements et la distribution de friandises systématique en fin de journée. Une rotation du matériel d’enrichissement, incluant une désinfection, sera organisée une fois par semaine pour éviter la lassitude et renouveler l’intérêt des animaux. Les animaux seront hébergés par groupes sociaux dans des volières conformes aux recommandations pendant toute la durée de l’étude. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. La chirurgie d'implantation de la canule sera réalisée par une équipe experte (extérieure à la société) qui a déjà réalisé cette chirurgie à de nombreusezs reprises et notamment il y a quelques années au sein de notre société. La technique chirurgicale est donc parfaitement maîtrisée ainsi que le protocole d'anesthésie/d'analgésie et de récupération de chirurgie. Le site chirurgical et les sites d'administration seront suivis pendant plusieurs jours après la chirurgie et les administration pour détecter tout signe clinique potentiel. Pour les besoins de la microdialyse cérébrale, les animaux seront maintenus en siège à contention plusieurs heurex d'affilée, la chaise à contention sera donc adaptée pour améliorer le confort des sièges et permettre aux animaux d'être quasiment autonomes (accès aux jouets, aux friandises, au biberonà, tout en gardant une interaction constante avec le manipulateur. Un entraînement spécifique des animaux sera mis en oeuvre pendant la phase d'acclimatation afin de réduire au maximum leur stress le jour des mises en siège prolongées.

Choix des espèces

En raison de la grande proximité phylogénétique entre le Primate Non-Humain (PNH) et l’Homme et en particulier des similitudes du fonctionnement cérébral et des comportements entre ces deux espèces, le modèle primate constitue un modèle de choix pour l’évaluation de molécules qui ont pour cible des récepteurs cérébraux. Le macaque cynomolgus a été choisi car le système nerveux central est connu pour être différents entre les rongeurs et les primates concernant par exemple l'expression ou le métabolisme des transporteurs d'efflux. Il apparaît qu'il existe une meilleure corrélation entre l'expression des protéines d'adhésion et de transport entre l'homme et le singe cynomolgus qu'entre l'homme et les rongeurs. De plus, il existe une meilleure corrélation entre le taux de recyclage du LCR du macaque cynomolgus et l'homme qu'entre la souris et l'homme.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des examens d'imagerie sous anesthésie pouvant durer jusqu'à deux heures et demie, une partie recevant une injection abdominale déclenchant une inflammation ou une diète enrichie en gras. Le projet cherche à comprendre le rôle de l'inflammation cérébrale dans la prise alimentaire et l'obésité. Le porteur affirme s'être assuré de l'absence d'approche in vitro capable de reproduire cette interaction multicellulaire.

Objectifs

Ce projet vise à caractériser, par Imagerie par Résonance Magnétique, la réaction inflammatoire cérébrale survenant après un repas standard ou un repas enrichi en gras. Ces expériences s’inscrivent dans le cadre plus large d’un projet multidisciplinaire, où il a été suggéré par d’autres méthodes, que cette inflammation cérébrale était faible et presque indétectable après un repas standard mais exacerbée après un repas enrichi en gras. Cette inflammation apparaît en particulier dans les cellules immunitaires du cerveau, dans l’hypothalamus, structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire. L’hypothèse est que cette réponse inflammatoire pourrait influencer le comportement alimentaire, en modifiant par exemple la sensation de satiété. Cependant, dans un contexte de suralimentation, d’apports trop riches en graisses, cette inflammation devient chronique et n’a plus d'effet bénéfique sur la prise alimentaire. Ce projet consistera à étudier et caractériser la réponse inflammatoire par Imagerie par Résonance Magnétique, dans le cerveau après un repas standard ou un repas enrichi en gras.

Bénéfices attendus

L'ensemble de l'étude vise à comprendre comment les cellules immunitaires du cerveau particient au contrôle de la prise de nourriture et à la perception de satiété, et, à long terme, comment ce méchanisme participe au développement de l'obésité.

Procédures

Les souris seront exposées à des tests d'imagerie médicale pour une durée maximale de 2H30, anesthésie incluse. Les souris peuvent subir un ou plusieurs tests d'imagerie. Une partie des animaux seront soumis à un traitement pharmacologique par une injection dans l'abdomen, d'une durée d'environ une minute.

Impact sur les animaux

Une partie des animaux vont subir une injection dans l'abdomen qui induira un début d'inflammation générale, mais dont les effets n'apparaitrons que lorsque les animaux seront sous anesthésie. Une partie des animaux aura une diète enrichie en gras, supposée induire une inflammation cérébrale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Nous nous sommes assurés de l'inexistence d'approches alternatives in vitro qui pourraient être utilisées pour reproduire l'interaction entre inflammation microgliale et alimentation. En effet les méthodes in vitro basées sur la culture cellulaire ne présentent pas les systèmes de communication multicellulaires nécessaires pour ce projet.

Réduction

Plusieur mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d'animaux utilsés dans ce projet : - une etude préliminaire sur un nombre restreint d'animaux pour s'assurer d'un déroulement efficace des expériences et - l'utilisation de tests statistiques optimaux, pour avoir le nombre d'animaux minimal sans compromettre la validité de nos résultats.

Raffinement

Conditions d’hébergement : Les animaux sont soumis à un cycle inversé d’alternance jour nuit 12h - 12h et ont accès à volonté à la nourriture et à l’eau. Le cycle inversé est utile pour notre étude car les animaux mangent la nuit et jeune le jour. Pour étudier la prise de nourriture, nous avons besoin que les animaux se nourrissent le jour. Une période d’acclimatation est respectée pendant laquelle ils sont habitués au cycle inversé de l'animalerie, à la préhension et à la présence de l’expérimentateur. Les souris sont stabulées dans un environnement enrichi selon le protocole défini par l'animalerie. Suivi des animaux : L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance (notamment, suppression de la douleur grâce à l’administration d’antalgiques).

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. En effet, le cerveau de souris permet une analyse neuroanatomique de haute résolution concernant les réseaux cellulaires activés en fonction de différents signaux métaboliques. Sa taille est compatible avec la microdissection d’aires cérébrales d’intérêt permettant des analyses biochimiques ou moléculaires. Cet animal nous permet également d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. La réalisation de différents tests fonctionnels permettant l’analyse des paramètres métaboliques est aussi possible chez cet animal. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les animaux seront adultes, pour travailler sur un cerveau mature et stable.

187 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit un diabète par streptozotocine, puis on implante par chirurgie cathéters, pompes et dispositifs de délivrance d'insuline, avec de nombreuses mesures de glycémie et prises de sang. Le porteur signale perte de poids, douleurs post-opératoires, risques d'infection et stress liés aux injections répétées. Le projet vise à valider la voie extrapéritonéale d'administration de l'insuline, et le porteur affirme que ces effets sur plusieurs organes ne peuvent être modélisés in vitro.

Objectifs

L’insuline sécrétée par les îlots de Langerhans du pancréas est la principale hormone permettant de réduire le taux de sucre dans le sang (appelée glycémie). Dans le cas du diabète de type 1 et dans certains stades avancés du diabète de type 2, sa sécrétion est trop faible pour obtenir une régulation correcte de la glycémie. De l’insuline est alors administrée aux patients pour palier à ce manque, par injection sous la peau (appelée voie sous-cutanée), ou dans certains cas directement dans l’abdomen (voie intrapéritonéale). Cependant, ces deux voies d’administration présentent des inconvénients notamment liés à diminution de l’efficacité de l’insuline, pour la sous-cutanée, et à des problèmes d’infection et d’adhésion tissulaire pour l’intrapéritonéal. La voie extra-péritonéale, correspondant à l’espace entre le péritoine (une fine membrane au qui recouvre les organes et qui comporte de nombreux vaisseaux sanguins) et les muscles abdominaux, semble être une alternative intéressante, en permettant un passage rapide de l’insuline dans le sang, tout en étant à distance des organes. Cependant, aucune étude n’a pour le moment été réalisée sur l’administration de l’insuline en continu en extra-péritonéal. Cette étude a donc pour objectif de montrer, chez le rat diabétique, les bénéfices d’une administration extra-péritonéale d’insuline par rapport aux voies sous-cutanée et intra-péritonéale.

Bénéfices attendus

Les seules données disponibles à ce jour sur la délivrance extrapéritonéale d’insuline concernent des injections uniques, afin d’évaluer une efficacité à court terme. Ce projet complèterait ces données en permettant d’évaluer les effets d’une adiministration chronique d’insuline en extrapéritonéale. Cela permettra ainsi d’étudier à la fois la régulation de la glycémie mais également d’autres marqeurs comme le niveau de stress oxydant ainsi que la réaction des tissus au site extrapéritonéal à un contact prolongé avec de l’insuline. Le principal bénéfice attendu est de démontrer que la voie extrapéritonéale peut constituer une réelle alternative aux voies sous-cutanée et intrapéritonéale, pour l’administration d’insuline aux patients diabétiques de type 1.

Procédures

[Gestes techniques réalisés : 1- Mesure de glycémie sur une goutte de sang (volume 6µL) sur animal vigile – Durée

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus sont : - perte de poids en lien avec l’état diabétique - des douleurs suite aux chirurgies réalisées pour la mise en place des cathéters, des pompes et du dispositif de délivrance d’insuline - risque d’infection suite aux implantations (pompe péristaltique, cathéter, dispositif de délivrance) - Un inconfort lié au positionnement de la pompe en sous-cutanée sur le dos de l’animal. - un stress en lien avec la répétition des injections d’insuline dans les cathéters ou les mesures de glycémies et prises de sang au cours du suivi

Devenir

La justification du sort des animaux est commune aux 3 procédures. Les 3 procédures de ce projet nécessité l’utilisation d’animaux avec un niveau de diabète suffisament conséquents pour observer les effets d’insuline administrée selon différentes voies ou avec différents systèmes d’administration. Par conséquent les animaux avec une glycémie trop basse sont écartés de l’étude. Ayant reçu une injection de streptozotocine, qui agit sur différents organes en plus de détruites les cellules béta des îlots pancréatiques, ils ne peuvent être utilisés pour d’autres projets sans risque d’amener un biais expérimental. Ils sont donc mis à mort. Ensuite, la finalité de chacune des procédures est d’étudier l’impact sur les tissus d’une délivrance d’insuline répétée (procédure 1) ou continue via des cathéters (procédure 2) ou un dispositif de délivrance diffuse (procédure 3). Cela nécessite des prélèvements de différents tissus qui nécessitent la mise à mort des animaux.

Remplacement

Les effets de l’administration chronique de l’insuline en extrapéritonéal mettant en jeu plusieurs tissus et organes, elle ne peut être modélisée in vitro. Ces deux paramètres sont évalués par des suivi de glycémie et des prises de sang qui ne sont pas réalisables in vitro.

Réduction

L’effectif des différents groupes prend en compte les sources de variabilité importantes de l’étude, telles que l’induction du diabète, les implantations de cathéter, pompes péristaltiques et de dispositifs de délivrance. Cela permettra d’avoir, selon l’expérience acquise par le laboratoire, suffisamment d’animaux pour réaliser des analyses statistiques sur les différents marqueurs étudiés (glycémie, poids, insulinémie). La plupart des groupes expérimentaux de ce projet combinent au moins deux des sources de variabilité cité plus haut, c’est pour cette raison que les effectifs ont été fixés à 12 animaux par groupe. Pour les animaux contrôles, sur lesquels aucune chirurgie n’est pratiquée, la variabilité est moins importante et l’effectif des groupes est réduit à 8 animaux. Le test statistique utilisé sera l’ANOVA pour des données ayant une distribution suivant une loi normale ou Kruskal-Wallis dans le cas contraire. Les groupes composés d’animaux diabétiques et non diabétiques sont répétés dans les deux phases du projet impliquant l’implantation de pompes péristaltiques. Cela obéit à une logique de rigueur scientifique, qui invite à ce que les cages hébergent des animaux des différents groupes, pour une meilleure représentativité des contrôles.

Raffinement

Le raffinement intervient au niveau Il intervient au niveau de l’hébergement avec un enrichissement des cages à l’aide de cylindres en PVC rouge, qui servent de refuge aux animaux et permet ainsi de diminuer leur stress. Pour l’ensemble des 3 procédures, où interviennent des chirurgies pour l’implantation des cathéters (procédure 1), de pompes péristaltiques (procédure 2 et 3) et de dispositif de délivrance (procédure 3) le raffinement intervient lors de l’anesthésie, réalisée au gaz pour un réveil plus rapide et de la prise en charge post-opératoire par l’administration d’un anti-inflammatoire et anti-douleur. Afin de réduire les risques d’infection, les chirurgies sont réalisées sous hotte à flux laminaire, avec l’utilisation d’un protocole de désinfection de la peau spécifique, ainsi que des champs opératoires stériles et une désinfection des instruments par chaleur humide. Le raffinement est aussi présent dans le suivi des animaux réalisé quotidiennement durant toute la durée de l’étude, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation adaptée aux procédures, qui permet de détecter rapidement la souffrance, la douleur chez les animaux et de mettre en place les traitements adaptés. En accord avec cette grille d’évaluation, des points limites prédictifs ont été déterminés afin de soustraire les animaux aux procédures expérimentales en cours d’étude, tels qu’une persistance de l’état diabétique (perte de poids, hyperglycémie) malgré l’administration d’insuline, une infection post-opératoire non traitable.

Choix des espèces

Le choix du rat est d’abord justifié par de fortes similitudes avec l’Homme sur le plan métabolique, au niveau de la régulation de la glycémie. Ce choix est également motivé par la capacité des rats à bien supporter les chirurgies, et par la possibilité d’accéder à la même voie d’administration de l’insuline que chez l’Homme (sous-cutanée, intra-péritonéale, extra-péritonéale) Enfin, nous avons également choisi d’utiliser le rat pour les premières études précliniques, pour limiter autant que possible le nombre de gros animaux (porcs et primates) nécessaires pour les études suivantes. Les rats Wistar seront de jeunes adultes, âgés de 7 semaines, coïncidant avec un poids de 200g environ. C’est à ce poids que le protocole d’induction du diabète présente le meilleur taux de succès. En effet, avec des âges/poids inférieurs la mortalité est plus élevée, tandis qu’à des âges/poids supérieurs le taux de réussite diminue. De plus, à cet âge, le système immunitaire est suffisamment mature pour que les animaux puissent subir des chirurgies sans risques accrus d’infections.

24 porcelets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit par voie orale une inflammation intestinale se traduisant par une diarrhée, avant de prélever l'ensemble du système digestif. Le projet évalue un ingrédient naturel censé limiter cette inflammation après le sevrage et réduire le recours aux antibiotiques. Le porteur indique vouloir croiser ces résultats avec un modèle de cellules intestinales in vitro pour, à terme, réduire ou supprimer le recours aux animaux.

Objectifs

L’objectif du projet est d’une part de valider un modèle d’inflammation intestinale par voie orale sur le porcelet puis d’utiliser ce modèle pour évaluer l’efficacité d’un ingrédient naturel sur l’inflammation. L’objectif est d’autre part de mettre en parallèle ces résultats avec ceux déjà obtenus in vitro sur modèle de cellules intestinales porcines afin de construire un modèle pharmacologique permettant de limiter les études sur animaux.

Bénéfices attendus

Dans la production porcine, le sevrage précoce et brusque est un événement très stressant obligeant le porcelet à s’adapter rapidement à des changements drastiques (changements brusques du régime alimentaire, séparation de la mère, nouvel environnement, etc.). Ces évènements ont des conséquences négatives sur la santé intestinale du jeune porcelet, ce qui augmente la susceptibilité aux maladies et entraîne également une diminution des performances. Au niveau intestinal, le sevrage induit en effet une dégradation de la barrière intestinale. La production incontrôlée de molécules inflammatoires contribue à influencer négativement l’intégrité intestinale et donc la barrière avec par exemple modifications de la perméabilité aux macromolécules, du transport des nutriments et des ions. La composition du microbiote intestinal est également affectée et l'association avec l’inflammation intestinale locale peut entraîner une expansion de bactéries pathogènes intestinales qui se traduit par l’apparition de diarrhée phénomène classique en post-sevrage pouvant conduire à l’utilisation d’antibiotiques. L'utilisation de molécule naturelle pourrait permettre de diminuer l'utilisation d'antibiotique et l'amèlioration du bien-être de l'animal.

Procédures

Il n' y a pas d'intervention sur animaux vigiles pendant la durée des procédures. Les prélèvements seront réalisés sur animaux non vigiles.

Impact sur les animaux

L’objectif est d’induire une inflammation digestive modérée. Elle pourra se traduire par l’apparition de diarrhée légère chez l’animal. Ce type de diarrhée n'a pas d’impact fort sur le comportement et/ou la consommation d’aliment et d’eau des porcelets.

Devenir

L'ensemble du système digestif doit être prélevé pour pouvoir évaluer l'effet protecteur de l'ingrédient.

Remplacement

L’objectif des procédures expérimentales nécessitent l’utilisation d’animaux pour valider les résultats obtenus in vitro et déterminer les doses à appliquer in vivo. En effet il n'est pas possible de simuler dans les tests in vitro (culture cellelaire intestinale) la réponse de l'organisme à l'inflammation intestinale et donc de modéliser la réponse physiologique. L'étude permettra de corréler les réponses obtenus in vitro et in vivo afin de pouvoir identifier les manques du modèle in vitro. A terme l’objectif majeur est de réduire ou de supprimer le modèle animal

Réduction

Un nombre minimal de porcelets a été calculé en tenant compte de l’amplitude de réponse attendue sur l’expression des gènes et de la variabilité de la réponse, en effectuant un calcul statistique du nombre de sujet nécessaire. Ces calculs nous ont permis de fixer un nombre d'animaux par groupe et qui au total représente un nombre de 24 animaux.

Raffinement

Les porcs seront hébergés en box individuels. Cependant, les cloisons entre les box permettent un contact visuel, olfactif et tactile (groin à groin) entre porc voisin. Des jouets seront mis à disposition : balle et/ou rouleau et/ou jouets à macher suspendus. Les animaux seront observés quotidiennement. Des points limites et critères d’arrêt ont été définis afin de permettre une intervention rapide sur les animaux

Choix des espèces

La problématique de ce projet concerne la gestion des diarrhées chez le porcelet en post-sevrage. Le porcelet d’élevage est donc l’espèce cible retenu pour réaliser ce projet. Stade de développement : sevrage. Ces porcelets seront âgés de 28 jours et pèseront environ 8.5 kg. L’âge de 28 jours du porcelet correspond au passage de l’allaitement vers la phase sevrage de l’animal. La problématique de ce projet concerne la gestion des diarrhées chez le porcelet au stade de développement "sevrage". Ce stade est choisi car il représente une période de stress importante pour le porcelet d’élevage. En conséquence nous avons choisi ce modèle pour réaliser ce projet et améliorer le bien-être des animaux durant cette phase de sevrage

121 animaux non-humains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 16 chiens et 105 porcs. Les porcs subissent des interventions chirurgicales pouvant durer jusqu'à six heures sous anesthésie profonde, puis sont tués sans réveil du fait des lésions provoquées dans plusieurs organes, alors que les chiens, opérés lors de procédures présentées comme non délabrantes, sont réutilisés ensuite. Le projet vise à mettre au point des plateformes robotiques d'ablation tumorale et de biopsie destinées d'abord à la chirurgie humaine. Le porteur affirme choisir le porc et le chien pour leur proximité anatomique avec l'humain et décrit un modèle qu'il juge indispensable pour valider l'efficacité in vivo.

Objectifs

Le projet a pour objectif le développement de plateformes robotiques destinées à l'oncologie interventionnelle (ablations tumorales), au diagnostic (biopsies) et/ ou à des interventions osseuses, par voie percutanée. Les objectifs principaux des plateformes robotiques sont: - d’atteindre très précisément les tumeurs afin de s’assurer que ces dernières seront bien détruites en limitant au maximum la destruction de cellules saines environnantes. - de cibler très précisément des tumeurs de très petite taille afin de disposer d'outils diagnostics fiables et performants (biopsies sous IRM par exemple) pour une prise en charge précoce. - de pouvoir ponctionner l'os ou y délivrer une substance (ciment osseux par exemple) de façon précise

Bénéfices attendus

Les plateformes robotisées proposent une atteinte très précise et sécurisée des tumeurs / tissus par voie percutanée. Couplées à une modalité d'imagerie CT-scan ou IRM, elles offrent un vaste panel d'utilisations, tout en élargissant le nombre de patients pouvant bénéficier de ces traitements mini-invasifs. Principalement destinées à l'utilisation en oncologie / chirurgie humaine, elles pourront également être utilisées en médecine vétérinaire et ainsi améliorer la prise en charge des animaux de compagnie. Une plateforme robotique a d'ores et déjà pu être mise au point et installée en centre anticancer pour le traitement de patients avec tumeurs des organes abdominaux.

Procédures

Les animaux sont soumis à des procédures chirurgicales: 1) insertion de cibles synthétiques (intervention non systématique) - par laparotomie, sous anesthésie: durée env. 30min - par voie percutanée, sous contrôle echographique, sous anesthésie: durée inférieure à 15 minutes 2) procédure chirurgicale robotique: - chez le Chien, la durée d'anesthésie totale sera plafonnée à 3h, et limitée autant que possible à 2h30, afin d'assurer une récupération optimale aux animaux. La procédure chirurgicale ne pourra donc pas excéder ces temps. - chez le Porc, la procédure pourra durer jusqu'à 6h, les animaux n'étant pas réveillés, et placés sous anesthésie profonde et analgésie adaptée. Ces procédures longues permettent d'évaluer un maximum de paramètres sur un seul animal et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pour les animaux sont liés à la réalisation des chirurgies pour l'insertion de cibles syntéthiques dans les organes par laparotomie: risque d'inconfort lié à la cicatrice, stress lié à l'isolement post-opératoire.

Devenir

Les porcs sont mis à mort sans réveil à l'issue de la procédure de chirurgie robotisée, du fait de la durée d'intervention et des essais effectués, qui peuvent entrainer des lésions dans différents organes. La procédure effectuée sur chiens est non délabrante et les animaux pourront être réutilisés après la procédure soit sur le même projet, soit sur un projet différent ou lors d'activités pédagogiques.

Remplacement

Les tests in-vitro (tests réalisés sur un fantôme et sur pièces anatomiques/cadavres) précédemment réalisés ont permis de vérifier et valider plusieurs paramètres dont la précision d’atteinte de la tumeur. En revanche, ils ne permettent pas de s’assurer que cette atteinte sera similaire sur un organisme vivant. En effet, ils ne prennent pas en considération les mouvements liés à la respiration et les risques potentiels d’atteinte d’autres structures tels que des vaisseaux sanguins ou organes lors du geste. Le projet a pour objectif de valider les aspects d’efficacité et de sécurité dans un modèle in-vivo, ne pouvant être validés lors des tests in-vitro.

Réduction

La réalisation d'une majorité de tests préalable in vitro ou sur pièces anatomiques permet de réduire le nombre d'animaux utilisés au strict minimum nécessaire pour la mise au point du protocole opératoire et l'obtention des données d'efficacité et de sûreté exigées par les autorités réglementaires (les robots opératoires sont des dispositifs médicaux). Les animaux sont opérés un par un, ou par petites séries de 2 animaux: cela permet de traiter les données obtenues au fur et à mesure, de réaliser des ajustements s'il le faut, et de stopper les procédures dès que les données nécessaires sont obtenues. Ainsi aucun animal "surnuméraire" n'est opéré.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec enrichissements propres à l’espèce. : ils disposent de vastes boxes, d'une taille supérieure à celle requise par la législation. Le sol est recouvert d'une litière végétale changée tous les jours. La nourriture est distribuée dans les gamelles et dans la litière pour leur permettre de prendre le temps de la trouver. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier formés aux soins et à la manipulation de ces espèces. Les animaux suivront également un programme de socialisation avec renforcement positif afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. Tout acte douloureux ou fortement stressant sera réalisé sous sédation ou sous anesthésie générale selon les besoins. Si nécessaire, la douleur sera prise en charge par l'administration de traitements analgésiques adaptés.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce animale se rapprochant anatomiquement le plus de l’Homme. Pour ce projet, nous avons besoin d’avoir des organes similaires à l’Homme en terme de structure et de taille, afin de pouvoir évaluer l’effet attendu en clinique. Les organes abdominaux du porc de 35 à 80kg (dont le foie) sont parmi ceux qui se rapprochent le plus de l’Homme. Le chien est l'espèce cible du robot de biopsie prostatique, donc le modèle de choix pour l'obtention des données recherchées. Par ailleurs les caractéristiques anatomiques de la prostate canine en font également un modèle intéressant pour l'obtention de données applicables à l'Homme, pour lequel ce robot pourra être adapté par la suite. Les animaux utilisés permettront donc de générer des données à double fin: le passage rapide en essais cliniques chez le Chien, et le développement utltérieur de la même technologie destinée à l'Homme. Les porcs utilisés en étude sont de jeunes animaux qui arrivent à maturité sexuelle, leur croissance n’est pas terminée mais leur taille permet un hébergement en animalerie conventionnelle dans de bonnes conditions. D’autre part, leur poids de 35kg à 80kg permet de travailler sur des organes abdominaux, notamment un foie de taille comparable à un foie humain, indispensable pour reproduire les conditions attendues en clinique. Les chiens seront des animaux adultes de plus d'1 an, de façon a avoir une prostate de taille définitive.

12 macaques rhésus vont être utilisés, gardés vivants et réintroduits dans leur groupe, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'environ quatre heures pour poser un plot de tête, un entraînement à l'IRM éveillée de 6 à 12 mois et des séances d'imagerie sous anesthésie avec injection d'un agent de contraste, pour comparer la perception de la voix entre espèces. Le porteur indique que la capture et la séparation du groupe provoquent du stress, que le contrôle hydrique limite la ration d'eau à la séance d'entraînement, et que l'anesthésie et l'agent de contraste comportent des risques pour le foie. Sur le remplacement, il affirme qu'une étude comparative entre espèces ne peut se faire sans recourir à des animaux.

Objectifs

Ce projet vise à utiliser l'IRMf pour mesurer l'activité cérébrale dans des conditions d'écoute passive et la comparer entre des groupes de sujets de taille comparable entre marmousets, macaques et humains. Les macaques seront scannés soit éveillés soit sous anesthésie en IRM 3T. Deux expériences seront réalisées: la localisation d'un patch vocal (neurones sensibles et spécifiques au traitement des vocalisations des macaques) et comparaison inter-espèces.

Bénéfices attendus

Nous espérons que cette recherche fournira de nouvelles informations cruciales sur les bases cérébrales du traitement de l'information vocale chez les macaques. En particulier, nous mesurerons la localisation anatomique et la variabilité interindividuelle des patchs vocaux des macaques avec une taille d'échantillon et une puissance statistique comparables à celles des études humaines, pour une comparaison optimale entre espèces.

Procédures

Entrainement à l'IRM éveillé: 1 à 2 sessions par jour de 10 minutes (pour les nouveaux animaux) à 1h (lorsque les animaux sont habitués) par animaux pendant 6 à 12 mois. Chirurgie pour la pose du plot de tête pour le scanning IRM éveillé; durée chirurgie: environ 4h. Durée session imagerie sous anesthésie: 3h environ pour les premiers animaux puis environ 1h30-2h pour les suivants.

Impact sur les animaux

Des nuisances sont attendues chez les animaux pour la partie imagerie : (1) lors de la préparation : mise à jeun, séparation de l’animal de son groupe et capture provoquent du stress ; la chirurgie de pose du plot de tête et ses potentielles complications pendant l’anesthésie, la chirurgie elle-même ou les infections post-chirurgicales ; durant l’entrainement à l’IRMf éveillée le contrôle hydrique est aussi une nuisance pour l’animal car il n’obtient sa ration journalière d’eau que pendant et après la séance d’entrainement(2) lors de l’acquisition IRM : l’anesthésie et ses potentielles complications respiratoires/cardiaques, l’injection intraveineuse de MION en agent de contraste et ses potentiels effets secondaires au niveau du foie, l’intubation si l’anesthésie le nécessite et (3) après la séance :injection d’un chélateur pour limiter l’effet de l’agent de contraste sur l’organisme et le foie en particulier.

Devenir

Le projet ne prévoit la mort d'aucun individu, ils seront tous réintroduit dans leur groupe sociaux.

Remplacement

Il s’agit d’une étude comparative : par définition celle-ci compare des résultats obtenus chez l’humain à ceux obtenus chez d’autres espèces existantes, afin d’inférer des mécanismes potentiellement présents chez un ancêtre commun, ici les mécanismes comportementaux et neuronaux de la perception de l’information vocale. Il n’est pas possible d’utiliser cette approche expérimentale sans avoir recours à des animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé sera minimal pour réduire autant que possible le nombre de singes impliqués, mais sera suffisant pour permettre une puissance statistique importante pouvant rendre les données interprétables.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en binômes, avec de l'enrichissement structurel et alimentaire renouvelé fréquemment. La réduction du temps d’isolement du singe de son binôme permet de réduire le stress et la possibilité de tensions lorsque le singe sera replacé dans sa cage. La modification de la mise à jeun n’affectera pas le binôme puisque la mise à jeun aura lieu pendant la nuit. Les singes seront sédatés puis anesthésiés et le contrôle des constantes se fera tout le temps du scan jusqu’au réveil. L’ajout d’agent de contraste permettrait d’améliorer la qualité des images tout en diminuant le nombre de sessions de scan par animal. Si un quelconque problème arrive lors de l’anesthésie gazeuse pendant l’IRM, alors le scan sera stoppé immédiatement et l’animal sera réveillé et surveillé.

Choix des espèces

Cette étude comparera les données observées chez l’humain à celles mesurées chez deux espèces de primates nonhumains: macaques et marmousets. Les raisons justifiant le choix des macaques comme espèce de comparaison sont les suivantes : - Ils sont relativement proches de nous sur le plan phylogénétique de sorte que les résultats nous renseigneront sur l'histoire de l'évolution relativement récente ; - Ils utilisent des vocalisations complexes et variées, bien caractérisées acoustiquement ; - Il s'agit d’un modèle neuroscientifique largement étudié, en particulier pour les neurosciences auditives, de sorte que les résultats obtenus seront interprétables en relation avec une grande quantité de données complémentaires ; - Enfin, ils peuvent être scannés en IRMf sur le même scanner que les humains, ce qui constitue un pont unique entre l'IRMf humaine et la littérature électrophysiologique sur les singes. Nous constituerons un groupe formé de sub-adultes afin de faciliter la gestion et l’entraînement dans les premières phases du projet, et afin qu’ils soient à un âge de jeune adulte pendant le durée du projet, pour comparaison optimale avec les groupes d’humains aussi constitués de jeunes adultes.