Procédures modérées

144 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leur cœur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont soumis pendant six mois à des régimes incluant des arrêts de nourriture de trois jours, à des tests de tolérance au glucose avec ponctions répétées de la queue et à des IRM sous anesthésie avec pose d'un cathéter dans la veine caudale, pour évaluer les effets du jeûne sur le cœur. Le porteur indique que les ponctions et la pose du cathéter peuvent provoquer stress, douleur et risque d'infection. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico n'existe et que l'expérimentation animale est "nécessaire" pour valider son hypothèse de cardioprotection.

Objectifs

Le jeûne est une méthode d’alimentation consistant à ingérer peu ou aucune nourriture sur une période allant de 12h à plusieurs semaines chez l’Homme. Cette coutume ancestrale est pratiquée par de nombreuses religions et, plus récemment, a reçu une attention croissante pour d’autres raisons de santé, économique et écologique. On distingue le jeûne intermittent, qui consiste à se priver de nourriture pendant une période de 14h sur une journée, le jeûne intermittent prolongé (3 – 5 jours) et le jeûne thérapeutique (1 à 3 semaines). En France, jeûner n’est pas proposé dans un cadre médicalisé. Pourtant, il a été prouvé que le jeûne retarde les processus liés à l’âge (stress oxydant, inflammation…), protège le cerveau des maladies neurodégénératives et diminue la croissance tumorale. Le jeûne intermittent prévient et réverse tous les aspects du syndrome métabolique chez le rongeur et chez l’Homme. En cardiologie, des études précliniques sur des rats mâles ont démontré une diminution de la fibrose myocardique liée à l’âge en prévenant l’inflammation et en maintenant les antioxydants. De plus, le jeûne intermittent diminue l’apoptose et l’inflammation puis prévient le remodelage du myocarde sur modèles d’infarctus du myocarde. Plusieurs jours de jeûne améliorent la diffusion de l’oxygène du capillaire à la mitochondrie de myocarde murin suggérant une amélioration de l’énergie cellulaire. Les objectifs de cette étude sont de caractériser les effets du jeûne intermittent et du jeûne thérapeutique sur le cœur de rat et de déterminer si ces derniers sont protecteurs lors d’un stress aigu induit par un épisode d’ischémie-reperfusion et dans un modèle de cardiomyopathie prédiabétique (induit par un régime riche en graisse et en sucre). Plus précisément, nous souhaitons caractériser le profil cardiométabolique du jeûne, notamment le métabolisme énergétique et le profil lipidique myocardiques. Notre hypothèse est que les changements physiologiques et métaboliques induits par le jeûne intermittent et/ou thérapeutique seraient cardioprotecteurs. Enfin, nous souhaitons déterminer s’il y a un effet du genre et comparer les mécanismes du jeûne intermittent et du jeûne thérapeutique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux caractériser les effets des jeûnes intermittent et thérapeutique sur la fonction cardiaque, le métabolisme énergétique et le remodelage du profil lipidique. Nous souhaitons savoir si ces méthodes sont cardioprotectrices envers un stress aigu (ischémie/reperfusion) et chronique (modèle de prédiabètes induit par le régime riche en graisse et en sucre). Enfin, nous évaluerons l’effet du genre de ces régimes.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents régimes décrits ci-après : régime normal pendant 6 mois ; régime normal pendant 3 mois puis nourris un jour sur deux pendant 3 mois ; - régime normal pendant 3 mois avec deux arrêts de la nourriture pendant 3 jours (à 4.5 et à 6 mois) ; régime riche en graisse et en sucre pendant 6 mois ; régime riche en graisse et en sucre pendant 3 mois puis nourris un jour sur deux avec le même régime pendant 3 mois ; régime riche en graisse et en sucre pendant 6 mois avec 2 arrêts de la nourriture pendant 3 jours à 4.5 et 6 mois. Tous les animaux seront soumis à trois tests de tolérance au glucose sur animaux vigiles. Celui-ci comprend une injection intrapéritonéale et 6 prélèvements de gouttes de sang dans la queue de l’animal (mesure de glycémie). Cette procédure sera répétée trois fois à 3, 6 et 9 mois. Tous les animaux seront soumis à trois examens d’imagerie IRM avec insertion d’un cathéter dans la veine caudale sous anesthésie générale. Cette procédure sera répétée trois fois à 3, 6 et 9 mois.

Impact sur les animaux

La procédure sur la mise en place des régimes peut entrainer un léger stress chez les animaux mais ne doit pas entrainer d'effet indésirable notable et a déjà fait l’objet de nombreuses publications au niveau international. L'eau quant à elle restera à disposition ad libitum. Le test de tolérance au glucose fait l’objet d’injection en intrapéritonéale et de ponctions répétées au bout de la queue de l’animal pour mesure de la glycémie pouvant générer un stress pour l’animal et un risque d’infection. Les animaux réagissent et cicatrisent bien, notre groupe a l’habitude de travailler avec ces mesures et fera le nécessaire pour surveiller tout évènement indésirable (stress, infection). Les anesthésies et les examens d’imagerie in vivo par IRM sont également des nuisances pour les animaux mais l’imagerie reste l’exploration la moins invasive de nos jours. Enfin, la pose d’un cathéter se fera sous anesthésie pou diminuer le stress de l’animal, cela peut augmenter la douleur après réveil ainsi que le risque d’infection que nous surveillerons quotidiennement.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure (après l'IRM à 9 mois) pour pouvoir prélever le cœur et réaliser des expériences ex vivo en cœur isolé afin de caractériser le métabolisme énergétique et le profil lipidique cardiaque par spectroscopie par résonance magnétique.

Remplacement

A l'heure actuelle, il n'existe aucune méthode de substitution in vitro et in silico pour étudier l'effet des jeûnes intermittent et thérapeutique sur la physiologie et le métabolisme cardiaque. De plus, l’expérimentation animale est nécessaire pour valider notre hypothèse de cardioprotection de ces régimes face à des stress aigu et chronique selon le sexe. De nombreuses similitudes existent entre la physiologie cardiaque des rongeurs, particulièrement celle du rat, et celle de l'homme. Les modèles pathologiques chez les rongeurs sont utilisés au laboratoire depuis de nombreuses années et toutes les techniques d'imagerie/ spectroscopie de résonance magnétique dans ce projet ont été caractérisées au sein même du laboratoire.

Réduction

Notre approche expérimentale permettra de réduire de façon drastique le nombre d'animaux en accord avec la règle des 3R. En effet, l'étude in vivo permettra de réaliser un suivi longitudinal de l’animal sans sacrifice et l'étude ex vivo sera réalisée sur le même animal. Le nombre d'animaux dans ce projet est le minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes. Nous souhaitons obtenir un effectif final de n=10 par groupe et nous envisageons 20% de perte de données (problème technique d’imagerie et de spectroscopie, problème de prélèvement du cœur pour l’expérience ex-vivo). Nous prévoyons donc 10 + 2 (20% de perte) = 12 rats par groupes. L’effectif de 10 animaux par groupe est déterminé à l’aide d’une analyse statistique (Statistica) prévoyant, pour un risque alpha de 5% et un risque béta de 10%, une amélioration de 25% de la fonction cardiaque dans nos modèles animaux pathologiques pour revenir à des valeurs physiologiques observées chez des animaux contrôles.

Raffinement

Les rats seront acclimatés pendant 14 jours avant le début de l'étude. La procédure sur la mise en place des régimes ne doit pas entrainer d'effets indésirables. Les durées et fréquences sont déterminées en fonction des données de la littérature (1 jour sur 2 pour le jeûne intermittent et 3 jours de jeûne thérapeutique). L'eau sera mise à disposition en qualité et quantité satisfaisantes. Tout au long des régimes et du projet, le bien-être des animaux sera assuré par un hébergement en portoir ventilé par cage de 2 individus avec un enrichissement composé de matériel pour nicher et se cacher ainsi que des buches et des rondins pour ronger afin de satisfaire les besoins physiologiques des animaux. Les conditions de température, lumière et humidité des cages seront contrôlées. Un animalier ou un chercheur contrôlera le bien-être des animaux tous les jours. Pour le test de tolérance au glucose et la mesure de l'insuline à jeun ou l'anesthésie ne peut pas être réalisée, une compresse d'eau chaude sera placée sur la queue de l'animal afin de faciliter le prélèvement de la goutte de sang le plus rapidement possible. Afin d'éviter toute infection, la queue de l'animal sera désinfectée avant et après la procédure avec de la Vétédine. Les jours suivants, nous vérifierons la bonne cicatrisation de la queue de l'animal. Pour la procédure d'IRM in vivo, les rats seront anesthésiés par un mélange d’isoflurane (Vetflurane 2%) et d’oxygène (1L/min) à l’aide d’une chambre d’induction et le bien-être animal sera assuré par le maintien des constantes vitales de l'animal. Durant les anesthésies, les yeux seront hydratés (Ocrygel) et la température maintenue à 37°C par couverture chauffante et monitoring par sonde rectale. Durant l'IRM, une injection d'adénosine (poudre chez Sigma Aldrich) à 0.33 mg/kg/min diluée en solution de chlorure de Sodiul à 0.9% à usage vétérinaire (B.Braun) sera réalisée via un cathéter disposé dans la veine caudale, le volume maximal est de 3 ml pendant 10 minutes maximun. La respiration et l'ECG seront surveillés pendant toute la durée de l'examen. Le comportement des animaux sera étroitement surveillé et une grille d'évaluation de la douleur sera remplie et le point limite déterminé en fonction des principes de Morton et Griffiths. Enfin, pour la procédure ex vivo sur le coeur isolé perfusé, nous réaliserons une euthanasie par injection d'euthasol (140mk/mg, IP) avant de prélever le cœur afin de ne pas faire souffrir l'animal.

Choix des espèces

Le modèle de rat soumis à ces régimes a été choisi car des études des jeûnes ont été réalisé sur cette espèce. De plus, nous souhaitons comparer nos résultats de cardioprotection avec ce qui a déjà été fait dans le laboratoire dans un souci de respect des 3R. Nous souhaitons également tester la cardioprotection des jeûnes sur le modèle de rat nourri avec un régime HFS qui permet de développer un modèle de prédiabète reproduisant la même genèse que chez l’Homme et de suivre ces effets sur l’organisme, en particulier le coeur. Le modèle HFS a été récemment décrit par notre équipe pour induire un état prédiabétique. Les rates soumises à ce régime présentent une altération de l’homéostasie glucidique, une dysfonction cardiaque précoce des trois mois de régime, ainsi qu’une sensibilité plus importante aux lésions d’ischémie-reperfusion caractérisée par une altération du métabolisme énergétique et de la fonction cardiaques, par comparaison aux rates contrôles sous-alimentation normale.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées au plus tard 28 jours après la lésion pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage de tamoxifène puis, sous anesthésie, des injections de chlorure de baryum dans les muscles pour provoquer une lésion et étudier la régénération musculaire. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable majeur, tout en fixant des points limites comme la paralysie ou la nécrose de la patte qui déclenchent la mise à mort. Sur le remplacement, il indique avoir mené des études préliminaires sur des lignées cellulaires mais conclut que l'étude au sein d'un "organisme dans son ensemble" reste nécessaire.

Objectifs

Parmi les tissus des organismes vertébrés, le muscle squelettique est l’un des plus remarquables : il présente un développement et une croissance prodigieuse et possède de grandes capacités régénératrices. Ces capacités de croissance et de régénération font de lui un organe très plastique. À l’origine de cette plasticité musculaire se trouve un réservoir de cellules souches, dont les plus étudiées à ce jour sont les cellules satellites qui, comme leur nom l’indique, se localisent en périphérie des fibres musculaires. Ces cellules sont mises en place au cours du développement. Le développement et le maintien de ces cellules par cet environnement est crucial à l’équilibre et à la régénération musculaire et déterminé par les gènes Hira, Pax3 et Pax7. Nous souhaitons étudier la fonction spécifique de chacun de ces gènes dans les cellules satellites pendant la régénération musculaire. Dans un but de suivre le principe des 3R et de réduire et remplacer l’utilisation excessive d’animaux impliqués dans les expériences in vivo, nous avons établi des lignées cellulaires dérivées de muscles pour les expériences préliminaires. Nous avons caractérisé et étudié ces lignées in vitro pour cibler les expériences les plus pertinentes à développer chez la souris pour la validation in vivo. Les deux procédures principales visent à analyser et caractériser les fonctions d’Hira, Pax3 et Pax7 au cours de la régénération musculaire. Pour essayer de minimiser la souffrance et le stress induit aux animaux, des analgésiques seront administrés avant et après la procédure d’induction de la régénération musculaire. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux qui peuvent présenter une mobilité réduite pendant cette période. Notre étude fera appel à un maximum de 400 souris au total reparties sur 2 procédures expérimentales.

Bénéfices attendus

Il a été récemment montré que l’absence de la protéine Hira dans les cellules souches musculaires adultes (cellules progénitrices, caractérisées par expression du gène Pax7) a pour conséquence une inhibition de la régénération musculaire. De plus, il a été démontré que Hira est un facteur clé pour garder l’identité myogénique des cellules satellites pendant la régénération du muscle. Ce projet permettra de comprendre si cette cascade régulatrice est spécifique des cellules satellites ou bien à un rôle général dans le maintien de l’identité cellulaire d’autres types cellulaires composant du muscle squelettique nous proposons de développer ce projet.

Procédures

Pour la procédure 1, 240 de la totalité des animaux (400) seront soumis au gavage de tamoxifène 2 fois avec un intervalle d’une semaine. Le geste de gavage ne prend que quelques secondes. Pour la procédure 2, 300 de la totalité des animaux (400) seront anesthésiés sous isoflurane (induction 4%, maintien 2%) et soumises à des injections de BaCl2 dans les muscles. L’intervention sera faite une seul fois par souris et la durée de l’intervention est de 10 minutes (après endormissement des animaux). Les 100 autres animaux seront analysés en homéostasie, donc non-soumis à des injections.

Impact sur les animaux

Il n'est attendu aucun effet indésirable majeur dans le contexte des génotypes utilisés, du traitement de tamoxifène par gavage ou de la lésion musculaires. Les animaux des differents génotypes sont comparables en termes de comportement/activité motrice spontanée et de poids corporel. Les génotypes des animaux utilisés ne sont pas délétères ou indésirables. Donc, à ce jour, nous ne nous attendons pas à un phénotype associé à ces procédures.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort au plus tard 28 jours post-lésion intramusculaire pour prélèvement des tissues nécessaires à l’analyse.

Remplacement

Nos projets s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps et l’interaction entre de nombreux types cellulaires. Pour éviter au maximum l’usage d’animaux dans l’étude et être confiant de la réussite de notre projet in vivo, nous avons fait des études préliminaires sur des lignées cellulaires musculaires avant de passer aux expériences sur les animaux. De fait, l’étude de ces processus au sein d’un organisme dans son ensemble où toutes les cellules impliquées sont en étroite communication est nécessaire et ne peut être substituée qu’en partie par l’in vitro. Par conséquence, la culture cellulaire restera une technique que nous utiliserons au cours de ce projet pour des tests préliminaires et complémentaires à l’utilisation des souris.

Réduction

Dans un but de suivre le principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) et de réduire l’utilisation d’animaux, le nombre d’animaux a été calculé sur la base de protocoles déjà publiés avec 10 animaux par lot ce qui est le minimum pour obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des analyses nécessaires. Ce nombre de souris n’a pas été calculé avec des méthodes de statistique mais basé sur notre expérience sur l’obtention de matériel biologique pour chaque technique.

Raffinement

Pour minimiser la souffrance et le stress induit aux animaux, des analgésiques seront administrés avant et après d’induction de la régénération musculaire. En préalable à l’injection, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane (induction 4%; maintien 2%). L’endormissement complet sera contrôlé par pincement ferme de la queue. L’anesthésie à l’isoflurane est rapide et profonde afin de permettre la réalisation de la procédure dans un temps relativement court et assurer un réveil rapide. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux. Pendant toute la procédure, les cages sont visuellement inspectées chaque jour donc tout animal présentant les points limites sera mis à mort (lordose, tremblements, prostration, paralysie, difficulté de locomotion, nécrose de la patte, perte de poids).

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples. Les approches de transgénèse et recombinaison homologue nécessaires à l’étude de mécanismes moléculaires de processus biologiques sont facilement réalisables. La recombinaison homologue permet de modifier de manière efficace et contrôlée le locus des gènes murins. Ce modèle étant couramment utilisé, de nombreuses lignées transgéniques, notamment lignages spécifiques, sont aujourd’hui disponibles à toute la communauté. Des lignées pures et génétiquement caractérisées sont disponibles pour ce modèle. La courte durée de gestation chez la souris est compatible avec la durée de nos expériences. Nos expérimentations concernent les jeunes adultes de 8 semaines, date à laquelle le muscle adulte est complètement formé. L’administration de tamoxifène par gavage sera faite à tous les animaux de l’étude qui presente l’allèle CreErt2. La tamoxifène va permettre l’induction de la recombinase Cre dans des lignées floxées au stade d’expression du promoteur contrôlant l’expression de la recombinase dans chaque lignée. Apres l’administration de tamoxifène par gavage, les animaux seront analysés pour l’étude de la régénération musculaire.

256 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit la pose chirurgicale d'un cathéter dans la veine porte, pour certaines couplée à la suppression d'une voie nerveuse spinale, puis une perfusion de solution sucrée sur 24 heures, avant la mise à mort pour analyse du cerveau. Le porteur reconnaît des risques d'hémorragie et de troubles de la motilité intestinale liés à la chirurgie. Il étudie comment l'intestin signale le glucose au cerveau et affirme que ces dialogues entre organes ne peuvent s'étudier sur cellules ou organoïdes.

Objectifs

L’obésité et le diabète de type 2 connaissent une croissance alarmante. La dérégulation de la glycémie, notamment chez des personnes diabétiques ou obèses, est un problème majeur de santé publique nécessitant une recherche constante quant aux thérapies proposées. Les études précédentes ont mis en évidence que la production de glucose (sucre) par l’intestin exerce des effets bénéfiques sur l’équilibre glucidique et énergétique. En effet, le glucose sécrété dans la veine porte (localisée à la sortie de l’intestin) induit un signal nerveux - appelé signal « glucose-portal » - qui cible les régions du cerveau du contrôle de la prise alimentaire et de la dépense énergétique. Différents circuits nerveux entourent la veine porte et permettent la détection des informations nutritionnelles et leur transmission au cerveau. La détection du glucose dans la veine porte pourrait impliquer les nerfs qui utilisent le transmetteur CGRP (Calcitonin gene related protein). Une partie de ces nerfs passe par une chaine ganglionnaires qui longe la colonne vertébrale pour apporter les informations au cerveau (voie nerveuse spinale). Les objectifs de ce projet sont de déterminer comment la détection du glucose est réalisée dans la veine porte et quelle est la voie nerveuse impliquée. Plus précisément, l’objectif de ce projet est de déterminer : 1/ Le rôle du neurotransmetteur CGRP dans la transmission du signal depuis la veine porte jusqu’au cerveau 2/ L’implication de la voie nerveuse spinale dans cette transmission Pour cela, nous étudierons si une augmentation de glucose dans la veine porte chez des souris transgéniques invalidées pour le neurotransmetteur CGRP, ou chez des souris non transgéniques dont la voie nerveuse spinale est altérée, active les zones du cerveau connues pour réguler la prise alimentaire ou l’équilibre de la glycémie.

Bénéfices attendus

Les mécanismes moléculaires par lesquels la production intestinale de glucose exerce ses effets bénéfiques sur l’obésité, le contrôle glycémique et l’accumulation de graisses dans le foie ne sont pas connus. Les résultats issus de ce projet nous permettrons d’identifier comment le glucose est détecté dans la veine porte et comment le cerveau reçoit et intègre informations nutritionnelles envoyées par l’intestin. Ce projet nous permettra d’identifier comment la production intestinale de glucose active le cerveau. Trouver des agents agissant sur ces mécanismes pourrait représenter une cible thérapeutique intéressante pour lutter contre l’obésité et ses complications.

Procédures

- A l’âge de 12 semaines, 32 souris recevront un régime enrichi en protéines et seront mise à mort après analgésie et anesthésie profonde. - A l’âge de 12 semaines, 64 souris subiront une chirurgie permettant la pose d’un cathéter dans la veine porte sous anesthésie et analgésie. Après une semaine de soins post-opératoires, la moitié des souris recevra une perfusion de solution sucrée et l'autre une perfusion de solution physiologique pendant 24 heures à l'état vigile. Puis les souris seront mises à mort après analgésie et anesthésie profonde. - A l’âge de 12 semaines, un groupe de 32 souris subira une chirurgie sous anesthésie et analgésie permettant la pose d’un cathéter dans la veine porte et une suppression de la voie nerveuse spinale. Un autre groupe de 32 souris subira une chirurgie permettant la pose d’un cathéter dans la veine porte et une intervention semblable mais qui ne touche pas la voie nerveuse spinale. Après au moins une semaine de soins post-opératoires, la moitié des souris de chaque groupe recevra une perfusion de solution sucré et l'autre une perfusion de solution physiologique pendant 24 heures, à l'état vigile. Puis les souris seront mises à mort après analgésie et anesthésie profonde.

Impact sur les animaux

Il est possible de rencontrer des difficultés lors de la pose des cathéters en veine porte. Les souris subissant cette chirurgie pourront présenter une détérioration du vaisseau ou l’apparition d’une hémorragie. La suppression d'une partie de la voie spinale peut conduire à une altération de la motilité intestinale et des sécrétions et provoquer plus de défécation.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort dans le but de mesurer l’expression des transporteurs de glucose dans la veine porte en utilisant plusieurs techniques d’imagerie et de quantification. Pour déterminer comment les informations nutritionnelles issues de la veine porte activent le cerveau, l’activation du cerveau sera mesurée par des marquages spécifiques sur des coupes histologiques de cerveaux fixés, obtenus après mis à mort d’animaux profondément anesthésiés.

Remplacement

Le glucose produit par l’intestin est détecté par des senseurs de glucose dans le circuit sanguin situé entre l'intestin et le foie (veine porte). Cette détection va être transmise par un signal nerveux de la veine porte vers le cerveau. En réponse, le cerveau va émettre des signaux nerveux vers la périphérie pour contrôler l'équilibre énergétique. La production de glucose par l'intestin et la détection du glucose dans la veine porte ont donc des impacts sur l’ensemble du métabolisme et impliquent des dialogues entre organes. Pour comprendre comment ces fonctions régulent l'organisme, les étude ne peuvent donc pas être réalisées sur cellules ou organoïdes. Pour comprendre précisément le rôle du signal nerveux entre intestin et cerveau, les études seront réalisées in vivo dans des modèles de souris transgéniques ciblant un neurotransmetteur.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des modèles animaux et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept, soit au maximum 16 souris par groupe. Ce nombre a été établi sur différents paramètres prenant en compte les seuils de détection des techniques utilisées, l’analyse statistique et la variabilité entre individus Au total, ce projet nécessitera au maximum 256 souris mâles transgéniques et contrôles.

Raffinement

Les souris contrôles C57BL6J seront commandées à l’âge de 5 semaines et auront ainsi une longue période d’acclimatation avant le début des procédures à l’âge de 12 semaines. Pendant cette phase d’acclimatation, des pesées hebdomadaires seront réalisés et les animaux seront observés et manipulés quotidiennement. L’implantation du cathéter dans la veine porte pour la perfusion de glucose sera réalisée sous anesthésie gazeuse avec un traitement analgésique et antalgique adapté pendant plusieurs jours afin de limiter la souffrance, la douleur et le stress de l’animal pendant et après cette chirurgie. Les animaux seront observés et pesés régulièrement. L’apport de nourriture et d’eau sera particulièrement suivi et adapté pour palier à un excès éventuel de défécation, qui pourrait être induit par la suppression du système nerveux spinal. Des signes de maladie, de perte de poids, de souffrance, de lésions ou de détérioration de l’état de santé général constituent des points limites au-delà desquels, si aucun moyen de prévention/correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort.

Choix des espèces

Le rôle de l’intestin, organe capable de produire du sucre entre deux repas ou lors de jeûne, sur le métabolisme glucidique et énergétique a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Ces études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine et la souris est un modèle dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Deplus, le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles (anticorps, kit biochimiques…). Les animaux seront tous utilisés à l’âge adulte, entre 12 et 15 semaines. A cet âge, les individus présentent un meilleur rétablissement post-chirurgical.

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un télétransmetteur implanté sous la peau, sont isolées en cage individuelle trois semaines pour l'enregistrement de l'électrocardiogramme, puis subissent une exploration électrophysiologique par voie transœsophagienne sous anesthésie avant d'être tuées sans réveil, pour étudier les effets de la suralimentation postnatale sur le cœur. Le porteur classe l'isolement en cage individuelle comme une atteinte modérée. Il affirme que ce projet, reposant sur des échanges entre plusieurs organes, doit être conduit sur un animal entier.

Objectifs

Les maladies liées au surpoids sont en constante augmentation non seulement dans nos sociétés occidentales mais aussi dans les pays émergeants. Ces pathologies associent des désordres cardiovasculaires (hypertension artérielle, athérosclérose, coronaropathies, néphropathies) à des anomalies métaboliques majeures (dyslipidémies, diabète). Leurs origines, plurifactorielles, sont bien entendu à rechercher dans une inadaptation de notre patrimoine génétique aux modifications profondes de l’alimentation et du niveau d’activité physique, liées aux changements de nos sociétés. Des travaux récents tendent à montrer que des altérations précoces de l’environnement, notamment nutritionnel, pourraient infléchir durablement l’orientation pondérale, métabolique et cardiovasculaire des individus et participer à l'augmentation du risque cardiovasculaire observée dans les pays développés. Préciser et comprendre les mécanismes responsables de la survenue de ces altérations cardiovasculaires et métaboliques induites par des modifications précoces de l’alimentation, et mieux comprendre l’origine de cette plus grande susceptibilité du cœur à ces situations pathologiques permettraient d'améliorer les actions de prévention et même de prise en charge de ces pathologies.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but une meilleure connaissance des conséquences cardiaques des modifications précoces de prise alimentaire et d'éventuelles altérations des interactions neuro-cardiaques issues de ces troubles alimentaires. Les laboratoires impliqués dans ce projet procéderont ultérieurement en fonction de leurs résultats à l'identification de cibles thérapeutiques potentielles et tenteront une stratégie de traitement (prévention des altérations neuro-cardiaques).

Procédures

L'ensemble des animaux sera soumis à 2 interventions successives : l'implantation de télétransmetteurs en position sous-cutané pour mesurer l'électrocardiogramme, puis l'exploration électrophysiologique transoesophagienne pour tester la vulnérabilité du coeur à faire des arythmies cardiaques. L'ensemble des expérimentations est réalisé sous anesthésie générale. Les animaux seront équipés du dispositifs de mesure de l'électrocardiogramme pendant 3 semaines, durée de leur mise en cage unique.

Impact sur les animaux

La caractérisation fonctionnelle des animaux repose d'une part sur l'enregistrement de l'électrocardiogramme par système holter implanté. Ces animaux implantés devront être isolés en cage unique pour des raisons techniques et de bien-être afin d'éviter les blessures entre animaux. L'implantation du holter en sous cutanée est bien maitrisée et aucune nuisance supérieure à une sévérité légère n'est attendue par l'acte chirurgical (implantation sous-cutanée necessitant seulement 3 petites incisions de la peau). L'isolement sera pris en compte pour le suivi journalier de l'animal et est classé comme sévérité modérée. L'exploration électrophysiologique trans-oesophagienne a été choisie car elle est réalisée sous anesthésie générale de l'animal et ne nécessite pas de chirurgie, à l'inverse de l'exploration intracardiaque et, n'induit pas de lésion ni de douleur. L'animal ne se révveille pas suite à cette expérimentation.

Devenir

Après avoir effectué l'enregistrement ECG par télémétrie, puis effectuer l'exploration électrophysiologique trans-oesophagienne, les animaux seront mis à mort sous anesthésie gazeuse (sans réveil).

Remplacement

Ce projet de recherche, qui repose sur des interactions entre différents organes (tissu adipeux, cerveau, foie, cœur et vaisseaux) ne peut pas être approché par des techniques reposant sur la culture cellulaire et les modèles in silico. Il nécessite d’être conduit sur un animal entier, de sa naissance à sa maturité.

Réduction

N’existant pas de méthode substitutive qui puisse éviter de recourir à l’usage d’animaux, cette étude sera réalisée en accord avec le principe des 3R avec notamment le but de réduire le nombre d’animaux (utilisation d'un même animal pour plusieurs mesures). Pour réduire la variabilité interindividuelle et donc le nombre de souris nécessaires pour démontrer un effet, nous utiliserons des lots d’animaux du même âge au moment de l’initiation du protocole. Nous avons fait le choix de méthodes (télémétrie, transoesophagien), compatibles entre elles permettant de réduire le nombre de groupes utilisés et obtenir le maximum d'informations sur chaque animal. Au niveau statistique, le nombre d’animaux a été déterminé par le logiciel G*Power avec un risque Alpha de 0.05 et une puissance de 0.95 ( avec une différence absolue attendue de 20 à 30% entre les groupes). Les résultats seront comparés entre les souris des 2 groupes (alimentation normale / suralimentation) par un test de comparaison de pourcentages et tests de comparaison de moyennes. Un nombre de 24 animaux maximum par groupe sera utilisé, soit 48 animaux au total.

Raffinement

L'ensemble de la procédure d'implantation du capteur de télémétrie sera réalisé sous anesthésie générale gazeuse. L'animal est monitoré jusqu’à son réveil complet puis placé dans une couveuse en cage unique pour récupérer. Le jour de la procédure, des visites régulières sont effectuées. Des soins per- et postopératoires appropriés serontégalement réalisés: analgésie locale puis injection d'analgésique avant le réveil pour prévenir la douleur. Une injection d'analgésique sera effectuée si un signe de douleur persiste dans les 2 jours suivant l’implantation. Une grille d'évaluation clinique de l'animal permettra son suivi et le respect des points limites. Les animaux seront hébergés en présence d'outils de raffinement (nid en cellulose et carré de cellulose).

Choix des espèces

Notre équipe de recherche a une longue expérience de projets expérimentaux conduits chez la souris. Nos appareils de mesure sont adaptés à la souris. La souris nous permet d’envisager les effets de la suralimentation sur un modèle très étudié dans différents projets, au niveau national et international, et qui sert de témoin « sauvage » aux études sur animaux génétiquement modifiés. Les animaux que nous utiliserons auront un âge de 6 mois, stade d'âge avancé, où la suralimentation devrait générer des troubles fonctionnels cardiaques.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris normales ou myopathes, elles subissent une blessure musculaire aiguë et des injections sous-cutanées, intrapéritonéales puis intramusculaires, avant le prélèvement du tissu musculaire. Le porteur reconnaît que le cumul des actes induit un stress et une douleur transitoire. Il indique tester in vivo une molécule anti-inflammatoire déjà jugée bénéfique in vitro, censée à terme accélérer la régénération du muscle.

Objectifs

Le muscle squelettique peut se réparer complètement après une blessure grâce au processus de régénération musculaire. Ce processus, habituellement efficace, peut être compromis dans certaines conditions (maladies métaboliques, vieillissement, myopathies). Les mécanismes cellulaires qui contrôlent la régénération musculaire sont bien connus, mais les effecteurs moléculaires sont encore peu nombreux à avoir été identifiés. Des travaux précédents ont montré qu'une molécule joue un rôle important au cours de la régénération musculaire en contrôlant les cellules de l'immunité (en stimulant les cellules souches musculaires qui permettent la régénération des fibres musculaires). Ces résultats ont été montrés grâce à une stratégie d'inhibition. L'objectif de l'étude est de réaliser une approche gain de fonction, en ajoutant la molécule dans le muscle au cours de la régénération musculaire. Le projet se base sur des travaux in vitro montrant un rôle bénéfique de la molécule. Le projet prévoit l'utilisation de souris normales qui subissent une blessure musculaire aigue, et des souris myopathes, qui présentent une régénération musculaire permanente. A terme, l'utilisation de cette molécule pourrait être envisagée pour un traitement permettant d'accélérer le processus de régénération musculaire.

Bénéfices attendus

Le processus de régénération musculaire, bien qu'habituellement très efficace, peut être ralenti ou empêché dans différentes conditions (maladies métaboliques, vieillissement, myopathies, etc). La connaissance des déterminants moléculaires du processus de régénération pourrait ouvrir des voies thérapeutiques afin d'aider ce processus en cas de défaillance. L'ajout de la molécule pourrait être bénéfique pour le muscle. Le projet vise à valider cette hypothèse in vivo, après que des expériences in vitro ont montré son bénéfice.

Procédures

Les souris subiront des injections de faible volume en sous cutanée (1 maximum) ; en intraperitoneal (5 au maximum), puis 3 semaines plus tard, des injections intramusculaires (4 au maximum). La durée de ces injections est d'environ 10 secondes (contention totale 30 secondes).

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (injections ip, injections im, anesthésies, blessure musculaire), qui induisent du stress et une douleur transitoire. Les données de la littérature ne rapportent pas d’effets indésirables des différentes substances injectées.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en vue de de récupérer le tissu musculaire pour des analyses histologiques et cellulaires.

Remplacement

Cette étude arrive à la fin d'une série d'analyses qui a montré in vitro les effets bénéfiques de la molécule anti-inflammatoire sur les cellules de l'inflammation et des vaisseaux. L'analyse finale nécessite de valider le rôle bénéfique de cette molécule au sein de l'organe, et de l'organisme entier, donc in vivo, de façon intégrée.

Réduction

L'expérience du laboratoire permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour les analyses. Le nombre de souris est diminué par deux car les deux pattes des animaux sont utilisées. Les analyses sont réalisées de manière séquentielle, sur des petits groupes d'animaux, ce qui permet d'ajuster les points d’étude et de réduire potentiellement le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Après chaque injection intramusculaire, les animaux font l'objet d'une surveillance accrue le jour même et le lendemain, afin de vérifier l'absence d'évènement indésirable au site d'injection, et plus généralement sur le comportement de l'animal. Un traitement antalgique est administré après induction de la lésion musculaire. Des points limites définis permettent d’éviter toute souffrance chez les animaux

Choix des espèces

Des travaux précédents ont montré que les processus mis en œuvre au cours de la régénération musculaire chez la souris sont proches de ceux observés chez l'homme . Les animaux sont utilisés entre 10 et 12 semaines, à l'âge adulte.

432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de tumeur de lymphome humain sous la peau, puis jusqu'à trois injections de composés sur animal vigile, la pousse tumorale étant surveillée jusqu'à un point limite. Le porteur teste une molécule immunostimulante déjà évaluée dans ce modèle et vise un futur essai clinique. Il affirme que la sensibilité des cellules tumorales dépend du microenvironnement et qu'il faut donc travailler sur un organisme entier.

Objectifs

Ce projet vise à étudier et quantifier l’efficacité antitumorale d'une molécule seule ou formulée avec des molécules encapsulées (qui rends la molécule moins toxique) sur un modèle humain de tumeur. Que ce soit la molécule ou la molécule encapsulée, les deux sont conçues stérilement et développées spécifiquement pour être compatible avec une injection intraveineuse. Cette molécule "prototype" seule ou encapsulée a déjà été évalué dans ce même modèle humain de tumeur. Dans les deux cas il a été observé une très bonne tolérance et des très bonnes réponses anti-tumorales. Afin d'évaluer la molécule dans des essais cliniques et pour répondre aux contraintes de la production à grande échelle, la molécule seule et la molécule encapsulée ont été optimisées. C'est pourquoi la Dose Maximale Tolérée (DMT) de la molécule industrielle doit être déterminée et son efficacité antitumorale doit être confirmée.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à moyen terme. Ce projet permettra de tester l’efficacité antitumorale d’une molécule immunostimulante. Le projet va permettre de développer en phase préclinique des molécules et des combinaisons qui permettront au mieux de guérir les patients atteints de ces cancers, au pire de ralentir la progression tumorale.

Procédures

- Implantation de tumeur en sous-cutané sur animal vigile (une fois au début de l'expérimentation, degré de gravité léger, quelques minutes) - Pousse tumorale : gêne si le volume tumoral au site d’injection atteint le point limite (lorsqu'il n'y a pas de réponse au traitement, la pousse tumorale prend une vingtaine de jours) - injection intraveineuse ou intrapéritonéale de composés thérapeutiques non toxiques (degré de gravité léger, quelques minutes), pour un maximum de 3 injections espacées de 7 jours.

Impact sur les animaux

- Perte de poids >10% non améliorée par ajout de nourriture humidifiée dans le fond de la cage en maximum 24h (peu probable) - Perte de poids >20% (très peu probable qui conduirait à la mise à mort de l’animal) - Injection de cellules tumorales en sous cutané : quelques minutes - Pousse tumorale : gêne si le volume tumoral au site d’injection atteint le point limite. Il n’y a pas de métastase attendue avec ce modèle tumoral. - Injection dans la veine caudale sur animal vigile sous contention de composés thérapeutiques: douleur caudale si inflammation du point d’injection (très peu probable), 2 heures maximum, pour un maximum de 3 injections espacées de 7 jours.

Devenir

Pour les deux procédures, tous les animaux seront mis à mort 100 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai.

Remplacement

Avant le passage chez l’animal, l’efficacité de notre molécule et de notre formulation a déjà été validée sur un modèle in vitro utilisé au laboratoire. En effet, nous avons déjà pré-validé notre molécule et notre formulation liposomale en in vitro par toutes les techniques pertinentes pour l'étude de nos produits. Nous devons passer maintenant à l'in vivo pour évaluer son effet sur un organisme entier. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux traitements anticancéreux dépend fortement du microenvironnement. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant sur l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans la tumeur nécessite de travailler sur un organisme entier. Pour toutes ces raisons nous devons effectuer les études d’efficacité sur la souris.

Réduction

Les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable. Les résultats seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire au autant que possible le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

vant toute manipulation les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en prenant la température corporelle par voie rectale (avec une sonde enveloppée avec un gel anesthésiant) une fois par jour pendant 5 jours. les souris seront observées quotidiennement 5 jours sur 7 . les expérimentateurs ont une très bonne expérience et détectent très rapidement le moindre signe de douleur afin d'appliquer les meilleurs mesures. Leur état général sera aussi suivi et annoter dans le cadre de l’expérimentation. Pour les deux procédures, tous les animaux seront mis à mort 100 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai. Les animaux feront l’objet d’un suivi très soutenu le jour J de l’injection, puis toutes les 24h jusqu’à 72h par les expérimentateurs. Par ailleurs, le personnel animalier inspecte quotidiennement les animaux et renseigne une grille de suivi basée sur des critères comportementaux (activité, isolement ...), physiques (poils hérissés, dos vouté …) qui permettent de détecter rapidement une souffrance ou l’atteinte d’un point limite.

Choix des espèces

Nous souhaitons évaluer nos traitements anticancéreux in vivo, grâce à l’utilisation d’une lignée cellulaire tumorales d'origine humaine (implantées chez la souris), avec des traitements utilisés en clinique humaine. L'utilisation d'une souche murine fortement immunodéprimée est donc nécessaire pour éviter les phénomènes de rejet des cellules ou des tissus implantés et favoriser la prise des greffes. En effet la souris immunodéprimée est un modèle reconnu pour l’implantation de xénogreffes. Notre équipe a une forte expérience de l’utilisation de souris immunodéprimées pour l’étude d'implantation de cellules humaines. Les autres modèles de mammifères immunodéprimés sont peu nombreux (rats) et il est préférable d’avoir recours aux modèles murins. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser a prise tumorale.

60 microcèbes, primates non-humains, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis replacés dans l'élevage. Chaque animal subit une mise à jeun et deux séances d'imagerie cérébrale sous anesthésie, IRM puis TEP avec traceur radioactif, pour évaluer l'effet des matières grasses laitières sur le métabolisme cérébral au cours de la croissance et du vieillissement. Le porteur signale les risques d'hypothermie et d'arrêt respiratoire liés à l'anesthésie. Il affirme que ces interventions nutritionnelles portant sur l'organisme entier ne peuvent être remplacées par des expériences sur cellules.

Objectifs

Les preuves scientifiques permettant de démontrer l'intérêt de l'introduction de matières grasses laitières dans l'alimentation des jeunes et des plus âgés sont peu nombreuses. Toutefois, les études chez les rongeurs laissent penser que la matière grasse laitière pourrait avoir des effets bénéfiques tout au long de la vie, lors de la croissance mais aussi, lors du vieillissement. Des études pilotes suggèrent même que l’ingestion de produits laitier au plus jeune âge pourrait avoir un impact à long-terme bien au-delà de la période pendant laquelle ils sont consommés. Ce projet permettra de mieux comprendre si l’ingestion de matières grasses laitières à différents âges de la vie peut avoir un impact positif sur les fonctions cognitives tout au long de la vie, incluant la phase critique du vieillissement, période pendant laquelle les fonctions cognitives déclinent naturellement. Nous émettons ici l'hypothèse que la matière grasse laitière pourrait avoir un impact favorable sur les fonctions cérébrales, et en particulier sur les fonctions cognitives, à plusieurs moments de la vie. Cet impact positif pourrait être procuré notamment grâce aux acides gras oméga-3 à longue chaîne qu’elle contient, contrairement à la matière grasse végétale qui n’apporte que des acides gras oméga-3 à courte chaîne. Ces acides gras oméga-3 pourraient permettre une meilleure utilisation par le cerveau de sa principale source d’énergie, le glucose. Pour tester notre hypothèse, nous proposons une étude pour déterminer si l'introduction de matières grasses laitières dans le régime alimentaire de primates non-humains omnivores, par rapport à un régime à base d'huiles végétales, a un impact sur le fonctionnement cérébral et en particulier sur l’utilisation par le cerveau de l’énergie apportée par les matières grasses) lors de deux périodes de la vie : la croissance (allant de la conception jusqu’à la maturité sexuelle, soit environ l’âge d’un an) et le vieillissement. Par conséquent, le projet aura pour objectif de démontrer que l’introduction de matière grasse laitière dans l’alimentation de modèles animaux âgés permettrait d’améliorer l’utilisation du glucose par le cerveau. Cette dernière partie sera étudiée en utilisant l’imagerie cérébrale TEP (Tomographie par émission de positrons) afin d’identifier des changements locaux d’activité métabolique cérébrale.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude permettront pour la première fois d’évaluer l’impact de la matière grasse laitière sur le fonctionnement cérébral dans deux contextes importants pour la physiologie humaine en s’appuyant sur les résultats obtenus avec un modèle primate non-humain : 1) au cours de le croissance (jusqu’à l’âge de 12 mois) et 2) au cours du vieillissement. L’étude au cours de la croissance permettra d’évaluer les effets à long terme de la matière grasse laitière. L’étude chez les animaux âgés est aussi importante que celle réalisée en période périnatale. En effet, cette étude visera à décrypter les mécanismes cérébraux associés au vieillissement. Ce projet présente l'avantage d'étudier l'impact de la matière grasse laitière au cours des périodes clés ciblées (croissance et vieillissement). Il s'agit d'un projet unique, original et pertinent, qui permettra d'étudier l'impact de la matière grasse laitière sur les fonctions cognitives mais aussi de décrypter les mécanismes métaboliques, physiologiques et moléculaires qui les sous-tendent. Ces travaux sont menés chez un primate omnivore afin de pouvoir être mieux appliqués à l’Humain par la suite et de participer à élaborer des conseils nutritionnels adaptés à tous les âges de la vie pour une meilleure santé cognitive.

Procédures

Ce projet comporte 1 procédure, comprenant 2 actes expérimentaux par animal, chacun appliqué aux animaux jeunes et âgés. Le premier acte expérimental consiste en une cartographie par imagerie par résonnance magnétique (IRM) de l’anatomie cérébrale des individus (environ 1h), étape nécessaire et préalable au deuxième acte qui consiste en la réalisation d’une mesure de l’utilisation cérébrale du glucose par tomographie par émission de positrons (TEP, environ 1h). L’ensemble des actes expérimentaux sera réalisé sur une période maximale de 4 semaines, incluant les temps d'acclimatation, la mise à jeun, l’imagerie, la décroissance radioactive et la récupération post-anesthésie.

Impact sur les animaux

Le présent projet nécessite la mise à jeune et l'anesthésie d'animaux. Les anesthésies nécessaires aux protocoles d'imagerie IRM et TEP constituent une nuisance potentielle, comme la mise à jeun, ou le risque d’hypothermie et d’arrêt respiratoire, Cependant, les protocoles d’anesthésies sont bien maîtrisés au sein du laboratoire et validé par le vétérinaire. , En en plus, les paramètres physiologiques comme la température corporelle et la respiration sont suivis sur chaque animal sous anesthésie afin d’évaluer en continu l’état de profondeur de l’anesthésie.

Devenir

Les actes expérimentaux décrits ci-dessus n'induisant pas d'effet indésirable à long terme, le replacement de l'ensemble des animaux dans l'élevage est prévu.

Remplacement

Ces expériences ne peuvent être remplacées par des méthodes alternatives puisqu’elles nécessitent l’exposition précoce au régime alimentaire pré-définiet notamment l’allaitement des petits par les mères. Les interventions nutritionnelles ayant par définition des effets sur l’organisme entier (de la digestion à l’utilisation des micronutriments et de leurs métabolites par les différents organes), ces expériences ne sauraient être remplacées par des expériences in vitro sur cellules.

Réduction

Afin de répondre à l’exigence de réduction du nombre d’animaux, ces expériences seront réalisées sur un nombre limité d’animaux (10 animaux par condition expérimentale, soit un total maximal de 60 animaux). Ces animaux sont issus d’une cohorte, dont le descriptif a été détaillé lors d’une précédente saisine. Ce nombre est suffisant pour évaluer les effets de régimes car les deux procédures (IRM et TEP) sont hautement sensibles et répétables. Les effectifs, déterminés à partir d’un test , prennent en compte la variabilité interindividuelle attendue au sein des groupes expérimentaux pour les mesures d’IRM et TEP (paramètres qui présentent la plus grande variabilité) et permettront de réaliser des tests statistiques avec assez de puissance

Raffinement

Les conditions générales de l’élevage seront conservées (fréquence de nourrissage, enrichissement, maintien des groupes sociaux) et les procédures appliquées seront organisées de sorte à laisser des temps de récupération longs entre deux procédures. Toute procédure entraîne un suivi attentif de chaque animal afin de s’assurer de leur bien-être. Des points limites ont été mis en place pour éviter toute souffrance de l’animal.

Choix des espèces

Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte (12 mois an) pour le groupe « jeune » et à l’âge de 7 ans pour le groupe « âgé ». L’objectif scientifique du projet étant d’étudier l’impact des matières grasses laitières sur les fonctions cérébrales au cours du développement et du vieillissement, ces deux catégories sont nécessaires. Les interventions nutritionnelles nécessitent l’exposition périnatale au régime et notamment l’allaitement des petits. Le microcèbe gris présente la particularité d'être omnivore, se nourrissant aussi bien de végétaux (feuilles et fruits) que d'animaux (petits mammifères ou reptiles, insectes). En tant que mammifère, il se nourrit naturellement de lait maternel (contenant donc naturellement de la matière grasse animale) pendant les 2 premiers mois de sa vie. Les altérations liées à l'âge, comparables à celles observées chez l'homme, apparaissent dès l'âge de 5 ans. De nombreuses études ont montré les similarités des changements cérébraux liés à l’âge entre ces deux espèces. Ce modèle représente donc un parfait compromis entre une longévité relativement longue, des facilités d'élevage dues à sa taille et une bonne proximité phylogénétique et physiologique avec l'homme.

40 rats et 80 rats roussards du Soudan (Arvicanthis) vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous subissent l'implantation chirurgicale d'une électrode dans le cerveau et un protocole de décalage horaire, une partie une restriction d'accès à l'eau et l'administration de fluoxétine, puis des stimulations électriques répétées, l'euthanasie servant à vérifier le site d'implantation. Le porteur étudie le fonctionnement de l'horloge biologique chez une espèce diurne. Il affirme que ces bases neurales ne peuvent être reproduites in vitro ni in silico et nécessitent l'animal vivant.

Objectifs

L'horloge principale est responsable de la régulation de tous les rythmes du corps et permet à l'organisme de s'adapter et d'anticiper les changements environnementaux. La perturbation des cycles externes peut nuire à notre santé. Des études récentes chez l'homme indiquent que la perturbation de l’horloge, tels que ceux causés par l'exposition à la lumière artificielle de nuit, par le jet lag ou par le travail posté, augmente le risque de développer des maladies cardiovasculaires, des troubles du sommeil, de la dépression et maladies métabolique. L'activité électrique de l'horloge biologique est la première étape de la formation de son signal de sortie qui détermine la libération de signaux capable de synchroniser toutes les fonctions rythmiques du corps, y compris l’activité comportementale. Il n’est pas clair quel est l’effet de l’activité électrique de l’horloge sur l’activité comportamentale, et si en stimulant l'activité électrique de l'horloge centrale on peut renforcer l'amplitude du rythme de l'activité comportementale, qui au contraire diminue avec l'âge. Ainsi, le premier objective est de définir l’effet de l’activité électrique de l'horloge sur l’activité comportementale chez une espèce diurne (Arvicanthis) et chez une espèce nocturne (rat) ; et de tester chez des Arvicanthis âgée si la stimulation de l’activité électrique de l’horloge peut augmenter l'amplitude du rythme d'activité comportementale. Un des signaux qui influence l'horloge biologique est la sérotonine qui peut modifier l'activité de l'horloge. Ainsi, le second objective de ce projet est de tester si une augmentation de sérotonine, peut accélérer la resynchronisation de l’activité comportementale de l’animale a un nouveau cycle de lumière /obscurité décalé de 6h.

Bénéfices attendus

Dans la société moderne, les rythmes sont perturbés et de plus en plus de preuves montrent que cela est nocif pour la santé. Les mécanismes de fonctionnement de l’horloge ne sont pas clairs chez les espèces diurnes, interdisant le développement de thérapies pour l'amélioration des fonctions diurnes, y compris humaines. Ce projet améliorera notre compréhension du fonctionnement de l’horloge centrale chez une espèce diurne. Cela fournira des informations utiles pour développer des stratégies efficaces pour améliorer les fonctions de l'horloge chez l'homme jeune et âgé. Plus précisément ce projet : 1. Fournira des informations sur la relation entre l'activité électrique et l'activité locomotrice chez les animaux diurnes, et les éventuelles différences avec les animaux nocturnes. Ces informations peuvent aussi être utilisées pour améliorer les conditions des patients qui présentent des pathologies associées à des troubles circadiens (troubles journaliers comme dans différents troubles de l'humeur, y compris la dépression). 2. Fournira des informations sur comment la signalisation sérotoninergique interagit avec la lumière pour déphaser l'horloge biologique chez une espèce diurne. Ces résultats pourraient permettre le développement de stratégies pour aider à combattre la désynchronisation circadienne chez les travailleurs postés et lors de décalage horaire.

Procédures

16 animaux seront soumis à un protocole de décalage horaire, dont 10 seront soumis à une restriction temporelle d'eau (accès à l'eau 6h par jour), pour un total de 16 jours (4 jours de restriction temporelle d'eau suivis de 5 jours d'accès à l'eau ad libitum). Cette restriction temporelle d’eau est nécessaire pour l'administration de fluoxétine-qui entraîne une augmentation des niveaux de sérotonine-(6 jours au total) à des moments précis de la journée. 6 animaux seront soumis au même protocole (décalage horaire) mais auront toujours accès à l'eau. Ces Arvicanthis seront soumis à une chirurgie de 1 heure 1 mois après la fin du protocole de décalage horaire (durée totale 47 jours). Tous les animaux (120) seront soumis à une chirurgie de 1h qui est nécessaire pour l'implantation de l'électrode de stimulation de la zone de la zone d'intérêt. 40 jeunes (2-5 mois) Arvicanthis (dont 16 issues du protocole de décalage horaire) et 40 jeunes (2-5 mois) rats, recevront 4 stimulations électriques par jour (durée 2h), pendant 6 jours dans 3 conditions de lumière (2 jours en 12h lumière : 12h d'obscurité, 2 jours en obscurité constante, 2 jours en lumière constante). 40 Arvicanthis âgées (>12 mois) recevront une stimulation électrique par jour (durée 2h-4h), pendant 3 jours (1 jour en 12h de lumière : 12h d'obscurité, 1 jour en obscurité constante, 1 jour en lumière constante).

Impact sur les animaux

La restriction temporelle d’accès à l’eau (6h) est nécessaire pour administrer la fluoxétine à un moment donné du temps journalier. Cependant, cela pourrait entraîner une déshydratation (dont l’importance sera évaluée dans une manipe pilote). Si une diminution de la prise d’eau est constatée, cela pourrait entrainer une diminution de la prise alimentaire et une conséquente perte de poids, entrainant un stress de l’animal. Dans une expérience précédente dans notre groupe de recherche, les Arvicanthis ont été traités pendant 5 jours avec la fluoxétine. Aucun effet délétère n'a été observé sur le bien être des animaux pendant et après le traitement à la fluoxétine. La chirurgie stéréotaxique, qui est nécessaire pour l'implantation de l'électrode de stimulation, peut entraîner une perte modérée de poids. Compte tenu que la chirurgie comporte une incision cutanée au niveau du crâne, une infection ou une inflammation des plaies cutanées ne peut pas être exclu. La restriction temporelle d’accès à l’eau (6h) est nécessaire pour administrer la fluoxétine à un moment donné du temps journalier. Cependant, cela pourrait entraîner une déshydratation (dont l’importance sera évaluée dans une manipe pilote). Si une diminution de la prise d’eau est constatée, cela pourrait entrainer une diminution de la prise alimentaire et une conséquente perte de poids, entrainant un stress de l’animal. Dans une expérience précédente dans notre groupe de recherche, les Arvicanthis ont été traités pendant 5 jours avec la fluoxétine. Aucun effet délétère n'a été observé sur le bien être des animaux pendant et après le traitement à la fluoxétine. La chirurgie stéréotaxique, qui est nécessaire pour l'implantation de l'électrode de stimulation, peut entraîner une perte modérée de poids. Compte tenu que la chirurgie comporte une incision cutanée au niveau du crâne, une infection ou une inflammation des plaies cutanées ne peut pas être exclu.

Devenir

Tous les animaux (80 Arvicanthis, 40 rats) seront mis à mort à la fin du projet. L'euthanasie est nécessaire à la vérification du site d'implantation de l'électrode de stimulation.

Remplacement

La compréhension des bases neurales de la diurnalité, qui implique au vu des connaissances actuelles un circuit de plusieurs structures cérébrales interconnectées, dont le schéma ne peut actuellement être reproduit avec une approche in vitro ou in silico, nécessite une approche in vivo chez l'animal vivant pour atteindre l'objectif.

Réduction

Notre approche longitudinale (enregistrement en continu d’un même animal dans différentes conditions expérimentales, animal utilisé comme son propre controle) permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés et de réduire la variabilité inter- individuelle. Le nombre d’animaux utilisés nous permettra d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Les résultats seront exploités avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les Arvicanthis seront gardés en cages ouvertes individuelles pour enregistrement rythmes journaliers, car les animaux adultes sont agressifs entre eux. Les animaux gardent des contacts olfactifs et auditifs avec les congénères dans la même pièce. Les cages sont enrichies avec un bâton à ronger. Les cages d'enregistrement in vivo sont équipées d'un joint tournant permettant à l'animal de rester libre de ses mouvements. La procédure invasive sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie. L'état de santé des animaux sera évalué au cours de l'étude et des points limites spécifiques ont été établis permettant d'interrompre les procédures et soustraire l'animal à la souffrance.

Choix des espèces

Rats: Pour comprendre la physiologie de l'horloge chez les animaux diurnes, nous devons aussi étudier les différences avec ll'horloge chez les nocturnes. La comparaison entre nocturne et diurne apporte des informations supplémentaires sur ce qui est différent entre les deux espèces. Cela permet d'améliorer les stratégies biomédicales actuellement en place, qui sont basées sur des informations provenant d'animaux nocturnes. Le choix de cette espèce nocturne est principalement basé sur le fait que le rythme de l'activité électrique de l'horloge biologique chez le rat a déjà été caractérisé. Ceci est nécessaire pour appliquer correctement notre protocole de stimulation Arvicanthis: Comprendre les bases neuronales de la diurnalité nécessite l'étude des animaux diurnes. La disponibilité du Rat roussard du Soudan (Arvicanthis ansorgei), un rongeur diurne élevé au Chronobiotron, est une opportunité unique d'atteindre cet objectif. Rats et Arvicanthis jeunes adulte (2-5 mois), pour étudier un système circadien mature et non-sénescent. Arvicanthis âgés (> 12 mois), pour tester l'effet de la stimulation électrique sur des animaux présentant un rythme faible d'activité comportementale.

17 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisées. Chacune subit une ovariectomie et la pose d'un implant d'estradiol sous anesthésie, la pose répétée de cathéters dans la veine jugulaire et jusqu'à 24 prélèvements de sang sur dix heures, répétés six fois, pour tester des analogues de kisspeptine destinés à maîtriser la reproduction des animaux d'élevage. Le porteur présente ce projet comme une piste pour supprimer les traitements hormonaux qu'il juge éthiquement contestables. Il affirme que la reproduction ne peut s'étudier que sur organisme entier et que le passage à l'animal reste incontournable.

Objectifs

Actuellement, la maîtrise de la reproduction des animaux d'élevage repose principalement sur la stimulation de l'ovulation par des hormones. Des systèmes considérés plus « naturels », tel l'effet mâle, sont aussi utilisés mais leur efficacité est moindre. Pour différentes raisons, ces deux approches ne répondent pas de façon satisfaisante aux attentes sociétales (absence de contaminant dans les produits consommés et de pollution de l'environnement) et à celles des producteurs (efficacité et rentabilité). Nous avons, dans un projet précédent, développé des analogues à partir d’un neurotransmetteur endogène, la kisspeptine (Kp) comme piste originale pour réduire voire éliminer l’utilisation d’hormones. Ce neurotransmetteur joue un rôle clé dans la stimulation de la reproduction, mais son instabilité métabolique, et par conséquent sa durée d'action trop courte, empêche son utilisation sur le terrain. Nous avons donc conçu et synthétisé des analogues avec une durée d'action plus importante que la molécule naturelle. Le présent projet vise à étudier l'effet de différentes formes de Kp humaine sur la fonction de reproduction des brebis, pour développer l'analogue le plus efficace possible.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont 1) comprendre la différence d'effet de différentes isoformes de Kp entre deux organismes, 2) mettre en place une forme de Kp optimale pour stimuler la reproduction de la brebis et 3) développer un outil permettant de maitriser la reproduction des animaux d'élevage (notamment ici, la brebis). De façon plus globale, ce projet vise à élaborer une stratégie d’élevage des animaux de rente avec une meilleur prise en compte du bien-être animal et des attentes sociétales en supprimant les traitements hormonaux et en trouvant des alternatives aux traitements actuellement mis en place et éthiquement contestables.

Procédures

- Ovariectomie et pose d’implant d’estradiol sous anesthésie générale sur 17 brebis (environ 2 heures) - Retrait d’implants d’estradiol sous anesthésie générale sur 17 brebis - Pose et dépose de cathéters dans la veine jugulaire sur animal vigile : 2 fois chez 17 brebis - Prélèvements de sang sur animaux vigiles par ponction de la veine jugulaire via un cathéter : 24 prélèvements sur 10h pour 17 brebis, répété 6 fois.

Impact sur les animaux

La kisspeptine est une molécule employée à de nombreuses reprises dans notre laboratoire dans le cadre de projets antérieurs. De plus, le peptide et ses effets sont très bien décrits chez les mammifères, et notamment chez les ovins. D'après notre expérience, suite à une injection aigüe de kisspeptine aucune nuisance ou effet indésirable n'est observé. En termes de manipulation des animaux, les chirurgies, injections et prises de sang sont des manipulations maitrisées par le laboratoire et réalisées par du personnel expérimenté. Cependant, des effets peuvent être observés, notamment suite à l'ovariectomie ou la pose des cathéters, des douleurs, perte de poids et perte de mobilité peuvent apparaître mais sont anticipés par l'injection d'analgésiques au moment des procédures.

Devenir

Les animaux auront été ovariectomisés, soumis à l'implantation d'un cathéter dans la jugulaire et injectées avec des isoformes de kisspeptine avec une durée de vie courte (de l'ordre de quelques minutes/heures), les animaux pourrons alors aisément être réutilisés ou replacés.

Remplacement

La reproduction est un mécanisme physiologique intégré extrêmement complexe qui ne peut être étudié que par une approche in vivo. Il en est de même pour toutes les études visant à la contrôler. Notre niveau de connaissances actuelle est largement insuffisant pour espérer mettre en place par exemple une approche de modélisation informatique afin de prédire comment le système répond à un stimulus donné ou pour une quelconque approche de substitution, comme des cultures cellulaires, capable de reproduire les phénomènes complexes d’intégration qui ont lieu au niveau de l’organisme entier. Cependant, l'activité des molécules à tester in vivo dans ce projet a déjà été caractérisée in vitro. Le passage à l'animal reste incontournable en l'état actuel de nos connaissances.

Réduction

Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. A la lumière des études publiées dans le domaine et de notre expérience, il nous sera nécessaire de constituer des groupes de 7 animaux par traitement. Dans le souci de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés ainsi que le nombre d'injections et de prise de sang réalisées sur chaque animal, nous prévoyons de tester plusieures molécules par animal à minimum 3 jours d'intervalle. Cet intervalle de temps permettra de laisser le temps aux molécules injectées de ne plus être détectable dans le sang et de pouvoir tester la molécule suivante sans crainte d'avoir une interaction avec la molécule précédente. Chaque groupe test d'une forme de Kp (composé de 7 animaux) sera comparé avec un groupe contrôle (composé de 17 animaux répartis sur chaque série de tests) pour assurer la validité scientifique et la puissance statistique nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe et seront également en groupe lors des procédures afin de minimiser au maximum le stress lié à la contention dans des cages individuelles qui sont souvent employées pour ce genre de procédures. Les méthodologies utilisées dans le cadre de ce projet ne dépasseront pas une douleur de classe modérée et nous mettrons en œuvre tout notre possible afin de garantir le bien-être de l’animal en lui apportant les soins adéquats en fonction des besoins. Dans cet optique, les animaux seront visités au moins une fois par jour avec contact direct ou non (sans réalisation de procédure), permettant l'habituation de l'animal à l'expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Un suivi journalier sera mis en place tout au long de la période d'expérimentation pour évaluer l'état de bien-être des animaux en s'assurant que les points limites ne soient pas atteints. Le comportement (notamment isolement) et l'apparence des brebis (notamment au niveau des plaies chirurgicales et implantation du cathéter) sera suivi avec attention et les animaux seront pesés (en prêtant attention au pourcentage de perte et qu'il ne dépasse pas le seuil critique de 20%) pendant 3 jours après l'ovariectomie. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de l'euthanasie ou le soulagement de la douleur des animaux suivant le stade d'atteinte des points limites (soulagement de la douleur en cas de dégradation d’un critère de comportement et d’apparence, euthanasie en cas d’atteinte du seuil critique des 20% de perte de poids et/ou dégradation de plus de deux critères de comportement et d’apparence). En cas de douleur les animaux seront traités comme suit : Anti inflammatoire non stéroïdien en intramusculaire éventuellement renouvelé 48H après si signes douloureux (baisse d'appétit, prostration, décubitus prolongé). Dans le cas où ces traitements ne résulteraient pas en une amélioration significative de l’état des animaux, ou dans le cas où certains comportements témoignant une douleur seraient détectés (par exemple prostration, décubitus prolongé, anorexie...) les animaux seraient alors euthanasiés par surdosage de barbituriques intraveineux. En cas d’hémorragie post-opératoire (muqueuses pâles), l’animal serait réanesthésié et nous rechercherions le site hémorragique pour procéder à la suture vasculaire.

Choix des espèces

La brebis est un modèle largement utilisé pour l’étude de la reproduction chez les animaux d’élevage et nous pouvons nous baser sur une littérature très riche sur ce modèle. Nous avons choisi d’utiliser la race Ile de France pour les brebis parce que c’est le modèle sur lequel nous avons obtenu nos résultats précédents et parce que c’est une race d’élevage d’intérêt économique important. Adulte pour étudier un animal sexuellement développé avec un axe gonadotrope actif.