Procédures modérées

Réutilisables à l'issue, après accord du vétérinaire, dans une autre étude du projet ou dans un autre projet, y compris un projet de classe "sans réveil", où ils seraient tués sous anesthésie, 384 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les chiens peuvent subir une chirurgie de 4 h 30 à 6 h 30 pour l'implantation d'un émetteur de télémétrie, avec ou sans cathéter dans le ventricule gauche, la pose d'une chambre vasculaire, et de nouvelles opérations pour repositionner un cathéter ou changer la chambre. S'y ajoutent six à huit jours d'isolement après l'opération, des prises de sang, des séjours de 48 heures en cage de collecte, des échographies cardiaques, un test d'inclinaison et des tests neurologiques et comportementaux que le résumé ne détaille pas, pour mesurer l'effet de candidats médicaments sur le cœur et les vaisseaux dans le cadre réglementaire de leur évaluation de sécurité. Le porteur présente le chien comme l'une des espèces "les plus pertinentes", un "modèle prédictif validé d'un point de vue règlementaire", et compte parmi les bénéfices pour l'animal "une acquisition de connaissances sur l'espèce utilisée".

Objectifs

Ce projet a pour but d'évaluer les effets de différents candidats médicaments sur les paramètres cardiovasculaires chez le chien vigile en utilisant la télémétrie dans le cadre réglementaire de l'évaluation de la sécurité des médicaments sur les fonctions vitales de l'organisme. La télémétrie permet de mesurer différents paramètres physiologiques chez l'animal vigile libre de ses mouvements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la vérification de l'absence d'effet ou la détermination du seuil d'effet de nouveaux médicaments sur le système cardiovasculaire, qui permettront par la suite une utilisation sécurisée du médicament en médecine humaine ou vétérinaire. Pour l'animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l'espèce utilisée (le chien) par le développement d'outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l'espèce la plus prédictive en fonction de l'objectif scientifique attendu.

Procédures

Dans ce projet, les animaux pourront être soumis à différentes chirurgies : - une chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie avec ou sans cathéter de mesure de la pression ventriculaire gauche(PVG) -une chirurgie d'implantation de chambre vasculaire. La durée de ces interventions sera entre 4h30 et 6h30. Si l'implantation de la chambre vasculaire est réalisée séparément de l'implantation de l'émetteur de télémétrie, la durée de l'intervention sera d'envion 1H. En cas de besoin, l’animal pourra être soumis à une nouvelle chirurgie pour repositionner le cathéter de l'implant ou de la chambre vasculaire, voire pour changer la chambre. Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements de sang (durée environ 30sec/prélèvement), d'urine ou de déjections (hébergement en cage de collecte pendant 48h maximum), des mesures d'échocardiographie pour observer le fonctionnement du coeur sans chirurgie (15-30 min par mesure), des tests neurologiques et comportementaux (durée de 10 min max par observation), un test de mesure du taux d’oxygène dans le sang (durée environ 1min), et/ou un test d'inclinaison pour détecter de potentielles baisses de tension (durée de 3 à 5 min).

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux seront anesthésiés, après une mise à jeun préalable, à une ou plusieurs reprises pour implantation de l'émetteur de télémétrie et/ou de la chambre vasculaire. Les animaux seront isolés pendant la période de récupération post-opératoire (6 à 8j). Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements de sang (durée environ 30sec/prélèvement), à des échographies cardiaques (15-30 min par mesure), à des tests neurologiques et comportementaux (durée de 10 min max par observation) et à des tests de changements de postures (test d'inclinaison). Les effets potentiellement indésirables du/des produits font l'objet d'échanges avec les fabricants des candidats médicaments testés pour adapter les outils d'observation des animaux afin d'anticiper au mieux de potentiels signes cliniques.

Devenir

Réutilisation des animaux dans une étude du même projet ou dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le chien car il n'existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets cardiovasculaires de ces candidats médicaments. Or, avant toute utilisation chez l'homme, l'animal constitue un passage obligatoire pour l'évaluation de l'efficacité ou la sécurité d'un médicament. A ce jour, le chien est l’une des espèces les plus adaptées à ce type de modèle car il présente un système cardiovasculaire proche de celui de l’homme.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d'animaux par groupe est utilisé afin d'analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d'effectuer des analyses statistiques robustes. Une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par: - La mise au point de procédures rigoureuses, - La formation du personnel, - L'utilisation de la télémétrie sans fil (animal libre de ses mouvements pendant les phases d’enregistrement), - La validation du système de télémétrie et validation pharmacologique du modèle, -L’utilisation d’une chambre vasculaire permettant d’éviter les piqûres répétées ou une restriction physique sur une longue période - Un suivi quotidien de l'état de santé des animaux, - Le recours à des procédures les moins invasives possible, - Le suivi d'éventuels signes cliniques, - La détermination des points limites, - Le recours aux procédures d'euthanasie dès que nécessaire, - Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post- opératoire de l'état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, - La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l'amélioration de la sensibilité des méthodes d'analyse, - La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales

Choix des espèces

Le chien est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur le système cardiovasculaire car il représente un modèle prédictif validé d'un point de vue règlementaire pour les effets cardiovasculaires d'un produit chez l'homme (système cardiovasculaire proche de celui de l’homme). Animaux adultes : ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

284 souris femelles immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules humaines de cancer de l'os sont injectées sous leur peau sur animal vigile, la tumeur est mesurée trois fois par semaine et des composés sont administrés dans l'eau de boisson et par injection, pour tester si l'inhibition d'une protéine renforce la chimiothérapie. Le porteur décrit une gêne possible à la locomotion et des effets tardifs de la chimiothérapie sur la reproduction. Il justifie le recours à l'animal par les limites des cultures in vitro en deux dimensions et présente les femelles comme moins agressives.

Objectifs

Le cancer reste un enjeu clinique important en France (382 000 nouveaux cas et 158 000 morts par an). Bien que le cancer soit mieux pris en charge aujourd’hui, les options thérapeutiques sont limitées pour certains cancers, comme pour le cancer de l’os. Sa prise en charge repose essentiellement sur les chimiothérapies qui sont associées à des effets indésirables ou à de la résistance. Il est nécessaire de remplacer celles-ci par des alternatives thérapeutiques ou de limiter les doses de chimiothérapies en les combinant à de nouvelles thérapies. Pour cela, il faut (1) identifier de nouvelles protéines qui jouent un rôle dans la réponse aux chimiothérapies et (2) évaluer le bénéfice à cibler ces protéines en combinaison avec les chimiothérapies. A l’aide d’une lignée cellulaire dérivée de l’os, il a été montré que la réduction de la quantité de la protéine P induit un arrêt de la prolifération des cellules cancéreuses en réponse à une chimiothérapie. Aujourd’hui il reste à démontrer que l’inhibition de la protéine P améliore la réponse aux chimiothérapies chez l’animal. L’objectif principal est de déterminer si l’inactivation de la protéine P est suffisante pour augmenter l’effet anti-tumoral des chimiothérapies. L’objectif secondaire est de déterminer si la protéine P joue un rôle dans le développement d’une tumeur, démontrant que l’inhibition de la protéine P peut être une approche anti-cancer à elle seule. Pour cela, une greffe de cellules génétiquement modifiées présentant une diminution de la quantité de la protéine P sera pratiquée chez la souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de contribuer à valider une nouvelle stratégie thérapeutique anti-cancer en santé humaine. Ce projet permettra d’évaluer le bénéfice thérapeutique de la perte de fonction d’une protéine P dans le traitement de cancers par chimiothérapies. Cette stratégie thérapeutique innovante permettra de réduire la dose des chimiothérapies utilisées tout en augmentant leur efficacité et ainsi diminuer les effets indésirables associés aux chimiothérapies.

Procédures

Des cellules humaines de cancer de l’os sont injectées sous la peau des souris. Pour effectuer ce geste, la souris est maintenue environ 15 sec, une seule injection de 0.1 ml. A la suite de cette injection, la souris développera une tumeur sous-cutanée. La croissance tumorale est suivie par des mesures au pied à coulisse 3 fois par semaine, l’animal est maintenu immobile environ 25 secondes. Les composés sont administrés par voie orale dans l’eau de boisson (à partir de l’entrée des souris en protocole jusqu’à la mise à mort),ou par injection intrapéritonéale (1x/semaine, 10 sec, pendant 5 semaines).

Impact sur les animaux

La greffe de cellules humaines par injection sous-cutanée est réalisée sur animal vigile. La tumeur pourrait entrainer dans de très rare cas une gêne à la locomotion. Le traitement ajouté dans l’eau de boisson donne un goût amer. Les effets non désirables des chimiothérapies sont observés à long terme (au-delà de 10 semaines de traitement), par exemple une atteint de fonction reproductrice chez la femelle.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs pour des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques. Si des animaux ne développent pas de tumeur, ils seront mis à mort 8 semaines post-greffe. En effet, les animaux ayant subi une injection de cellules tumorales, ne peuvent pas être réutilisés dans un autre projet.

Remplacement

En amont de ces expérimentations in vivo, les chimiothérapies et le médicament-candidat ont été testés sur les cellules in vitro. Les approches in vitro sont nécessaires mais elles restent limitées à un seul type cellulaire ayant une structure en 2D. La deuxième étape de validation du médicament-candidat est in vivo, c’est-à-dire d’étudier son action dans des conditions physiologiques et seul un organisme entier le permet.

Réduction

Une étude préliminaire de validation du modèle est conduite sur un nombre limité de souris (20 souris). Si les résultats de cette étude sont concluants, l’étape 2 sera alors mise en œuvre pour déterminer la concentration de chimiothérapie à utiliser. Cette procédure sera également faite sur un nombre limité d’animaux (50) pour 3 chimiothérapies testées (chimiothérapies classiquement administrées chez l’homme pour le cancer de l’os). Enfin, à l’issu de cette 2ème étape, la procédure 3 sera conduite en séquentielle afin de ne pas avoir à gérer un nombre d'animaux trop important (une chimiothérapie à la fois). Le but de cette procédure est d’étudier s’il est possible de réduire les effets indésirables des chimiothérapies en co-administrant un médicament-candidat.

Raffinement

Le traitement ajouté dans l’eau de boisson ayant un goût amer, 3% de sucrose sont additionnés pour permettre une bonne hydratation. Les analyses de croissance des tumeurs sont non invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requiert pas d'injection d'anesthésiant ou d'antalgique. L'effet des composés sur l'état physiologique des souris est suivi par la pesée des animaux, et la mesure du développement tumoral. De l'aliment sera mis en fonds de cage si une souris présentait une gêne à la locomotion. Des points limites adaptés sont définis de manière objective pour chaque procédure, incluant des critères d'arrêt de l'expérience en cas de souffrance.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l’analyse de greffes de lignées cellulaires en oncologie. Les expérimentations sont réalisées sur des souris immunodéprimées pour qu’il n’y ait pas de rejet de la greffe des cellules humaines. Des femelles sont mises en œuvre car elles présentent un caractère moins agressif que les mâles, ce qui permet un remaniement plus facile de la composition des cages lors de constitution des groupes de traitement des animaux. Les souris femelles sont également choisies car les cellules humaines ont été obtenues à partir d’une tumeur développée chez une femme. La greffe est pratiquée sur les souris de 6–8 semaines, pour des raisons d’efficacité de prise tumorale et de reproductibilité.

1600 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par les établissements partenaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après tonte et dépilation sous anesthésie, un produit est appliqué sur leur dos jusqu'à vingt-quatre fois pour induire un psoriasis, avec des injections sous-cutanées et des pesées répétées. Le porteur attend une perte de poids pouvant atteindre 20 %, un érythème, une desquamation et un épaississement de la peau, et précise que l'élevage préalable conduit aussi à tuer les animaux non sélectionnés. Il affirme ne pas pouvoir se passer de l'expérimentation animale pour cette maladie multifactorielle.

Objectifs

Le psoriasis est une maladie pro-inflammatoire chronique et multifactorielle de la peau (démangeaisons, plaques inflammatoires, …), touchant 2 à 4% de la population française, principalement bénigne et actuellement sans traitement curatif définitif. Dans 20% des cas, des formes sévères sont relevées montrant l’augmentation des risques cardiovasculaires et métaboliques chez ces patients. Le récepteur TRPV1 (Transient Receptor Potential Vanilloide 1) est un acteur majeur dans la perception et l’intégration des sensations douloureuses (nociception), et est impliqué dans l’inflammation des couches superficielles de la peau (épiderme externe et derme plus profond), dans de nombreuses maladies, mais son rôle précis au niveau vasculaire local et/ou dans les échanges entre les différents types cellulaires, n’est pas clairement démontré à ce jour. Aujourd’hui, parallèlement à des études pharmacologiques en biologie cellulaire (in vitro sur cultures cellulaires) ou par des analyses biochimiques et de biologie moléculaire sur organes isolés (ex vivo, explants de peau ou prélèvements tissulaires de patient), notre objectif est de caractériser in vivo l’implication du récepteur TRPV1 dans un modèle induit de psoriasis chez des souris génétiquement modifiées. Ce projet inclus 2 procédures expérimentales. La procédure 1, de sévérité legère, est une procédure d'élevage permettant de générer 3 nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées « Knock-Out tissu-spécifique », où l’expression du gène TRPV1, soit le complexe protéique constitutif du récepteur TRPV1 exprimé à la membrane cellulaire, est spécifiquement invalidée dans l’un des 3 compartiments cellulaires suivants : vasculaire (microcirculation vasculaire locale), épidermique (relations entre les cellules constitutives de l’épiderme) ou nerveux (relations entre cellules sensitives), et de sélectionner au maximum de 1600 animaux d’intérêt. Ces animaux seront tous inclus dans la procédure 2, de sévérité modérée, permettant d’induire un modèle psoriasique selon 3 modalités : très court terme / précoce – 3 jours, court terme / aigüe – 6 jours et long terme / chronique – 9 semaines. Au terme de l’induction du modèle pathologique, des analyses fonctionnelles et biochimiques permettront de caractériser finement l’implication du récepteur TRPV1 au niveau des 3 compartiments précédents, de proposer une nouvelle approche de développement de traitements du psoriasis et/ou des pathologies dermatologiques similaires.

Bénéfices attendus

Actuellement, il n'existe aucun traitement curatif définitif, seuls des traitements symptomatiques aux résultats transitoires sont proposés aux patients étant atteint d’un psoriasis. L'idée novatrice de ce projet est d'étudier l'implication fine du récepteur TRPV1 et de le placer au centre de la dérégulation de l'équilibre homéostatique (constantes fonctionnelles régulées et maintenues à des valeurs bénéfiques pour l’organisme), incluant l'ensemble des acteurs, et d'identifier si possible le site d'inflammation privilégié (épithélial, neuronale, vasculaire) permettant d'envisager une possible nouvelle voie de développement d’un traitement diminuant le nombre et l’intensité des poussées.

Procédures

Les souris issues des 3 nouvelles lignées KO tissu-spécifique TRPV1, soit au maximum 1600 animaux, obtenues par la procédure 1 – élevage et obtention des 3 lignées de souris LoxP-Cre Knock-Out tissu-spécifique TRPV1, seront incluses dans la procédure 2 – Induction du modèle de psoriasis chez la souris et seront donc soumises à 3 types d’interventions : I – en amont du protocole d’induction (procédure 2), chaque souris sera tondue et dépilée (crème VEET « peaux sensibles »), sous anesthésie gazeuse ; intervention réalisée 1 fois et d’une durée maximale de 5 minutes, II – durant le protocole d’induction (procédure 2), chaque souris vigile recevra une application externe / topique de Vaseline® (condition contrôle) ou d’Aldara™ 5% (condition induite), sur la zone dépilée ; intervention réalisée 2 fois pour la modalité « précoce – 3 jours », 5 fois pour la modalité « aigüe – 6 jours » et 24 fois pour la modalité « chronique – 9 semaines » et d’une durée de moins de 5 minutes, III – Durant la procédure 2, chaque souris vigile recevra une injection sous-cutanée préventive de NaCl 0,9% (300µL), après contention manuelle, pour limiter déshydratation générale liée à la procédure d’induction ; intervention réalisée 2 fois pour la modalité « précoce », 3 fois pour la modalité « aigüe » et 6 fois pour la modalité « chronique », d’une durée d’environ 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux sont : I – du stress lors des pesées régulières (entre 2 et 7 fois par semaine, durée inférieure à 30 secondes) diminuant avec l’habituation, II – du stress lors des anesthésies gazeuses générales de préparation (tonte, dépilation) des animaux en amont de l’induction du modèle, de faible intensité (maximum 5 minutes), III – du stress et de l’inconfort lors des manipulations des animaux vigiles pour induire le modèle (application dorsale de crème, injection sous-cutanée préventive, observations comportementales, …), de faible intensité, et se réduisant avec l’habituation à la répétition journalière des opérations (5 minutes par animal et par jour), IV – une perte de poids corporel transitoire, attendue durant les premières 48 heures après début du traitement d’induction et pouvant atteindre 20% maximum, due à une déshydratation générale, soit d’une intensité modérée (maximum durant une semaine), V – L’apparition des « symptômes » induits, caractéristiques du psoriasis (rougeur / érythème, desquamation, épaississement cutané), d’intensité faible à modérée (durée totale de l’expérimentation) et VI - du stress lors de la réalisation des transferts des animaux vers nos partenaires (préparation, conditionnement, nouvel environnement transitoire, vibrations lors du transport, …), de faible intensité, sur 24-48h.

Devenir

Ce projet comporte 2 procédures expérimentales. Lors de la procédure 1 – Elevage et obtention des 3 nouvelles lignées de souris Knock-Out tissu-spécifique TRPV1, l’apparition éventuelle d’un phénotype dommageable mettrait fin au projet et l’ensemble des animaux seraient mis à mort. Les animaux présentant les génotypes d’intérêt, ainsi que les géniteurs d’intérêt pour la cryoconservation de leurs gamètes, seront gardés en vie. Les animaux non-sélectionnés seront mis à mort. Les animaux sélectionnés en procédure 1, intègreront la procédure 2 – Induction du modèle de psoriasis chez la souris, où ils seront transférés immédiatement vers nos partenaires (modalité « précoce – 3 jours » et « aigüe – 6 jours ») ou intègreront la modalité « chronique – 9 semaines », où ils débuteront le protocole d’induction du psoriasis, avant d’être transférés, à leur tour, vers nos partenaires, qui se chargeront de finaliser l’induction et de réaliser les expérimentations finales, puis mettrons à mort l’ensemble des animaux. Ils seront donc tous conservés en vie dans notre établissement.

Remplacement

Le psoriasis est une maladie multifactorielle, dont la physio-pathologie implique différents intervenants et composantes au sein de la peau (vasculaires, nerveux, barrière cellulaire, …), ne pouvant être reproduits et étudiés uniquement par le développement de modèles cellulaires et/ou l’utilisation de méthodes alternatives. Nous ne pouvons donc pas nous passer de l’expérimentation animale et de la mise en place de protocoles in vivo pour prendre en compte l’ensemble de ces aspects.

Réduction

L’ensemble du projet a été conçu afin de réduire au maximum le nombre d’animaux sans compromettre l’interprétation statistique des résultats. De par la variabilité interindividuelle dans les tests fonctionnels finaux, nous devons inclure 20 animaux par double analyse fonctionnelle pour obtenir des résultats robustes. Si les variations des résultats expérimentaux sont « significatives », nous envisagerons de réduire le nombre d’animaux par groupe et ainsi diminuer le nombre global d’animaux nécessaire. De plus, nous limiterons le nombre de groupes « contrôle » dans les 3 modalités d’induction du modèle (précoce - 3 jours, aigüe - 6 jours, chronique - 9 semaines), en utilisant les animaux contrôles de la modalité d’induction « aigüe - 6 jours » pour la réalisation des analyses de la modalité « précoce - 3 jours ».

Raffinement

Les responsables du projet s’assureront du bien-être de l’ensemble des animaux au quotidien, par la réalisation d’observations comportementales et d’évaluations du poids corporel, au minimum 2 par semaine. Si nécessaire et en suivant une échelle de cotation adaptée, les responsables prendront en charge la gestion de la douleur ou du mal-être par une analgésie adaptée, et si un point limite est atteint, pratiqueront la mise à mort immédiate de l’animal concerné.

Choix des espèces

L’utilisation de souris comme modèle d’étude in vivo est courant en immuno-dermatologie. Son système immunitaire, humoral et cellulaire est largement décrit depuis de nombreuses années et font référence, ce qui nous permettra d’expérimenter sans avoir recourt à des espèces de mammifères plus proches de l’homme. Dans notre contexte, il nous semble d’autant plus pertinent d’induire un psoriasis sur cette espèce, car, commercialement, nous pouvons obtenir des animaux génétiquement modifiés d’intérêt (mutant KO total TRPV1, souris LoxP-TRPV1, souris Cre-tissu spécifique), et créer des souris Cre-LoxP KO spécifique TRPV1 par les méthodologies d’inactivation Cre-LoxP développées dans les années 2000. Le modèle inductible d’inflammation cutanée / psoriasis est documenté depuis plus de 10 ans, utilisé par de nombreuses équipes mondialement et nos partenaires sont rompus à son utilisation. Les 3 nouvelles lignées produites permettront de caractériser l’implication du récepteur TRPV1 au sein de 3 compartiments cellulaires impliqués dans le psoriasis induit chez la souris. Le psoriasis touche l’ensemble de la population, du jeune à l’adulte, avec un pic d’apparition de la maladie chez l’homme se situant entre 20 et 30 ans. Notre étude souhaite évaluer les phases précoces d’apparition du psoriasis, puis l’installation de la pathologie à court terme (phase aigüe) et l’évolution à long terme (phase chronique) dans un modèle induit de dermatite psoriasiforme chez la souris. Nous utiliserons donc des animaux adultes, âgés de 8 à 12 semaines et dont le poids variera entre 20 et 30g au moment de débuter le protocole d’induction du modèle.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, elles reçoivent une injection de chlorure de baryum dans les muscles de la patte pour provoquer une lésion, après un gavage de dioxine, afin d'étudier l'effet de ce polluant sur la régénération musculaire. Le porteur reconnaît qu'une paralysie ou une nécrose de la patte reste possible, et prévoit la mise à mort au plus tard vingt-huit jours après la lésion. Il indique que l'étude d'interactions cellulaires dans l'organisme entier ne peut être qu'en partie remplacée par la culture in vitro.

Objectifs

Parmi les tissus des organismes vertébrés, le muscle squelettique est l’un des plus remarquables parce qu’il possède de grandes capacités régénératrices, ce qui font de lui un organe très plastique. À l’origine de cette plasticité musculaire se trouve un réservoir de cellules souches, dont les plus étudiées à ce jour sont les cellules satellites qui, comme leur nom l’indique, se localisent en périphérie des fibres musculaires. La dioxine, un polluant organique et hautement toxique, a un impact sur les cellules souches du muscle squelettique et il a été démontré qu’il existe une différence de réponse face à la pollution au sein des sous-populations de cellules souches du muscle. Une partie d’entre elles semblent résistantes à la pollution et présentent un mécanisme de résistance unique, tandis que la majorité des cellules satellites y sont sensibles. Ceci interroge désormais sur le rôle respectif de ces deux sous-populations quant à la réparation du muscle squelettique dans un contexte de pollution. Comme la pollution est un facteur de risque important pour la santé humaine nous proposons avec ce projet et sur la base de nos résultats, de décrypter les réponses cellulaires et moléculaires spécifiques de chacune de ces deux souspopulations au cours de la régénération musculaire après une exposition à la pollution. Alerter sur les effets de la pollution dans un système biologique tel que le système musculaire permettra de comprendre quel stress cellulaire peut engendrer la pollution. Dans notre étude, nous utiliserons des modèles murins qui subiront une exposition à la dioxine ou à une molécule contrôle. Une partie des souris sera, dans un deuxième temps, soumise à une blessure musculaire. Nous pourrons ainsi étudier l’impact de la pollution par dioxine sur les cellules souches musculaires notamment au cours du processus de la régénération musculaire.

Bénéfices attendus

Comme notre projet s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps et l’interaction entre de nombreux types cellulaires nous ne pouvons pas mettre en place une méthode alternative au vivant. Dans un but de suivre le principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) et de réduire l’utilisation excessif d’animaux, le nombre d’animaux a été calculé sur la base de protocoles déjà publiés avec 15 animaux par lot ce qui est le minimum pour obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des analyses nécessaires. Pour essayer de minimiser la souffrance et le stress induit aux animaux, des analgésiques seront administrés avant et après d’induction de la régénération musculaire. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux. Notre étude fera appel à un total de 480 souris sur une procédure expérimentale.

Procédures

Pour le déroulement de ce projet les animaux seront anesthésiés sous isoflurane (induction 4%; maintien 2%) et soumises à des injections de BaCl2 dans les muscles TA et BCPS. L’intervention sera faite une seul fois par souris et la durée de l’intervention est de 10 minutes (après endormissement des animaux).

Impact sur les animaux

Il n'est attendu aucun effet indésirable majeur dans le contexte du traitement de TCDD par gavage. Les animaux gavés avec TCDD ou contrôle nonane sont comparables en termes de comportement/activité motrice spontanée et de poids corporel. Les génotypes des animaux utilisés ne sont pas délétères ou indésirables. L’induction de la régénération musculaire peut entrainer des contraintes au niveau du mouvement de la patte pendant quelques heures. Dans notre expérience nous n’avons jamais observé de complications majeures liés à la régénération musculaire mais nous ne pouvons pas négliger la possibilité qu’une éventuelle paralysie ou nécrose de la patte puisse se manifester.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour analyse au plus tard 28 jours post-lésion intramusculaire.

Remplacement

Nos projets s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps et/ou l’interaction entre de nombreux types cellulaires/tissus. De fait, l’étude de ces processus au sein d’un organisme dans son ensemble où toutes les cellules impliquées sont en étroite communication est nécessaire et ne peut être substituée qu’en partie par l’in vitro. Pour éviter au maximum l’usage d’animaux dans l’étude et être confiant de la réussite de notre projet in vivo, nous avons fait des études préliminaires sur des lignées cellulaires musculaires avant de passer aux expériences sur les animaux. De plus, la culture cellulaire restera une technique que nous utiliserons au cours de ce projet pour des testes préliminaires et complémentaires à l’utilisation des souris.

Réduction

Dans un but de suivre le principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) et de réduire l’utilisation d’animaux, le nombre d’animaux a été calculé sur la base de protocoles déjà publiés avec 15 animaux par lot ce qui est le minimum pour obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des analyses nécessaires. Ce nombre de souris n’a pas été calculé avec des méthodes de statistique mais basé sur notre expérience sur l’obtention de matériel biologique pour chaque technique.

Raffinement

Pour minimiser la souffrance et le stress induit aux animaux, des analgésiques seront administrés avant et après d’induction de la régénération musculaire. En préalable à l’injection, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane (induction 4%; maintien 2%). L’endormissement complet sera contrôlé par pincement ferme de la queue. L’anesthésie à l’isoflurane est rapide et profonde afin de permettre la réalisation de la procédure dans un temps relativement court et assurer un réveil rapide. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux. Pendant toute la procédure, les cages sont visuellement inspectées chaque jour donc tout animal présentant les points limites sera mis à mort (lordose, tremblements, prostration, paralysie, difficulté de locomotion, nécrose de la patte, perte de poids).

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples. Les approches de transgénèse et recombinaison homologue nécessaires à l’étude de mécanismes moléculaires de processus biologiques sont facilement réalisables. La recombinaison homologue permet de modifier de manière efficace et contrôlée le locus des gènes murins. Ce modèle étant couramment utilisé, de nombreuses lignées transgéniques, notamment lignages spécifiques, sont aujourd’hui disponibles à toute la communauté. Des lignées pures et génétiquement caractérisées sont disponibles pour ce modèle. La courte durée de gestation chez la souris est compatible avec la durée de nos expériences. Nos expérimentations concernent les jeunes adultes de 6 semaines, date à laquelle le muscle adulte est complètement formé et les cellules satellites sont en quiescence. L’administration de tamoxifène par gavage sera faite à tous les animaux de l’étude. La tamoxifène va permettre l’induction de la recombinase Cre dans des lignées floxées au stade d’expression du promoteur contrôlant l’expression de la recombinase dans chaque lignée. Apres l’administration de tamoxifène par gavage, les animaux seront analysés pour l’étude de l’impact de l’exposition à la TCDD et pour l’étude de la régénération musculaire.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de la patte leur inflige une douleur neuropathique maintenue pendant sept semaines, avec des tests de douleur répétés et, pour certaines, une injection de naloxone déclenchant un syndrome de sevrage. Le porteur précise que l'allodynie mécanique ne peut être soulagée "car c'est l'objet de l'étude", et attend une perte de poids transitoire, pour évaluer une association méthadone-gabapentine. Il affirme le remplacement "impossible", la douleur ne pouvant être observée que chez l'animal vivant et vigile.

Objectifs

La douleur neuropathique est consécutive à une lésion ou une pathologie du système nerveux somatosensoriel, généralement chronique elle affecterait 5 à 7% de la population française. Les traitements actuels ne sont pas efficaces chez tous les patients et leurs effets secondaires conduisent de nombreux patients à arrêter le traitement. Antidépresseurs, anticonvulsivants (Gabapentine) et tramadol/tapentadol sont parmi ces traitements. En clinique, les opiacés classiques (morphine, fentanyl) sont de moins en moins prescrits pour soulager ce type de douleur du fait de leurs nombreux effets indésirables et de la crise des opiacés qui existe aux États-Unis en particulier. Les médecins se tournent alors de plus en plus vers la méthadone qui est actuellement utilisée dans de nombreux pays, mais pas encore en France, comme traitement antalgique des douleurs complexes liées au cancer. Ces douleurs complexes et chroniques mêlent des douleurs par excès de nociception ainsi que des douleurs neuropathiques, ce qui rend difficile leur évaluation et leur traitement. L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de la méthadone seule mais également en association avec un traitement plus courant la Gabapentine dans le soulagement des douleurs neuropathiques périphériques dans un modèle murin. L’association de ces 2 molécules permettra de cibler des cibles moléculaires différentes, de réduire les doses efficaces et donc les effets secondaires avec une même activité antalgique. Plusieurs doses seront testées afin de trouver une association de doses idéale, c’est-à-dire provoquant un soulagement idéal de la douleur neuropathique avec les plus petites doses possibles (ce qui provoquera donc le moins d’effet indésirable possible). Le but final de ce projet sera de proposer une association présentant moins d’effet indésirable pour des essais cliniques.

Bénéfices attendus

Le projet s'inscrit dans une démarche de raffinement des traitements existants chez l’Homme pour soulager les douleurs neuropathiques. L’association de méthadone et de gabapentine (anticonvulsivants déjà utilisé à plus fortes doses en clinique dans le traitement des douleurs neuropathiques) permettra de cibler des cibles moléculaires différentes, de réduire les doses efficaces et donc les effets secondaires avec une même activité antalgique. Le but final de ce projet sera de proposer une association présentant la meilleure efficacité avec le moins d’effet indésirable pour des essais cliniques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une douleur chronique pendant 7 semaines. Les animaux subiront donc une chirurgie au niveau de la patte droite de l'animal d’une durée de 5 min environ sous anesthésie générale. Ces animaux subiront également 6 fois le test de douleur durant une vingtaine de minutes environ avant la chirurgie neuropathique puis trois fois par semaine (délai de 5 jours minimum après la chirurgie avant la reprise des tests) pendant 5 semaines. Les animaux auront un traitement par un analgésique potentiel (méthadone, gabapentine, morphine ou 2 de ces molécules associées) dans leur eau de boisson 15 jours après l’induction de la douleur neuropathique Certains animaux seront soumis à un syndrome de sevrage modéré par une injection de naloxone.

Impact sur les animaux

Il y a présence de douleur, plus particulièrement une allodynie mécanique qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Suite à la chirurgie neuropathique (présente dans toutes les procédures de ce projet), une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie, une perte de poids transitoire peut se produire. Le traitement par la méthadone peut produire un syndrome de tolérance, d’hyperalgésie ou de sevrage, normalement peu présents voir pas présents aux doses utilisées dans ce projet. Un effet positif, antidouleur, induit par les traitements est également attendu.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux à la fin de chaque procédure pour prélèvements post-mortem.

Remplacement

Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, la caractérisation de la douleur nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Le nombre de souris nécessaire a été calculé mathématiquement et les effets de la combinaison des deux traitements sera évalué par les tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie dont la température, l’humidité et le cycle jour/nuit sont contrôlés, nourriture et boisson sont disponibles ad libitum. Ils seront hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton et de la frisure seront placés dans la cage pour favoriser la nidation pour limiter les comportements d’agressivité, et des barreaux de bois à ronger pour favoriser le comportement naturel du rongeur de ronger. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant la chirurgie d’induction de douleur neuropathique des méthodes d’anesthésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites pour limiter la souffrance de l’animal sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, ces nouvelles pratiques pourraient être intégrées au projet.

Choix des espèces

Les modèles d’animaux neuropathiques utilisés dans cette étude ont été caractérisés et validés pharmacologiquement chez la souris (travaux antérieurs de notre équipe) et non dans une autre espèce comme le rat par exemple. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g).

200 souris et 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une injection de manganèse à travers le tympan puis une IRM d'une heure et demie, pour mettre au point une imagerie des acouphènes servant à tester des candidats médicaments. Le porteur signale un inconfort de l'oreille après l'injection et indique que les animaux sont tués juste après l'IRM parce que le manganèse, toxique à forte dose, est incompatible avec leur maintien en vie. Il affirme qu'aucune méthode alternative validée ne permet de mesurer les acouphènes chez l'animal.

Objectifs

Développer des techniques IRM comme marqueur des acouphènes chez le rongeur en vue de développer et tester des médicaments traitant ce trouble.

Bénéfices attendus

Consolidation scientifique de cette technique d’imagerie pour évaluer l’efficacité de candidat médicament sur les acouphènes.

Procédures

Tous les animaux vont subir une imagerie IRM pendant 1h30 maximum.

Impact sur les animaux

Inconfort au niveau de l'oreille après l'injection trans-tympanique du manganese.

Devenir

Les animaux sont tous euthanasiés en fin de procédure afin d'éviter les effets du marqueur nécessaire pour détecter les acouphènes (MnCl2). Une forte dose de MN2+ peut produire de signes cliniques qui représentent des points limites, donc l'incompatibilité avec le maintien des animaux au-delà de l'acquisition IRM.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe pas de méthodes alternatives validées pour mesurer la présence d'acouphènes chez l'animal et l'activité cérébrale in-vitro. Il reste nécessaire de vérifier l’efficacité des principes actifs avant de poursuivre le développement chez l'Homme.

Réduction

Le développement d’une technique IRM du sodium permettra à l’avenir de garder les animaux dans le temps. Cette technique sera complètement non invasive et permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés en les gardant pour qu’ils puissent être leurs propres contrôles dans le temps.

Raffinement

Nous avons choisi d'utiliser l'IRM comme methode quantitative de mesure des acouphènes afin d'éviter une approche par électrophysiologie neurochirurgicale avec l'implantation d'électrodes dans le cortex auditif. Cette méthode, moins invasive, ne nécessite pas un point limite associé à la technique de'IRM en elle même. Les animaux sont euthanasiés directement après la mesure IRM sans réveil après l'IRM. L'approche de l'anesthésie sous isoflurane, nous permet de conserver une anesthésie constante et régulière pour éviter le stress d'un réveil de l'animal. Nous conservons les animaux sur un plateau chauffant à température nécessaire pour éviter l'hypothermie de l'animal.

Choix des espèces

Le modéle des acouphénes chez le rat et la souris est validé dans la litérature. Selon les données préliminaires de pharmacologie obtenues sur le traitement des acouphénes, le choix de l'espace s'orientera vers la souris ou le rat. Les animaux utilisés sont des adultes avec une oreille interne complètement formée et fonctionnelle. Cela implique l’utilisation d’animaux âgés au minimum de 4 semaines.

40 jeunes moutons mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'antigènes avec adjuvant, une dizaine de rappels au cours de leur vie productive, pour produire un sérum servant à fabriquer des réactifs de diagnostic vendus. Le porteur indique que l'adjuvant peut provoquer des inflammations locales, et précise que les animaux sont euthanasiés à la fin "afin de ne pas être reconduit dans la filière alimentaire". Il justifie le choix de l'espèce par l'absence de modèle in vitro performant et par les volumes de sérum obtenus.

Objectifs

Les anticorps polyclonaux de mouton anti-immunoglobuline de lapin et de souris sont utilisés dans la production de différents réactifs de diagnostic in vitro pour le test : - de maladies métaboliques liées aux hormones stéroïdiennes (estradiol et cortisol) ; - mesure de la concentration des hormones thyroïdiennes T4 et T3. Le dosage de ces hormones est réalisé dans le cadre d’un bilan de la fonction thyroidienne. L’anticorps de mouton est utilisé pour assurer la sensibilité et spécificité des tests en assurant la capture des anticorps spécifiques de lapin ou de souris dirigés contre chacune des molécules à doser (estradiol, cortisol, T3, T4).

Bénéfices attendus

En l'absence de modèle in-vitro performant, c'est l’espèce ovine qui a été choisie. Les résultats de développement des tests de diagnostic concernés ont montré l’efficacité de l’immunisation chez cette espèce. La qualité des anticorps ainsi obtenus s’est révélée satisfaisante (sensibilité et spécificité) permettant de garantir la fiabilité du résultat rendu par les tests : un faux résultat (faux positif, faux négatif ou erreur de dosage) rendu par le test dans un laboratoire clinique peut avoir un impact grave sur la santé, le suivi médical et la prise en charge des patients testés avec ces méthodes. Cette espèce donne la possibilité d’effectuer des prélèvements de sang à différentes reprises, ce qui permet de produire des quantités importantes de sérum hyper-immun et ainsi de limiter le nombre d’animaux impliqués dans le projet pour couvrir les besoins pour les 5 prochaines années de production.

Procédures

Pour un animal lors de la primo injection (1seule fois dans la vie de l’animal) : 4 injections par voie intra-dermique à 28 jours d’intervalle (3 minutes pour la totalité d’une injection). Et lors d’un rappel (une dizaine de fois dans sa vie productive) : 1 seule injection par voie intra-dermique (3 minutes pour la totalité de l’injection).

Impact sur les animaux

Par expérience, ces protocoles ne sont pas susceptibles d'occasionner douleur, souffrance ou angoisse. Les antigènes sont administrés avec adjuvant qui peut entrainer des inflammations locales au point d’injection. Ces inflammations, seront suivies quotidiennement et traitées si besoin par un protocole de traitement adapté. Toutefois, la surveillance particulière et quotidienne de ces animaux en protocole assure, en cas de signes cliniques, le déclenchement de soins spécifiques sur les conseils d'un vétérinaire. L'observation quotidienne de la troupe permet de détecter les premiers signes d’alerte : apathie, arrêt de l’alimentation, dégradation de l’état général.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de ne pas être reconduit dans la filière alimentaire.

Remplacement

Indisponibilité de modèle in vitro performant pour la production d’anticorps contre les antigènes considérés ayant les caractéristiques nécessaires (spécificité, avidité, sensibilité) pour un dosage ELISA automatisé. Les anticorps polyclonaux obtenus sont très spécifiques de l'antigène injecté et très sensibles en raison du nombre d’épitopes différents qu'ils reconnaissent.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés est calculé au plus juste en fonction des besoins de production. Le calcul du nombre d'animaux dépend du volume de produit commandé. Ce nombre d’animaux a été optimisé au fil des années d’expérience et permet d’être ajusté au plus près des besoins. Les quantités de sérum obtenues avec les moutons sont importantes, présentent des taux élevés d’anticorps ayant une forte affinité vis à vis de l'antigène injecté et correspondent aux volumes souhaités.

Raffinement

Les moutons, animaux grégaires, sont stabulés en petits groupes dans des conditions conformes à la réglementation et adaptées à l'espèce. Les animaux ont accès à la nourriture via une distribution de concentrés, au foin et à l’eau à volonté. Ils sont soignés quotidiennement, avec une surveillance intensifiée assurant leur bien-être. L'observation de signes cliniques de souffrance déclenche des soins spécifiques sur les conseils d'un vétérinaire.

Choix des espèces

Le mouton est une espèce documentée et classiquement utilisée pour la production d'anticorps polyclonaux. Bien que présentant une grande hétérogénéité, les anticorps polyclonaux sont très spécifiques de l'antigène injecté et très sensibles en raison du nombre d’épitopes différents qu'ils reconnaissent. Les quantités de sérum obtenues avec les moutons sont importantes, présentent des taux élevés d’anticorps ayant une forte affinité vis à vis de l'antigène injecté et correspondent aux volumes souhaités. Les animaux utilisés sont des jeunes mâles adultes afin de permettre le prélèvement de volumes sanguins (donc de sérums hyper-immuns) suffisamment importants pour la réalisation des diagnostics visés par l’étude.

346 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc, un suivi de la tumeur trois fois par semaine sous anesthésie et, pour une partie, des injections d'anticorps, afin de tester le blocage d'une réponse immunitaire régulatrice sur la croissance de la tumeur. Le porteur présente cette approche comme une possible alternative ou un complément au traitement anti-PD1. Il conclut que la complexité des réactions immunitaires rend "nécessaire" l'expérimentation in vivo.

Objectifs

Notre système immunitaire est divisé en deux: une réponse inflammatoire qui protège l'organisme contre les infections et les cancers, et une réponse immunitaire régulatrice (anti-inflammatoire) qui contre-balance la réponse inflammatoire pour éviter des réponses trop fortes ou non nécessaires, et donc l'apparition de maladies autoimmunes ou d'allergies. Cependant, il est suggéré que la réponse immunitaire régulatrice peut également avoir un rôle néfaste, comme dans le cancer où elle pourrait empêcher l'élimination de la tumeur par notre corps. D’un point de vue thérapeutique, il serait donc intéressant de bloquer la réponse immunitaire régulatrice dans le but de stopper la croissance tumorale. Pour imaginer bloquer la réponse régulatrice, il est nécessaire d'en comprendre les mécanismes sous-jacents, en particulier la façon dont elle est régulée. Dans ce projet, nous souhaitons donc déterminer les molécules impliquées dans la mise en place de la réponse régulatrice dans un contexte tumoral. Nous testerons dans une seconde partie le potentiel thérapeutique des molécules identifiées en les bloquant à l'aide d'anticorps pour voir si cela arrête la croissance tumorale. Ceci nous permettra de déterminer si bloquer ces molécules pourraient être utilisé comme traitement en complément des thérapies actuelles.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les phénomènes contrôlant la réponse anti-inflammatoire, ainsi que le rôle des cellules régulatrices impliquées dans le cancer. L'étude des mécanismes induisant la réponse T régulatrice dans la tumeur, ainsi que le blocage de cette réponse pourraient permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pouvant servir dans le traitement du cancer. De plus, ce projet nous permettra de déterminer si le blocage de ces cibles pourrait se réveler comme une meilleure alternative au traitement actuel anti-PD1 ou alors en améliorer son efficacité.

Procédures

Lors de la première partie du projet, 94 animaux seront anesthésiés au jour 0 puis injectés en sous-cutané avec des cellules tumorales (durée : 5 minutes). Par la suite, ces 94 animaux seront anesthésiés trois fois par semaine pendant 3 semaines maximum pour le suivi de la croissance tumorale (prise de photos + mesure de la tumeur) (durée : 5 minutes x 9 traitements =45 minutes). Au total, la durée de cette procédure expérimentale par souris est de 50 minutes. Lors de la deuxième partie du projet, 252 animaux seront anesthésiés au jour 0 puis injectés en sous-cutané avec des cellules tumorales (durée : 5 minutes). Par la suite, ces animaux seront anesthésiés trois fois par semaine pendant 3 semaines maximum pour le suivi de la croissance tumorale (prise de photos + mesure de la tumeur) (durée : 5 minutes x 9 traitements =45 minutes). Ces animaux seront également injectés par voie intrapéritonéale 3 fois par semaine pendant 3 semaines (durée : 10 secondes x 9 injections = 1 minute 30 secondes). Au total, la durée de cette procédure expérimentale par souris est de 51 minutes 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux développeront une tumeur localisée sur le flanc, au niveau du point d’injection des cellules. Des résultats préliminaires de notre équipe démontrent que ce type de greffe n’engendre pas de métastases au niveau d’autres sites. Nous avons déjà fait des injections intrapéritonéales d’anticorps sur d'autres modèles par le passé, et n'avons observé aucun changement de comportement de la part des animaux traités, cependant une rougeur pourrait survenir au point d'injection. Le traitement avec des anticorps devrait faire régresser la tumeur. Tous les animaux seront surveillés se traités selon les points limites énoncés.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour analyser la croissance tumorale et la réponse immunitaire au niveau des ganglions lymphatiques et de la tumeur.

Remplacement

Les cibles (molécules et cellules) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe et par d'autres laboratoires. Les phénomènes mis en œuvre dans ces réactions immunitaires mettent en jeu plusieurs organes (tumeur et ganglions lymphatiques) et réseaux impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécéssaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre la réponse immunitaire et et son implication dans la croissance tumorale.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un maximum de 346 souris, permettant de caractériser la réponse T régulatrice dans la croissance tumorale, et son potentiel en tant que cible thérapeutique. Les groupes comporteront 8 souris, ce qui est l'effectif minimal pour avoir des résultats statistiquement interprétables pour les paramètres étudiés (fréquence de Tregs et taille de la tumeur) à l'aide d'un t-test. Deux expériences pilotes seront effectuées avec un nombre limité de souris par groupe, ce qui permettra de déterminer 1) la lignée cellulaire la plus appropriée, 2) les doses d'anticorps à injecter. De plus, nous allons tout d'abord étudier une lignée de souris dans laquelle le gène d'intérêt est absent dans tout l'organisme, puis, si des résultats intéressants sont produits, d'étudier ensuite la lignée de souris dans laquelle le gène est absent dans un type cellulaire donné. De la même manière, nous essayerons de bloquer la signalisation de OX40L avec des anticorps, seulement si nous obtenons des résultats prometteurs au cours de la partie 1 concernant le rôle de cette molécule.

Raffinement

Les animaux seront gardés en groupe dans leur cage pour préserver les interactions sociales, avec un enrichissement. L'injection de cellules tumorales, les prises de photos et les mesures de la taille de la tumeur seront faites sous anesthésie gazeuse légère. Après ces traitements, les animaux seront placés sous une lampe chauffante et surveillés jusqu'à leur réveil. Les sites d'injections d'anticorps seront alternés. Tout au long du protocole, les animaux seront surveillés de manière visuelle et selon la grille d'évaluation de la douleur établie. Si un animal dépasse le point limite établi, il sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Si le cas est plus grave, l'animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Les mécanismes impliqués dans les réponses immunitaires mettent en jeu différents organes, ce qui rend nécessaire l’utilisation d’expériences in vivo pour étudier ces mécanismes. Le modèle choisi est la souris car elle présente un système immunitaire similaire à celui de l’Homme avec une immunité innée et une immunité adaptative. Les animaux seront utilisés à partir de 10 semaines après la naissance afin d’étudier le système immunitaire à l’âge adulte.