Procédures modérées

120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisées comme animaux de réforme ou pour d'autres travaux pratiques. Hébergées seules pendant cinq jours en cage à métabolisme, sur une grille métallique de surface réduite, elles reçoivent un diurétique dans leur nourriture pour que des étudiants de Master mesurent la fonction rénale. Le porteur reconnaît que cet hébergement individuel génère des nuisances, tout en jugeant le traitement sans gravité. Il indique que l'usage de rongeurs reste "nécessaire" à la formation, l'étude des effets du diurétique ne pouvant selon lui se faire que sur un animal.

Objectifs

Ce projet est dispensé sous la forme de séances de travaux pratiques pour des étudiants de première année de Master. Il a pour objectif de les initier à l'expérimentation en cage à métabolisme pour évaluer les fonctions rénales à l'aide d'analyses statistiques à partir de données biologiques qu'ils auront collectées. Plus particulièrement, les étudiants seront amenés à tester les effets d'un diurétique (le furosémide) utilisé couramment en médecine humaine pour diminuer le volume sanguin, chose souhaitable dans le cadre de certaines maladies à oedèmes, l'hypertension artérielle ou les insuffisances cardiaques. D'un point de vue pratique, le furosémide est adapté à une expérimentation courte car ses effets sont rapides. Celui-ci provoque une augmentation du volume des urines, et donc une diminution du volume sanguin.

Bénéfices attendus

Ces séances de travaux pratiques visent à familiariser les étudiants de première année de Master à l'analyse in vivo de la fonction rénale de souris placées en cage à métabolisme, ce qui permet également de les sensibiliser aux problèmes méthodologiques de ce type d'expérimentation qui a pris une place centrale dans les stratégies d'élucidation de mécanismes physiopathologiques à la suite du développement de modèles animaux transgéniques. Plus globalement, ces séances de travaux pratiques permettent de familiariser les étudiants à l'utilisation des animaux à des fins scientifiques et à leur manipulation dans des conditions réglementaires.

Procédures

Tous les animaux seront hébergés en cages à métabolisme individuelle durant une période de 5 jours. Durant cet hébergement, une diète alimentaire standard sera présentée aux animaux sous forme de nourriture en poudre, avec eau déminéralisée ad libidum. Le furosémide sera additionné à la nourriture en poudre en fin de matinée du 4ème jour jusqu'au 5ème jour. Durant les 5 jours, les urines seront collectées, et la prise d'eau et de nourriture seront mesurés. Ces analyses ne nécessitent pas la manipulation des animaux. En revanche, le poids des animaux sera déterminé quotidiennement et nécessitera la sortie des animaux de leur cage à métabolisme le temps de leur pesée (30 secondes à 1 minute). Pour cette mesure, les animaux seront manipulés à l'aide d'un tube en polycarbonate.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cages à métabolisme. Celles-ci sont transparentes et disposées les unes à côté des autres. Cela permet le maintien du contact visuel, olfactif et acoustique entre les congénères. Les cages seront placées dans une pièce dédiée, calme, avec une température contrôlée à 22°C +/-2°C et bénéficiant d’une périodicité jour/nuit de 12h/12h. Cependant, ce type d’hébergement génère des nuisances sur les animaux car ceux-ci sont hébergés individuellement, et se déplacent sur une grille métallique de surface réduite. Hormis l'hébergement en cage à métabolisme, le traitement au furosémide durant une journée ne relève d'aucune gravité. Celui-ci provoque transitoirement l'augmentation de la diurèse des animaux, mais celle-ci ne s'accompagne pas d'une déshydratation car les animaux ont libre accès l'eau de boisson durant toute la procédure expérimentale.

Devenir

Le traitement au furosémide des animaux durant une journée n'entraîne aucun phénotype dommageable. En conséquence, tous les animaux pourront être réutilisés par l'EU comme animaux de réforme, ou pour d'autres types de séances de travaux pratiques (démonstration de la préhension/contention d'animaux, ...).

Remplacement

Dans la mesure du possible, le remplacement des animaux par des méthodes alternatives (études de films, analyses d'articles scientifiques, méthodes in vitro, ...) est préféré. Toutefois, l'un des objectifs de la formation en Master à laquelle les étudiants sont inscrits est notamment de les former à la compréhension des mécanismes qui sous-tendent les différentes fonctions physiologiques et pathologiques chez les animaux ou l’humain. De ce fait, l'utilisation de rongeurs reste nécessaire : l'étude des effets d'un diurétique (furosémide) sur la fonction rénale ne peut se faire que sur un animal. Durant les expérimentations, une attention particulière sera portée aux points limites nécessitant une euthanasie de l'animal.

Réduction

Ce projet a une durée de 5 ans, et est dispensé une fois par an. Chaque année, l'effectif est volontairement limité à 24 étudiants répartis en 4 groupes afin de tenir compte des exigences liées à la surface d'expérimentation de la pièce dédiée à l'hébergement en cage à métabolisme. Les résultats de chaque groupe seront analysés séparément. Ce projet nécessite 6 souris par groupe d'étudiants, soit un total de 120 souris (4 groupes d'étudiants x 6 souris par groupe x 5 ans). Par ailleurs, nous limiterons le nombre d'animaux en réalisant les expériences sur un même animal, car les mêmes animaux fourniront les données contrôles (jours 10 et 11) et les données provenant du test au furosémide (jour 12). Par ailleurs, le traitement au furosémide des animaux durant une journée n'entraîne aucun phénotype dommageable. En conséquence, tous les animaux pourront être réutilisés comme animaux de réforme, ou pour d'autres types de séances de travaux pratiques (démonstration de la préhension/contention d'animaux, ...).

Raffinement

Préalablement à leur hébergement en cages à métabolisme, les animaux en provenance du fournisseur agréé subiront une période d'acclimatation de 7 jours en stabulation (accès libre à la nourriture et à de l'eau filtrée) dans des cages ventilées (maximum 5 animaux par cage) dans les locaux de l'établissement utilisateur, et selon les normes en vigueur dans cet établissement utilisateur (température de 22-24 °C, éclairage de 7h à 19h, régime standard, litière : rafle de maïs, change une fois par semaine). Par ailleurs, l'environnement des animaux sera enrichi avec du nid végétal et des cylindres en carton. L'hébergement en cages à métabolisme sera lui aussi réalisé dans l'établissement utilisateur, et selon les mêmes normes que celles liées à l'hébergement en cages ventilées (température de 22-24°C, et éclairage de 7h à 19h). Par ailleurs, la détermination quotidienne du poids, de l’apparence physique et du comportement des animaux durant leur hébergement en cages à métabolisme nous permettra de définir les points limites nécessitant une euthanasie de l’animal. L’ensemble des expériences sera mené en présence de personnels hautement qualifiés dans des locaux d’hébergement respectant les standards en vigueur. Le taux d’encadrement des étudiants sera d’un enseignant par groupe d’étudiants (soit 6 étudiants), ce qui est élevé dans les conditions standards de travaux pratiques (1 enseignant pour 20 étudiants). Cela permettra d’assurer une vigilance constante sur la mise en œuvre des bonnes pratiques d’expérimentation par les étudiants.

Choix des espèces

Nous avons choisi de mener nos expériences chez la souris en raison de l'existance de nombreuses données publiées dans la littérature concernant les effets du furosémide sur la fonction rénale de ces animaux. Nous utiliserons des souris adultes jeunes âgées de 8-10 semaines dans le but d'évaluer les effets du furosémide sur le phénotype rénal à un stade pour lequel la fonction rénale n'est pas physiologiquement altérée par l'âge.

120 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection virale dans la veine de la queue, un gavage de glucose et des injections d'insuline et de tyloxapol, entrecoupés de nombreux prélèvements de sang, pour étudier le rôle d'un récepteur du foie dans les maladies liées au gras. Le porteur décrit des douleurs après les injections et les prélèvements, prises en charge par un analgésique. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne peut remplacer l'animal pour mimer la complexité d'un organisme, et rappelle qu'aucun traitement efficace n'existe à ce jour.

Objectifs

Les pathologies métaboliques touchant le foie se développent de plus en plus dans les pays industrialisés et peuvent évoluer vers des formes plus graves de la maladie pouvant se révéler mortelles. A ce jour, aucun traitement n’est disponible, mais certains acteurs du métabolisme du cholestérol peuvent constituer de nouvelles cibles d’intérêt. L’activité du récepteur P2Y13 est particulièrement étudiée par notre équipe. Dans ce projet, nous souhaitons étudier son rôle, en procédant à son invalidation au niveau hépatique, chez des souris soumises à un régime riche en graisses. Nous y étudierons le développement de l'insulino-résistance, de la stéatose et de la fibrose hépatique afin d'évaluer l'implication de ce récepteur dans le développement ou la protection contre ces pathologies. Les résultats obtenus constitueront un appui de recherche fondamentale et pré-clinique permettant d’évaluer l’importance physiologique et physiopathologique du récepteur P2Y13 dans le développement des pathologies métaboliques touchant le foie. Ils définiront une potentielle cible thérapeutique pour la prévention ou le traitement de ces maladies, pour lesquelles, pour rappel, il n'existe pour l'heure pas de composés suffisamment efficaces.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'identifier l'implication du récepteur P2Y13 au niveau hépâtique dans l'établissement de la steatose hépatique.

Procédures

La solution de particules adenovirales (AAV) sera injectée dans la veine caudale (1 injection par souris sur toute la durée de l’expérimentation). Au cours de l'expérimentation, chaque souris recevra un gavage oral de glucose accompagné de 2 prélèvements sanguin à la veine caudale (30 min avant et 15 min après l’administration du glucose), 1 injection intra-péritonéale d'insuline suivi de 5 prélèvements à la veine caudale (0, 30, 60, 90, et 120 min après l’injection d’insuline) et 1 injection de tyloxapol suivi de 5 prélèvements à la veine caudale (0, 1, 2 et 4h après l’injection de tyloxapol) Pour chaque animal, les interventions de gavage au glucose et d’injection intra-péritonéale d’insuline et de Tyloxapol seront espacées de 8 jours .

Impact sur les animaux

Douleurs post-injection et post-prélèvement sanguin : un analgésique (Carprofen 5mg/kg, dilué dans PBS stérile) sera administré par voie sous-cutanée à la fin de la manipulation et le lendemain.

Devenir

A l'issue de l'étude, les animaux seront euthanasiés et les tissus prélévés seront utilisé au maximum dans une démarche de recherche scientifique saine et préaleblement inteligement réfléchie.

Remplacement

Nous souhaitons étudier le rôle hépatique du récepteur P2Y13 dans le développement de la stéatose hépatique (NAFLD) et de la stéatohépatite non alcoolique (NASH). Afin de mimer au mieux la complexité d’un organisme, aucun modèle actuel (études in vitro ou études informatiques) ne permet de remplacer l’utilisation de modèles animaux pour ce genre d’étude.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé pour pouvoir réaliser des analyses statistique au terme de chaque procédures suivant les recommandation mathématiques de chaque situation (ANOVA ou Student t-test) Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons validé et adapté l’ensemble des analyses biologiques à de petites quantité de matériel (sang, tissus) et nous avons optimiser l’obtention de plusieurs paramètres sur un même animal quand cela est possible, telle que la réalisation de procédures différentes à 8 jours d’intervalle. Les procédures se feront uniquement sur des souris mâles car l’étude de la contribution des œstrogènes n’est pas pertinente dans notre projet.

Raffinement

Plusieurs mesures seront mises en œuvre pour respecter /optimiser le bien-être des animaux utilisés et la fiabilité́ des résultats qui seront obtenus. Ces solutions sont détaillées ci-dessous: Bien-être : -L'hébergement des animaux dans des locaux totalement adaptés (zootechnie de Rangueil) -Le respect de la période d'acclimatation de l'animal (4 jours) -Une surveillance quotidienne de l'animal par du personnel qualifié -Euthanasie de l'animal s’il est détecté́ comme étant en souffrance (prostration, perte de poids supérieure à 20%) -La présence d'un enrichissement (papier ou igloo) dans chaque cage -Plusieurs animaux par cage en conservant les groupes sociaux constitués au départ (4 au minimum à 6 au maximum) -Utilisation de l'anesthésie générale lors des procédures expérimentales qui le nécessite (Procédure n°1). Faire les injections et les prélèvement sanguins au niveau de la veine caudale par un expérimentateur formé à la manipulation et l'utilisation des animaux, et, ayant de l'expérience sur les méthodes. Utiliser un analgésique en péri- et post-injection (Carprofen). Surveillance des animaux par la responsable SBEA de la zootechnie afin d'optimiser les soins aux animaux après les procédures expérimentales Optimisation des expériences: -Notre recul sur la qualité́ des mesures enregistrées aux cours des procédures telles que les test de tolérance au glucose et a l’insuline (procédure n°3 et 4) ou la mesure de la sécrétion hépatique des VLDL (procédure 5). -La réduction du nombre d'animaux: optimiser l'obtention de plusieurs paramètres sur un même animal quand cela est possible ; des aliquots dédiés de différents organes seront réalisés afin d'optimiser leur utilisation pour diverses analyses biologiques (western blot, séquençage, analyses biochimiques,...). -Optimisation de la qualité́ des données par la mise en place de conditions optimales pour leur obtention (pièce calme, réduction du nombre d'expérimentateur dans la pièce à 1 ou 2) et à l’utilisation de test statistiques appropriés (ANOVA ou Student t-test selon les recommandations mathématiques de chaque situation)

Choix des espèces

L'espèce souris est choisie pour ce projet car il générera des données qui compléteront des résultats déja obtenus sur ce modèle. D'une manière générale, nous disposons d’une grande expertise de l’utilisation de cet animal et des procédures nécessaires à la réalisation de nos travaux. Ce modèle permet en outre d’étudier l’implication de différentes voies de signalisation et la communication entre les différents tissus de l'organisme. De plus, les données scientifiques de référence sont très nombreuses permettant d’avoir un recul sur la qualité de nos résultats. Enfin, la souris est un animal qui possède un taux élevé de reproduction ce qui permet d’avoir à disponibilité un nombre suffisant d’animaux pour la réalisation de nos travaux. Les souris seront utilisées à l’âge de 8 semaines, ce qui correspond à des animaux matures, ne manifestant pas d'altérations du métabolisme énergétique ou d'atteintes hépatiques qui peuvent être observées chez des souris plus agées.

245 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie abdominale sous anesthésie avec injection de cellules souches dans les testicules, pour y induire des tumeurs et vérifier que ces cellules reprogrammées gardent leur capacité à se différencier. Le porteur indique que les sutures peuvent provoquer des blessures que l'animal s'inflige lui-même, ainsi qu'une perte de poids, et que les souris sont mises à mort au plus tard huit semaines après l'injection. Il présente les retombées pour la médecine régénérative comme "cruciales" tout en les renvoyant au conditionnel, et conclut que la démonstration ne peut être réalisée sans recours au modèle animal.

Objectifs

Au début du développement, les cellules de l’embryon ne sont pas spécialisées dans une fonction. Ces cellules dites « souches » vont ensuite acquérir des identités spécialisées et devenir par exemple des cellules du muscle ou des neurones. La possibilité de changer l’identité établie de cellules, par des procédés expérimentaux appelés reprogrammation, génère des espoirs en médecine régénérative. Il est possible de former des cellules souches induites à partir d’une autre cellule, un fibroblaste. Au cours de ce processus les cellules perdent leur identité et passent dans un état particulier qui leur permettra de devenir souches. Deux gènes ont été identifiés et semblent être impliqués dans la régulation de l’identité cellulaire au cours de la reprogrammation. Leur présence ou absence affecte l’efficacité de la reprogrammation. Nous souhaitons alors étudier comment la présence ou l’absence de ces deux facteurs dans la cellule de départ affecte l’acquisition des propriétés souches dans les cellules reprogrammées. Dans le cadre du projet différents types de cellules avec des identités spécialisées sont reprogrammées en cellules souches induites. Le potentiel souche des lignées de cellules souches induites obtenues doit être ensuite confirmé par des tests chez l’animal, qui consistent en l’injection de cellules souches induites chez la souris adulte afin d’induire des tumeurs bénignes. Ces tumeurs ne disséminent pas et sont constituées, non pas de cellules cancéreuses, mais de cellules souches induites qui auront changé d’identité. L’enjeu principal de ces tests est donc d’identifier les types cellulaires spécialisés une fois la tumeur bénigne formée, grâce à des analyses au microscope des tumeurs collectées.

Bénéfices attendus

L’identification des régulateurs de l’identité cellulaire et la compréhension de leur mode de fonctionnement au cours de la reprogrammation serait de grande importance pour la médecine régénérative. Ces connaissances seront cruciales afin de générer des cellules de haute qualité avec une bonne efficacité. De plus, les cellules souches induites contribuent largement dans le domaine de modélisation des maladies et le développement des stratégies thérapeutiques. Par ailleurs des mécanismes peuvent être conservés dans des modèles de cellules souches à l’origine de pathologies humaines telles que le cancer. En conséquence, approfondir la connaissance des mécanismes moléculaires qui régissent l’identité des cellules souches induites présente aussi un enjeu pour la cancérologie. Les travaux in vitro nous ont permis d’identifier deux nouveaux régulateurs limitant ou favorisant la génération des cellules souches induites en partant de différents types de cellules spécialisés. Nous sommes en train d’identifier le réseau de gènes régulé par chacun de ces deux facteurs. Pour approfondir ces résultats nous souhaiterons donc étudier in vivo comment ces gènes pourront affecter les propriétés des cellules souches induites et donc mieux comprendre leur mode de fonctionnement.

Procédures

Les souris seront soumises à une unique procédure chirurgicale d'une durée de 20 min sous anesthésie générale et traitement antalgique pour éviter toute douleur. La procédure consistera en une incision au niveau de l’abdomen et une injection des cellules en suspension dans les testicules des animaux en conditions stériles. L’abdomen sera ensuite refermé et l’animal sera suivi post-réveil de l’opération ainsi que tout au long de la formation des tumeurs.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables qui sont attendus pour les animaux sont ceux qui peuvent découler : i) de la procédure chirurgicale (inflammation, infection et douleurs localisées), ii) de la présence de sutures cutanées qui peuvent entrainer des blessures cutanées à posteriori causes par l’animal lui-même par démangeaisons iii) de douleurs et de modifications du comportement de la souris (perte de poids) liées à la procédure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après une anesthésie générale dès l'atteinte des points limites ou après une période maximale de 8 semaines après l'injection des cellules souches dans les testicules. Les testicules seront ensuite prelevées et une analyse histologique sera faite au sein de nos laboratoires.

Remplacement

Jusqu’à présent, le projet a complètement été mené grâce à des expériences sur cellules murines en culture, donc sans faire appel à aucun modèle animal. Néanmoins, afin de pouvoir conclure sur ces résultats et pouvoir les publier, il est nécessaire de démontrer par d’autres approches, que les cellules souches induites maintiennent leur capacité de générer toutes les cellules de l’embryon. Cela ne peut être réalisé sans le recours à des modèles animaux.

Réduction

Le nombre de souris injectées sera réduit à 245 (49 groupes de 5 souris) pour les raisons suivantes : - Le choix des testicules comme site d’injection permet de doubler le potentiel de développement de tumeurs bénignes sans augmenter le nombre d’animaux. - Le résultat attendu de ce projet est l’observation qualitative de cellules/tissus spécialisés au sein des tumeurs mais nous ne recherchons pas d’effet statistique, permettant ainsi de réduire la taille des groupes d’animaux. Notre expérience antérieure nous permet de prédire que 2 souris sur 3 injectées avec des cellules souches développent des tumeurs. Ceci, combiné aux données de la littérature, nous permet de réduire le nombre de souris receveuses à 5 par condition pour obtenir un nombre suffisant de tumeurs analysables et ne pas reproduire l'expérience inutilement.

Raffinement

Durant toute la procédure, et en particulier dès le réveil post-chirurgie, les souris seront observées régulièrement (3 fois par semaine) afin d’identifier tout signe potentiel de mal-être ou de souffrance. Nous avons défini une série de points limites conduisant à l’arrêt de nos protocoles et à la mise à mort immédiate des souris concernées. De plus, anesthésiques et analgésiques seront utilisés avant, pendant et après la procédure opératoire.

Choix des espèces

L’ensemble du projet est focalisé sur l’étude de la biologie des cellules souches de souris. Il nous apparaît donc opportun de réaliser les expériences de formation de tumeurs bénignes chez la même espèce afin de récapituler au mieux les voies de signalisations qui vont induire la différenciation des cellules souches induites dans les tumeurs. Toutes les expériences seront réalisées avec des souris adultes de 6 à 8 semaines, qui est l'âge habituellement utilisé pour l’induction de ces tumeurs bénignes.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc, des prélèvements de sang à l'oeil et huit injections intrapéritonéales d'immunothérapie, pour tester si la déplétion des macrophages améliore un traitement anticancéreux. Le porteur renvoie les retombées pour les patients au conditionnel et reconnaît que l'objectif immédiat reste de comprendre le comportement des cellules. Sur le remplacement, il affirme que l'étude des interactions entre tumeur et microenvironnement immunitaire ne peut pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Objectifs

Le cancer colorectal, est le 3ème cancer le plus fréquent chez l’homme et le 2ème plus mortel, faisant de cette pathologie un enjeu majeur de santé publique. Bien que l’utilisation des immunothérapies, ont montré une efficacité remarquable dans le traitement de plusieurs types de cancers, leur effet reste cependant limité dans le traitement du cancer du côlon. Ceci peut notamment s’expliquer par la mise en place de voies d’immunosuppression alternatives. Il a notamment été montré que les macrophages infiltrant la tumeur peuvent jouer un rôle immunosuppressif (pro-tumorale) dans plusieurs types de cancer, dont le cancer colorectal. Par conséquent, nous émettons l’hypothèse que la déplétion des macrophages intra tumoraux pourrait améliorer l’efficacité des immunothérapie dans le traitement du cancer du côlon. Pour cela, des souris porteuses de tumeurs de côlon seront déplété ou non en macrophages, et traité ou non par immunothérapie . La croissance tumorale ainsi que le phénotype immunitaire seront évalués.

Bénéfices attendus

Ces travaux ont avant tout une portée translationnelle, puisqu’ils pourraient permettre d’établir à la fois le combo immunothérapie et les macrophages comme des cibles potentielles chez les patients atteints de cancer colorectal.

Procédures

-Rasage des souris sur le flanc après désinfection à l’alcool sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane (1x2min/souris) - Injection de cellules tumorales en position sous cutané sur le flanc des souris sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (1x30sec/souris) - Prélèvement de 100µl de sang au niveau de l'oeil (2x 1min / souris) - Injection intrapéritonéale de d'immunothérapie (8x20sec / souris).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées ne présentent pas de phénotype dommageable. Les tumeurs injectées par voie sous-cutanée ne développent pas de métastases et ne provoquent pas/peu de douleurs. Les traitement utilisés dans ce projet ne provoquent pas d’effets secondaires délétères détectables. Les souris reçoivent au total 8 injections par voie intra-péritonéale. Les animaux subissent donc un ensemble d’étapes de classe de gravité modérée, susceptible d’entraîner une angoisse modérée et de courte durée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane ; les rates, ganglions lymphatiques et les tumeurs seront prélevées pour peser et analyse du phénotype immunitaire .

Remplacement

Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro. Cependant, la validation de nos résultats nécessitera une série d'expériences in vivo pour mesurer l’impact de la déplétion en macrophage sur l’efficacité antitumoral dd'une immunothérapie . À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, l'étude de la pathologie, en particulier les interactions entre les cellules tumorales et leur microenvironnement immunitaire, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature. Nous avons ainsi calculé unetaille d'échantillon de 10 souris par groupe. Cettt procédure sera réalisé en 2 temps, avec 5 souris par groupe. La deuxième expérience sera réalisée si la première expérience est concluante afin de renforcer la signification statistique des données et de pallier à un problème technique éventuel.

Raffinement

Les tumeurs injectées par voie sous-cutanée ne développent pas de métastases et ne provoquent pas/peu de douleurs ou d'inconfort autre que le stress et la douleur liés à l'injection. De plusLes traitement utilisés dans ce projet ne provoquent pas d’effets secondaires délétères détectables. Les animaux subissent donc un ensemble d’étapes de classe de gravité modérée. Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (2 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage et du DietGel et/ou de l’HydroGel sera utilisé en cas de douleur et angoisse de l'animal.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation in vivo est justifié par l’existence de la lignée tumorale et des réactifs thérapeutiques, qui à notre connaissance n’ont pas été développés dans d’autres modèles pré-cliniques. De plus notre laboratoire a développé une expertise unique dans l'analyse du système immunitaire et du cancer chez la souris, et a tous les réactifs nécessaires à disposition. Pour atteindre la maturité du système immunitaire, les souris seront âgées de 7 à 12 semaines en fonction des disponibilité des animeaux chez le fournisseur. En revanche l'age des souris sera homogène entre les différents groupes expérimentaux.

462 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur transfère des lymphocytes T qui déclenchent un diabète auto-immun, avec injections répétées et jusqu'à dix prélèvements de sang à la queue, l'hyperglycémie entraînant soif, perte de poids et baisse d'activité avant l'euthanasie. Le projet vise de nouvelles immunothérapies ciblant les lymphocytes responsables de la destruction des cellules du pancréas. Le porteur affirme que la validation de ces stratégies passe forcément par des "organismes entiers", les composés étant d'abord testés in vitro.

Objectifs

Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune caractérisée par une perte totale ou quasi-totale de la capacité du pancréas à produire de l’insuline, hormone essentielle pour réguler le taux de glucose dans le sang. La perte de la fonction insulinique est due à la destruction des cellules béta du pancréas par son propre système immunitaire. Parmi l’ensemble des cellules immunitaires se sont les lymphocytes T qui sont majoritairement retrouvés au niveau des lésions pancréatiques et qui sont responsables de la destruction des cellules bêta. Les modèles murins ont permis de mettre en évidence que l’apparition de la maladie se fait en deux étapes consécutives dans des tissus anatomiquement distincts. Premièrement, les lymphocytes T sont activés dans les ganglions lymphatiques drainant le pancréas. Puis ils infiltrent le pancréas où ils vont pouvoir aller détruire spécifiquement les cellules bêta. L’Europe et l’Amérique du Nord ont les taux d’incidence les plus élevés, supérieurs à 10 personnes pour 100 000 habitants par an avec des taux d’augmentation annuelle de 2 à 3 %. Le seul traitement disponible consiste en des injections régulières d’insuline. Il n’existe actuellement sur le marché aucune thérapie ciblant la cause de cette maladie. Notre objectif est de développer de nouvelles stratégies d’immunothérapie ciblant les lymphocytes T impliqués dans la maladie.

Bénéfices attendus

Le diàbète de type 1 est une maladie auto-immune dont l’incidence en Europe et Amérique du Nord est supérieure à 10 personnes pour 100 000 habitants par an avec des taux d’augmentation annuelle de 2 à 3 %. Le seul traitement disponible consiste en un apport quotidien d’insuline. Il n’existe actuellement sur le marché aucune thérapie ciblant la cause de cette maladie. Nous espérons que nos études contribueront à jeter les bases de nouvelles stratégies thérapeutiques efficaces sur le diabète de type I. De manière plus globale, les connaissances et résultats obtenus pour ce projet devraient contribuer au développement de nouvelles stratégies immmunothérapeutiques pour d’autres pathologies auto-immunes.

Procédures

1. Injection dans la cavité abdominale : Pour reduire le nombre de cellules dans le sang, qui est nécessaire pour déclencher la maladie. 1 seule fois pour chaque animal. L'injection prend moins de 10 secondes. 2. Injection intra-veineuse : Pour injecter les lymphocytes tueurs autoréactifs. 1 seule fois pour chaque animal. L'injection prend moins de 10 secondes. 3. Injection intra-veineuse : 1 seule fois pour chaque animal. Pour injecter un traitement à base de cellules. L'injection prend moins de 10 secondes. 4. Injection dans la cavité abdominale : Pour injecter un traitement à base d'anticorps. 6 injections maximum par souris. L'injection prend moins de 10 secondes. 5. Prélèvements sanguins : Les souris seront suivies pour l’apparition du diabète en mesurant le taux de glucose dans le sang. Une goutte de sang obtenue par ponction dans la veine de la queue est suffisante pour relever une mesure. Un maximum de 10 prélèvements par souris. Cela prend moins de 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les souris seront surveillées pour détecter l'apparition de la maladie en mesurant les niveaux de glucose dans le sang tous les 3 jours. Une goutte de sang sera prélevée dans la veine de la queue à cette fin. Les prélèvements répétés peuvent causer du stress aux animaux. Au cours de nos expériences, certaines souris vont développer un diabète auto-immun constaté par une hyperglycémie, ce qui marquera la fin de nos expériences. Cette condition peut entraîner une douleur légère ou modérée pendant les 1 ou 2 derniers jours de l'expérience avant l’euthanasie des animaux. L'hyperglycémie apparaît vers le 10ème jour après le transfert de cellules T. Après ce point, les souris commencent à uriner plus fréquemment. 3-4 jours après l'apparition de l'hyperglycémie, les souris présenteront des poils dressés, une perte de poids et une mobilité réduite. Les animaux seront euthanasiés après deux mesures consécutives supérieures à 300 mg/dL. Les injections provoquent une gêne de très courte durée chez les souris. Les cellules ou les anticorps injectées ne doivent avoir aucun effet indésirable notable sur les souris.

Devenir

Une partie des animaux sera euthanasiée à J11 pour prélèvement des organes. L’autre partie sera suivie notamment pour l’apparition du diabète. Les animaux seront euthanasiés au fur et à mesure de l’expérience quand ils présentent des signes de souffrance ou deux valeurs consécutives de glycémie supérieure à 300 mg/dL. Les expériences seront arrêtées au bout de 30 jours et toutes les souris encore en vie à ce moment là seront euthanasiées pour pélèvement d’organes.

Remplacement

Le diabète est une maladie auto-immune qui implique différents acteurs du sytème immunitaire ainsi que différents organes (ganglions lymphatiques, pancréas...). La validation de nouvelles stratégies d’immunothérapie implique donc forcément l’utilisation d’organismes entiers. Cependant, les composés nouvellement développés seront systématiquement testés et validés in vitro et seules les approches ayant données des résultats probants in vitro seront évaluées in vivo chez la souris.

Réduction

La réalisation des expériences in vivo est conditionnée par l’obtention au préalable de résultats probants in vitro. Nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles, ce qui évite de réaliser un tri lors des naissances des souris. Pour les expériences d'apparition du diabète, 12 souris par groupe seront nécessaires pour avoir des résultats significatifs. D’après notre expérience avec ce modèle, pour des expériences de caractérisation des cellules T ex vivo, 9 souris par groupe devraient être suffisantes pour obtenir des résultats significatifs. Le nombre d'animaux représente le minimum requis.

Raffinement

Les souris sont élevées dans des portoirs ventilés dans un milieu enrichi. Nous nous basons sur une grille de score pour évaluer le comportement et l’état des animaux tous les 2 à 3 jours. Si nous constatons un problème (perte de poids excessive, poil hérissé…) les souris seront euthanasiées. L’apparition d’un diabète se traduit par le fait que les souris commencent à uriner plus fréquemment, une perte de poids et une baisse de l’activité. Afin d’améliorer la condition des souris, dès le début de l'hyperglycémie, une observation quotidienne des cages et du niveau des biberons sera effectuée. De plus, afin de faciliter l’accès à la nourriture, elle sera directement deposée dans la cage.

Choix des espèces

Le projet proposé ici est basé sur nos résultats précédents obtenus en utilisant notre modèle de souris transgénique de diabète auto-immun. Outre les modèles de diabète auto-immun spontané, plusieurs modèles de maladie induite chez des souris transgéniques ont été générés, qui permettent de suivre facilement et rapidement le devenir des cellules T responsables de la destruction des cellules bêta du pancréas. Les animaux utilisés seront des animaux âgés de 8 à 16 semaines. A cet âge les souris ont un système immunitaire suffisamment développé pour les besoins du projet. Par ailleurs, ceci nous permettra d’être dans la continuité des précédents travaux menés par l’équipe.

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une neurochirurgie d'environ trois quarts d'heure pour injecter un microARN dans le striatum, une région cérébrale liée au comportement compulsif, avant d'être tué le lendemain par perfusion de formaldéhyde dans le cœur sous anesthésie. Le projet cherche à confirmer, chez le rat, un mécanisme de régulation génétique déjà observé en culture cellulaire dans le contexte de l'addiction à l'héroïne. Le porteur affirme que seul le modèle in vivo permet cette vérification, l'étude neurobiologique invasive étant impossible chez l'humain.

Objectifs

Le but de ce projet est d’évaluer si miR-3594-5p est capable d’inhiber l’expression du gène Sez6 dans les neurones du striatum. L’expression d’un gène peut être définie comme l’ensemble des processus par lesquels l’information héréditaire stockée dans un gène est lue pour aboutir à la fabrication de molécules qui auront un rôle dans le fonctionnement de la cellule, comme les protéines ou les ARNs. miR-3594-5p est une petite molécule d’ARN appelé microARN qui ne produit pas de protéine mais qui est capable de réguler l’expression de différents gènes. Le striatum est une région cérébrale clée car elle joue un rôle critique dans le développement de comportement compulsif. Des travaux antérieurs ont démontré que les rats ayant développé une consommation compulsive et excessive d'héroïne, et non les individus ayant développé une consommation contrôlée et limitée de drogue, présentaient un niveau d'expression plus élevé de miR-3594-5p dans le striatum. L’augmentation du taux de cette molécule est associée à une diminution de l'expression du gène Sez6, gène impliqué dans la régulation des connexions entre les neurones, dans cette même région cérébrale. Il a déjà été mis en évidence que cette molécule est capable d’interagir directement avec le gène Sez6 dans un modèle de culture cellulaire. Il nous reste à déterminer la fonction de cette molécule dans le striatum de rat. Pour cela, nous devons démontrer que cette molécule interagit bien avec Sez6 dans les neurones du striatum de rat et inhibe bien son expression dans ces mêmes neurones.

Bénéfices attendus

Cette procédure confirmera les résultats antérieurs obtenus grâce au modèle de culture cellulaire et les étendra à un organisme vivant entier et intégré. Elle confirmera le rôle fonctionnel de régulation du miR-3594-5p dans le striatum de rat. Elle fournira une information unique sur le rôle de cette molécule dans l’inhibition spécifique de l’expression du gène Sez6 dans les neurones striataux. Les résultats issus de cette expérience seront très importants pour conforter les résultats déjà obtenus.

Procédures

Chacun des 48 animaux sera soumis à une neuro-chirurgie afin d'injecter le miR-3594-5p ou les molécules contrôles dans le striatum. Ce type de chirurgie est effectué en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et dure en moyenne 45 min. La procédure expérimentale relève de la classe modérée et est très brève puisqu’elle se termine un jour après la neuro-chirurgie.

Impact sur les animaux

Ces animaux sont soumis à une procédure très brève dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Les seules nuisances ou effets indésirables potentiels sont ceux associés à la neuro-chirurgie bien que toutes les précautions soient prises pour être dans des conditions d’asepsie et pour réduire au maximum ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse (anesthésie, analgésie, anti-inflammatoire, conditions aseptiques, suivi post-opératoire, raffinement des conditions d’hébergement ...). Les rats ne seront soumis qu’à une seule procédure n’excédant pas une journée. L’étape de réveil de l’animal est cependant nécessaire avant sa mise à mort pour laisser une fenêtre de temps nécessaire à la molécule pour inhiber le gène Sez6.

Devenir

A la fin des expériences, il est nécessaire de vérifier l'emplacement des infusions de la molécule dans le cerveau et de mesurer le degré d’inhibition de l’expression du gène Sez6. Ceci nécessite une fixation du tissu cérébral par perfusion intracardiaque d’un agent fixant (formaldéhyde) de tous les animaux. Cette procédure est réalisée sous analgésie (carprofène, 15 min avant) et anesthésie profonde (mélange de kétamine et de xylazine) afin de supprimer ou de limiter au maximum la douleur et la souffrance des animaux.

Remplacement

Des études précédentes ont démontré que miR-3594-5p se fixait sur l’ARNm de Sez6 dans un modèle de culture cellulaire (modèle in vitro). Malheureusement ce modèle ne permet pas de déterminer le rôle fonctionnel et physiologique de cette interaction dans le striatum de rat. Seul le modèle in vivo (rat de laboratoire, Rattus Norvegicus, jeunes adultes, mâles) peut nous permettre d’évaluer si miR-3594-5p inhibe bien l’expression du gène Sez6 dans les conditions biologiques et intégrées du striatum. Il est encore impossible in vitro de reproduire la complexité d’un milieu biologique intégré tel que le cerveau. Ce recours à l’animal se justifie car l’utilisation d’approches neurobiologiques invasives chez l’homme est impossible, rendant inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce. De plus, le phénomène que nous étudions ne peut être récapitulé sur des modèles mathématiques valides et réalistes.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire au projet est réduit au minimum. Un effectif final de 14 rats par groupes est un compromis rationnel, compte tenu de l’exigence éthique de réduction du nombre d’animaux et des contraintes expérimentales propres au projet scientifique proposé. Nous devons en effet avoir un nombre suffisant d’animaux en fin d’expérience pour détecter des différences significatives entre nos trois groupes expérimentaux à l’aide des tests statistiques appropriés. Le pourcentage d’attrition moyen est estimé à 10 pour cent en fin d’expérience (injection de la molécule mal placée 5 pour cent ; dégradation de santé 5 pour cent), l’effectif initial par groupe devra donc être de 16 rats. Le plan expérimental complet impliquera donc un lot de 48 rats pour le test de 3 conditions différentes (injection de la molécule, injection du contrôle négatif, injection du contrôle positif).

Raffinement

Les animaux sont logés par groupe de 2 dans des cages afin d’éviter le stress de l’isolement social. De plus, ces cages sont enrichies grâce à des tunnels de jeu et des os à ronger afin de limiter l’ennui et le manque de stimulation. Toutes les chirurgies sont réalisées sous analgésie (carprofène, 15min avant le début de la chirurgie) et anesthésie gazeuse (isoflurane), sont effectuées en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et durent entre 45 min et 1h. En fin de chirurgie, l'animal reçoit une injection sous-cutanée de sérum physiologique, pour favoriser la réhydratation. Il est ensuite placé dans une cage de réveil sur une couverture chauffante jusqu’au réveil (c'est à dire remise sur pattes et locomotion) avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Après le réveil complet, l'animal est relogé dans sa cage de stabulation avec son congénère pendant les 24 heures restantes avant la fin de la procédure expérimentale. Pendant toute la procédure expérimentale, les animaux sont sous surveillance afin de pouvoir détecter le plus rapidement possible les éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et de pouvoir y remédier rapidement. Lorsque le point limite est franchi, l’animal est mis à mort dans les plus brefs délais. Nous mettrons à mort l'animal par asphyxie au CO2. Pour s’assurer d’une mort effective, chaque animal restera sous surveillance pendant 1 heure après l'arrêt cardiaque. Les manifestations éventuelles d'inconfort, de stress ou de douleur sont donc suivies quotidiennement par des méthodes non invasives (inspection et manipulation quotidiennes, pesée régulière (3 fois par semaine avant la chirurgie)) et évaluées selon une grille d’évaluation des points limites. Si une perte de poids corporel supérieure à 20 pour cent est observée en 48 heures, l'animal sera alors mis à mort, sachant que dans tous les cas, il y a aussi d’autres points limites qui sont atteints. Toutes les procédures sont effectuées par du personnel formé.

Choix des espèces

Le choix du rat de laboratoire constitue une sorte de compromis. En effet, cette espèce est suffisamment proche de l’homme (même classe d’animaux vertébrés des Mammifères) pour servir de modèle animal valide des phénomènes de régulation des gènes par les microARNs par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (par exemple les invertébrés). En même temps, elle est suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (comme les primates non-humains). Des espèces invertébrées peuvent être utilisées pour élucider les mécanismes de régulation génétiques par les microARNs mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’homme pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions. Les animaux utilisés sont tous de jeunes adultes en fin d’adolescence en début d’expérience (âge moyen 2 mois et demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité face à l’addiction.

375 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris génétiquement modifiées reçoivent un traitement déclenchant une inflammation du foie, avec des prises de sang obtenues par une entaille au scalpel de la veine de la queue étalées sur six heures, avant la mise à mort pour prélèvements. Le projet étudie le rôle de cellules immunitaires dans les maladies chroniques du foie. Le porteur affirme qu'aucune autre espèce ne peut être utilisée et que les études in vitro ne reproduisent pas les interactions entre organes.

Objectifs

Les maladies chroniques du foie représentent la principale cause de développement du cancer du foie et sont souvent associées à des problèmes de diabète, d'obésité. Ces complications hépatiques vont d’un foie gras jusqu'au cancer. Malgré l'importance clinique de ces pathologies, aucun traitement pharmacologique efficace n’est actuellement disponible. La mise en place d’une inflammation chronique joue un rôle crucial dans le développement de ces maladies. Les cellules immunitaires sont impliquées dans les processus inflammatoires suite à divers signaux de danger. Ces cellules sont retrouvées, entre autres, dans des organes comme le tissu adipeux et l’intestin qui participent au développement des complications hépatiques. En particulier, dans ces maladies du foie, les fonctions de l’intestin sont dégradées et ceci contribue à l’activation des cellules immunitaires hépatiques. Afin de répondre à notre problématique, nous utilisons des animaux qui n’expriment une molécule présente à la surface des cellules immunitaires et qui est connue pour contrôler les fonctions de ces cellules. Ces souris seront soumises à un traitement favorisant l’apparition d’une inflammation au niveau du foie mimant celle observée au cours des maladies chroniques chez l’homme. Nous espérons ainsi démontrer le rôle exact des cellules immunitaires dans ces maladies et pouvoir proposer des stratégies thérapeutiques les ciblant. Ces études seront réalisées dans le souci d'utiliser un nombre raisonnable d'animaux sans compromettre les objectifs du projet et tenant compte des exigences de remplacement, réduction et raffinement. Ce projet utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Leur bien-être sera scrupuleusement pris en compte en termes de conditions d’élevage, d’hébergement et de soins afin de réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, d’une part, d’apprécier la contribution exacte des cellules de l'immunité dans la mise en place de l’inflammation hépatique et d’autre part de définir le rôle de notre molécule d’intérêt dans ce contexte pathologique. Ainsi, notre étude permettra de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression d’une inflammation au niveau du foie qui est un évènement crucial dans le développement et la progression des maladies chroniques du foie. Nous espérons pouvoir proposer de cibler les fonctions des cellules immunitaires comme nouvelle stratégie thérapeutique pour ces maladies qui actuellement ne disposent pas de traitements pharmacologiques.

Procédures

Un prélèvement de sang de 200µl sera réalisé aux temps T0, 2H, 4H et 6h. Les souris seront placées brièvement (5minutes) sous une lampe chauffante afin de dilater la veine caudale. Une entaille à l'aide d'une lame de scalpel sera réalisée à T0 (1 à 2 secondes). Aux temps suivants (2H, 4H et 6h), un simple passage bref (moins de 30 secondes) sous la lampe chauffante suffira pour récupérer les 200µL de sang.

Impact sur les animaux

Au cours de ce projet, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs : modification de l'état de la fourrure, prostration, difficulté de déplacement, respiratoire et d'ouverture des yeux, absence de réponse aux stimuli. Le protocole expérimental durera 6h maximum et de ce fait il n’est pas attendu de perte de poids. Les souris seront sous surveillance toutes les heures jusqu’à la fin de l’expérimentation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure

Remplacement

Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.

Réduction

Notre approche statistique garantit l’obtention de résultats exploitables avec un nombre minimum d’animaux. Cette approche est basée sur des groupes de 10 animaux avec la réalisation des tests statistiques suivants : ANOVA ou Student ou Mann-Whitney si la distribution des valeurs ne suit pas une distribution gaussienne. Nous utiliserons des souris mâles ou femelles permettant ainsi d’utiliser l’ensemble des animaux de notre élevage. Il est prévu 3 séries d’expériences mais si dès la deuxième série les résultats sont significativement significatifs, nous ne réaliserons pas la dernière série. Nous prévoyons d'utiliser 375 souris maximum sur une période de 5 ans. Les souris sous fond génétique C57BL/6 proviendront de notre élevage pour les deux procédures (souris invalidées pour notre molécule d'intérêt et souris contrôles issues de notre élevage). Nous utiliserons la technique de cytométrie spectrale dans notre étude qui présente l’avantage de nécessiter moins de cellules pour l’analyse et donc in fine moins d’animaux.

Raffinement

La mise en place de points limites précoces, prédictifs, adaptés à chaque nos procédures et basés sur une observation détaillée des animaux au cours de chaque procédure, permettra de limiter la sévérité de celles-ci. Les souris seront hébergées selon les mesures réglementaires pour le raffinement : en groupe (6 souris par cage, ou 5 souris par cage si une des souris fait 30g ou plus) dans des cages enrichies (igloos, ouate, baguettes de bois à ronger). Nous utiliserons la technique de cytométrie spectrale dans notre étude qui présente l’avantage de nécessiter moins de cellules pour l’analyse et donc in fine moins d’animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Les souris seront traitées au lipopolysaccharide (LPS) entre 6 et 10 semaines d’âge

7 500 souris et 3 300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une molécule par diverses voies, avec prélèvements répétés de sang, d'urines et de fèces, une partie des rats subissant la pose d'un cathéter sur le canal biliaire et un séjour en cage métabolique, avant des prélèvements terminaux d'organes. Le projet mesure le comportement pharmacocinétique de composés candidats. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro fiable et que le recours aux animaux est "indispensable".

Objectifs

Les caractéristiques pharmacocinétiques sont les premières données générées in vivo après que les tests in vitro aient été concluants. Ils vont permettre de décrire les différentes phases que va subir le composé quand il entre dans l’organisme du rongeur par différentes voies. Le rongeur a été choisi dans ce projet car c’est un modèle de choix du fait de la bonne disponibilité de la littérature, d’études rétrospectives en pharmacocinétique, de sa facilité d’utilisation et de son anatomie et sa physiologie bien connues.

Bénéfices attendus

La connaissance des propriétés pharmacocinétique d’un produit chez l’animal avant le design des études de pharmacologie permet d’utiliser le meilleur traitement (dose, voie d’administration) et participe à réduire le nombre d’animaux utilisés en pharmacologie. A terme, les résultats précliniques de ce projet permettront de mieux comprendre la pharmacocinétique de nos composés afin de de développer en clinique des composés prometteurs ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients.

Procédures

Procédure 1 : Etude de pharmacocinétique d'une durée de 24 heures pour un composé pharmaceutique administré chez le rat ou la souris avec prélèvements de sang, urines, fèces et tissus. Un maximum de 4 prélèvements de sang pour la souris et de 7 prélèvements pour le rat seront effectués sur ces 24h. Procédure 2 : Etude d’excrétion d’une molécule administrée chez le rat avec prélèvement de la bile via un cathéter au niveau du canal cholédoque, urines, fèces. Les sécrétions biliaires et urinaires seront collectées en continu sur une période de 24 heures en cage métabolique apre sune période d'acclimation de 15 heures. la procédure en elle même dure 39 heures.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux recevront des molécules issues de notre recherche. Les nuisances attendues : stress en cage métabolique ou suite de chirugie pour pose de pompe osmotique en s.c.. : mis en place d'un suivi analgésique et d'une observation réguliere des animaux.

Devenir

Tous les animaux des ces procédures seront mis à mort à la fin de l'étude afin de permettre la réalisation de prélévements terminaux (sang et organes).

Remplacement

Il n’existe pas de modèle fiable in vitro permettant de prédire de manière exacte et approfondie le comportement pharmacocinétique d’un produit chez l’homme. L’utilisation d’animaux est donc indispensable pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques d’un composé.

Réduction

Dans un but de diminution du nombre d’animaux et d’augmentation de l’information, le nombre d’animaux de l’étude est basé sur notre expérience. Nous utiliserons le plus petit nombre d’animaux qui permet d’obtenir des résultats avec une variabilité acceptable. Ainsi en screening, 2 animaux sont utilisés pour la voie intra veineuse et 3 animaux pour la voie orale pour décrire la pharmacocinétique des produits sur 24h. L’étude pharmacocinétique est réalisée par prélèvements multiples.

Raffinement

Animaux qui entrent dans l’étude : suivi régulier du comportement. Nous utilisons les Guides d'évaluation du Bien-Etre pour évaluer l'inconfort ou la souffrance de nos animaux. Nous avons défini des critères d'alarme et d'interruption adaptés à la procédure. Le nombre de groupes dans chaque expérience est optimisé en fonction des temps de prélèvements nécessaires, notamment de la durée de l’étude. Pour obtenir plus d’informations les échantillons utilisés pour le dosage du produit administré peuvent aussi être utilisés pour la bioanalyse des métabolites.

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Nos modèles ont été sélectionnés et seront mis au point, sur la base de la littérature existante et en s’appuyant sur l’expertise du fournisseur, afin de limiter l’utilisation de gros animaux pour les études précoces de recherche. Le rat et la souris sont choisis pour ces études parce que ces espèces sont aussi très représentées dans les modèles pharmacologiques et dans les études de toxicologie. L’étude des corrélations entre les données vitro et les données vivo obtenues chez le rat et la souris permettent de mieux définir la prédiction de la pharmacocinétique chez l’homme avant les premières études cliniques. Les rats et les souris utilisés dans ce projet seront des adultes afin que leur métabolisme soit mature (pas de forme pédiatrique dans nos aires thérapeutiques)

180 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses humaines de côlon, pancréas ou foie sont greffées sous leur peau, puis un anticorps ou un placebo est injecté trois fois par semaine pendant jusqu'à soixante jours, avant l'euthanasie pour prélever les tumeurs. Le porteur affirme n'avoir observé aucun effet secondaire des traitements dans des projets antérieurs, la surveillance portant surtout sur la taille des tumeurs. Il indique qu'il est "indispensable" d'évaluer l'anticorps dans un organisme entier, la culture cellulaire ne reproduisant pas l'environnement tumoral.

Objectifs

La transplantation de cellules cancéreuses humaines chez la souris permet d'en approfondir la caractérisation biologique. Dans ce travail, nous souhaitons évaluer les effets anticancéreux d'un anticorps, développé dans notre laboratoire, sur la croissance des cellules cancéreuse humaines (côlon, pancréas, foie) greffées chez la souris. Nous savons que ces cellules ne forment pas de métastases dans nos conditions de croissance chez la souris. Les animaux greffés seront soignés dans des conditions standard (portoir avec cages ventilées et enrichissement) et nourris sans restriction avec une alimentation standard. Ce modèle permettra d'étudier les effets du traitement avec l'anticorps d’intérêt. Même si certaines données ont d'ores et déjà pu être obtenues sur le rôle de l'anticorps dans les modèles de cellules en culture, il est indispensable d'évaluer leur efficacité dans un modèle animal plus intégré, impliquant tous les types cellulaires de l'environnement de la tumeur chez la souris. Une expérience se déroulera sur 60 jours entre le moment où les cellules cancéreuses sont greffées et l'analyse des résultats. Si nous envisageons un délai de 5 ans, celui-ci englobe le temps de plusieurs expériences et le temps de l'écriture d'une publication pour valoriser le travail.

Bénéfices attendus

Nous nous attendons à ce que l'anticorps d’intérêt diminue la croissance des tumeurs chez la souris dans le but de développer une nouvelle piste thérapeutique dans le traitement des cancers digestifs chez l'homme.

Procédures

Les souris utilisées sont des femelles adultes de 6 semaines à leur arrivée à l'animalerie. Nous avons choisi des femelles pour éviter l'agressivité des mâles liée au sexe et des adultes pour avoir un système mature et des animaux qui sont adultes du début à la fin de l'expérience. Après un temps d'acclimatation de 4 jours, elles entrent dans un protocole de suivi de croissance tumorale pour une durée maximum de 60 jours. On réalise une injection de cellules tumorales humaines digestives sous la peau de souris femelles adultes sous anesthésie. Les cellules vont être tolérées par la souris et vont commencer à croître à l’endroit de l’injection. Cette injection dure moins de 30 secondes. A partir du jour d’implantation, les souris vont recevoir un composé visant à diminuer ou ralentir la croissance tumorale. Ces injections se font 3 fois par semaine sur animal non endormi et sont composées soit d’un placebo, soit de la molécule d’intérêt. L’ensemble des souris est également évalué 3 fois par semaine quant à leur état général, leur poids et la taille des tumeurs au cours du temps. Cette évaluation se fait le même jour que les injections pour éviter l’accumulation de stress soumis aux animaux. L’ensemble de ces actes (injection et évaluation) ne dépassent pas 1 minute par animal. A la toute fin de l’expérience tous les animaux sont euthanasiés.

Impact sur les animaux

L’utilisation des molécules d'intérêt ou des molécules chimio-thérapeutiques utilisées dans les traitements des cancers digestifs, a d’ores et déjà été réalisée et validée dans des projets antérieurs et aucun effet secondaire nuisible n’a été noté. Les différents traitements n’affectent ni l’état général, ni le poids des animaux. Seules la taille des tumeurs et la nuisance liée aux injections répétées pour le traitement en cours d’expérience doivent être surveillée de manière vigilante, car ils peuvent être susceptibles d’altérer le bien-être animal et être à l’origine d’une perte de poids importante.

Devenir

A la fin de l’expérience ou lorsqu’un animal a été jugé avoir atteint un point limite affectant le bien-être animal, il sera euthanasié pour prélever les tumeurs greffées et les analyser. Aucun autre organe ne sera prélevé.

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être obtenues actuellement par d’autres méthodes compte tenu de la complexité physiologique de l’environnement de la tumeur comprenant plusieurs types cellulaires impossible à reproduire avec des cellules en culture, nous obligeant à travailler à l'échelle d'un organisme. Des études sur cellules en culture sont, par ailleurs, prévues pour étudier d’autres paramètres qui complèteront ce volet d’expérimentation animale sans pouvoir le remplacer.

Réduction

Nous avons déterminé le nombre d'animaux nécessaire et suffisant dans chaque sous-groupe pour avoir des résultats exploitables. Ce nombre est de 5 souris par sous-groupe, chacune greffée de 2 tumeurs sur chaque flanc, c'est à dire 10 tumeurs greffées par groupe, ceci dans le but de diminuer de moitié le nombre d'animaux inclus dans une expérience.

Raffinement

Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les animaux seront anesthésiés au moment de la greffe des cellules cancéreuses sous la peau. Au cours de l’expérience, une surveillance visuelle quotidienne et un suivi clinique (3 fois par semaine) seront réalisés dans le calme pour limiter au maximum le stress des animaux. L’administration d’analgésique sera réalisée si nécessaire (en cas de douleur). Des conditions d’hébergement standard adaptées sont appliquées avec une alimentation standard sans limite de quantité. Enfin, un enrichissement composé de coton et de lanières cartonnées en accordéon sera proposé aux animaux afin qu’ils puissent se confectionner des nids.

Choix des espèces

Les souris utilisées sont des femelles adultes de 6 semaines à leur arrivée à l'animalerie. Nous avons choisi des femelles pour éviter l'agressivité des mâles liée au sexe et des adultes pour avoir un système mature et des animaux qui sont adultes du début à la fin de l'expérience. Après un temps d'acclimatation de 4 jours, elles entrent dans un protocole de suivi de croissance tumorale pour une durée maximum de 60 jours. Nous avons choisi l'utilisation de la souris qui est une espèce animale qui se rapproche au mieux sur le plan physiologique à l’espèce humaine. Seule la souris nous permettra de répondre clairement aux questions que nous nous posons sur les effets anticancéreux d'un anticorps sur les cancers digestifs humains. De plus, le modèle souris apporte 2 autres avantages : sa taille et sa masse qui limite les quantités de traitement à administrer et le nombre extrêmement grand d'outils biologiques qui permettent la caractérisation des tissus cancéreux chez la souris. Les souris utilisées sont des femelles adultes pour que les animaux restent au même stade mature tout au long de l’expérience. Nous avons privilégié des femelles pour limiter les conflits entre mâles greffés dans une même cage.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une obésité et un diabète leur sont induits par un régime gras et des injections de streptozotocine, avec tests de tolérance au glucose, prises de sang répétées et densitométrie, avant l'euthanasie pour prélever leurs os et d'autres organes. Le porteur indique que la streptozotocine peut provoquer douleur transitoire et hypoglycémie, et que l'excès de poids peut gêner la mobilité des souris obèses. Il affirme qu'un modèle cellulaire isolé ne peut rendre compte des interactions entre tissus recherchées ici.

Objectifs

Ce projet a pour objectif principal de mettre en place un modèle animal atteint d’obésité et de diabète de type 2 (DT2), afin d’étudier in vivo les altérations de fragilité osseuse liées à l’obésité et au diabète. En France 56 % des hommes et 40 % des femmes souffrent de surpoids ou d'obésité, un problème de santé publique qui favorise l’apparition de diabète et d’hypertension artérielle, responsables de complications rénales et cardiovasculaires. Selon des études cliniques et fondamentales, l’obésité et sa complication en diabète (hyperglycémie), sont aussi associées à une fragilité exacerbée des os et un risque de fracture augmenté. Ces anomalies osseuses s’accompagnent d’une augmentation de graisses qui s’acumulent dans la moelle osseuse, ainsi que d’altérations inflammatoires dans la moelle osseuse et dans les tissus périphériques. Cela suggère des effets délétères de l’accumulation de graisses sur le renouvellement de l’os et sa résistance. Cependant, les mécanismes par lesquels l’obésité et le diabète amplifient l’accumulation de graisses dans la moelle osseuse n’ont pas été identifiés. De plus, le rôle de ces graisses dans la fragilisation des os chez les individus obèses/diabétiques, reste à élucider. Le présent projet vise à évaluer chez la souris obèse diabétique : 1) l’accumulation et la distribution des graisses de la moelle osseuse, 2) l’impact de ces graisses sur la masse et la qualité du tissu osseux, 3) l’effet de l’obésité et du diabète sur la capacité de transformation des cellules stromales/précurseurs de la moelle osseuse en cellules graisseuses, et 4) à analyser la production de molécules immunoinflammatoires et leur rôle dans la formation de graisses et dans la fragilisation de l’os. Le modèle d’obésité induit chez les rongeurs à l’aide d’un régime alimentaire riche en graisses, est décrit comme un modèle de choix pour l’étude des conséquences de l’obésité sur la santé.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de mieux comprendre la relation physiopathologique entre les désordres métaboliques liés à l’obésité et au diabète, et les maladies de fragilité osseuse. Il vise à générer des données à fort potentiel translationnel pouvant conduire au développement d’outils novateurs pour la prédiction, la prévention et la prise en charge des pathologies osseuses chez l’Homme. A court terme, ce projet permettra de valider la mise en place d’un modèle animal d’obésité et de diabète, représentatif de la pathologie humaine. Les études proposées apporteront des informations précieuses quant aux conséquences de l’obésité et du diabète sur la fragilisation des os. Elles pourraient éclairer le rôle précis de l’élévation de la graisse médullaire et de ses facteurs sécrétés, dans l’apparition d’altérations de la structure et de la microarchitecture des os. Les analyses prévues portent sur différents sites osseux afin d’apprécier la sensibilité spécifique de chaque site aux effets de l’obésité et du diabète. Le suivi longitudinal non invasif par densitométrie in vivo, permettra de corréler l’apparition des atteintes de masse osseuse avec la sévérité de l’obésité et du diabète. Des molécules liées à l’immuno-inflammation seront également mesurées dans les tissus et dans le sang circulant prélevés sur les animaux. Les résultats attendus pourraient permettre l’identification de biomarqueurs circulants et/ou tissulaires pour une évaluation précose et prédictive des atteintes ostéomédullaires et osseuses dans le contexte de l’obésité et du diabète. Si les résultats s’avèrent concluants, cela pourrait ouvrir la voie à de nouvelles études translationnelles et cliniques, pour évaluer l’intérêt de l’adiposité médullaire et de molécules immuno-inflammatoires séléctionnées dans des stratégies de prise en charge des pathologies de fragilité osseuse. De plus, compte tenu de la prévalence croissante de l’obésité et du diabète et leurs conséquences multiples sur la santé humaine, la validation du modèle animal peut à terme, ouvrir la voie vers de nouvelles collaborations avec des partenaires qui s’intéressent à d’autres complications du diabète.

Procédures

La procédure proposée dans le présent projet implique plusieurs gestes expérimentaux appliqués aux groupes d’animaux utilisés. Dans un premier temps, les souris seront mises sous régime alimentaire contrôle (LFD) ou riche en graisses (HFD) pour induire une obésité. Après 4 semaines de régime alimentaire contrôle ou gras, les souris maintenues vigiles recevront 3 injections intrapéritonéales de solution de streptozotocine (STZ) (groupes HFD/STZ) ou de tampon (groupes HFD et contrôle LFD) ; une injection par jour pendant 3 jours consécutifs. Pour vérifier la mise en place de la pathologie du diabète (hyperglycémie) dans les groupes HFD/STZ, des mesures de glycémie à jeun et des tests de tolérance au glucose (IPGTT) et à l’insuline (IPITT) seront réalisés sur tous les groupes d’animaux maintenus vigiles. La glycémie sera mesurée sur une goutte de sang prélevée dans la veine de la queue après ponction à l’aide d’une aiguille. Elle sera mesurée au début du protocole puis toutes les 4 semaines. Les tests IPGTT et IPITT sont prévus à deux temps, aux semaines 7 et 15 du protocole. Après une injection intrapéritonéale d’une solution de glucose (pour IPGTT) ou d’insuline (pour IPITT), une série de 5 mesures de glycémie seront réalisées à des intervalles de 15-30 minutes. Un temps de récupération de 3-4 jours est prévu entre le test IPGTT et le test IPITT. Les animaux de la cohorte 3 (60 souris) recevront aussi 3 injections intrapéritonéales de marqueurs fluorescents dont la sécurité est validée. Les 3 injections sont prévues sur les animaux maintenus vigiles aux semaines 12, 14 et 16 (la veille de la mise à mort). Enfin, tous les groupes d’animaux du projet (180 souris/3 cohortes) subiront des mesures par densitométrie (scanner) pour évaluer la composition corporelle en fonction du régime appliqué. Trois mesures de densitométrie (semaines : 0, 8 et 16) seront réalisées sur les souris sous anésthésie générale au gaz d’isoflurane ; chaque mesure dure 4-6 minutes d’acquisition. Deux prises de sang sont également prévues (aux semaines 8 et 16) sur tous les animaux. La première sur les souris vigiles, est prévue par ponction de la veine latérale de la queue et à l’aide d’un capillaire après application locale d’un gel anesthésique. Le second prélèvement est prévu par ponction cardiaque sur les souris sous anesthésie générale terminale à l’isoflurane, juste avant mise à mort (semaine 16) pour prélèvement d’organes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront utilisés comme modèle pathologique d’obésité et de diabète, induit par un régime alimentaire gras avec ou sans injections de streptozotocine (STZ). Le modèle est largement décrit dans la littérature, les principales nuisances / effets indésirables inhérents aux procédures expérimentales prévues sont les suivants : - Pendant les injections IP de solution de STZ ciblant les cellules du pancréas, comme déjà obsevé dans un protocole du laboratoire (n°2021060316221938), les animaux peuvent manifester un stress limité dans le temps voire une douleur transitoire (12-24 heures) dus au pH acide de la solution de STZ. Un risque de prostration de l’animal peut être aussi observé pendant 30 à 60 minutes post-injection en raison d’un risque d’hypoglycémie consécutive à l’injection de STZ. Une surveillance renforcée sera mise en place jusqu’à rétablissement complet de l’animal puis 2 surveillances par jour au minimum. - Lors des injections IP de solutions de marqueurs fluorescents, ou de solution de glucose/insuline pour les tests de tolérance au glucose/insuline, les animaux pourraient subir un stress limité dans le temps. Lors des prises de sang pour les mesures de glycémie, la ponction de la veine caudale pour le prélèvement sanguin peut induire une douleur localisée et ponsctuelle. Pour la prise de sang prévue à la 8ème semaine du protocole, un gel de pramocaïne 1% (anesthésique local) sera appliqué préalablement à la ponction. - Une prise de poids qui pourrait provoquer une gêne limitée à la mobilité des animaux obèses (HFD) à partir de la semaine 12 du protocole. Après installation d’une hyperglycémie diabétique chez les animaux traités avec la STZ (groupes HFD/STZ), la prise de poids peut s’inverser par comparaison aux animaux des groupes HFD. Le poids des animaux sera donc contrôlé de manière hebdomadaire et son impact sur le bien-être des animaux sera pris en compte dans la surveillance des points limites.

Devenir

Le présent projet vise à étudier l’impact de l’obésité et du diabète de type 2 (DT2) sur l’accumulation de graisses dans la moelle osseuse, et les conséquences de ces graisses sur le tissu osseux qui augmenteraient la fragilisation des os et le risque de fracture. Ainsi, à la fin de la procédure expérimentale proposée, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et analyse.

Remplacement

Le projet proposé vise à étudier in vivo les mécanismes physiopathologiques qui expliqueraient les relations observées entre accumulation d’adiposité médullaire (graisse de la moelle osseuse) et développement de fragilités osseuses dans le contexte d’obésité et de diabète. Ce contexte de pathologies métaboliques, complexes et multifactorielles, et ses conséquences systémiques nécessitent une approche d’étude intégrée, qui tient compte des interactions multiples entre tissus et entre tissus et facteurs moléculaires circulants. Ainsi, le modèle de souris obèse/diabétique constitue un modèle de choix et bien établi pour mimer la pathologie humaine. De plus, ce projet s'intéresse à l’implication de facteurs métaboliques et des molécules immuno-inflammatoires circulantes dans le sang, dont l’étude requiert un modèle d'étude chez l’animal vivant. L’utilisation d’alternatives basées sur des modèles cellulaires isolés in vitro ne pourra répondre à ces objectifs. Les hypothèses et les objectifs de ce projet s’appuient sur des études complémentaires déjà réalisées in vitro sur des modèles de cellules souches de la moelle osseuse, exposées à des stimulations métaboliques et immuno-inflammatoires. Ces études in vitro ont permis d’identifier des molécules qui pourraient impacter le tissu osseux et dont l’évaluation nécessite un modèle in vivo.

Réduction

Le nombre d'animaux sera limité à un maximum de 20 par groupe pour assurer des résultats statistiquement comparables. Ce nombre tient compte des données de la littérature, et des analyses prévues devant faire l’objet de tests statistiques. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans le présent projet, plusieurs analyses sur plusieurs sites osseux seront regroupées dans la même étude et sur les mêmes groupes d’animaux. Les mêmes prélèvements osseux (e.g. le même tibia) serviront à la fois pour des analyses par histologie et par immunohistochimie. Le deuxième tibia de chaque animal servira pour des analyses par microtomographie (microCT). Ce même tibia (comme tous les autres prélèvements osseux) sera scanné par microCT, une première fois pour analyser la microarchitecture osseuse, et une seconde fois pour évaluer la graisse de la moelle osseuse après un traitement spécifique de l’échantillon. Pour réaliser un suivi de l’apparition des atteintes osseuses et de la composition corporelle au cours du temps, et en conformité avec le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés, plusieurs mesures (scans) à l’aide d’un densitomètre sont prévues sur les mêmes souris in vivo. Outre la réduction du nombre de groupes d’animaux utilisés à différents temps de suivi, cette approche permettra aussi de réduire les biais expérimentaux liés à la variabilité interindividus des mesures réalisées. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour les projets du laboratoire, d’autres organes seront récupérés et utilisés dans un autre projet collaboratif qui s’intéresse à l’étude des dysfonctions vasculaires et rénales liées au diabète.

Raffinement

Les animaux, hébergés par groupes de ~4-6 souris/cage, seront inclus dans le protocole après 1-2 semaines d’acclimatation dans l’établissement d’expérimentation. Avant injection intra-péritonéale de la solution de streptozotocine (STZ), les souris seront prélablement habituées à des injections de sérum physiologique afin de prévenir/réduire le risque de stress. Après injection de la STZ, une surveillance renforcée sera mise en place pendant au moins une heure puis au minimum 2 fois par jour. La surveillance portera sur des signes relatifs au bien-être et l’état général de l’animal, son comportement et son alimentation. En cas de mal-être persistant, une eau de boisson à 10% de sucrose sera fournie à l'animal pendant 24 heures, et des aliments hydratés seront déposés au fond de la cage. Le poids corporel sera également mesuré une fois par semaine. Une perte de poids excessive (>15% du poids initial avant injection STZ) et persistente pendant 3 jours consécutifs, entraine une sortie du protocole et la mise à mort de l’animal. Pour préserver la qualité de l’alimentation, les aliments sont entièrement remplacés 2 fois par semaine. Lors de la ponction de la veine caudale pour prélèvement sanguin, un gel anesthésique sera préalablement appliqué localement. Les mesures in vivo de la composition corporelle à l’aide d’un scanner (densitomètre ou microCT) seront réalisées sur les animaux sous anesthésie gazeuse, ce qui garantit une sédation rapide et un réveil rapide des animaux. Enfin, après développement d’une hyperglycémie, la litière sera changée plus fréquement (~2 fois/semaine) en raison d’un risque d’augmentation de la fréquence/volume d’urines.

Choix des espèces

La souris et particulièrement la souche C57BL6J est largement reconnue pour sa sensibilité à la prise de poids sous régime gras, et à l’action de la streptozotocine-STZ ciblant les cellules du pancréas pour induire une défcience de sécrétion d’insuline à l’origine d’hyperglycémie. La souris C57BL6J présente aussi un fond génétique largement exploité en recherche sur des modèles génétiquement modifiés des pathologies d’intérêt (maladies osseuses et métaboliques). Ainsi, l’utilisation de cette souche de souris présente un intérêt pour permettre des analyses comparatives et complémentaires des données expérimentales obtenues sur des modèles pathologiques induits par des méthodes différentes sur la même souche Des souris jeunes adultes (âgées de 6 à 7 semaines) pour pouvoir les suivre durant un protocole expérimental relativement long (16 semaines après inclusion). Le protocole s’appuie également sur des données de la littérature issues de protocoles ayant validé des modèles similaires (obèses et/ou diabétiques) avec des souris C57BL6J dont l’âge d’inclusion varie de 6 à 12 semaines.