Procédures modérées
Evaluation des nouvelles approches therapeutiques de la carcinose peritoneale ovarienne et du colon dans le modele preclinique rongeur souris
- Recherche appliquée
- Cancers
1 130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue car porteuses d'une pathologie qualifiée de létale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie, des injections répétées par plusieurs voies et une nébulisation pour tester des nanoparticules chargées de chimiothérapie contre la carcinose péritonéale. Le porteur indique des douleurs post-opératoires, un gonflement de l'abdomen et une possible perte de poids, l'imagerie servant à repérer les points limites. Il affirme que les interactions entre système immunitaire et tumeur ne peuvent être reproduites in vitro, les bénéfices étant présentés comme une amélioration attendue du traitement.
Objectifs
Ce projet vise à étudier de nouveaux traitements à base de nanoparticules pour la carcinose du péritoine. La carcinose péritonéale est une évolution fréquente de plusieurs cancers intestinaux et gynécologiques et constitue la principale cause de décès chez ces patients. Les thérapies actuelles ne permettent pas aux agents de chimiothérapie d’atteindre efficacement le péritoine. Cela entraîne une mauvaise distribution et pénétration des principes actifs dans la tumeur, générant une mauvaise réponse au traitement pouvant évoluer vers une résistance aux thérapies.
Bénéfices attendus
L'intérêt de cette approche réside dans l'amélioration du traitement et du pronostic des patients souffrant de carcinose péritonéale. Plus largement, l'utilisation de la nébulisation combinée à l'utilisation de nanoparticules pour délivrer des chimiothérapies améliorera la diffusion des médicaments dans la cavité péritonéale et augmentera la pénétration des médicaments dans les nodules tumoraux. Le bénéfice immédiat pour les patients sera la réduction de la fréquence des traitements, la réduction des effets secondaires dus à l'administration systémique des principes actifs et la détermination d’un nouveau mécanisme d’action des nanoparticules basé sur la modulation de la réponse immunitaire.
Procédures
- procédure chirurgicale - 15 min ; imagerie par bioluminescence - 2 min ; injections - >1 min (voie intraveineuse, voie intrapéritonéale, voie sous-cutanée); nebulisation 5 sec; anesthesie - max 20 min. Nombre d'injections: Si bioluminescence: 15 maximum (1 chaque dueux jours) (voie intrapéritonéale) Si tumeur: 1 (voie intrapéritonéale) Si traitment:1 (voie intrapéritonéale ou voie intraveineuse) Si analgesie: maximum 3 ( voie sous-cutanée)
Impact sur les animaux
Effets dus à la chirurgie: - doleur post-operatoire - diminution des mouvements dans la cage. Effets dus au modele tumoral: - un gonflement de l'abdomen - une éventuelle perte de poids. Effet dus à l'administration des produits: - aucun
Devenir
Tous les animaux sont mis a mort a la fin des procedures car, ils sont tous atteint d'une pathologie lethale
Remplacement
L’utilité prédictive des modèles tumoraux chez la souris ne peut pas être remplacée par des études in vitro. L'activité des cellules immunitaires liée à des tumeurs est régulée par de nombreux facteurs dont la plupart sont encore inconnus et donc impossible à reproduire in vitro. Il est très compliqué de recréer in vitro toutes les interactions entre le système immunitaire, les cellules accessoires secondaires et la tumeur car, à l'heure actuelle, toutes ces interactions ne sont pas encore totalement maitrisées. De plus, l'évaluation d'une nouvelle approche thérapeutique, comme celle décrite dans ce projet, doit tenir compte de l'effet du principe actif et de la procédure sur la santé globale de l'animal, ce qui ne peut être réalisé in vitro. Des tests in vitro ont déjà été réalisés pour évaluer la cytotoxicité des nanoparticules sur les lignées tumorales et la capacité des nanoparticules à libérer correctement le médicament et le moment de la libération.
Réduction
Le nombre d'animaux a été estimé par les biostatisticiens comme étant le minimum nécessaire pour obtenir des résultats exploitables. Cette estimation permettra d'analyser avec précision un nombre suffisant d'animaux et d'obtenir des résultats avec une marge d'erreur très faible, évitant ainsi des résultats non concluants et la nécessité de répéter l'étude pour valider les données. Le projet étant conçu par étapes successives, le nombre d'animaux calculé à chaque étape peut être réduit en fonction des résultats obtenus aux étapes précédentes : en fonction de la précision et de la reproductibilité interindividuelle de la croissance tumorale dans le temps, il sera possible de réduire le nombre d'animaux requis pour les expériences suivantes. Par ailleurs, en cas de croissance tumorale lente, il sera possible d'échelonner les séances de bioluminescence afin de réduire le nombre d'anesthésies et d'injections intrapéritonéales que les animaux devront subir.
Raffinement
Les protocoles les moins invasif et le moins douloureux possibles sont privilégies. Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d’élevage et de bien-être afin d’enrichir l’environnement des souris. Les animaux porteurs de tumeur sont suivis quotidiennement pour éviter tout souffrances inutiles, et prendre les mesures adéquate dans le cas éventuelle d’apparition de nuisances. Les animaux ayant subit une chirurgie seront monitorés plus suivant et un protocole antalgique est mis en place. L’imagerie par bioluminescence nous permet de déterminer de manière précoce l’apparition des signes de catégorie point limite et ainsi, d’intensifié le suivi des animaux lors de cette étape intermédiaire et d’agir en conséquence (Analgésique ou mise a mort). L’apparition de signe point limite conduit automatiquement a une mise à mort de l’animale concerné pour lui éviter toute souffrance inutile
Choix des espèces
Les souris utilisées sont le modèle primaire et le plus utilisé pour les études oncologiques impliquant le système immunitaire. Le mécanisme immunitaire des souris est largement décrit dans la littérature et de nombreux outils de diagnostic sont disponibles pour effectuer des analyses immunologiques par rapport à d'autres modèles comme les rats. De plus, la disponibilité de différentes lignées cellulaires tumorales murines qui imitent les tumeurs humaines permet d'utiliser des animaux immunocompétents. Les souris seront adultes, âgées de 8 à 10 semaines, car il est nécessaire que le système immunitaire soit développé et mature.
Rôle des hématopoïèses clonales de signification indéterminée dans la physiopathologie de l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
2 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever notamment le cœur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules sanguines anormales, subissent une ablation des ovaires, un régime gras et l'administration de L-NAME dans l'eau de boisson pour induire une insuffisance cardiaque, avec plusieurs prélèvements sanguins. Le porteur indique que ces procédures peuvent générer des douleurs modérées et transitoires, prévenues par analgésiques. Il affirme que la complexité de la maladie rend le recours à un organisme vivant "nécessaire", les bénéfices pour les patients restant hypothétiques.
Objectifs
Notre objectif est d’étudier le rôle des cellules sanguines anormales dans le développement de maladies du cœur appelées insuffisances cardiaques, caractérisées par l’incapacité du cœur à envoyer suffisamment de sang dans les vaisseaux. Nous rechercherons si ces cellules sanguines anormales accélèrent l’apparition ou aggravent ces insuffisances cardiaques. Nous étudierons également si ces cellules anormales peuvent remplacer certains facteurs participant à l’apparition ces insuffisances cardiaques. Nous déterminerons les propriétés des cellules sanguines qui participent au développement de ces insuffisances cardiaques et chercherons à empêcher leur action en testant des médicaments ciblant les phénomènes identifiés.
Bénéfices attendus
Les insuffisances cardiaques sont responsables de l’hospitalisation de nombreux patients chaque année en France et conduisent au décès de 70 000 personnes. Identifier les cellules sanguines anormales comme responsables de ces maladies permettrait d’identifier les patients les plus à risque et donc d’adapter leur suivi médical. Cela pourrait aussi conduire à la découverte de nouveaux mécanismes contre lesquels des médicaments plus efficaces pourraient être proposés afin d’éviter les décès et les hospitalisations dont les insuffisances cardiaques sont responsables.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - pour créer les cellules sanguines anormales : injections de cellules anormales (3 injections sont prévues sur 3 jours consécutifs,
Impact sur les animaux
Certaines des procédures employées peuvent générer des douleurs qui ne persisteront pas dans le temps et resteront modérées. Ceci sera prévenu par l’emploi de produit anesthésiants et antalgiques administré avant la procédure mise en cause et éventuellement après la procédure.
Devenir
A la fin des procédures, l’ensemble des animaux seront sacrifiés. Ceci est indispensable pour prélever les organes que nous étudierons, notamment le coeur.
Remplacement
L‘insuffisance cardiaque est une pathologie complexe mettant en jeu des interactions de divers mécanismes, dont beaucoup restent inconnus, entre de nombreux types de cellules. Etudier l’ensemble de ces acteurs et plus encore leurs interactions ne peut pas à l'heure actuelle être réalisé uniquement par des tests in vitro. Le recours à un organisme vivant proche de l’Homme, et dans lequel nous pouvons à la fois crée des cellules anormales et induire une insuffisance cardiaque (maladie du coeur) est donc nécessaire pour réaliser ce projet.
Réduction
Différentes lignées et modèles sont nécessaires à la réalisation de ce projet pour recréer les différents types de cellules anormales. D’après la littérature scientifique, le nombre d’animaux nécessaires par lot est de 40. Nous utiliserons donc 10 animaux par lot en reproduisant au maximum 5 fois les expériences (marge d’un lot dans le cas de mort prématurée d’animaux ne permettant pas l’aboutissement d’une ou plusieurs expériences). Des analyses de résultats à la fin de chaque expérience nous permettront éventuellement de réduire ce nombre.
Raffinement
L’hébergement des animaux permet de réduire le stress et l’inconfort (animalerie agrée, personnels formés, cage de 3 à 6 animaux maximum en portoir ventilé avec libre accès à l’eau et à la nourriture ainsi qu’un environnement adapté avec igloo cartonné et serpentins de papier à dérouler). Les animaux seront systématiquement anesthésiés lors des administrations intraveineuses et des prélèvements sanguins et nous utiliserons des analgésiques afin de limiter la douleur. Deux fois par semaine, nous évaluerons le bien-être des animaux afin d'identifier les points limites et d'apporter dans les plus brefs délais la mesure adaptée à l'animal.
Choix des espèces
L'utilisation de souris comme modèle d'étude dest pertinente car : - Différentes lignées de souris sont disponibles pour reproduire les cellules anormales étudiées. - Les modèles utilisés nos permettront d'identifier ces cellules anormales. - Le modèle d'induction de l’insuffisance cardiaque chez la souris est couramment utilisé. - Nous disposons du matériel et des compétences nécessaires. Des souris adultes âgées d’au moins 6 semaines au début du protocole seront utilisées. Notre objectif n'est pas d'étudier des processus développementaux mais des processus physiopathologiques. Pour être sûr de ne pas induire de phénotype confondant, les expériences de transfert adoptif de moelle ou l’induction des KO/KI de nos gènes d'intérêt seront réalisés chez des animaux d'au moins 6 semaines.
Etude du développement de l’aortite abdominale chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par dislocation cervicale après anesthésie, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Chaque animal subit une chirurgie pour poser une mini-pompe diffusant de l'angiotensine II pendant quatre semaines, puis des injections hebdomadaires d'inhibiteurs, afin d'étudier une protéine impliquée dans l'inflammation de l'aorte abdominale. Le porteur décrit surtout comme gêne la présence de la pompe et des agrafes, qu'il qualifie de non douloureuses. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet de visualiser les interactions cellulaires de la dilatation aortique, les bénéfices se limitant à une meilleure compréhension des mécanismes.
Objectifs
Nous étudions le rôle d'une protéine présente au sein des cellules composant la paroi des vaisseaux. Ces cellules jouent un rôle essentiel dans sa physiologie. Dans des conditions homéostatiques, elles présentent un phénotype contractile et expriment des protéines leur permettant de se contracter. Dans des conditions physiopathologiques (comme des dommages vasculaires) elles subissent de profonds changements et adoptent un phénotype sécrétoire et inflammatoire et sont responsables de la dégradation du vaisseau. Cela provoque des dommages vasculaires le plus souvent irréversibles et une inflammation vasculaire appelée aortite lorsqu’elle touche l’aorte. L’objectif de notre étude est donc d’explorer le rôle de la délétion de cette protéine dans les cellules de la paroi vasculaire. Pour cela nous développerons des souris transgéniques. Nous étudierons le diamètre aortique des souris ainsi obtenues. L’anévrisme de l’aorte abdominale (AAA) étant également une cause d’aortite mettant en jeu les cellules de la paroi vasculaire aortique nous soumettrons les souris mutées à un modèle expérimental d’anévrisme via l’infusion continue d’Angiotensine II. Tous les animaux inclus dans l'étude seront manipulés avec attention et soumis à une anesthésie gazeuse dès que les expériences les exposent à une souffrance ou une douleur. Ce projet nous permettra de comprendre plus précisément quels mécanismes inflammatoires sont mis en jeu au cours des maladies vasculaires notamment celles touchant l'aorte.
Bénéfices attendus
Ce projet devra nous permettre d'améliorer notre compréhension des mécanismes immuno inflammatoires rencontrés au cours de l’inflammation de l’aorte abdominale.
Procédures
Au cours de ce projet nous allons poser des mini pompes osmotiques d'angiotensine II : cette pose nécessite une chirurgie qui sera réalisée en condition stérile et sous anesthésie. La chirurgie durera 10 minutes et les animaux garderont la pompe 4 semaines. Pour éviter toute souffrance dûe à la chirurgie nous injecterons un analgésique aux animaux. La pompe ne dérange pas les souris, elles ont une alimentation et un comportement normal. Nous allons aussi injecter des inhibiteurs de populations cellulaires spécifiques. Les injections auront lieu une fois par semaine pendant 4 semaines. L'injection en elle même dure quelques secondes et se réalise dans le péritoine de l'animal. Elle n'est pas douloureuse.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux sont relatifs à la présence de la pompe en sous cutanée pendant 4 semaines. Elle n'est pas douloureuse mais peut représenter une gêne pour la souris. La présence des agraffes sur la zone d'incision peut aussi représenter une gêne pour la souris.
Devenir
A l'issue de chacune des procédure les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie par un mélange d'isoflurane à 3% dans l'oxygène 0,5ml/mn.
Remplacement
Les modèles in vivo sont une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes impliqués dans le développement des complications aortiques. En effet, il n’existe actuellement aucun modèle in vitro qui permette de visualiser les interactions cellulaires et tissulaires complexes qui se déroulent au cours de la dilatation et de l’inflammation aortique.
Réduction
Nous essaierons de tirer un maximum d'informations issues d'un seul animal en vue de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Concernant les mesures de diamètres aortiques nous les réaliserons sous échographie car cette technique non invasive et indolore permet de répéter les mesures sur le même animal sans que celui-ci ne souffre. Compte tenu de la variabilité du phénotype, les données préliminaires (Mann Whitney) nous conduisent à estimer pour chaque expérimentation des groupes d'environ 10-20 souris (par groupe expérimental) pour des analyses statistiques robustes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages respectant un nombre maximum de 5 animaux par cage. L'air, le taux d'humidité et la température sont contrôlés au sein de l'animalerie. Les animaux auront accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Les cages seront enrichies en maisonettes et en coton afin d'améliorer le bien-être animal. Le cycle jour nuit sera respecté selon un éclairage adapté. Les animaux seront changés une fois par semaine par un personnel habilité et compétent. Les expériences induisant une douleur ou un stress chez l'animal seront réalisées sous anesthésie gazeuse (isoflurane 3% induction et 2% entretien dans l'oxygène). La pose sous cutanée de mini pompes osmotiques sera précédée et suivie par l'administration d'un analgésique (Buprénorphine: se référer à la procédure 3 pour les détails). Les points limites spécifiques à chaque procédure seront respectés (se référer à la partie Procédures).
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour l'étude des maladies cardiovasculaires. De plus, c’est le seul modèle dans lequel ont été générées les lignées déficientes pour l’expression des protéines que nous souhaitons étudier. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications vasculaires dans un espace de temps raisonnable. La souris est l'espèce dont la technologie de transgénèse est la plus fiable et la mieux établie. Les portées des souris sont les plus faciles à produire. Grâce à ce modèle de souris, nous pourrons obtenir des résultats très importants et très rapidement pour notre projet ce qui ne serait pas le cas avec une autre espèce qui prendrait beaucoup plus de temps à se reproduire et où le nombre de naissance serait nettement moins important. Les animaux seront utilisés à divers âges de développement. Pour les études du diamètre aortique par échographie nous utiliserons des animaux à 8 semaines et à 20 semaines. Concernant l'injection des agents pharmacologiques nous traiterons les souris à partir de 7 semaines. De même pour l’implantation des pompes, nous utiliserons les souris de 7 à 11 semaines.
Essais précliniques de traitement de la glycogénose de type 1a par thérapie génique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
456 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du sang et du foie, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Elles subissent une biopsie de phalange dans les premiers jours de vie, une induction de la maladie, une injection de vecteur viral dans la veine de la queue puis des jeûnes courts répétés. Le porteur indique que la maladie a été induite uniquement dans le foie pour éviter des hypoglycémies sévères et potentiellement mortelles, et que des points limites déclenchent une mise à mort en cas d'hypoglycémie. Il affirme que la correction des cellules hépatiques ne peut se mesurer qu'in vivo, sur l'"organisme en entier", et renvoie l'essai clinique à un stade ultérieur.
Objectifs
La glycogénose de type 1a est une maladie génétique rare caractérisée par une incapacité de l’organisme à produire du glucose (sucre) pour maintenir la glycémie autour de 1 g/L de sang entre 2 repas. La maladie se caractérise par des hypoglycémies sévères rapidement après un repas, ainsi que par l’accumulation de glycogène, polymère de sucre, et de graisses dans le foie. Ainsi, les patients présentent des foies très gros et gras, et développent à long terme des tumeurs hépatiques. A l’exception d’un contrôle nutritionnel très strict limitant les hypoglycémies, il n’existe actuellement aucun traitement curatif. La transplantation hépatique est la seule solution lorsque le développement tumoral est trop important. La thérapie génique consiste à apporter le gène « médicament » (gène sain) dans les cellules du foie grâce à l’utilisation de vecteurs viraux injectés dans la circulation générale. Ces virus délivreront l’ADN aux cellules hôtes ciblées mais ils ne pourront pas se multiplier dans les cellules et donc provoquer une infection virale. Ces vecteurs sont déjà utilisés pour traiter d’autres maladies métaboliques du foie comme l’hémophilie chez l’homme. Des preuves de concept ont mené au développement d’un nouveau vecteur (brevet déposé) qui permet, après une seule injection chez des souris atteintes de glycogénose de type 1a, de maintenir une glycémie très similaire à celle des souris saines pendant plusieurs mois, même lors de périodes de jeûne, et de rétablir les paramètres métaboliques, en corrigeant les niveaux de glycogène et de graisses du foie. Avant de débuter la phase d’essais cliniques, l’utilisation de ces vecteurs nécessitent une phase de validation préclinique comprenant des études d’efficacité de doses chez des souris malades, des études démontrant une absence de toxicité des vecteurs utilisés, une étude immunologique, et l’assurance qualité de la production des vecteurs en grande quantité. Dans ce projet, nous testerons l’efficacité de différentes doses du vecteur candidat chez des souris atteintes de glycogénose de type 1a. Cette étude sera complétée par l’analyse de vecteurs dont la capside (enveloppe du virus) a été légèrement modifiée afin d’augmenter l’efficacité de la thérapie génique.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet devrait permettre de définir la dose optimale de vecteur viral adéquate, efficace et non toxique, pour lancer un essai de thérapie génique pour des patients atteints de glycogénose de type 1a
Procédures
Les souris atteintes de glycogénose de type Ia seront obtenues par transgenèse ce qui nécessite une biopsie de tissu (au niveau de la 1ère phalange, inférieure à 1 mm) réalisée à l’âge de 7 à 10 jours, pour vérifier la modification de leurs gènes. Ce geste est réalisé en quelques secondes. L’induction de la pathologie chez les souris transgéniques sera réalisée par un traitement injecté dans le péritoine à l’âge de 3 semaines, pendant 5 jours de suite ; les souris saines recevront le même traitement. Ce geste est réalisé en quelques secondes. Pour la thérapie génique, toutes les souris seront injectées dans la veine de la queue avec les vecteurs viraux ou une solution de sérum physiologique (souris « non traitées ») à l’âge de 10 semaines environ. Pour cela, les souris sont soumises à une contention de quelques minutes (5 minutes maximum). Avant et après traitement, une mesure du taux de sucre dans le sang (glycémie) sera réalisée, tous les mois, à partir d’une goutte de sang prélevée à l’extrémité de la queue grâce à l’utilisation d’un glucomètre (Dextro). Ce geste est réalisé en quelques secondes. Une prise de sang sera aussi réalisée en veine sub-mandibulaire. Pour cela, les souris sont soumises à une contention de 1 à 2 minutes. Au total ; les souris seront soumises à 10 interventions dont 1 biopsie, 6 injections, et 3 prélèvements de sang. En fin de procédure, les animaux seront mis à mort par une méthode respectant l’éthique animale, afin de prélever leurs organes, en particulier le foie pour analyser les taux de glycogène et de graisse.
Impact sur les animaux
Ce projet concerne une pathologie caractérisée par le développement d’hypoglycémies lors de jeûnes courts (entre les repas) et par des atteintes hépatiques menant au développement de tumeurs du foie. Sans contrôle nutritionnel strict, les hypoglycémies peuvent être fatales et mener à la mort. Les souris seront soumises à des jeûnes courts entre 2h30 et 6h, ce qui représente une période entre deux repas. Chez les souris saines, la glycémie est normalement régulée grâce à une production de glucose assurée principalement par le foie (dégradation des stocks de glycogène), mais aussi par les reins et l’intestin. Afin d’éviter la mort des animaux atteints de GSDIa et non traités, la maladie a été induite uniquement dans le foie des souris. Ceci permet de limiter les hypoglycémies au cours d’un jeûne long grâce à la production de glucose par les reins et l’intestin. Cependant, ces souris peuvent développer des hypoglycémies quelques heures (2-3h) après une prise alimentaire car elles ne peuvent pas utiliser leur stock de sucre hépatique. La connaissance du modèle animal a permis de définir des points limites, en contrôlant les risques d’hypoglycémie. Pour cela, des croquettes sont accessibles aux souris directement dans la cage pour leur éviter la perte d’énergie nécessaire pour atteindre les mangeoires. Avant la mise à jeun, une partie de leur cage est placée sur une plaque chauffante pour éviter les hypothermies. Un suivi très régulier de ces animaux est réalisé par le technicien en charge du protocole expérimental. En effet, le suivi des premiers signes d’hypoglycémie qui se caractérisent par une diminution de la mobilité, prostration, et/ou refroidissement de l’animal est réalisé très régulièrement afin de pouvoir injecter une solution de glucose en cas de mal-être ou de valeurs trop basses de sucres mesurées à l’aide du dextro à partir d’une goutte de sang. Il est à noter que les souris femelles sont plus susceptibles de développer des hypoglycémies et le contrôle de leur comportement est renforcé.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort par une méthode éthiquement autorisée pour prélèvement du sang et du foie. Des études moléculaires, histologiques et biochimiques seront réalisées afin d’évaluer la correction des cellules du foie et de déterminer les taux de glycogène et de sucre dans le foie. Le nombre de vecteur viral par cellule de foie sera aussi mesuré.
Remplacement
La validité des constructions virales peut être vérifiée par traitement de cellules en culture après mesure de l’expression du gène sain ou de la production de glucose. Cependant, l’efficacité de correction des cellules du foie ne peut pas être mesurée par une approche en culture cellulaire. En effet, les vecteurs viraux sont injectés dans la circulation générale et doivent pénétrer dans les cellules du foie après avoir traversé les vaisseaux sanguins. Notre étude nécessite donc de travailler sur l’organisme en entier afin d’évaluer le pourcentage de cellules hépatiques qui seront corrigées après injection du vecteur en veine caudale..
Réduction
Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des pathologies étudiées, des modèles animaux, et du métabolisme, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept. Afin de pouvoir faire une analyse statistique, l’étude préclinique nécessitera la comparaison de groupes de 12 souris. Les premières études de thérapie génique privilégiaient l’utilisation de souris mâles mais l’étude préclinique requiert une analyse de l’efficacité du traitement chez les mâles et les femelles puisque la pathologie touche autant les hommes que les femmes. Cependant, le nombre d’animaux a été limité à 6 souris/groupe pour l’étude préliminaire afin de sélectionner le vecteur qui permettra de mieux corriger les hépatocytes (étude préliminaire avant l’étude préclinique). L’étude préclinique sera réalisée avec le vecteur viral de référence. Elle sera complétée avec un deuxième vecteur sélectionné uniquement si l’étude préliminaire montre une efficacité de correction plus élevée après modification de la capside. Au total, ce projet réalisé sur 3 ans nécessitera l’obtention de 456 souris (mâles ou femelles) transgéniques et contrôles.
Raffinement
Afin d’éviter la mort précoce des animaux atteints de GSDIa, la pathologie a été induite uniquement dans le foie des souris ; ceci permet d’éviter les hypoglycémies sévères au cours d’un jeûne long grâce à la production de glucose par les reins et l’intestin. La connaissance des modèles animaux a permis de définir des points limites, en contrôlant les risques d’hypoglycémie et en limitant les efforts des souris pour accéder aux mangeoires. Pour cela, des croquettes sont accessibles aux souris directement dans la cage. Un suivi de glycémie sera aussi réalisé si un animal est retrouvé prostré dans une cage, et/ou ne répondant pas ou peu aux stimulations du zootechnicien. En cas d’hypoglycémie (quantité de sucre dans le sang trop faible), la souris sera systématiquement injectée avec une solution de glucose. Enfin, une partie de la cage est placée systématiquement sur une plaque chauffante afin de maintenir la température corporelle de la souris. Une crème anesthésiante sera appliquée avant la prise de sang pour la mesure de glycémie afin de réduire la douleur. Les souris seront hébergées par groupe, dans un milieu enrichi pour favoriser la nidation et le refuge des souris dans des petites huttes. L’état de bien-être sera évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques (état du pelage, mouvements/posture de la souris, prise de poids, morsures...). En cas de petites plaies causées par les souris, une crème à base de teintures mères et d’huiles essentielles aux propriétés cicatrisantes et antiseptiques sera systématiquement appliquée par les zootechniciens en charge du suivi du bien-être animal. Les souris seront mises à mort à la fin du protocole ou lors de l’atteinte d’un point limite défini dans le projet selon les méthodes autorisées par la législation.
Choix des espèces
Souris (Mus musculus) En ce qui concerne la production de glucose par l’organisme, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs, tels que le poisson, montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Les expériences seront donc réalisées avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’homme et qui reproduisent toute la pathologie hépatique observée chez les patients. Par ailleurs, le modèle de souris atteintes de glycogénose de type 1a uniquement dans le foie n'existe que chez la souris. Ce modèle a l’avantage d’être viable grâce au maintien de la production de glucose par les reins et l’intestin. Les protocoles seront réalisés chez des souris adultes âgées d’un minimum de 2 mois. L’induction de la délétion du gène G6pc1 sera réalisée chez des souris adultes âgées d’un minimum de 6 à 8 semaines. Le traitement des animaux par les vecteurs viraux sera réalisé 6 semaines après l’induction de la pathologie. La mise à mort des animaux sera effectuée 15 jours (procédure 2) ou 6 mois (procédure 3) après l’injection des vecteurs.
Evaluation d’un protocole de vaccination anti-tumorale chez la Souris et le Rat
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Rats : 120
3 860 souris et 120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever la rate et la tumeur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux reçoivent une immunisation sous la peau et, pour une partie, une implantation de cellules tumorales, le porteur les mettant à mort dès que la tumeur s'ulcère, se nécrose ou dépasse un volume fixé. Il indique tester un adjuvant à base de mélanine pour un futur vaccin contre le glioblastome, tout en affirmant que la souris est l'espèce "la plus adaptée" et que le modèle de gliome implantable n'existe que chez le rat. Les retombées cliniques sont renvoyées après sélection d'un candidat et poursuite du développement pharmaceutique.
Objectifs
Le cancer reste une maladie souvent mortelle, pour laquelle la recherche de traitements innovants est requise. L’induction d’une immunité contre un antigène cible par vaccination à l’aide d’adjuvants classiques (tels que ceux utilisés dans les vaccins anti-infectieux) permet d’obtenir facilement des anticorps circulants. Ces anticorps sont cependant peu efficaces pour lutter contre les tumeurs. L’obtention de lymphocytes T capables de tuer les cellules cancéreuses est plus difficile car les adjuvants disponibles actuellement donnent généralement des réponses faibles ne permettant pas d’induire une réponse antitumorale satisfaisante. Nous avons récemment découvert que la mélanine synthétique utilisée en tant qu’adjuvant vaccinal permettait de stimuler de façon exceptionnelle la réponse immunitaire lymphocytaire contre un antigène peptidique donné (i.e. un fragment de protéine surexprimée ou bien anormalement exprimée par les cellules cancéreuses et présenté à leur surface). Notre but est de poursuivre le développement de notre adjuvant afin d’obtenir à terme un vaccin thérapeutique pour le traitement des cancers humains, en nous concentrant plus particulièrement sur le glioblastome, la plus fréquente des tumeurs cérébrales, pour lequel il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement satisfaisant. Des peptides cibles issus de protéines exprimées dans les glioblastomes humains seront sélectionnés, puis validés par des tests in vitro. La capacité de ces peptides associés à notre adjuvant à base de mélanine à induire une réponse immunitaire et à contrôler la croissance tumorale, sera évaluée in vivo chez la Souris ou le Rat. L’étude chez l’animal est indispensable pour mesurer une réponse immunitaire par lymphocyte et la Souris constitue l’espèce la plus adaptée pour les études immunologiques. Comme il n'existe pas de modèle de gliome implantable en sous-cutané chez la Souris, les effets anti-tumoraux de nos formulations seront évalués chez le Rat, pour lesquels un tel modèle existe.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra la sélection d’un candidat vaccin pour le traitement du glioblastome, dont nous poursuivrons le développement pharmaceutique avant d’initier les essais cliniques chez l’Homme. A l'issue de ce projet nous aurons : 1- Sélectionné deux peptides-candidats issus de protéines surexprimées ou anormalement exprimées par les gliomes humains 2- Déterminé la formulation (ratio peptide/mélanine, temps de contact) permettant d'obtenir une réponse imunitaire optimale pour chacun des deux peptides 3- Réalisé les études de stabilité de notre adjuvant à base de mélanine synthétique sur 3 ans
Procédures
Les immunisations seront réalisées par injection sous la peau sur animaux anesthésiés. L’ensemble de la procédure dure environ 5 minutes. Une ou deux injections (à deux semaines d'intervalle) seront réalisées par animal. Les implantations de cellules tumorales sous la peau seront réalisées sur animaux anesthésiés. L’ensemble de la procédure dure environ 5 minutes. Une seule implantation sera effectuée par animal.
Impact sur les animaux
L’injection du vaccin est susceptible de provoquer une rougeur, un gonflement, une démangeaison ou une douleur au point d'injection, ce qui fera l'objet d'une surveillance quotidienne. Il est cependant à noter qu'aucune des expériences menées à ce jour n'a mis en évidence de tels effets indésirables. Dans les expériences impliquant l’implantation d’une tumeur sous la peau, un effet indésirable potentiel est l'apparition d'une ulcération ou d'une nécrose de la tumeur. Une surveillance quotidienne des animaux sera mise en place et il sera procédé à leur mise à mort en cas d'ulcération ou de nécrose de la tumeur ou bien dès que celle-ci atteindra un volume déterminé à l’avance et adapté à l’espèce.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chacune des procédures afin de pouvoir obtenir le matériel biologique (rate, tumeur) nécessaire à l'évaluation de la réponse immunitaire.
Remplacement
Il s’agit d’une étude qui nécessite d’être réalisée in vivo pour évaluer la réponse immunitaire et antitumorale après immunisation par voie sous-cutanée. Aucun modèle in vitro n’est en effet prédictif d’une réponse immune chez l’animal ou chez l’Homme, en raison de la complexité des mécanismes biologiques impliqués (interactions cellules présentatrices des antigènes-lymphocytes, interactions cellules immunitaires-tumeur (y compris microenvironnement tumoral)). Cependant, les corrélations entre les résultats obtenus chez l’animal et les résultats des études in vitro menées en parallèle seront évaluées en permanence dans l’objectif de remplacer le modèle in vivo par la prédiction in vitro lorsque cela sera possible.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au nombre minimum nécessaire et suffisant pour permettre l’analyse statistique des données. Les protocoles de ce projet utiliseront des modèles validés par la littérature, permettant d’obtenir des résultats reproductibles et ainsi de limiter la multiplication des expériences. De plus, les expériences sont conçues de façon à utiliser les mêmes groupes contrôles pour plusieurs préparations vaccinales ce qui permettra de limiter encore davantage le nombre d’animaux. Au total, 3980 animaux seront utilisés dans ce projet, 3860 souris et 120 rats.
Raffinement
Les expériences nécessiteront des procédures peu traumatisantes. Toutes les injections sont effectuées sous anesthésie générale. Les vaccins sont formulés de façon à être bien tolérés et à ne pas induire de douleur ou de réaction indésirable au point d’injection. Chez les animaux porteurs de tumeurs, la croissance tumorale est mesurée tous les 2 à 3 jours à l’aide d’un pied à coulisse, ce qui constitue une procédure non invasive, non douloureuse et peu perturbante pour l’animal. Les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne afin de déceler précocement des signes de souffrance et d’y mettre un terme par une mise à mort anticipée si nécessaire.
Choix des espèces
Souris : La souris est le modèle de choix pour l'étude de la réponse immunitaire. Le système immunitaire des souches utilisées dans ce projet est bien caractérisé et de nombreux outils immunologiques sont disponibles (bases de données et outils de prédiction in silico, réactifs et méthodes permettant d’étudier et de mesurer l’intensité la réponse immunitaire). Il existe un modèle de souris transgéniques dont le système immunitaire est capable de reconnaitre les antigènes tumoraux humains, que nous pourrons utiliser pour valider notre candidat vaccin avant passage aux essais cliniques chez l’Homme. Rat : Il n’existe pas de modèle de glioblastome implantable en sous-cutané chez la Souris. En revanche, il existe un modèle reconnu chez le Rat, que nous allons utiliser dans ce projet. Les animaux seront agés de 5 à 7 semaines en début d’expérimentation, ce qui permet d’utiliser des animaux jeunes adultes dotés d’un système immunitaire mature.
Production d’anticorps contre les vésicules extracellulaires des bactéries Escherichia coli.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
2 chèvres vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisées pour d'autres expérimentations ou confiées à une association d'adoption à l'issue. Chaque animal reçoit jusqu'à cinq injections intramusculaires et sept prélèvements sanguins à la jugulaire pour produire des anticorps dirigés contre des vésicules bactériennes. Le porteur indique que le protocole peut provoquer fatigue, douleur, hyperthermie et, dans un cas extrême, un choc anaphylactique. Il affirme que le recours à l'animal vivant est "indispensable" et qu'il n'existe "aucune alternative" non animale, seul un "organisme intégré et vivant" pouvant synthétiser ces anticorps.
Objectifs
Les vésicules de membranes externes (OMV) sont des vésicules formées à partir de la membrane externe des bactéries Escherichia coli. Ces vésicules font l’objet de nombreux projets de recherche dans des domaines variés (traitement anti-cancéreux, vaccinologie, ...). Le but de ce projet est de produire des anticorps dirigés contre ces vésicules (anticorps non disponibles à ce jour). Les anticorps fixés sur les vésicules pourront être marqués par fluorescence (immunomarquage) afin de pouvoir suivre le trajet des vésicules au niveau cellulaire et ainsi de comprendre le mécanisme d’action des OMV au niveau des cellules.
Bénéfices attendus
Le sérum des chèvres prélevées permettra de récupérer des anticorps dirigés contre les vésicules extra-cellulaires (OMV) de bactéries et de créer un stock d’anticorps pour les expérimentations en laboratoire ultérieurement (exemple : suivi des OMV par marquage fluorescent des anticorps dirigés contre les OMVs (immunomarquage)). Cela permettra de mieux étudier le mécanisme d’action encore méconnu de ces vésicules.
Procédures
5 injections intramusculaires maximum (durée de 5 secondes environ) à 2 semaines d’intervalle entre chaque injection, sur 2 chèvres vigiles. Et 7 prélèvements sanguins à la veine jugulaire (environ 10 secondes par prise de sang) sur 2 chèvres vigiles avec 2 semaines d’intervalle entre chaque prise de sang.
Impact sur les animaux
Le protocole est susceptible de générer un stress chez l'animal au moment des manipulations (injections et prises de sang) et une réaction inflammatoire et immunitaire attendue liée à la production d'anticorps en réponse à l'injection des OMV, qui pourrait entrainer un état de fatigue, de la douleur et de l'hyperthermie de manière transitoire, voire un choc anaphylactique (dans un cas extrême, non attendu). Ce protocole ne doit pas entrainer d'effet délétère à long terme, ni de souffrance et ne nécessite pas la mise à mort des animaux. De nombreuses validations in vitro et in cellulo ont déjà été réalisées de manière à garantir la qualité des vésicules utilisées à des fins vaccinales. De plus, l’innocuité chez l’animal a déjà été établie dans un modèle poussin.
Devenir
Les chèvres seront réformées pour d’autres expérimentations ou alors adoptées par une association spécialisée dans le placement d’animaux anciennement utilisés à des fins scientifiques.
Remplacement
L'absence d'anticorps disponibles nécessite de recourir à une production d'anticorps par immunisation contre les vésicules extracellulaires d'intérêt. Ce projet ne peut pas être réalisé in vitro. En effet, il n'existe aucune alternative non animale disponible permettant de produire des anticorps. A l'heure actuelle, tous les anticorps sont produits dans des organismes modèles (souris, rat, lapin, chèvre, âne ou singe le plus souvent). Le recours a l'animal vivant est ici indispensable car la production d'anticorps étant secondaire à une immunisation (ici consécutive à l'injection d'OMV) et mettant en jeu des mécanismes complexes et séquentiels, seul un organisme intégré et vivant est capable de synthétiser ces anticorps.
Réduction
Le nombre d’animaux minimal nécessaire pour afin de garantir la production d’anticorps est de 2 individus. En effet, une seule chèvre ne serait pas suffisante dans le cas où le système immunitaire de la chèvre ne répondrait pas à l’immunisation (pas de production d’anticorps) car il existe une variabilité de réponse immunitaire entre les animaux d’une même espèce. 2 chèvres est donc le nombre minimal nécessaire afin d’augmenter les chances de récupérer des anticorps par prélèvement sanguin sur les chèvres.
Raffinement
Les chèvres seront logées à côté d’un troupeau de chèvre (afin de répondre aux besoins sociaux intra-espèce des chèvres, car il n’existe pas de risque infectieux), en boxe intérieur sur aire paillée. Les animaux auront des abreuvoirs, du foin à volonté et une distribution de granulés quotidienne. Les densités par animal sont respectées conformément à la réglementation (directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010 relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques). Des brosses sont mises à disposition sur les murs du logement afin que les chèvres puissent se frotter contre celles-ci afin d’enrichir leur environnement. Elles auront la possibilité d’exprimer un comportement propre à leur espèce. Avant le début du protocole expérimental, les chèvres auront une longue période d’acclimatation dans leur nouvel environnement (supérieure à 1 mois).
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle chèvre car il permet de purifier une quantité importante de sérum, ce qui évitera de devoir reproduire la même expérimentation régulièrement. Par ailleurs, le modèle chèvre étant couramment utilisé pour produire des anticorps, de nombreux réactifs dirigés contre cette espèce sont disponibles dans le commerce, ce qui permettra d'utiliser les anticorps produits dans de nombreuses applications. Chèvre adulte (afin de limiter le risque d'apparition de choc anaphylactique).
Etude moléculaire et cellulaire dans un contexte physiopathologique chez la souris
- Enseignement supérieur
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, non pour produire des connaissances mais pour former des étudiants de BUT aux techniques d'expérimentation. Chaque souris reçoit quatre injections d'une neurotoxine provoquant une neurodégénérescence dopaminergique, avant une perfusion transcardiaque réalisée par l'enseignant puis le prélèvement du cerveau. Le porteur indique que le modèle s'accompagne de troubles moteurs, réduction et lenteur des déplacements, qu'il juge modérés au vu de la dose et de la durée. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle non animal capable de mimer cette neurodégénérescence et justifie le projet par la "nécessité" pédagogique de la formation.
Objectifs
Les objectifs du projet sont de permettre à nos étudiants, futurs techniciens de laboratoire de recherche, de faire l’apprentissage de la mise en place d’une procédure expérimentale dans un contexte physiopathologique sur animaux de laboratoire, et ce dans le respect de la réglementation et des lois d’éthique sur l’utilisation d’animaux vivants. Ce projet comprendra la caractérisation d'un dysfonctionnement moléculaire et cellulaire dans ce contexte physiopathologique qui est celui de la neurodégénerescence dopaminergique induite par l'administration systémique d’une neurotoxine chez la souris. Il permettra aux étudiants de maitriser certaines techniques d'études de ces dysfonctionnements cellulaires. Les méthodes choisies pour évaluer la perte neuronale seront des techniques immunologiques avec un immunomarquage sur coupes de cerveaux et un immunoblot sur extraits cérébraux.
Bénéfices attendus
Le projet proposé étant à visée pédagogique, les bénéfices attendus sont ceux de permettre l'acquisition de compétences telles que définies dans le programme du BUT-BMB. Ainsi, dans le cadre général de la réalisation d’une procédure expérimentale chez l'animal, tous les aspects allant de sa mise en place à sa validation auront été abordés lors d'enseignements dirigés avant d'être pratiquement effectués avec les étudiants (mise en pratique des techniques de contention et d'administration chez la souris - respect du bien-être animal - analyse comportementale des animaux - prélèvement de tissu). Ce projet permet aussi de sensibiliser les étudiants à la nécessité d'une recherche bibliographique pour faire un choix pertinent de modèle expérimental mimant une pathologie humaine (en mettant l'accent sur la connaissance des limites des modèles expérimentaux). Il permet aussi d'aborder les diverses techniques utilisées pour étudier un processus physiopathologique et/ou pour valider un modèle expérimental et éventuellement l'efficacité d'un traitement.
Procédures
Les substances testées seront administrées par voie intrapéritonéale de manière répétée (4 fois) à intervalle d'une heure. Cinq jours après ces administrations, les souris recevront une injection sous cutanée d'analgésique suivie 20 min plus tard d'une injection intrapéritonéale d'une solution anesthésiante afin de procéder à la perfusion transcardiaque d'une durée d'environ 10 min (réalisée par l'enseignant) de sérum physiologique puis de solution fixatrice avant le prélèvement du cerveau. Chacune des administrations intrapéritonéales et sous cutanées est d'une durée maximale de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Ce modèle expérimental de neurodégénérescence dopaminergique s'accompagne d'une réduction progressive de la motricité qui dépend de la dose de neurotoxine administrée. Les troubles moteurs sont donc les effets indésirables attendus (réduction et lenteur des déplacements). Cependant, l'importance de ces troubles devraient être modérée au regard de la dose de neurotoxine choisie et de la durée de la procédure expérimentale (5 jours). Afin de palier l'éventuel impact de ces troubles moteurs sur la prise alimentaire de la souris, des croquettes seront directement mises à disposition de l'animal dans sa cage. Une surveillance biquotidienne des animaux sera effectuée par l’enseignant pendant les 5 jours précédents la mise à mort : surveillance de l'aspect général de la souris, de sa prise alimentaire et hydrique.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure expérimentale lors de la perfusion transcardiaque réalisée par l'enseignant avant le prélèvement du cerveau. Le cerveau est l'organe cible de la neurotoxine sur lequel sera réalisé l'évaluation de la neurodégénérescence dopaminergique.
Remplacement
Le projet s’inscrivant dans le cadre d’une SAÉ (Situation d'Apprentissage et d'Évaluation) consacrée à la réalisation d’une étude moléculaire et cellulaire dans un contexte physiopathologique (SAÉ 3.BMB.02), il permet de répondre aux objectifs et problématique professionnelle de la SAÉ : « inscrire les expérimentations dans un contexte physiopathologique pour caractériser et ou proposer un modèle d’étude ». De plus, il est nécessaire d'avoir recours à des animaux car il n’existe pas de modèle expérimental non animal capable de mimer la neurodégénerescence dopaminergique.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit à son minimum tout en considérant un nombre suffisant pour permettre aux étudiants de tester chaque condition expérimentale. Ainsi, la promotion de 2° année de BUT étant divisée en 4 groupes de TP, les étudiants de chaque groupe travailleront en trinôme avec un total de 4 trinômes par groupe de TP. Chaque trinôme testera chaque condition expérimentale (au nombre de 2) sur une seule souris (condition contrôle, injections de sérum physiologique versus condition perte neuronale dopaminergique, injections de MPTP).
Raffinement
Ce protocole a été adapté pour limiter l'inconfort et le stress des animaux. Une phase d'acclimatation des animaux à leur nouvel environnement (animalerie du département Génie biologique de l'IUT) est instaurée une semaine avant la mise en oeuvre de l'expérimentation au cours de laquelle les animaux sont manipulés par le personnel technique et l'enseignant (préhension et déplacement des cages). Toutes les administrations de substances effectuées par l’étudiant sont pratiquées sous le contrôle de l’enseignant encadrant la SAÉ dans une salle de travaux pratiques du département dédiée à la réalisation de ce projet. Une formation pratique à l’administration de substances aura déjà été faite en 1° année et consolidée au début du semestre au cours duquel sera réalisée cette étude afin de rappeler les consignes de contention de la souris et d’administration par voie i.p. La perfusion transcardiaque étant techniquement plus délicate sera quant à elle réalisée par l'enseignant sous analgésie et anesthésie profonde induites par les étudiants. Une surveillance des animaux sera instaurée après administration des substances jusqu’à la mise à mort (2x par jour pendant 5 jours post-injection (troubles moteurs – troubles du comportement – contrôle de la prise alimentaire et hydrique – contrôle de l’aspect général). Cette surveillance sera effectuée par l’enseignant responsable du projet. Les souris sont placées dans des cages enrichies avec divers objets (copeaux et tunnel en carton). Enfin, les étudiants sont sensibilisés au bien être animal et à la règle des 3R depuis la 1° année de leur formation. L'ensemble du personnel (enseignants - technicien animalier) dispose d'une formation et qualification adéquate à l'expérimentation animale.
Choix des espèces
Outre le primate non-humain, la Souris est l’espèce animale la plus utilisée pour réaliser ce modèle expérimental. De plus, il s'agit plus particulièrement de la souche C57Bl/6J qui est utilisée pour induire la perte neuronale dopaminergique à l’aide de la neurotoxine MPTP. En effet, cette souche est sensible à cette neurotoxine de manière dose-dépendante, ce qui permet de contrôler l'intensité des troubles moteurs et de mimer divers stades de la pathologie humaine. De plus, une administration systémique peut être réalisée chez la Souris car la neurotoxine passe la barrière hématoencéphalique chez cette espèce alors qu'une administration intracérébrale est requise chez le Rat en raison de sa très faible biodisponibilité cérébrale (dégradation enzymatique de la substance par l'endothélium avant son passage de la barrière hématoencéphalique). Les souris utilisées sont des individus adultes qui doivent avoir atteints leur maturité cérébrale (environ 6 semaines)
Traitement de la fibrose pulmonaire par anticorps thérapeutique dans un modèle de souris humanisée.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
288 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans la trachée de la bléomycine puis des cellules bronchiques issues de patients, suivies de quatre à cinq injections et, pour certaines, de deux gavages par jour pendant treize à dix-sept jours. Le porteur indique que les instillations provoquent une gêne respiratoire, que la maladie induite peut aggraver la difficulté respiratoire en fin de protocole et que le gavage peut entraîner une inflammation de l'œsophage voire des saignements. Il conclut que l'étude ne peut se faire qu'in vivo car les réactions dépendent de l'"organisme entier" intact, l'usage clinique de l'anticorps étant renvoyé à un horizon de trois à cinq ans.
Objectifs
Ce projet est une étude pharmacologique visant à tester un anticorps thérapeutique dirigé contre une protéine humaine exprimée dans les poumons et pour le traitement de la fibrose pulmonaire dans un modèle de souris humanisées. La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) chez l'homme est caractérisée par une perte irréversible et progressive de la capacité pulmonaire due à un remodelage de l'arbre pulmonaire avec développement de tissus cicatriciels. Le pronostic de cette maladie est extrêmement limité avec une survie médiane de 2-3 ans. En dehors de la transplantation pulmonaire, aucune option thérapeutique convaincante n'est actuellement disponible. Seules certaines molécules permettent de ralentir la progression de la maladie. Le développement de médicaments pour cette maladie mortelle est donc essentiel. Dans cette maladie, la prolifération aberrante des certaines cellules appelées cellules basales bronchiques contribue au mécanisme pathologique central de la FPI. Ces cellules basales bronchiques humaines (cellules basales des voies aériennes ou cellules ABC) sont des cellules de l'arbre bronchique qui peuvent proliférer in vitro après avoir été prélevées par frottis. Des travaux préliminaires ont démontré qu’un modèle de souris humanisées de FPI peut être établi par administration de ces cellules ABC issues de patients atteints de FPI dans les poumons des souris. En revanche, l'administration de cellules ABC provenant de volontaires sains n'entraîne pas de maladie. À l'aide de ce modèle de souris humanisées de FPI, nous souhaitons tester l’efficacité d’un anticorps thérapeutique qui s’est déjà montré efficace pour le traitement d’autres pathologie du foie et des reins.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait développer une stratégie thérapeutique pour les patients qui souffrent de fibrose pulmonaire idiopathique. Cet anticorps est déjà en développement clinique pour le traitement de maladies du foie et des reins. Les résultats positifs de ce projet permettraient utilisation de cet anticorps chez les patients atteints de FPI à moyen terme (3 à 5 ans).
Procédures
Les animaux subiront le premier jour une instillation dans la trachée de bléomycine pour induire la maladie pulmonaire, et le 4ème jour de cellules bronchiques issus de patients. Cet acte est réalisé sous anesthésie générale gazeuse et dure environ 1 minute. Les animaux recevront ensuite 4 ou 5 injections sur une période de 13 à 17 jours. Ces injections sont faites sur animaux vigiles et prennent moins d’une minute à être réalisées. Certains animaux recevront un gavage oral 2 fois par jour pendant 13 à 17 jours. Le gavage oral est également réalisé en moins d’une minute et est réalisé sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les instillations dans la trachée vont engendrer une gêne respiratoire qui peut perdurer quelques heures (
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder au prélèvement des poumons.
Remplacement
Les processus réactionnels étudiés dans ce projet dépendent de l'organisme entier intact. Il s'agit d'une analyse structurelle et fonctionnelle de l'architecture pulmonaire, qui ne peut être étudiée dans son intégralité dans des cultures cellulaires. Il n’est donc pas possible de remplacer l’étude sur les animaux pour ce projet.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux inclus dans cette étude, nous n’utiliserons que des groupes pertinents nous permettant de conclure quant à l’efficacité de notre approche. Le nombre d’animaux inclus par groupe sera suffisant pour arriver à une conclusion claire. La taille des effectifs a été déterminée à priori en se basant sur les résultats d’une expérience menée par des collaborateurs et en utilisant une approche statistique préalable. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques paramétriques et/ou non paramétriques.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre de manière précoce les procédures permettant de soustraire les animaux à la souffrance si besoin. Une méthode anesthésique (isoflurane) est appliquée lors des procédures le nécessitant. Les animaux sont observés quotidiennement, et une observation scorée est réalisée 2 fois par semaine.
Choix des espèces
Le modèle de fibrose pulmonaire induite chez la souris est un des modèles les plus utilisé pour étudier cette maladie. Les souris utilisées sont immunodéficientes et ne rejettent pas les cellules humaines greffées. Ce modèle nous permet ainsi d’étudier le comportement de cellules pulmonaires (cellules basales des bronches ou cellules ABC) issues de patients atteints de maladie pulmonaire et de tester des approches thérapeutiques dans un contexte humain. Les animaux d’un âge adulte de 10-15 semaines seront utilisé, cette pathologie étant une maladie apparaissant à l’âge adulte, surtout chez les personnes de + de 50 ans.
Etude des circuits de la valence émotionnelle dans l’anxiété
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie du cerveau avec implantation de fibres optiques, puis un protocole de stress, soit un conditionnement de peur par chocs électriques, soit une limitation de litière chez le juvénile, avant des tests comportementaux d'anxiété dont le détail n'est pas précisé. Le porteur affirme que l'augmentation de l'anxiété est inhérente au "besoin" de la recherche et que la culture cellulaire ne permet pas de mesurer l'activité neuronale in vivo. Les retombées annoncées pour les patients anxieux sont renvoyées au long terme, l'objectif immédiat restant de cartographier des circuits neuronaux.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de mettre en évidence les altérations des circuits de neurones contrôlant les émotions dans des modèles de pathologie anxieuses chez la souris. Notre recherche ciblera l'identification d'altérations structurelles (anatomiques) ainsi que fonctionnelles (activité électrique). Ensuite nous utiliserons des techniques de manipulation de l'activité de circuits de neurones pour restaurer les altérations observées, avec l'objectif de restaurer des niveaux d'anxiété normaux.
Bénéfices attendus
A long terme, les connaissances générées par notre recherche permettront de pouvoir envisager des stratégies théropeutiques innovantes chez les patients atteints de troubles anxieux.
Procédures
Chirurgies: grâce à l'utilisation de coordonnées sur la boîte crânienne, des substances permettant de visualiser les cellules sont injectées dans le cerveau et des fibres de verre de moinsn d'un demi milimetre de diamètre sont ensuite implantées afin de visulaiser les cellules. Chaque souris subira une chirurgie, sous anesthésie totale, recevra des traitements analgésiques et son bien être sera surveillé quotidiennement. Les animaux subiront une procédure de stress parmi deux modèles [1] soit un conditionnement de peur chez l'adulte impliquant de légers chocs électriques, [2] soit une limitation de litière chez le juvénile. Enfin, les souris seront ensuite exposées à des tests comportementaux pour mesurer leur niveaux d'anxiété, ce qui n'induit pas de nuisances pour l'animal car ils sont habitués à la présence de l'expérimentateur/trice de façon quotidienne pendant une semaine en amont du test (handling). Les tests durent entre 5 et 20 minutes chacuns, et un seul test par jour est réalisé, sur une durée maximale de 10 jours.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont la douleur potentielle induite pas la chirurgie qui est traitée avec des analgésiques, et un niveau d'anxiété augmenté chez certains individus par les procédures de stress. Cette augmentation de l'anxiété est inhérente au besoin de la recherche de substrat biologiques des troubles anxieux dans des modèles pré-cliniques qui est l'objet de cette saisine (la souris dans notre étude).
Devenir
Nous devons réaliser des vérification histologiques sur tissu cérébral, donc euthanasier l'animal.
Remplacement
Le projet porte sur une analyse de la connectivité des neurones et de leurs propriétés de codage d’informations au cours du comportement. Par conséquent, cette procédure doit être effectuée chez des animaux vivants. Des méthodes telles que la culture cellulaire ne permettent pas la quantification des connexions neuronales ou de la mesure de l’activité en réponse à une simulation sensorielle in vivo.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude et des circuits associés. Afin de limiter le nombre d'animaux, nous réalisons plusieurs test comportementaux pour chaque individus, ce qui réduits considérablement le nombre d'animaux nécessaires. Nous réalisons également toutes nos expérience sur les mâles et les femelles afin d'éviter l'euthanasie de masse inutile des femelles.
Raffinement
Avant la mise en place du modèle d’anxiété, les animaux seront hébergés en cages collectives, afin de limiter le stress dû à l’isolement. Les cages seront également enrichies de nids en coton. Une surveillance particulière sera adressée aux animaux en période péri-opératoire. L’acte chirurgical sera effectué dans des conditions de propreté maximales. Des antibiotiques et analgésiques seront administrés en cas d’infection ou de douleur. Une partie des animaux (100) subira aussi un stress plus léger que le conditionnement de peur, qui n'implique pas de chocs électriques afin d'améliorer le BEA. Ces 100 animaux seront soumis à un protocole de stress plus léger dès leur naissance, par une limitation de litière du jour 2 au jour 12 (souris non sevrées). A l'age adulte (environ 12 semaines) les souris seront alors testées dans des tests permettant d'évaluer leur niveau d'anxiété. Cette modification de procédure nous permet de tester un modèle de modélisation de l’anxiété plus éthologique et éthique car nous n’imposerons plus de de chocs électriques aux animaux.
Choix des espèces
Les souris sont un modèle largement utilisé pour l’étude des circuits impliqués dans la peur et les troubles anxieux. Dans des projets futurs, nous ferons appel à des souris transgéniques. Dans un souci de continuité et de rigueur scientifique dans nos études, nous avons besoin d'utiliser le même modèle. De plus, la majorité des études se font sur la souris. Il est donc là aussi nécessaire de travailler sur la souris, pouvoir comparer nos résultats avec les publications actuelles. Par ailleurs, la souris est génétiquement très bien définie, offrant ainsi un large panel de choix dans les méthodes utilisables, non au niveau du laboratoire, mais au niveau mondial. Les animaux seront utilisés au stade adule, soit à partir de 10 semaines, un âge qui correspond à la maturité des circuits neuronaux des aires cérébrales ciblées. De plus, les souris adultes sont plus résistantes et récupèrent plus rapidement après la chirurgie.
Caractérisation comportementale de souris exprimant une mutation du récepteur alpha1 de l’hormone thyroïdienne dans les neurones à parvalbumine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des souris porteuses d'une mutation du récepteur de l'hormone thyroïdienne dans leurs neurones à parvalbumine, et leurs témoins, reçoivent une puce sous la peau, boivent une eau acidifiée pendant les 21 jours d'un test sur écran tactile, passent dans une arène de suivi automatisé (Live Mouse Tracker) et reçoivent un agent pro-convulsivant qui provoque des myoclonies et quelques crises cloniques et toniques. 36 souris vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur présente pourtant l'implantation sous-cutanée de la puce comme "la seule intervention" prévue. Toutes sont tuées à l'issue, et leur cerveau est prélevé après une perfusion intracardiaque de fixateur sous anesthésie.
Objectifs
L’hormone thyroïdienne est essentielle pour le bon développement du cerveau chez les mammifères. Un défaut de celle-ci au cours du développement du cerveau induit des troubles neurologiques tels que retards mentaux, défauts de concentration, épilepsie, défauts de contrôle du mouvement. Les mécanismes par lesquels l’hormone thyroïdienne agit sur le cerveau sont mal compris. Il a été montré récemment qu'un récepteur de l’hormone thyroïdienne joue un rôle majeur, notamment dans les neurones dits inhibiteurs. Parmi ces neurones inhibiteurs, une sous-population particulièrement sensible a été identifiée : des neurones qui expriment une protéine appelée parvalbumine. Chez l’homme, des pathologies telles que l’autisme, l’épilepsie et la schizophrénie sont associés à un déficit de neurones à parvalbumine. De plus, chez la souris, l’invalidation du gène de la parvalbumine induit des altérations du comportement qui évoquent les troubles du spectre autistique. L’objectif de ce projet est d’évaluer si le blocage de l'hormone thyroïdienne uniquement dans les neurones à parvalbumine induit des modifications de comportement chez la souris. Nous faisons l’hypothèse que ces souris pourraient présenter des altérations modérées de leur comportement, potentiellement en lien avec les troubles autistiques.
Bénéfices attendus
L'étude du rôle de l’hormone thyroïdienne dans les neurones à parvalbumine permettra de mieux comprendre le développement du cerveau chez les mammifères. Plus précisément, les résultats de ce travail contribueront à mieux comprendre ce qui se passe chez les patients atteints de pathologies affectant cette hormone thyroïdienne. Plus largement, comme les neurones à parvalbumine jouent un rôle majeur de coordination de l’activité dans le cerveau, les résultats de cette étude devraient améliorer notre connaissance de l’origine de plusieurs maladies neurologiques, dont l’autisme.
Procédures
Une implantation sous-cutanée d'une puce constituera la seule intervention que subiront les animaux. Elle se fera sous anesthésie et avec une couverture antalgique durant une durée de 30 minutes maximum. Les animaux consommeront de l'eau acidifiée pendant le test Touch Screen (21 jours). Une injection d'un produit pro-convulsivant: durée moins d'une minute. Une injection de produits anesthésiques: durée moins d'une minute
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les animaux subiront une implantation d'une puce, permettant l'identification par radiofréquence, en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse. Lors des périodes d'analyse du test Live Mouse Tracker, ils seront simplement transférés dans une arène de 50 cm de côté qui disposera de sciure, boisson et aliment qu'ils pourront explorer. Pour le test du Touchscreen, l'eau des biberons des cages d'élevage sera acidifiée pendant les jours de test (21 jours). Suite à l’injection d'un agent pro-convulsivant par voie intrapéritonéale, les animaux présenteront des myoclonies (contractions rapides et brutales des muscles) et peu de crises cloniques (spasmes rythmés) et toniques (augmentation accrue du tonus musculaire ou raideur). Enfin, les animaux seront anesthésiés avec un mélange d'anesthésiques avant d’être perfusés par voie intracardiaque avec une solution tampon et un fixateur de tissus afin de préléver leurs cerveaux pour réaliser des analyses histologiques.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux afin de réaliser des analyses histologiques.
Remplacement
L'objectif de ce projet étant d'étudier le rôle de l'hormone thyroïdienne dans le dévelopement du cerveau, il est nécessaire de travailler sur un organisme entier, car il est actuellement impossible de reproduire in vitro le développement du cerveau. A cet égard la souris est un modèle pertinent, car elle présente une organisation du système nerveux proche de celle de l'Homme. Des études in vitro sont réalisées en parallèle, notamment pour aborder les aspects moléculaires de l'hormone thyroïdienne.
Réduction
D’après notre expérience, les paramètres comportementaux présentent en général une grande variabilité interindividuelle, il est nécessaire de prévoir 12 souris par groupe pour pouvoir conclure statistiquement. En fonction de la répartition des données nous utiliserons des tests paramétriques ou non paramétriques pour mettre en évidence des différences significatives dans les résultats des tests comportementaux entre les groupes expérimentaux (mutants vs contrôles). A l’issue de l’étude comportementale, nous avons prévu de prélever les cerveaux de 6 souris de chaque groupe, de façon à disposer de matériel biologique qui permettra de prolonger l’étude par une exploration histologique, si les tests comportementaux révèlent des différences entre souris exprimant la mutation et souris témoins. Cela évitera de générer une nouvelle cohorte de souris pour l’histologie, le cas échéant. Le nombre de 6 par groupe est suffisant pour conclure statistiquement sur les paramètres histologiques.
Raffinement
Afin de réduire l'inconfort et le stress des animaux, la durée minimale sera appliquée pour chaque test. Des phases de récupérations entre les différents tests seront prévues. De plus, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Ils subiront la pose d'une puce sous-cutanée sous anesthésie et avec une couverture antalgique suite à laquelle une attention particulière sera effectuée afin de vérifier la bonne cicatrisation. Nous utiliserons du gel ophtalmique hydratant durant les implantations pour éviter un dessèchement oculaire. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C), qui permettra un retour progressif de la température corporelle de l'animal. Un antiseptique local par spray pourra être administré si besoin. Nous avons défini des points limites éthiques dans le cadre de la procédure expérimentale. Chaque animal sera ainsi suivi avant les expériences afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt avant l’expérimentation voire l’euthanasie de l’animal.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour étudier le rôle de l'hormone thyroïdienne dans l'organisme car elle joue un rôle similaire chez la souris et chez l'homme. De plus, c'est actuellement la seule espèce chez laquelle existent différentes lignées premettant de bloquer cette hormone dans un type cellulaire choisi. Cette étude comportementale sera réalisée sur des souris adultes, âgées de 16 à 20 semaines au début des tests, de façon à ce que le développement du cerveau soit terminé au début de l’étude.
Rôle du microbiote intestinal dans les infections expérimentales à Cryptosporidium en modèle souris.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Pour savoir si le microbiote intestinal participe à la réponse immunitaire contre le parasite Cryptosporidium, 1 800 souris, dont des souriceaux infectés à trois jours de vie, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent le parasite par la bouche, sous contention, certaines après un traitement antibiotique, certaines issues de lignées génétiquement modifiées porteuses d'une déficience de l'immunité, et aucune médication ne leur est donnée pour ne pas fausser les mesures immunologiques. Le porteur met 20 à 30 % de souris en plus à la reproduction parce que le stress de certaines lignées "favorise le cannibalisme", et admet que l'association de l'antibiotique, de l'infection et de la déficience génétique peut "altérer l'état général". Les souris sont mises à mort pour prélever leurs tissus, plus tôt si un souriceau reste écarté du nid par sa mère plus d'une heure, ou si une souris adulte reste prostrée, le poil ébouriffé, plus de 24 heures.
Objectifs
La cryptosporidiose est une maladie parasitaire intestinale responsable de diarrhée chez l’Homme et les animaux. Le but de ce projet est de déterminer si le microbiote intestinal participe ou non à la mise en place de la réponse immunitaire protectrice par l’hôte. Cette réponse immunitaire protectrice sera étudiée en utilisant notamment des souris génétiquement modifiées pour des éléments de la réponse immunitaire.
Bénéfices attendus
Ce projet répond tout d’abord à des questions fondammentales de la compréhension des mécanismes immunitaires protecteurs contre Cryptosporidium avec plus particulièrement dans ce projet, l’étude de l’implication du microbiote intestinal dans cette réponse immunitaire protectrice. A terme, mieux comprendre les interactions entre l’hote, le pathogène et le microbiote aidera à développer les meilleures stratégies de contrôle contre le parasite.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à une administration orale du parasite, sous contention. Chaque animal recevra une administration unique. Cette intervention durera une dizaine de secondes.
Impact sur les animaux
Les données du laboratoire obtenues dans la cadre du projet antérieur permettent de dire que, sur des souris non génétiquement modifiées (souriceaux ou adultes), il n’est pas attendu d’effets indésirables lors du traitement avec les antibiotiques. Toutefois, il se peut que la conjonction des traitements : antibiotique, infection et déficience génétique puisse altérer l’état général de l‘animal. Deux visites quotidiennes sont réalisées dans la salle expérimentale où sont hébergées les souris. Il faudra veiller à ce que les souriceaux ne soient pas mis à l’écart par la mère de façon prolongée. Si les souriceaux sont écartés du nid pendant plus d’une heure ce qui révèlerait un refus de la mère de les alimenter, le point limite sera atteint et ils seront euthanasiés. Pour les souris adultes, il faudra surveiller qu’elles ne soient pas prostrées avec le poil ébouriffé et qu’elles s’aliment. Si la souris est prostrée avec le poil ébouriffé, à l’écart et que cela perdure plus de 24h, le point limite sera atteint, elle sera euthanasiée. De plus, si les animaux se blessent ou présentent une malformation, ils sont euthanasiés.
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique.
Remplacement
L’étude de l’immunité protectrice dans un contexte infectieux ne peut être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires et de la présence du microbiote intestinal.
Réduction
Le plan expérimental (nombre d’animaux par lot, nombre de lots expérimentaux, répétition des expérimentations) a été établi de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de l’exploitabilité et de la significativité des résultats. Toutefois, malgré l’enrichissement, l’état de stress qui caractérise certaines lignées de souris favorise le cannibalisme, c’est pourquoi plus d’animaux sont mis en reproduction (20 à 30% de plus). Du point de vue statistique, nous utilisons des tests non paramétriques adaptés pour les petits échantillons mais 6 animaux par lots au minimum sont requis. Les animaux surnuméraires sont toujours utilisés et peuvent être introduits dans un autre protocole. Pour analyser les données, nous utiliserons des modèles statistiques mixtes qui tiennent compte à la fois des facteurs à effet fixe (exemples : infection ou déficience génétique de l’animal ou traitement antibiotique) et des facteurs à effet aléatoire (répétition des expériences). D'après nos expérimentations précédentes et dans ces conditions, ces effectifs et répétitions sont suffisants pour conclure du point de vue significatif ET biologique sur nos données. Pour les souriceaux uniquement, deux animaux supplémentaires sont ajoutés dans chaque lot car de la mortalité est parfois observée dans les portées (très jeunes animaux, indépendamment de l’infection ou d’un traitement). Nous travaillerons donc avec 8 animaux par lot pour les souriceaux et 6 animaux par lot pour les souris adultes.
Raffinement
Les souris sont hébergées en animalerie A2 en atmosphère contrôlée, à raison de 5 souris maximum lorsqu’elles sont adultes, dans un environnement enrichi (refuge en polycarbonate, feuilles de papier absorbant, copaux, morceau de bois) ou 1 mère avec sa portée par cage, dans un environnement enrichi (papier absorbant qui diminue le cannibalisme des souris à la mise-bas, sizzle-nest, bâtonnets de coton, morceau de bois). Toute médication est proscrite pour ne pas interférer avec les paramètres immunologiques étudiés. Cependant les animaux sont suivis tous les jours (enrichissement social) afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites durant tout le protocole et de limiter la douleur induite : souriceaux mis à l’écart par la mère, qui ne grossissent pas ou dont le pelage ne se développe pas (lié au retard de croissance) ; souris amaigries, prostrées et avec le poil ébouriffé. Nous prenons encore plus de précautions (bruit) lors des visites lorsqu’il s’agit d’expérimentations avec les femelles gestantes et les premiers jours suivant la mise-bas.
Choix des espèces
Le modèle souris est utilisé en tant que modèle expérimental pour étudier la cryptosporidiose. Le souriceau est représentatif de l’infection chez les jeunes ruminants. Dans les élevages, les jeunes ruminants se contaminent rapidement dès la naissance et éliminent le parasite en 3 semaines environ. Le souriceau inoculé avec le parasite entre 3 et 7 jours de vie élimine le parasite comme le jeune ruminant en 3 semaines environ. La souris adulte immunodéficiente, notamment lorsqu’elle est génétiquement modifiée pour un gène de l’immunité, est également très utilisée comme modèle mimant l’infection chez l’homme puisque l’homme immunodéficient (greffe, immunosupression, infection HIV) est également très sensible à l’infection. Dans la présente demande, l’utilisation de souris (souriceaux, souris adultes) nous permettra de décortiquer très précisément les mécanismes de protection. Les souriceaux sont inoculés par le parasite lorsqu’ils auront 3 jours (modèle publié et validé scientifiquement de la cryptosporidiose des nouveau-nés). Les souris adultes entreront en expérimentation entre 7-12 semaines d’âge.
Codage synaptique de l’entrée sensorielle dans le cortex insulaire postérieur
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 942 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de 30 à 60 minutes pour une injection de virus dans le cerveau, certaines dès l'âge de trois semaines, puis la pose d'une fenêtre crânienne d'une à deux heures, pour l'imagerie de l'activité du cortex insulaire postérieur, une région impliquée notamment dans le traitement du goût. Le porteur annonce aussi des "tests comportementaux spécifiques" sans les nommer, et les bénéfices se limitent à des "notions fondamentales" que l'équipe espère acquérir. Les souris qui ne sont pas tuées sur place pour des études d'électrophysiologie partent dans un autre établissement utilisateur, où elles sont utilisées puis tuées elles aussi.
Objectifs
L'objectif principal du projet est de déterminer les propriétés des circuits neuronaux du cortex insulaire postérieur (CIP) et les mécanismes par lesquels ces circuits traitent les informations sensorielles. En effet le cortex insulaire est impliqué dans une grande variété de fonctions, notamment l'interoception, les états émotionnels et, dans sa partie postérieure, le traitement sensoriel du goût, du toucher, du son et de la température. Nos connaissances sur les propriétés des circuits neuronaux du CIP et sur sa connectivité fonctionnelle dans des conditions physiologiques et pathologiques sont très limitées. Il a été postulé que la plasticité à court terme est un facteur clé dans le façonnement du traitement sensoriel, permettant par exemple de distinguer des stimuli de nature similaire. Cependant, cette hypothèse n'a pas encore été testée directement. Nous utiliserons une approche multidisciplinaire allant du traçage anatomique et fonctionnel in vitro à l'imagerie fonctionnelle in vivo et enfin nous évaluerons la pertinence de nos résultats avec des tests comportementaux spécifiques. Nous activerons ou inactiverons des voies spécifiques et testerons les conséquences sur la fonction des circuits et le traitement sensoriel. Nous modifierons, au niveau d'une synapse spécifique, la plasticité à court terme en éliminant ou en surexprimant des protéines clés impliquées dans la transmission synaptique et nous testerons les conséquences sur la fonction du circuit, le traitement sensoriel et le comportement.
Bénéfices attendus
Nous espérons identifier les principales projections sous-corticales vers le CIP et comprendre le circuit synaptique par lequel les informations sensorielles sont intégrées dans le CIP. Grâce à l'approche expérimentale impartiale conçue ici, nous espérons acquérir des notions fondamentales sur l'anatomie et la fonction du circuit sous-cortical-cortical impliqué dans le traitement sensoriel gustatif. Dans une perspective plus large, cela ouvrira la voie à une meilleure compréhension de la physiologie du CI, une région proposée pour orchestrer les entrées sensorielles, cognitives et émotionnelles.
Procédures
- 1 procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 30 et 60 min - 1 procédure chirurgicale avec implantation fenêtre cranienne : entre 1 et 2H
Impact sur les animaux
Ces animaux sont soumis à des procédures dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Des nuisances ou effets indésirables potentiels sont ceux associés à la chirurgie bien que toutes les précautions soient prises pour être dans des conditions d’asepsie et pour réduire au maximum ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse (anesthésie, analgésie, anti-inflammatoire, suivi post-opératoire, raffinement des conditions d’hébergement ...)
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour des études électrophysiologiques ou alors ils seront utlisés dans un autre établissement utilisateur où ils seront euthanasiés également.
Remplacement
La souris est une espèce de choix pour étudier le système nerveux central des vertébrés, qui fournit des informations largement transférables à l'homme. Ce projet vise à comprendre les mécanismes qui sous-tendent le rôle des propriétés et des plasticités synaptiques dans le traitement sensoriel dans le CIP chez des animaux au comportement éveillé. Par conséquent, aucun des modèles in vitro ou in silico ne peut être utilisé ici.
Réduction
La solidité de nos hypothèses de travail vérifiées par nos études précédentes, le caractère innovant des méthodes utilisées (imagerie chronique), ainsi que la qualité de la mise en œuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l'expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre d'animaux. Nous utiliserons des tests statistiques appariés (t-test apparié pour des données paramétriques ou le test de Wilcoxon pour des données non parametrique).
Raffinement
Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet : logement sur des racks ventilés, dans des cages adaptées, enrichissement de l'environnement et points limites adaptés pour éliminer ou réduire toute douleur. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L'expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du néocortex de la souris présentent de nombreuses similitudes avec le néocortex d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les injections de virus seront effectuées sur des animaux âgés de 3 semaines à 6 mois. Comme la taille du cerveau varie entre 3 semaines et 6 mois, les coordonnées stéréotaxiques seront ajustées en conséquence.Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.au laboratoire. L'expérimentateur a une forte expérience de pour toutes les procédures proposées.