Procédures modérées

279 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur lèse un muscle de la patte arrière par injection d'une toxine, puis on leur injecte des cellules immunitaires génétiquement modifiées par voie intramusculaire ou dans la veine de la queue. Le porteur cherche à mettre au point une stratégie pour délivrer des molécules thérapeutiques aux muscles dans les maladies musculaires. La mise à mort sert des analyses des tissus, et le porteur précise que tout animal tué peut fournir des prélèvements à d'autres projets de l'équipe.

Objectifs

Un obstacle majeur au développement de thérapies musculaires est de parvenir à délivrer les molécules thérapeutiques aux muscles, qui sont répartis dans tout l'organisme et représentent plus de 40% de la masse totale chez l’adulte. Ce projet vise à développer une nouvelle stratégie de délivrance aux muscles, basée sur l'utilisation de cellules sanguines génétiquement modifiées. La plupart des maladies musculaires provoquent une dégénérescence des fibres, entraînent un recrutement naturel de cellules immunitaires du sang aux sites de régénération, le muscle étant très irrigué. En modifiant ces cellules immunitaires pour les rendre capable de reconnaître les sites de régénération et de fusionner avec les cellules musculaires, nous cherchons à générer un outil qui puisse cibler le muscle blessé, fusionner avec les fibres nouvellement formées et délivrer des molécules d'intérêt thérapeutique. Les cellules immunitaires utilisées dans ce projet sont des cellules T (lymphocytes) génétiquement modifiées par des virus, afin d'exprimer des molécules de reconnaissance musculaire et des protéines de fusion à leur surface. Des essais de fusion de ces cellules sanguines à des cellules musculaires ont déjà été réalisés dans l’équipe apportant une preuve de principe pour cette stratégie in vitro. Nous sommes prêts à étendre notre étude in vivo, par l'utilisation d’un modèle animal capable de reproduire cet obstacle de délivrance présent chez l'homme. La souris représente un modèle optimal pour ces approches, avec la possibilité d’utiliser des protocoles établis pour la délivrance de cellules par voie intraveineuse, et la possibilité de mimer les phénomènes de réparation des muscles. Les lymphocytes T génétiquement modifiés seront administrés à des souris immunodéficientes, dont le muscle a été lésé par une injection de toxine, induisant un contexte de régénération et d’inflammation aigu. L’objectif du projet est donc d’utiliser les cellules T comme cargo pour véhiculer des molécules thérapeutiques aux muscles en régénération via la circulation sanguine. Les objectifs sont donc multiples : s’assurer qu’après manipulation génétique, les cellules T thérapeutiques fusionnent aux muscles dans un contexte systémique d’organisme vivant, qu’elles peuvent être recrutées aux sites de régénération et qu’une combinaison de ces deux propriétés permette d’avoir un système de transport de molécules thérapeutiques efficace.

Bénéfices attendus

Ce projet totalement novateur permettrait de prouver la fusion de cellules immunitaires sanguines aux cellules musculaires in vivo et ainsi de mettre en avant l’utilisation de ces cellules sanguines comme outils thérapeutiques dans le combat contre les myopathies ; notamment la myopathie de Duchenne, très étudiée aujourd’hui, pour laquelle pourtant les alternatives thérapeutiques font défaut. Si cette stratégie fonctionne, des systèmes de réparation des mutations génétiques causant la maladie sont en train de faire leurs preuves sur le marché, leur expression par nos cellules immunitaires thérapeutiques pourrait être une avancée majeure dans le domaine. De plus, l’étude de la régénération des muscles dans ce modèle spécifique de souris immunodéficientes n’a jamais été réalisée et elle permettra d’enrichir la littérature.

Procédures

La première intervention commune à tous les animaux sera la lésion musculaire (d’un muscle de la patte arrière), par injection intramusculaire d'une toxine, qui peut occasionnellement entrainer une diminution de la mobilité des souris pendant les heures qui suivent. Cette injection sera unique pour chaque patte de l’animal, le temps d’injection par patte est de 30 secondes, l’anesthésie pour cette procédure est au maximum de 10 minutes par animal et se fait par isoflurane (transitoire par les voies respiratoires). Les animaux subiront également des injections de cellules immunitaires. Certains en intramusculaire, la procédure est la même que pour la lésion. D’autres en intraveineux, qui correspond à une injection unique de cellule dans la veine de la queue, sous anesthésie toujours par les voies respiratoires. L’injection dans la veine dure 1 minute par injection et les animaux seront anesthésié au maximum 10 minutes. Les souris recevront aussi une injection d’analgésique pour éviter les douleurs liées aux injections intra-musculaires et intra-veineuses, en sous-cutanée, au maximum 2 fois (une fois lors de la lésion et une fois lors de l’injection de cellules, si les deux injections sont à des temps différents). Les souris soumises à de l’imagerie in vivo pourront y être soumises tous les 3 jours (injection de réactif, en sous-cutanée, puis anesthésie, par les voies respiratoires pendant maximum 10 minutes le temps de la prise d’image) pendant au maximum 14 jours. Les animaux vont être transportés dans leurs cages d'habitat avant chaque lecture de bioluminescence (dans le même bâtiment), le transport (aller ou retour) dure au maximum 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux de ce projet vont subir des interventions non chirurgicales et les seuls actes effectués seront des injections sous-cutanées et intra-musculaires. L’injection intra-musculaire de cardiotoxine pour léser le muscle porte un risque spécifique et une attention particulière sera portée sur la capacité motrice des souris (même si les animaux présentent une régénération spontanée et totale des muscles après cette technique et qu’elle ne doit en théorie pas les empêcher de marcher, même directement après lésion). L’inconfort lié à la piqûre sera évitée car sous anesthésie et la douleur au réveil sera prise en charge par des analgésiques préventifs. Les injections de cellules intra-musculaire ou intraveineuses (prolifération non contrôlées in vivo) seront à surveiller pour toute apparition de masse dans la patte, l’inconfort et la douleur seront pris en charge de la même manière que lors de la lésion musculaire. Les effets indésirables attendus pour les injections sous-cutanées sont l’inconfort lié à la sensation de piqûre. Les animaux vont aussi être soumis à des inhalations d’isoflurane (anesthésique) plusieurs fois au cours des expériences, une bonne et rapide récupération de l’anesthésie (réveil) est à surveiller. Les animaux vont aussi devoir être transportés (dans le même bâtiment) avant toute imagerie de bioluminescence. L’accès à l’eau et la nourriture ainsi que leurs habitats ou le groupe dans la cage resteront inchangés.

Devenir

A l’issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour analyse des tissus. En effet, même dans le cas où les images de bioluminescence donnent des résultats positifs, des analyses histologiques des tissus (coupes musculaires) seront effectuées afin de comprendre plus en détail (de façon microscopique) le fonctionnement des phénomènes que l’on voit apparaître tels que la localisation des cellules injectées ou leur fusion aux muscles, ou tout simplement attesté d'une bonne régénération du muscle.

Remplacement

Ce projet vise à tester la capacité de fusion de cellules T modifiées avec les fibres musculaires, suite à leur administration systémique dans la circulation sanguine. Après une preuve de concept de la fusion des deux types cellulaires (sanguine et musculaire) in vitro, il n’existe actuellement aucun moyen de continuer ce projet pour une étude dans un contexte systémique autrement que dans un système animal complet. L’organisme de la souris pourra permettre de comprendre l’influence du micro-environnement de la lésion musculaire et l’implication des cellules en périphérie des muscles sur notre modèle thérapeutique.

Réduction

Ce projet a été pensé avec un nombre d’animaux minimum pour avoir un effet statistiquement significatif. Un effort de réduction des animaux est amené par l'utilisation de l'imagerie de bioluminescence in vivo : cela permet de suivre la progression de l'expérience à différents points de temps sans mettre à mort l’animal. De plus tout animal mis à mort peut être utilisé pour obtenir des prélèvements nécessaires à d’autres projets de l’équipe (notamment extraction de cellules T pour test in vitro sur ce projet). Lorsque cela est possible, les muscles des deux pattes seront injectés afin réduire le nombre d’animaux en conservant une puissance statistique qui nous permettra de conclure sur l’expérience. Finalement, le projet est découpé en multiples procédures qui vont nous permettre de comprendre le comportement des cellules injectées dans l’animal et d’ajuster certains paramètres avant l’expérience d’intérêt thérapeutique, ce projet ne représente alors pas seulement la recherche d'un résultat mais la compréhension de processus encore non décrits dans la littératures.

Raffinement

Dans un esprit de raffinement du projet, les protocoles choisis en priorité sont ceux qui limitent la douleur et l’inconfort de l’animal. Des analgésiques et des anesthésiques sont combinés pour réduire au maximum la douleur et le stress de l’animal lors des procédures de type lésion musculaire et injection de cellules. Les animaux sont surveillés quotidiennement dans les trois jours qui suivent l’injection de cardiotoxine ou de cellules notamment afin de s’assurer de la mobilité des animaux dans les cages. Une grille d’évaluation clinique est mise en place, basée sur le comportement (prostration, aggressivité), l’aspect physique (aspect du poil, prise ou perte de poids) et la physiologie de l’animal (de plis cutanés, signes de déshydrations, de diarrhées). Le niveau d'analgésique (de pallier 1, 2 ou 3) est adapté selon le score total. Un score supérieur à 8 sans effet des analgésiques de pallier 3 constitue un point limite de mise à mort de l’animal. Le raffinement des animaux passe aussi par l’enrichissement de leur habitat spécifique à leur génotype dommageable immuno-déficient comme des aliments et des éléments de jeu irradiés et des manipulations en milieu stérile.

Choix des espèces

La souris est couramment utilisée dans le domaine de l’immuno-oncologie (cellules CAR T) et les protocoles associés à cette technique sont hautement normalisés. De plus, le modèle de lésion aiguë à la cardiotoxine est vastement utilisé et la régénération spontanée et rapide des muscles de souris ce qui en fait un candidat très intéressant pour notre étude. Le modèle murin sert aussi couramment de modèle de dystrophie musculaire dans des études précliniques ce qui valide notre approche pour une potentielle étude dans un contexte de lésion chronique des muscles, voire, dans le cadre d’une application thérapeutique chez les patients. Le projet concerne des animaux adultes étant donné que le muscle termine sa croissance aux alentours de 5 semaines. Les animaux sont utilisés préférentiellement entre 7 et 12 semaines. Cependant, afin de réduire le nombre d'animaux pour former des cohortes, les souris peuvent être utilisées jusqu'à l'âge de 5 mois.

1 888 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit une fibrose du foie par des injections deux fois par semaine pendant quatre à douze semaines ou par un régime gras, puis certaines subissent sous anesthésie une coupure de la queue ou une lésion du foie au laser après ouverture du ventre pour provoquer un saignement observé au microscope. Le porteur étudie le rôle de la coagulation dans la cirrhose et les saignements associés, sur des mécanismes qu'il décrit comme mal connus. La mise à mort est justifiée par le prélèvement d'organes et de grands volumes de sang.

Objectifs

La fibrose hépatique est une cicatrisation anormale du foie en réponse à des agressions répétées (infection par un virus, consommation excessive d'alcool, consommation excessive d'aliments gras ou sucrés (maladie du foie gras). La maladie du foie gras est la première cause de maladie du foie dans le monde, affectant 25% de la population mondiale, et est caractérisée par une accumulation de graisses dans le foie puis l'apparition d'une inflammation et à terme d'une fibrose. La fibrose du foie peut progresser vers la cirrhose qui est une maladie grave responsable de 150000 décès par an en Europe. Les mécanismes de la fibrose du foie sont incomplètement compris et il n'existe à ce jour aucun traitement approuvé. La coagulation est une cascade de réaction aboutissant à la formation d'un caillot qui va permettre d’arrêter un saignement. Le foie joue un rôle central dans la coagulation car il synthétise les facteurs qui servent à coaguler. En cas de cirrhose, la production de ces facteurs est perturbée ce qui peut favoriser les saignements, notamment après une biopsie. Mieux comprendre les mécanismes qui perturbent la coagulation au cours de la cirrhose permettrait de mieux prévenir les saignements. De plus, la coagulation favorise également le développement de la fibrose du foie, ce qui en fait une cible thérapeutique potentielle. Nous étudions une protéine enzymatique qui inhibe la coagulation et favorise donc les saignements. Elle est produite par les plaquettes, les cellules immunitaires et les cellules endothéliales, et sa concentration est augmentée dans le sang des patients qui ont une cirrhose. Cette protéine enzymatique protége du développement de la fibrose pulmonaire mais son rôle dans le développement de la fibrose du foie est inconnu. Les deux objectifs du projet sont de comprendre le rôle de cette protéine enzymatique dans le développement de la fibrose du foie (en général et dans la maladie du foie gras) et son rôle dans la coagulation et les saignements survenant au cours de la cirrhose.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont nombreux 1) En déterminant les mécanismes de développement de la cirrhose et fibrose du foie, nous allons potentiellement trouver de nouvelles pistes pour développer des traitements de ces maladies chez les personnes avec un foie gras mais aussi chez les personnes qui ont de la fibrose liée à un virus ou à une consommation excessive d'alcool. 2) En étudiant la coagulation de la cirrhose, nous comprendrons mieux les mécanismes complexes qui entrainent une coagulation anormale chez les patients atteints de cirrhose. Nous allons voir si bloquer une protéine de la coagulation permet de diminuer les saignements sur des modèles de souris. Si c'est efficace, cela pourrait devenir un traitement préventif des saignements qui surviennent chez les patients qui ont une cirrhose après une biopsie et cela éviterait d'avoir à transfuser les patients dans un contexte actuel où on manque de poches de sang.

Procédures

La demande d’autorisation de projet concerne les procédures suivantes Sur animal vigile : - Injections dans le ventre d'un produit deux fois par semaines pendant 4 à 12 semaines pour développer de la fibrose au niveau du foie - Mise sous régime riche en matières grasses pour créer une maladie du foie gras pendant 4 à 12 semaines. Sur animal anesthésié: - Injection dans une veine de la queue d’un anticorps (molécule qui bloque la coagulation) pour stopper les saignements sous anesthésie - Coupure de la queue pour induire un saignement sous anesthésie - Lésion avec un laser du foie après ouverture du ventre pour induire un saignement et observation des cellules qui aident à arrêter le saignement à l'aide d'un microscope sur la souris encore vivante sous anesthésie - Prélèvement de sang dans une veine du ventre puis euthanasie sous anesthésie et prélèvements des organes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont - Une perte de poids initiale puis une stabilisation du poids chez les souris traitées pour induire une cirrhose - Pour les souris qui ont un régime riche en graisses, une prise de poids modérée est attendue - Des douleurs temporaires au moment de l'injection de produit dans le ventre - Possible stress les premiers jours des injections dans le ventre lié à la nouveauté de la procédure qui devrait s’estomper avec le temps - Les procédures pouvant induire des douleurs ou un stress telles que le prélèvement dans la veine du ventre, l’injection de produit dans la queue, la coupure de la queue pour induire un saignement ou les lésions du foie induites par un laser - La fibrose du foie et la cirrhose sont des maladies indolores qui n'entraînent pas d'altération du bien être animal.

Devenir

Les souris seront toutes euthanasiées à l'issue des procédures sous anesthésie car elles ne pourront pas être maintenues en vie (car on aura prélevé plusieurs organes vitaux ou prélevé une trop grande quantité de sang).

Remplacement

La coagulation et le développement de la fibrose du foie étant des processus complexes, il n’est actuellement pas possible de remplacer totalement le modèle animal par des modèles informatiques ou des modèles de cellules en laboratoire. Néanmoins, pour limiter l'utilisation de trop de souris, nous réaliserons certains tests pour étudier la coagulation sur du sang prélevé sur des malades quand cela est possible.

Réduction

Nous avons réduit le nombre d'animaux au strict minimum afin d'être en mesure d'obtenir des résultats interprétables. Nous avons utilisé des tests statistiques pour déterminer le nombre de souris minimum que nous incluerons dans le projet pour mettre en évidence une différence entre les deux groupes. Nous utiliserons les mêmes souris contrôles (souris qui n'ont pas de traitement toxique pour le foie) pour plusieurs procédures. De plus, nos souris contrôles seront issues des accouplements faits pour générer les souris des différentes lignées.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour assurer le bien être des animaux: surveillance quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie, enrichissement de l'environnement (batonnets en bois et cotons), analgésie et anesthésie lors des procédures douloureuses. Le bien être sera également évalué à l'aide d'une grille d'évaluation (étude du comportement des animaux, de leur poids...) pour prendre en charge la douleur de manière anticipée.

Choix des espèces

Le modèle murin permet d’utiliser des souris génétiquement modifiées. Les techniques pour modifier le génome développées chez les souris et les nombreux outils actuellement adaptés à la souris en font un modèle de choix pour l'étude. Enfin, la fibrose du foie et la cirrhose étant des maladies multifactorielles, la proximité génétique de la souris vis à vis de l’Homme nous permettra de nous affranchir en partie de certaines variables occasionnées par d’autres espèces. Le début des procédures sur les animaux se fera à partir d’un âge de 8 semaines (ce qui correspond à l’âge adulte chez l’homme et qui est l'âge auquel apparaît cette maladie chez l'homme).

911 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de mutations dans les voies de réparation de l'ADN, elles subissent des prélèvements sanguins tous les quatre mois pendant un an et développent pour certaines des syndromes tumoraux, celles-ci étant tuées dès l'apparition des tumeurs. Le porteur étudie le rôle de la réparation de l'ADN dans le développement des systèmes immunitaire et nerveux et dans la genèse de cancers comme la leucémie lymphoïde chronique. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative in vitro" pour ces processus de développement.

Objectifs

Les cassures double brin de l’ADN (CDB) sont les lésions génomiques les plus toxiques et font pourtant partie intégrante de processus biologiques au cours du développement du système immunitaire et du système nerveux. Des mécanismes puissants de réparation de ces lésions ont été conservés au cours de l’évolution afin d’éviter l’instabilité génétique qu’elles peuvent engendrer. La mauvaise réparation des CDB est à la base de nombreuses pathologies chez l’homme allant de certaines maladies neurodégénératives (Ataxie télangiectasie), aux déficits immunitaires sévères en passant par le développement de cancers. Chez l’animal, les formes les plus sévères de déficit de réparation des CDB se traduisent par une létalité embryonnaire tardive consécutive à la mort massive des neurones. Néanmoins, les voies de réparation de l’ADN constituent des cibles thérapeutiques privilégiées pour le développement des traitements anticancer. Notre laboratoire a identifié plusieurs gènes impliqués dans diverses voies de réparation des CDB à partir de l’analyse de situations pathologiques chez l’homme. Depuis de nombreuses années nous associons ces études issues du patient au développement de modèles animaux d’invalidation génique afin de mieux comprendre la physiopathologie des facteurs identifiés.

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce projet une meilleur compréhension du rôle des mécanismes de réparation de l'ADN au cours du développement du système immunitaire et du système nerveux central. Ce projet nous aidera également à mieux comprendre comment les défauts de ces mécanismes de réparation participent à la genèse de syndromes tumoraux que l'on rencontre en pathologie humaine, notamment la leucémie lymphoïde chronique.

Procédures

sacrPour évaluer la survenue de leucémie chez les animaux porteurs de mutation dans les voies de réparation de l'ADN, des prélèvements sanguins (une minute sous anesthesie) seront réalisés tous les 4 mois sur une période de 1 an (soit 3 prélèvement par animal) pour l'analyse de l'apparition de cellules pré-leucémiques.

Impact sur les animaux

Les seuls effets indésirables que nous anticipons sont le développement de syndromes tumoraux dans certaines situations. Les animaux seront particulièrement suivis pour l'existence de ces tumeurs et euthanasiés dès leur apparition.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue des procédures pour prélèvements d'organe et analyse phénotypique

Remplacement

Le développement du système nerveux central et du système immunitaire sont des processus très complexes pour lesquels il n’existe malheureusement pas d’alternative in vitro aux analyses sur animaux entiers pour avoir une vision d’ensemble. Pour certaines études mécanistiques il existe néanmoins la possibilité d’utiliser des lignées cellulaires après immortalisation in vitro des lymphocytes. Nous utiliserons cette approche afin de diminuer le nombre d’animaux dans la mesure du possible.

Réduction

Notre expérience préalable sur ce type de modèles animaux nous montre que les phénotypes, lorsqu’ils sont dommageables (létalité embryonnaire, baisse de viabilité avant sevrage ou déficit immunitaire), sont en général suffisamment importants et homogènes pour être statistiquement significatifs sur de faibles cohortes. Nous calculons le nombre minimal d'animaux nécessaire à l'aide d'outils statistiques.

Raffinement

Un des phénotypes dommageables possible des animaux par ailleurs viables étant un déficit immunitaire plus ou moins sévère, ils seront obtenus et maintenus en portoirs ventilés, en zone protégée afin de minimiser leur exposition à des agents pathogènes. Un suivi quotidien permettra de s’assurer que les animaux ne développent pas de signes cliniques d’infection. Devant un état moribond du pelage, une voussure ou prostration sévère ou un amaigrissement important laissant supposer une telle infection ou un mal-être général, les animaux seront systématiquement sacrifiés. Les animaux sont par ailleurs maintenus dans un environnement enrichi (coton, bâton, tunnel) avec eau et nourriture ad libitum et en groupe social.

Choix des espèces

Le développement du système nerveux central et du système immunitaire sont particulièrement bien étudiés depuis de nombreuses années chez la souris. De nombreuses lignées mutantes existent déjà et peuvent être croisées sur de nouveaux modèles. Le développement de nouvelles technologies permet l’ingénierie de mutations « fines » calquées sur les mutations observées en pathologie humaine. De nombreux réactifs existent pour l’analyse phénotypique des modèles murins. - Pour évaluer le phénotype dommageable affectant la survie (embryonnaire et postnatale) le génotypage des animaux sera réalisé au moment du sevrage (3 semaines) - Pour confirmer un éventuel phénotype dommageable embryonnaire, les embryons seront récupérés à E18, date à partir de laquelle il est possible de réaliser un immunophénotypage - Pour évaluer le phénotype dommageable sur le système immunitaire, les animaux seront sacrifiés à 6-8 semaines, période classique d’analyse pour laquelle le système immunitaire est pleinement fonctionnel

3 300 poulets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués pour examen des lésions du tube digestif, 800 réutilisés dans d'autres procédures. Ils sont infectés par voie orale avec des coccidies puis reçoivent des produits candidats par gavage, l'infection provoquant des diarrhées pouvant contenir du sang et une prostration pendant trois à quatre jours. Le porteur cherche de nouvelles voies de contrôle des coccidioses pour "le maintien d'une production avicole rentable". Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro pertinent, un partenaire ayant développé des modèles jugés "non représentatifs".

Objectifs

Les coccidies sont des parasites qui se développent dans le tube digestif de leurs hôtes, et chez le poulet, elles peuvent causer des coccidioses, maladies très fréquentes à impact économique et sanitaire majeurs. Des moyens de contrôle de ces affections existent, comme les additifs coccidiostatiques, les vaccins anticoccidiens, des médicaments vétérinaires en cas de formes cliniques, et des désinfectants à action anticoccidienne pour réduire la pression environnementale de ces parasites. Néanmoins, chacune de ces approches a des inconvénients, et l’approche la plus utilisée, les additifs coccidiostatiques, est confrontée à des problèmes de résistances sur le terrain de plus en plus fréquents, et à une image négative liée à l’exposition prolongée des animaux à des produits pharmacologiquement actifs. Les autres approches ont aussi des inconvénients (administration et recyclage vaccinal délicats pour les vaccins, émergence de résistance pour les médicaments vétérinaires, efficacité non totale pour les désinfectants), et il est indispensable de trouver de nouvelles voies de contrôle des coccidies pour le maintien d'une production avicole rentable avec des animaux en bonne santé. L’objectif est de tester l’effet de produits distribués dans l’aliment ou dans l’eau de boisson ou par gavage avec une suspension liquide, sur le développement des coccidies en infection expérimentale chez le poulet.

Bénéfices attendus

Ce projet est mené en parallèle avec une évaluation in vitro des produits et dans sa continuité, afin de trouver une corrélation entre les deux modèles et d’identifier et de valider des conditions utilisées dans ces essais in vitro qui seraient pertinentes pour disposer de méthodes alternatives à l’expérimentation animale. Ces travaux pourraient également permettre d’identifier des candidats pertinents pour le contrôle des coccidies et des coccidioses qui n’auraient pas démontré une efficacité dans le cadre de tests in vitro.

Procédures

Administration de produits par voie orale (une à six fois, quotidiennement) dans le cas de gavage, et inoculation de coccidies par voie orale individuellement (une seule fois), avec contention de chaque sujet par un agent et administration par un autre agent. La durée de chaque opération n'excède pas 1 mn, préhension et contention incluses.

Impact sur les animaux

Signes cliniques engendrés par le développement des coccidies chez les sujets du lot témoin infecté et des lots infectés recevant des produits qui seraient inefficaces : matières fécales altérées pouvant aller jusqu’à la diarrhée (et du sang avec certaines espèces de coccidies), de la frilosité pouvant aller à de la prostration dans les manifestations les plus sévères. Les doses infectieuses sont maîtrisées de façon à ce qu’il n’y ait pas de mortalité, même avec les espèces de coccidies susceptibles de tuer en cas de très forte infection. Le développement de ces parasites étant rapide et auto-limité, les signes cliniques, lorsqu’ils sont présents, ne durent que trois à quatre jours au maximum. La guérison est spontanée, mais les conséquences sur les performances sont importantes.

Devenir

Tous les oiseaux utilisés dans les essais sont mis à mort pour observation des lésions du tube digestif causées par le développement des coccidies. Lors de la mise en place des poussins d'un jour, 5 sujets sont euthanasiés pour analyses vétérinaires, ce qui fait que 100 des 900 sujets ne servant pas aux essais sont mis à mort dès leur arrivée. Les 800 sujets ne servant pas aux essais, à cause de leurs poids extrêmes, sont réutilisés dans d'autres procédures.

Remplacement

L’approche du projet vise à comparer les résultats obtenus dans des modèles in vitro (générés par un laboratoire partenaire) avec les résultats dans le modèle d’infection in vivo, en vue de remplacer les essais in vivo si les modèles in vitro s’avèrent pertinents. Actuellement, aucun modèle in vitro n’a été validé par une confirmation lors d’essais in vivo avec infection expérimentale des poulets avec des coccidies pathogènes.

Réduction

Afin de réduire les effectifs au maximum lors des essai sin vivo, le criblage d’efficacité sera conduit sur des effectifs limités à 10 sujets par lot. Pour les essais avec étude de l’impact sur les performances zootechniques, les effectifs seront limités à 20 sujets par lot, ce qui permet d’utiliser des tests paramétriques pour comparer les résultats.

Raffinement

Les oiseaux seront hébergés dans des cages conformes aux conditions exigées en expérimentation animale, en groupes homogènes, avec un éclairage naturel, complété par un éclairage artificiel en période de jours courts, avec maîtrise de la température et de la pression et suivi de l’hygrométrie. Des cordelettes seront suspendues dans les cages, ainsi que des CD, afin que les oiseaux puissent les manipuler. Le système d’abreuvement est constitué d’une rampe de pipettes qui est également utilisée comme perchoir par les oiseaux. Des points limites ont été définis dans chacune des procédures.

Choix des espèces

Les coccidies des volailles sont strictement inféodées aux espèces qu’elles parasitent (sauf rares exceptions). Ainsi, les coccidies du poulet (Gallus gallus) ne se développent que chez cet hôte. Il n’existe actuellement pas de modèle in vitro ou ex vivo qui permette de remplacer pertinemment le modèle de reproduction des coccidioses permettant d’évaluer correctement l’intérêt de produits candidats au contrôle de ces maladies. Le présent projet s’inscrit dans un projet avec plusieurs partenaires, dont un qui a développé des modèles in vitro qui s’avèrent pour l’instant non représentatifs du développement in vivo et dont les résultats positifs ne sont actuellement pas du tout confirmés par les essais in vivo. Les oiseaux seront mis en place à l’âge d’un jour, après éclosion et récupération au couvoir, afin d’éviter toute contamination accidentelle avec des coccidies. Ils seront élevés en animalerie protégée jusqu’à l’âge de 26 jours au maximum pour les coquelets ou poulettes (procédure 1), et de 14 jours pour les poulets de chair (procédure 2). Ils seront inoculés deux jours plus tard et le suivi d’infection sera effectué pendant 7 jours. Ces âges correspondent aux périodes d’apparition les plus fréquentes de coccidioses dans les élevages, et la durée du cycle parasitaire n’excédant pas plus de sept jours, il n’est pas nécessaire de les garder au-delà de ce délai pour pouvoir mesurer les effets des parasites sur les animaux.

18 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le ventre de chaque animal est divisé en quatre zones où sont implantées des prothèses résorbables et une prothèse de référence, suivies quatre mois, puis une seconde chirurgie retire les implants avant la mise à mort. Le porteur justifie ces opérations par la mise au point d'une prothèse contre le prolapsus génital féminin, bénéfice renvoyé à une avancée future. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne permet de s'affranchir de l'animal et que le modèle animal reste la seule possibilité.

Objectifs

L'objectif est de mettre au point une prothèse pour traiter de façon chirurgical, le prolapsus génital chez la femme (déscente d'organe). Il existait des prothèses qui pouvaient se poser par voie vaginale, qui étaient non résorbables, mais elles ont été retirées du marché en raison de complication entrainant des douleurs et des réinterventions. Nous souhaitons donc créer et tester une prothèse dont les propriétés mécaniques sont contrôlées dans le temps afin de fournir le soutien nécessaire aux tissus natifs le temps de la cicatrisation des tissus environnants pour le traitement du prolapsus génital de la femme. Les verrous technologiques que souhaite lever notre projet sont les suivants : conception et réalisation d'implants résorbables aux propriétés de dégradation contrôlées, maîtrise de l'évolution in vivo des comportements mécaniques des implants, et finalement le développement d'une prothèse qui serait résorbable tout en assurant un bon maintien.

Bénéfices attendus

Nous attendons comme bénéfices une avancée vers l'amélioration de la prise en charge du prolapsus génital de la femme, qui touche une femme sur 3 en France et qui a des conséquence en terme de qualité de vie.

Procédures

Les animaux se verront implantés des prothèses. Le ventre de chaque animal sera séparé en 4 zones. Nous sélectionnerons 2 prothèses résorbables en fonction de leurs caractéristiques mécaniques en laboratoire. 9 lapins seront implantés sur 2 zones un des nouveaux matériaus et sur les deux autres zones une prothèse de référence non résorbables. Les 9 autres lapins seront implantés sur 2 zones l'autre nouveaux matériaus et sur les deux autres zones une prothèse de référence non résorbables. Les lapins seront suivis pendant 4 mois, puis les prothèses seront prélévées pour pouvoir étudier leurs propriétés mécaniques résiduelles 4 mois après la pose. Lors de l'explantation, les lapins seront mis à mort car les conséquences de la chirurgie ne seront pas compatibles avec une bonne qualité de vie. Chaque lapin aura une première intervention qui consiste en l'implantation des prothèses d'environ 30 min, puis il y aura un suivi de 4 mois et enfin une deuxième intervention, l'explantation d'environ 30 min avec mise à mort.

Impact sur les animaux

L'étude, étant donné que nous allons implanté des prothèses à l'animal, pourrait entrainer un inconfort et de la douleur en post-opératoire. Il y a également un risque d'infection et de trouble de la cicatrisation.

Devenir

Suite à l'implantation les animaux seront suivis pendant 4 mois avec surveillance quotidienne de leur bien être de de leur santé afin de repérer les points limites et de pouvoir idnentifier les signes de douleur pour les soulager. Le raffinement sera également adapté. Avant l'explantation, les animaux seront tous mis à mort, car l'explantation des prothèses a des conséquences très lourdes pour l'animal et ne sont pas compatibles avec le maintien en vie. Les souffrances seraient trop importantes

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro ou informatique, nous permettant de nous affranchir de l'expérimentation sur animaux. En effet, de trop nombreux facteurs complexes intervenant dans la cicatrisation ne peuvent être reproduits en in-vitro ou par simulateur, c'est pourquoi la seule possibilité pour cette étude est le modèle in-vivo.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit à la plus petite quantité possible pour obtenir des résultats significatifs. De plus, afin de limiter le nombre de lapin au strict minimum, chaque lapin sera son propre témoin car il lui sera implanté à la fois le matériau à l'essai et à la fois le matérau témoin. L’abdomen de chaque lapin sera divisé en 4 zones, 2 zones auront une prothèse à l’étude et les deux autres servira de témoin avec une prothèse non résorbable.

Raffinement

Les animaux auront une période d’acclimatation de 10 jours. L'ensemble des procédures sera réalisé par du personnel formé. La douleur sera traitée de manière efficace par la mise en place d'une anesthésie et analgésie adaptée au cours de la chirurgie mais également tout au long du processus de cicatrisation afin de diminuer au maximum la souffrance des animaux. Ils seront suivis quotidiennement afin de détecter tout signe de souffrance liée au protocole.

Choix des espèces

Le lapin est l'espèce animale retenue pour l'étude de la prothèse dégradable au cours du temps. Ce modèle est fréquemment utilisé dans la littérature, notamment pour l'étude et le développement de prothèses destinées à la cure de hernie. Les animaux seront à un stade adultes car ses prothèses sont destinés à des adultes ayant terminés leur croissance

3 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dont la croissance est suivie deux à trois fois par semaine, la mise à mort intervenant quand la tumeur dépasse 1,2 à 1,5 cm ou s'ulcère, seuils présentés comme des points limites. Le porteur valide de nouvelles lignées de cellules tumorales destinées à être commercialisées auprès de laboratoires travaillant sur des thérapies anticancéreuses. Il affirme que l'interaction entre l'hôte et les cellules tumorales ne peut être reproduite que chez un animal vivant.

Objectifs

Des lignées cellulaires tumorales murines génétiquement modifiées exprimant des cibles humaines sont développées pour valider des thérapies anti-cancer dans des souris de laboratoire génétiquement modifiées ou non. Ces lignées cellulaires permettent de tester les composés spécifiques des cibles humaines sans passer par un composé de remplacement spécifique de la forme murine de la cible. Cet outil doit être validé pour ses propriétés tumorales in vivo, le meilleur clone sera choisi et la fonctionnalité de la cible humaine in vivo doit être démontrée. A la création d‘une lignée cellulaire murine tumorale génétiquement modifiée, différents clones sont obtenus. Ils sont testés in vitro pour leur capacité de croissance, l’expression et la fonctionnalité de la cible humaine d’intérêt. Après ces tests, 2 clones sont sélectionnés pour être testés in vivo. La validation in vivo comporte est en 2 étapes : Une 1ère étape de croissance tumorale en souris de laboratoire génétiquement modifiées ou non, définit le pourcentage de prise tumorale et la cinétique de pousse. Les 2 clones sont comparées à un ou des clones non modifiés de la même lignée. L’expression de la cible d’intérêt dans la tumeur est testée. Sur ces critères, l’un des clones est sélectionné. L’injection de la lignée tumorale ne dure pas plus d’1 minute et le développement tumoral est suivi pendant 2 à 3 semaines La tumeur est mesurée par des techniques ni invasives ni douloureuses et dure au maximum 5 minutes. La 2ème étape valide la fonctionnalité in vivo de la cible humaine exprimée par le clone choisi. C’est une expérience d’inhibition de la croissance tumorale en souris de laboratoire génétiquement modifiées ou non. Une thérapie spécifique de la cible humaine exprimée par la lignée cellulaire est utilisée pour inhiber la pousse tumorale (étape finale de validation). Cette étape comprend l’injection des cellules tumorales et la mesure et des tumeurs dans les mêmes conditions que la 1ère étape. S’ajoute l’administration du traitement pour valider la fonctionnalité de la cible thérapeutique. Son administration prend moins d’1 minute et il est administré au maximum 3 fois/semaine. La règle des 3R sera respectée en limitant le nombre d’animaux au strict nécessaire pour faire les analyses et assurer la pertinence des résultats. Les procédures ne doivent pas entrainer de souffrance aigue et longue. En cas de souffrance, des analgésiques seront administrés. L’environnement des animaux sera enrichi.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de valider in vivo dans des souris de laboratoire génétiquement modifiées ou non des lignées cellulaires murines tumorales génétiquement modifiées pour exprimer des cibles humaines. Ces lignées auront pour application l’évaluation et la sélection de thérapies humaines contre le cancer en évitant de passer par un composé de remplacement spécifique de la forme murine de la cible d’intérêt. Elles seront suite à ce projet (cette validation) commercialisées pour être disponibles pour les laboratoires développant ce type de composés.

Procédures

La nature des procédures inclues dans le projet nécessite l’implantation de cellules tumorales (durée maximum de l’injection 1 minut)e, la pousse de tumeur (durée de 2 à 3 semaines) et leur suivi ( durée maximum de 5 minutes / souris / mesure à raison de 2 à 3 mesures par semaine). Le diamètre tumoral moyen défini comme point limite est de 1,2 cm pour une pousse tumorale sans traitement et 1,5 cm pour une étude thérapeutique. Par ailleurs, toute apparition d’ulcération sur les tumeurs est aussi un critère de surveillance et une ulcération de grade 4 de la tumeur est défini comme un point limite. Dans les 2 cas (diamètre moyen supérieur à 1,2 ou 1,5cm selon les cas ou ulcération grade 4), les animaux seront immédiatement mis à mort. Si des administrations répétées de composés sont réalisées, elles peuvent, selon la voie choisie et si le site d’administration est conservé, conduire à une souffrance passagère. Les effets douloureux devraient être limités à quelques minutes ou heures. L’administration du composé dure environ 1 minute et peut-être réalisé jusqu’à 3 fois / semaine. Dans la mesure du possible, le site d’administration sera changé entre 2 administrations et/ou l’application en local d’une crème anesthésiante sera réalisée afin de limiter la souffrance animale.

Impact sur les animaux

La nature des procédures inclues dans le projet nécessite l’implantation de cellules tumorales (durée maximum de l’injection 1 minut)e, la pousse de tumeur (durée de 2 à 3 semaines) et leur suivi ( durée maximum de 5 minutes / souris / mesure à raison de 2 à 3 mesures par semaine). Le diamètre tumoral moyen défini comme point limite est de 1,2 cm pour une pousse tumorale sans traitement et 1,5 cm pour une étude thérapeutique. Par ailleurs, toute apparition d’ulcération sur les tumeurs est aussi un critère de surveillance et une ulcération de grade 4 de la tumeur est défini comme un point limite. Dans les 2 cas (diamètre moyen supérieur à 1,2 ou 1,5cm selon les cas ou ulcération grade 4), les animaux seront immédiatement mis à mort. Si des administrations répétées de composés sont réalisées, elles peuvent, selon la voie choisie et si le site d’administration est conservé, conduire à une souffrance passagère. Les effets douloureux devraient être limités à quelques minutes ou heures. L’administration du composé dure environ 1 minute et peut-être réalisé jusqu’à 3 fois / semaine. Dans la mesure du possible, le site d’administration sera changé entre 2 administrations et/ou l’application en local d’une crème anesthésiante sera réalisée afin de limiter la souffrance animale. Une dégradation de l’état général de l’animal pouvant se traduire par une modification du comportement, une perte de poids peut se produire. Des critères de points limites seront appliqués afin de limiter la souffrance animale. Les modèles de tumeurs liquides sont connus comme plus aggressifs et la survillance des animaux pour ces modèles sera renforcée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de permettre des analyses sur les différents organes et complétés les observations faites sur le sang au cours de la procédure.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative non animale pour ce projet car le projet est de valider les propriétés tumorales des lignées murines génétiquement modifiées in vivo pour leur utilisation ultérieure en modèles murins. L’interaction complexe hôte/cellules tumorales ne peut être mimée que dans le contexte d’un animal vivant complet pour valider les lignées tumorales développées.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par lot est calculé pour obtenir des résultats qui soient statistiquement interprétables et en tenant compte de la variabilité potentielle de la taille des tumeurs au sein d’un même groupe afin d’obtenir des résultats exploitables et ne nécessitant pas la répétition de l’expérience utilisant des animaux additionnels. Les volumes de prélèvements de sang seront limités pour obtenir la quantité nécessaire mais sans excès de sérum afin de faire les mesures voulues. Cela doit permettre de prélever plusieurs fois le même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Dans la mesure du possible, nous limiterons les groupes contrôle, sans impacter pour autant l’interprétation de l’expérience. En fin d’étude, à la mise à mort des animaux, plusieurs organes pourront être prélevés pour faire diverses explorations et ainsi mutualiser l’utilisation des animaux pour explorer plusieurs questions et paramètres au sein de la même expérience et ainsi limiter le nombre global d’animaux utilisés pour répondre à la question scientifique posée.

Raffinement

Dans le cadre des études décrites ici, les animaux seront surveillés quotidiennement. Une crème anesthésiante pourra être appliquée au site d’injection en cas d’injection répétées sans changement de site et dans la mesure du possible, les injections répétées seront faites en changeant réguDans le cadre des études décrites ici, les animaux seront surveillés quotidiennement. Une crème anesthésiante pourra être appliquée au site d’injection en cas d’injection répétées sans changement de site et dans la mesure du possible, les injections répétées seront faites en changeant régulièrement de site d’injection pour limiter la douleur. Cette même crème pourra être appliquée pour les prélèvements sanguins répétés. Là encore le site de prélèvement voire la voie pourront être modifiés dans la mesure du possible et en cas d’apparition de lésion cutanée et de dommages au niveau de la veine prélevée. En cas de lésion, des soins seront réalisés (désinfectant et cicatrisant cutané) et l’évolution sera surveillée avec application des points limites le cas échéant. Les volumes et diamètres tumoraux seront mesurés 2 à 3 fois par semaine et les souris présentant une tumeur proche du diamètre moyen limite de 1,2 ou 1,5 cm selon le contexte de l’étude et/ou un début d’ulcération de la tumeur seront plus particulièrement surveillées au quotidien. Un analgésique pourra être administré à toute souris présentant un signe de souffrance (changement de comportement, de l’aspect de la fourrure, …etc…).

Choix des espèces

Le rongeur par sa taille et sa manipulation aisée, est un modèle de choix pour l’humanisation de certaines cibles thérapeutiques. Aujourd’hui les conditions zootechniques et le niveau d’ingénierie génétique sont tels que la construction à façon de lignées présentant l’humanisation d’une ou plusieurs cibles thérapeutiques est possible. En correspondance, des lignées cellulaires murines tumorales humanisées pour les cibles d’intérêt notamment en immuno-oncologie sont créées. Ces cellules doivent être validées dans des modèles de souris afin de permettre l’étude préclinique de nouvelles thérapies. Les souris de laboratoire génétiquement modifiées ou non seront utilisées dès l’âge de 6 semaines et jusqu’à un âge d’environ 16 semaines, et au maximum 20 semaines. En effet, il faut que les souris inclues dans ces études soient suffisamment matures notamment d’un point de vue du système immunitaire pour que les résultats observés soient pertinents.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 30 reçoivent une irradiation pulmonaire de 80 Gy sous anesthésie, 30 des instillations nasales répétées de clodronate pour supprimer certains macrophages, et l'ensemble passe des séances d'imagerie sous anesthésie avant les prélèvements. Le porteur étudie le rôle des macrophages dans les lésions pulmonaires après radiothérapie, en vue d'améliorer à terme la prise en charge des cancers du poumon inopérables. Il affirme que la réponse du tissu pulmonaire aux rayonnements ne peut être appréhendée qu'in vivo et présente l'irradiation choisie comme sans conséquence clinique notable d'après son expérience.

Objectifs

L’option thérapeutique de choix pour le traitement des tumeurs pulmonaires de stade précoce est la chirurgie. Cependant, environ 20 à 30% des patients sont à haut risque chirurgical, et le traitement en radiothérapie classique n’a qu’une efficacité limitée sur la tumeur. La radiothérapie en conditions stéréotaxiques consiste à irradier de très petits volumes avec une précision très importante. Cette option thérapeutique a depuis 10 ans grandement amélioré la prise en charge des patients inopérables atteints de cancer des poumons de stade précoce. La réduction du volume d’irradiation autorise l’utilisation de protocoles d’irradiation plus agressifs avec des doses plus fortes et assure alors un meilleur contrôle tumoral. Cependant, et malgré la précision, certains patients développent des effets secondaires pulmonaires. Irradier de très petits volumes chez la souris n’est possible que depuis quelques années grâce à la commercialisation d’outils capables de générer des mini-faisceaux. Depuis plusieurs années au laboratoire, nous travaillons sur un modèle d’irradiation stéréotaxique pulmonaire chez la souris. Nous avons acquis un recul important sur les effets de ces techniques. En particulier, nous avons mis en évidence une augmentation massive du nombre de macrophages au niveau du site et poursuivons les projets sur le rôle de ces nombreux macrophages dans le développement des lésions pulmonaires. Les projets en cours semblent démontrer qu’une population de macrophages présents dans les alvéoles pulmonaires pourrait être impliquée dans le développement des lésions pulmonaires après irradiation stéréotaxique. Le présent projet vise à compléter et confirmer ces premiers résultats en supprimant ces macrophages grâce à l’instillation de liposomes contenant du clodronate, et en suivant le développement des lésions pulmonaires en l’absence de ces macrophages.

Bénéfices attendus

Dans la bibliographie un intérêt majeur est porté aux macrophages dans de nombreux contextes pathologiques en particulier en ce qui concerne les dommages pulmonaires. Une meilleure compréhension du rôle des macrophages dans la réponse aux rayonnements ionisants, et en particulier des avancées dans la compréhension de leurs actions en réponse à l’irradiation de petits volumes pulmonaires pourrait permettre d’améliorer l’index thérapeutique de la radiothérapie thoracique, en offrant des perspectives préventives ou thérapeutiques sur les lésions radiques pulmonaires

Procédures

- Irradiation 80 Gy d’environ 45 minutes, sous anesthésie générale : 30 animaux concernés - Instillation intranasale de liposomes de clodronate, sous anesthésie légère, 6 instillations par souris espacé de 3 à 4 jours : 30 animaux concernés - Imagerie pulmonaire sous anesthésie générale,2 séances par animal : 60 animaux concernés

Impact sur les animaux

Pour les irradiations et les imageries, les animaux étant anesthésiés pour limiter les mouvements et pour limiter la douleur potentielle immédiate de ces actes (administration et irradiation localisée), il peut y avoir un effet des anesthésies répétées et les effets potentiels de l’anesthésie sur les variables physiologiques. Pour les administrations, même si les animaux sont légèrement anesthésiés, il est possible de noter un inconfort transitoire après l’administration, ou encore un écoulement nasal. D’après le recul acquis au laboratoire, l’irradiation focale pulmonaire à la dose choisie ne génère pas par la suite de conséquences cliniques notables jusqu’à 6 mois post-irradiation. L’administration de clodronate est un modèle très décrit dans la bibliographie et ne génère pas de conséquence clinique notable chez les animaux.

Devenir

Tous les prélèvements seront faits post-mortem. Les prélèvements concernent tous les animaux du projet.

Remplacement

La réponse globale du tissu pulmonaire aux rayonnements ionisants ne peut être appréhendée qu’in vivo, au sein d’un système biologique intégré

Réduction

Les modèles d’expérimentation présentés pour l’étude des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Pour effectuer des tests statistiques paramétriques, il est donc nécessaire d’avoir un minimum de 8 animaux pour chaque groupe pour obtenir des résultats exploitables en fonction des analyses effectuées. Pour les analyses d’expression des gènes, le nombre d’animaux sera réduit à 3 à 4 par groupe, nombre suffisant pour obtenir des résultats robustes.

Raffinement

Les conditions de soins et d’hébergement des animaux sont adaptées aux procédures réalisées afin de limiter au minimum la souffrance animale (suivi des animaux, anesthésie pour les irradiations, les imageries et les instillations, hébergement en groupe avec enrichissement).

Choix des espèces

La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé dans les études précliniques. C’est également l’espèce de référence utilisée au sein de notre laboratoire. Les précédents projets d’irradiation pulmonaire du laboratoire ont été menés sur souris. Les animaux seront utilisés entre 10 et 15 semaines, correspondant au stade adulte. Le stade adulte est choisi car la thématique de recherche concerne les séquelles des radiothérapies chez les adultes, les effets secondaires des tumeurs pédiatriques étant un domaine de recherche particulier.

18 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 12 tués à l'issue pour l'analyse de leur cerveau et 6 gardés en vie pour un usage ultérieur. Chaque animal est habitué à la contention, passe une IRM et un scanner sous anesthésie, un test de seuil moteur et de l'imagerie fonctionnelle en état vigile, puis reçoit une neurostimulation cérébrale par ultrasons. Le porteur veut évaluer cette technique chez le singe dans la perspective d'un essai chez l'humain contre des troubles neuropsychiatriques, les résultats obtenus chez les rongeurs étant jugés insuffisants. Il justifie le recours au macaque par sa proximité phylogénétique et l'analogie de ses zones cérébrales avec celles de l'humain.

Objectifs

Dans une première approche expérimentale, nous avons mis en place et validé des séquences ultrasonores et un dispositif expérimental permettant la stimulation ultrasonore chez les rongeurs. Dans la continuité de ce projet et en raison des limitations physiologiques des rongeurs et des contraintes physiologiques liés au crâne et au cerveau humain, nous souhaitons évaluer l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation ultrasonore chez le singe dans la perspective d’un essai clinique chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons évaluer l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation ultrasonore chez le singe dans la perspective d’un essai clinique chez l’Homme. Ce projet permettra de progresser dans la possibilité de transposer cette technique en clinique humaine. Nous aurons ainsi une avancée supplémentaire pour espérer avoir une alternative non-invasive et résolutive pour le traitement des troubles neuropsychiatriques.

Procédures

Habituation à la manipulation et au positionnement à la neurostimulation : 30 min par jour, 2 à 5 fois /semaine. IRM sous anesthésie générale : 1 fois par animal, durée 1h. Scanner X sous anesthésie générale: 1 fois par animal, durée acquisition 10 min. Détermination du seuil moteur sur animal vigile: 1 fois par animal, durée 1h. Imagerie fonctionnelle sous anesthésie générale: 2 fois pour le groupe 1 et 4 fois pour le groupe 2 d'une durée de 80min par imagerie. Neurostimulation sur animal vigile: 1 fois par animal , durée 30 min.

Impact sur les animaux

Les sources de stress sont occasionnées par l’induction anesthésique, l’injection intraveineuse du radiotraceur et le réveil. Le singe est facilement stressé, la contention nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute une source de stress supplémentaire. Les animaux, après la phase d’acclimatation, seront habitués à être sortis de leur cage et aux manipulations. D’après nos précèdentes manipulations sur rongeurs, la neurostimulation ne semble pas avoir d’effet indésirable.

Devenir

A l'issue des procédures, 12 animaux seront euthanasiés pour des études histologiques et métabolomiques sur les prélèvements cérébraux, afin d'appréhender les effets cellulaires de la neurostimulation ultrasonore. Les 6 animaux restant seront gardés en vie pour un futur replacement.

Remplacement

Dans une première approche expérimentale, nous avons mis en place et validé des séquences ultrasonores et un dispositif expérimental permettant la stimulation ultrasonore chez les rongeurs. Dans la continuité de ce projet et en raison des limitations physiologiques des rongeurs et des contraintes physiologiques liés au crâne et au cerveau humain, nous souhaitons évaluer l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation ultrasonore chez le singe dans la perspective d’un essai clinique chez l’Homme.

Réduction

D’après les groupes expérimentaux que nous souhaitons faire, nous travaillerons sur 9 macaques mâles et 9 macaques femelles. Nous travaillerons sur 7 macaques mâles et 11 macaques femelles. Ces animaux seront répartis en 2 groupes expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en volière avec les congénères pour garder les liens sociaux et en présence d’objets d’enrichissement. Les animaux disposent de plateformes surélevées . l'alimentation couvre les besoins journaliers et est complétée par une distribution de friandises deux fois par jour. Un programme d'enrichissement hébdomadaire est mis en place dans le cadre de leur hébergement ( recherche et diversité de l'alimentation, manipulation d'objets, échelle, musique, tv...) ceci donnant un environnement favorable aux procédures expérimentales. Les animaux seront observés tous les jours. Les procédures expérimentales seront réalisées dans une salle correctement chauffée. Pour les procédures sous anesthésie, les animaux seront manipulés sur un tapis chauffant, un monitoring cardio-pulmonaire sera effectué pendant toute la durée de la manipulation. Les animaux seront placés sous surveillance à leur réveil. Nous avons défini des points limites permettant d’apprécier la douleur, l’inconfort des animaux. Ces points limites seront principalement des signes observables et évaluables par le personnel de zootechnie habilité sur les singes. Nous considérons donc comme point limite toute manifestation de douleur : perte de poids et locomotion réduite, prostration du PNH, déshydradation, état des muqueuses et des selles et l'apparence générale du pelage. Chaque jour, le personnel de zootechnie veillera à l’apparence physique des animaux et aux interactions sociales. Les animaux seront pesés à réception puis avant chaque procédure. En présence de l'un de ces signes, des mesures préventives seront prises, médication en concertation avec le vétérinaire référent et/ou apports alimentaires alternatifs. Pour limiter le stress des animaux, nous ferons une habituation à la manipulation. Dans un premier temps, nous habituerons les animaux à recevoir des récompenses (friandises) après avoir effectué des tâches simples, toucher un objet sans bouger pour coopérer avec l'animal et instaurer une relation de confiance entre l'animal et l'expérimentateur. Puis dans un deuxième temps, ils seront habitués à être installé en salle de manipulation pour éviter tout stress lié à l'environnement de la salle. Les macaques recevront des friandises à la suite.

Choix des espèces

Le choix de cette espèce se justifie (1) par l’analogie des zones cérébrales et de la neurobiologie entre le singe et l’humain et (2) par sa proximité phylogénétique avec l’espèce humaine. Des macaques pubères seront utilisés pour cette étude. Les pathologies pouvant être soignées par la méthode de neurostimulation ultrasonore sont pour la plupart des pathologies de l’adulte. De ce fait, il s’avère nécessaire de travailler sur des animaux post-pubère ayant un âge supérieur à 3 ans et un poids inférieur à 5 kg.