Procédures modérées

112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante sous anesthésie une pompe sous-cutanée diffusant en continu de la phényléphrine ou de l'angiotensine II, ce qui provoque une hypertension artérielle, puis elles subissent jusqu'à cinq séances d'imagerie sous anesthésie et un prélèvement sanguin à la queue, pour caractériser un modèle de fibrose cardiaque et tester de nouveaux traceurs d'imagerie. Le porteur indique que la chirurgie mène à un stress et une douleur au réveil qu'il évalue comme modérés. Il affirme que l'étude de la fibrose cardiaque ne peut se passer de l'animal, les modèles cellulaires ne reflétant pas l'environnement neuro-hormonal.

Objectifs

Il existe à l’heure actuelle peu de méthodes permettant un diagnostic précoce de la fibrose interstitielle cardiaque et par conséquent peu de traitements disponibles. L’objectif de ce projet est donc de mettre en place et caractériser un modèle de fibrose cardiaque interstitielle chez la souris, puis d’évaluer de nouveaux traceurs d’imagerie diagnostique précoce de cette pathologie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra dans un premier temps de caractériser un modèle de fibrose interstitielle cardiaque avant d’explorer de nouvelles stratégies de diagnostic précoce. Par la suite, des études visant à évaluer de nouveaux traitements seront possibles avec à terme une possible translation à la clinique grâce à l’utilisation ici des mêmes imageries que celles réalisées chez l’homme.

Procédures

les animaux subiront les actes suivant : * implantation d’une pompe sous-cutanée sous anesthésie générale Durée : 15 à 20 minutes * prélèvement sanguin (procédure 1 seulement) sur souris vigiles : Durée : 30 secondes * Imagerie in vivo avec injection intraveineuse sous anesthésie isoflurane. L’imagerie se déroulera au maximum sur 1h. La procédure d’imagerie n’est pas répétée dans la procédure 1 et sera répétée 5 fois à une semaine d’intervalle dans la procédure 2.

Impact sur les animaux

la chirurgie d’implantation d’une pompe sous la peau fermée par une suture mènera à un niveau de stress et douleur évalué comme modéré au réveil de l’animal. L’infusion continue de 2 composés par cette pompe (phenylephrine / angiotensine II) provoquera une hypertension artérielle également évaluée à un niveau modéré. Le prélèvement sanguin (procédure 1 uniquement) nécessitera une contention de quelques secondes et la réalisation d’une piqure à la queue et est évalué comme léger. Enfin la procédure d’imagerie pourra engendrer un stress léger au moment de la mise sous anesthésie et du réveil de l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir réaliser différentes analyses complémentaires sur le tissu cardiaque.

Remplacement

L’étude de la fonction et de la fibrose cardiaque ne peut se passer d’une étude chez l’animal. En effet, les modèles cellulaires ne reflètent pas l’environnement neuro-hormonal présent physiologiquement, ni la fonction cardiaque dans son ensemble (contraintes de pression par exemple).

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons choisi de construire notre projet en 2 étapes et d’y associer des analyses in vitro. De plus, en comparaison avec une étude classique qui nécessite la mise à mort des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie peut être répétée à différents temps et permet de réduire le nombre d’animaux d’autant.

Raffinement

L’imagerie est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. De plus, la majorité des procédures (injection intraveineuse, prélèvements et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit/plaque chauffant(e) réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Enfin le geste chirurgical appliqué dans ce projet est assez peu invasif (pose d’une pompe sous cutanée) et sera associé à une couverture analgésique.

Choix des espèces

Le rongeur est le modèle de référence en cardiologie car l’environnement neuro-hormonal et la physiologie cardiaque sont proches de l’humain. Les animaux seront commandés à l’âge de 8-9 semaines et seront traités de 10 à 14 semaines comme décrit précédemment dans la littérature

3 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intra-mammaire de cellules tumorales, des chimiothérapies et immunothérapies répétées par voie intrapéritonéale sur deux semaines, des mesures de tumeur au pied à coulisse tous les deux jours et des prélèvements sanguins, pour étudier le rôle d'enzymes dégradant l'ADN tumoral dans l'immunité anti-tumorale. Le porteur indique que les animaux sont mis à mort après avoir atteint les points limites ou pour prélever leurs tissus. Il décrit cette question comme "fondamentale" et affirme qu'une étude sur échantillons humains ne peut remplacer des souris génétiquement modifiées développant des tumeurs mammaires.

Objectifs

Le cancer est la principale cause de mortalité en Europe et 14.1 millions d’individus dans le monde sont affectés par cette maladie. Malgré les avancées technologiques dans le diagnostic et le traitement des cancers, de nombreux patients succombent à la maladie. Il est donc urgent de développer de nouvelles études afin d’améliorer la prise en charge des patients, ainsi que d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de développer des traitements efficaces. Le système immunitaire est au centre de nouvelles approches thérapeutiques et permet d’induire une immunité anti-tumorale et donc la destruction des tumeurs. L’efficacité de ces immunothérapies requiert au préalable une inflammation dans le site tumoral. Celle-ci n’est présente que dans un nombre limité de tumeurs et peut être induite par l’ADN tumoral. De plus, de nombreuses thérapies, incluant la chimiothérapie et la radiothérapie ont été montrées comme induisant une mort des cellules tumorales conduisant à la libération de l’ADN tumoral qui stimule les réponses inflammatoires et « booste » l’immunité anti-tumorale. Ces observations posent la question fondamentale de savoir comment et par quels mécanismes est régulée la capacité de l’ADN dérivé des tumeurs à stimuler l’immunité anti-tumorale. Nous avons caractérisé récemment des enzymes dont la fonction principale est de couper/digérer l’ADN libéré par les cellules mourantes contrôlant ainsi sa capacité à induire une réponse inflammatoire par le système immunitaire. Nos résultats préliminaires suggèrent que la déficience d’une de ces enzymes limite l’impact thérapeutique des chimiothérapies et leur capacité à induire une réponse immunitaire anti-tumorale. Nous proposons donc dans le cadre de cette demande d’autorisation de projet d’étudier les mécanismes d’action de ces enzymes, ciblant l’ADN tumoral, dans la régulation de l’immunité anti-tumorale en réponse aux thérapies conventionnelles (chimiothérapie et immunothérapies). Cela nous permettra de caractériser la fonction de ces enzymes dans la régulation de l’immunité anti-tumorale et d’identifier de potentielles pistes thérapeutiques afin de renforcer l’efficacité thérapeutiques des traitements communément utilisés chez les patients.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de caractériser le rôle d'enzymes ciblant l’ADN tumoral dans la régulation de l’immunité anti-tumorale induite par différents traitements couramment utilisés en thérapie des cancers. C’est une question fondamentale car l’ADN libéré par les cellules tumorales joue un rôle clef dans l’activation de l’immunité tumorale en réponse à diverses thérapies. Il semble que ces enzymes soient requises pour l’induction de l’immunité anti-tumorale induite par certaines chimiothérapies selon nos résultats préliminaires. Ainsi, une meilleure compréhension du rôle de ces enzymes pourrait déboucher sur de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints de cancer.

Procédures

1. L’injection intra-mammaire des cellules tumorales est effectuée sur des animaux anesthésiées en moins d’une minute. 2. Injection intrapéritonéale avec des thérapies anti-cancéreuses conventionnelles (chimiothérapie (5 injections tous les 2 jours) et immunothérapies (3 injections tous les 4 jours) est effectué durant 2 semaines sur des animaux vigiles. Cette injection est très rapide et dure moins de 30 secondes par souris. 3. La mesure de la taille tumorale est effectuée tous les deux jours avec un pied à coulisse sur des animaux anesthésiées. Cette procédure dure moins d’une minute par souris. 4. Les prélèvements sanguins sont effectués sur des animaux anesthésiés à deux reprises espacées de deux semaines. Cette procédure est très rapide et dure moins d’une minute par souris. 5. La vaccination par les cellules tumorales morte en sous-cutanée sur des souris anesthésiées s’effectue à 3 reprises espacées d’une semaine. L’injection dure environ une minute par souris.

Impact sur les animaux

1. La présence de tumeur du sein chez la souris peut impacter le bien-être des animaux. 2. Le traitement des souris par des thérapies anti-cancéreuses conventionnelles (chimiothérapie et immunothérapies) peut induire des effets secondaires (dans notre cas mineurs) qui peuvent impacter le bien-être des animaux. 3. Les prises de sang chez les animaux peuvent conduire à un affaiblissement transitoire. 4. Les injection sous-cutanées et intrapéritonéales peuvent induire un inconfort transitoire des animaux

Devenir

Tous les animaux inclus dans l’expérimentation seront mis à mort à la fin de ce projet, soit après avoir atteint les points limites soit afin de procéder à des prélèvements tissulaires pour des analyses supplémentaires.

Remplacement

Afin d’étudier la fonction des enzymes coupant/digérant l'ADN des cellules tumorales dans l’immunité anti-tumorale et dans la régulation de l’efficacité thérapeutique de traitement anti-cancéreux, nous utilisons des animaux génétiquement modifiés qui à la fois ont des déficiences en ces enzymes digérant l’ADN et développent spontanément des tumeurs mammaires. Ainsi, cette étude ne peut pas être réalisée avec des échantillons humains. De plus nous étudions l’interaction entre le système immunitaire et les cellules tumorales dont la modélisation dans un système d’organoïdes n’est pas à ce jour optimale et ne peut remplacer les modèles in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales ont été déterminés pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Nous utilisons les souris femelles pour notre projet car nous travaillons sur le cancer du sein. Cependant, les souris mâles issues de nos croisements ne seront pas mises à morts mais utilisées dans le cadre d’un projet sur l’obésité et pour le maintien de nos colonies.

Raffinement

1.Hébergement : les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention : les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maîtrise des méthodes de préhensions douces, les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur : Les prises de sang sous mandibulaires, les injections s.c, ainsi que la mesure des volume tumoraux sont réalisés sur des animaux anesthésiés afin de réduire l’inconfort et la douleur incombé par ces procédures.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris pour répondre à nos objectifs de recherche. Les souris sont les animaux de choix pour notre projet car des souches génétiquement modifiées déficientes pour les enzymes qui digèrent l’ADN que nous étudions sont disponibles et permettent de répondre au mieux à nos objectifs. Des souris génétiquement modifiées qui développent des tumeurs mammaires seront aussi utilisées dans notre projet. Celles-ci sont idéales pour notre étude car elles récapitulent très bien le processus de développement des tumeurs mammaires humaines, ce qui en fait un excellent modèle d’étude et facilite l’applicabilité des résultats à l’Homme. Nous utiliserons les souris adultes entre 8 et 14 semaines. En effet, nous nous intéressons au rôle de nos enzymes digérant l’ADN dans l’induction de l’immunité anti-tumorale en réponses aux thérapies conventionnelles dans le cancer du sein, une pathologie qui affecte presque exclusivement l’adulte.

430 bovins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, gardés en vie puis envoyés à l'abattage pour la vente commerciale des carcasses. Ils subissent un écornage, jusqu'à onze prises de sang, des prélèvements de fèces et deux biopsies de tissu adipeux, pour mesurer l'efficacité alimentaire et des marqueurs de qualité de la viande selon les régimes d'engraissement. Le porteur revendique un "besoin constant d'animaux" et présente le projet comme une source de références techniques pour la filière et sa valorisation économique. Il affirme que le recours aux bovins est "obligatoire" puisqu'ils sont l'espèce cible de l'élevage étudié.

Objectifs

L'agriculture est depuis toujours en constante évolution. Pour l'aider dans cette mutation la recherche agronomique a initié de nombreux programmes de recherche, auparavant orientée vers l'augmentation des performances et de l'amélioration de la productivité des espèces animales élevées et destinées à produire du lait et/ou de la viande. Aujourd'hui, elle s'orienterait plutôt à maintenir le niveau de production des animaux (ovins, bovins...) tout en prenant plus en compte les contraintes du milieu, les risques environnementaux (production des gaz à effet de serre, polution des sols...) ou attentes sociétales (bien être animal, qualité des produits, traçabilité de l'alimentation...). Pour répondre à une partie de ces enjeux, notre établissement utilisateur a un besoin constant d'animaux. Pour réaliser des études fines des mécanismes physiologiques d'ingestion et de la digestion des aliments chez les ruminants , les animaux modèles utilisés sont ici des bovins issus du troupeau allaitant.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à acquérir des références techniques sur les pratiques en élevage pour engraisser les bovins avec le maximum d’herbe et de fournir des repères sur la qualité des viandes ainsi produites. Ces pratiques seront mises en perspective avec les coûts de production et d’opportunité que leur application engendre. Il s’agira aussi d’identifier au sein de la filière des solutions pour mieux valoriser la qualité des viandes issues d’une finition maximisant l’herbe et porteuses d’une meilleure répartition de la valeur ajoutée.

Procédures

Ecornage : 1 fois /animal en début d'expérimentation et d'une durée de quelques minutes (100 animaux max). Prises de sang : 4 fois /animal durant l'expérimentation (180 animaux) et 11 fois/animal durant l'expérimentation (250 animaux) (intervalle entre chaque prélèvement minimum une semaine) et d'une durée de moins d'une minute à chaque fois. Prélèvement de féces : 2 fois /animal en début et milieu d'expérimentation (180 animaux) et 6 fois/animal (250 animaux) et d'une durée de moins d'une minute à chaque fois. Biopsie de tissu adipeux : 2 fois /animal (430 animaux max) en début et milieu d'expérimentation et d'une durée d'une dizaine minutes à chaque fois. Digestibilité : 1 fois /animal en milieu d'expérimentation et de maximum 13 jours (80 animaux).

Impact sur les animaux

Faible risque de troubles digestifs (acidose). Risques modérés liés à la manipulation des animaux lors des interventions (accident de pesée etc..)

Devenir

Les animaux seront gardés en vie à l'issue de toutes les procédures mais seront destinés à l'abattage pour vente commerciale des carcasses à la fin des expérimentations.

Remplacement

Le contexte du projet est l'élevage de ruminants où l'animal est, par conséquent, au centre des préoccupations. Le projet a pour objectif la recherche d’indicateurs peu on non invasifs capables de traduire la variabilité observée chez l’animal en croissance/engraissement. De fait avoir recours à des bovins (animal cible) est obligatoire.

Réduction

Les procédures pour réduire le nombre d'animaux seront mises en oeuvre dès que possible et serviront à limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés et la sévérité des procédures appliquées. Dans certains cas une approche en carré latin pourra être utilisée (dans ce cas l'animal est son propre témoin et soumis aux différents régimes alimentaires expérimentaux) pour réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Tout est mis en oeuvre pour raffiner les procédures expérimentales, les conditions d'hébergement et l'utilisation des animaux par exemple en limitant la durée d'hébergement en stalles de digestibilité, en ayant des temps de repos suffisant entre procédures pour les animaux. De plus les animaux seront suivis quotidiennement pour s'assurer de la bonne santé des animaux.

Choix des espèces

Le contexte du projet est la prédiction de l’efficience et de la qualité des carcasses en fonction des régimes alimentaires en phase d'engraissement, d’où l’intérêt à travailler avec des bovins en croissance/engraissement.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses du sein sous la peau, puis une résection chirurgicale de la tumeur sous anesthésie et un suivi de l'évolution métastatique. Le porteur mène un criblage pan-génomique par CRISPRi pour identifier des gènes régulant la progression métastatique du cancer du sein. La mise à mort sert à prélever les organes et à rechercher les métastases par imagerie et analyse moléculaire.

Objectifs

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent dans le monde (2,26 millions) et malgré les progrès des thérapies, un grand nombre de patientes décède chaque année des suites métastatiques (685,000). La majorité des cancers du sein sont d’origine canalaire, et 15% sont diagnostiquées in situ, c’est-à-dire qu’ils n’ont pas franchi la barrière physique qui les entoure constituée par la lame basale. Au moins un tiers des tumeurs resteraient in situ et bénignes, et près de deux tiers de ces tumeurs évoluant vers un stade invasif. A ce jour, en absence de marqueurs prédictifs de l’évolution vers le stade invasif, les médecins traitent les patientes porteuses de tumeurs in situ comme si elles avaient des tumeurs malignes. Ceci a un coût humain et économique important qui va en augmentant avec les progrès des techniques d’imagerie. En outre, il n’existe pas de traitement spécifique contre la transition in situ-invasif ou la progression métastatique. Il est urgent d’identifier des biomarqueurs prédictifs pour évaluer le risque de transition vers le stade invasif - première étape du processus métastatique - pour éviter un traitement lourd et inutile aux patientes porteuses de tumeurs bénignes. Il est tout aussi nécessaire de trouver des cibles thérapeutiques pour combattre la dissémination des cellules tumorales. Nous souhaitons identifier de nouvelles protéines inhibitrices de l’invasion, dont la réduction de l’expression a une action pro-métastatique. Jusqu’alors, les divers criblages génomiques de nombreux cancers n'ont pas permis d'identifier de mutations somatiques responsables spécifiquement de la progression métastatique. Une raison possible est que l'acquisition des capacités métastatiques, contrairement à la transformation et à la prolifération, serait principalement causée par des mécanismes de régulation épigénétique, post-transcriptionnelle ou post-traductionnelle. Nous proposons de réaliser un criblage in vivo afin d'identifier les gènes dont la répression de l’expression confèrerait aux cellules tumorales des propriétés agressives et métastatiques. Nous utiliserons les métastases générées après xénogreffe de cellules mammaires humaines comme sources pour identifier les ARN enrichis dans les métastases comparées aux tumeurs primaires. Notre modèle d'étude est le cancer du sein mais les gènes identifiés dans notre étude pourraient permettre de dessiner un paradigme pour d'autres cancers invasifs.

Bénéfices attendus

Au travers de ce projet, nous identifierons de nouveaux gènes régulateurs du processus métastatique dont l’étude permettra une meilleure compréhension de la progression de la maladie cancéreuse et de la transition d’une tumeur in situ à une tumeur invasive. Les gènes identifiés serviront à établir une signature du risque de développer des tumeurs invasives pour aider au pronostic et diagnostic. Enfin, les voies de signalisation associées à ces gènes ouvriront de nouvelles perspectives dans la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques des cancers métastatiques.

Procédures

Sur le plan des gestes chirurgicaux prévus dans ce projet, les animaux receveurs de greffe par voie sous cutanée seront soumis à une résection de la tumeur au site initial d’injection. Les procédures expérimentales de transplantation et de résection seront réalisées sous anesthésie, et la mise en place d’une analgésie pré, per et post opératoire sera assurée pour une bonne prise en charge de la douleur chez les animaux. La durée estimée pour la transplantation (de l’induction de l’anesthésie à la greffe) est de 5 minutes par animal. La procédure de résection (de l’induction de l’anesthésie à la phase de réveil sur tapis chauffant) représente 15 minutes par animal. Le retrait des agrafes qui interviendra 10 à 15 jours après l’exérèse des greffons nécessite 5 minutes par animal. En complément de ces approches, dans le contexte du suivi hebdomadaire, les souris feront l’objet d’une mesure du greffon induit. Ce geste basé sur la de préhension nécessite 1 minute par animal. La surveillance de la survenue métastatique par imagerie optique -de l’induction de l’anesthésie à l’acquisition des signaux bioluminescents - est estimée à 10 minutes pour chaque animal

Impact sur les animaux

Les principaux effets délétères attendus portent sur l’induction d’une pathologie cancéreuse chez le modèle murin. Par ailleurs, l’injection sous-cutanée d’une grande quantité de cellules est connue pour engendrer une réaction inflammatoire mais qui est contenue en raison du statut immunodéprimé de la souche murine utilisée. Outre l’application du principe des 3Rs, afin que ces dommages soient réduits à un minimum, nous procéderons par étape tout au long de ce projet et nous nous appuierons sur la mise en place d’une grille de score pour définir une fréquence d’interventions la plus adaptée afin de garantir le bien-être des animaux. L’expérience préliminaire servira de base pour déterminer l’impact de l’injection de 30x10E6 de cellules, évaluer les caractéristiques cinétiques de croissance tumorale et ajuster au mieux le suivi des animaux. Par ailleurs, les souris feront l’objet d’une phase d’acclimatation en vue de leur inclusion dans les procédures expérimentales et seules les manipulations nécessaires seront effectuées. Nous veillerons à conserver les caractéristiques de l’espèce par le maintien des animaux en groupe tout au long de leur stabulation et l’apport d’enrichissement dans les cages pour améliorer leur bien-être.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure en vue de l'investigation tissulaire ex-vivo. L’analyse des tissus (organes) par imagerie optique nous permet d’explorer la présence de métastases. Les foyers tumoraux distants ainsi mis en évidence seront préparés pour l’extraction de matériel biologique en vue de l’identification des gènes associés à l’évolution métastatique de la pathologie par analyse moléculaire.

Remplacement

Le processus métastatique très complexe impliquant l’organe d’origine de la tumeur, les organes receveurs des métastases et les systèmes de circulation des cellules invasives par voie sanguine ou lymphatique ne peut pas encore être reconstitué in vitro. Si la recherche de nouveaux gènes impliqués dans ce processus par un criblage pan-génomique ne peut pas être effectué in vitro, des méthodes complémentaires pourront tout de même être utilisées pour certaines étapes du projet. Sur la base des gènes identifiés in vivo, on utilisera donc des approches in vitro dès que possible et dès qu’elle sera pertinente en vue de disposer de modèles d’études complémentaires notamment en matière de caractérisation moléculaire. In fine ces modèles d’étude complémentaires nous permettront d’utiliser moins de souris.

Réduction

Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, le suivi du développement de la pathologie maligne chez les animaux transplantés se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés non invasifs, tels que la mesure des greffons à l’aide d’un pied à coulisse et le recours à l'imagerie optique in vivo par bioluminescence. Tout au long de ce projet, nous procéderons par étape et nous mettrons en place des groupes contrôles pour nous assurer de la pertinence de notre modèle et passer à l’étape suivante.

Raffinement

Afin d’améliorer le cadre de vie des animaux, les besoins physiologiques seront respectés (nourriture et eau ad libitum). Nous optimiserons les conditions d’hébergement des animaux par la présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés, lanières de papier et/ou coton) et par leur maintien en groupes de 3 à 5 afin d’éviter le stress de l’isolement. Les procédures expérimentales de transplantation seront réalisées sous anesthésie, et la mise en place d’une analgésie pré, per et post opératoire sera assurée pour une bonne prise en charge de la douleur chez les animaux. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.

Choix des espèces

Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). C’est de plus, le modèle le plus fourni en études pour ce qui concerne le domaine de la cancérologie. Les animaux utilisés dans ce projet seront des animaux à l’âge adulte (8-10 semaines) De par notre expérience et selon les données de la littérature, cette fenêtre d’âge est optimale pour la prise de greffe de cellules tumorales chez le modèle murin dans un contexte de xénogreffe.

213 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des composés perfluorés par voie intraveineuse ou orale, séjournent 24 heures en cage à métabolisme, puis sont tuées après un prélèvement de sang important, l'appareil chauffant utilisé pour l'injection dans la queue pouvant provoquer des brûlures. Le porteur cherche des stratégies pour accélérer l'élimination des PFAS accumulés dans l'organisme. Il affirme qu'il n'est "pas possible de s'affranchir" de l'animal, le devenir d'une molécule n'étant pas prévisible par des études in vitro.

Objectifs

L’objectif du projet est d’élaborer et évaluer une ou des stratégies de remédiation pour augmenter l’élimination corporelle des composés alkyl perfluorés (PFAS) accumulés dans l’organisme et réduire ainsi les niveaux d'exposition systémique des PFAS et leurs impacts sur la santé Pour atteindre cet objectif, il est nécessaire de caractériser les processus physiologiques qui limitent l’excrétion des PFAS et conduisent à leur accumulation. La clairance rénale jouant a priori un rôle majeur par rapport à la clairance biliaire, nous analyserons ensuite les mécanismes qui contrôlent l’élimination rénale des PFAS dont les propriétés de la liaison des PFAS aux protéines plasmatiques et les processus de filtration glomérulaire, de sécrétion et de réabsorption tubulaires des PFAS. Les résultats orienteront les approches exploratoires de remédiation vers l’utilisation d’inhibiteurs de la réabsorption rénale des PFAS. L’étude de la relation entre l’exposition systémique aux PFAS et un ou des biomarqueurs prédictifs de leurs effets perturbateurs métaboliques pourra être utilisée comme critère de jugement de la capcité des approches exploratoires à réduire les concentrations au-dessous des seuils d’expression des effets délétères des PFAS.

Bénéfices attendus

La prévention des effets délétères des contaminants environnementaux repose essentiellement sur la réduction des expositions externes via l’établissement de doses sans danger. Cette approche ne permet cependant pas de protéger l’homme des substances chimiques dont la principale source d’exposition est interne, comme certains des composés alkyls perfluorés (PFAS). La très faible capacité d’élimination corporelle de ces composés serait à l’origine de la demi-vie plasmatique élevée, de certains d’entre eux qui s’élève à plusieurs années chez l’homme, et est à l’origine de leur bioaccumulation. L’augmentation de l’élimination de ces composés représente le moyen de diminuer l’exposition des tissus aux effets toxiques de ces substances. Pour cela, notre approche basée sur la caractérisation des processus physiologiques qui limitent l’excrétion des PFAS et leurs effets toxiques permettra d’identifier des méthodes de remédiation.

Procédures

Dans le cadre de la procédure 1, 84 souris recevront une administration intraveineuse unique (N=42) ou une administration orale unique (N=42). Les souris seront hébergées pendant 24h dans une cage à métabolisme. Un prélèvement de sang unique sera réalisé chez l’animal anesthésié et immédiatement suivi de la mise à mort et des prélèvements de tissus. Six autre souris (contrôles) seront hébergées pendant 24h dans une cage à métabolisme et à l'issue des 24h, un prélèvement de sang unique sera réalisé chez l’animal anesthésié et immédiatement suivi de la mise à mort et des prélèvements de tissus. Au cours de la première étude de la procédure n°2, un prélèvement unique de sang sera réalisé chez l’animal anesthésié (n=15) et immédiatement suivi de la mise à mort. Au cours de la deuxième étude de la procédure n°2, toutes les souris (n=36) recevront une administration orale quotidienne d’un mélange de composés alkyl perfluorés pendant 4 jours et, 3 jours après le début des administrations orales, une administration unique intraveineuse d’iohexol seul (n=12), avec du mannitol (n=12) ou avec un inhibiteur des transporteurs rénaux (n=12). Suite à l'administration intraveineuse, les souris seront hébergées pendant 24h dans une cage à métabolisme afin de recueillir les urines et les fèces. Trois prélèvements sanguins de sang seront réalisés au cours des 24h chez l’animal anesthésié. Le dernier prélèvement sera immédiatement suivi de la mise à mort. Les 60 souris de la procédure 3 recevront une administration orale quotidienne pendant 28 jours. Au bout des 28 jours, un prélèvement de sang unique sera réalisé chez l’animal anesthésié et immédiatement suivi de la mise à mort et des prélèvements de tissus. Les administrations orales seront réalisées par gavage. La durée du gavage varie de 10 à 30 secondes. Les administrations intraveineuses seront réalisées dans une veine latérale de la queue à l’aide d’une seringue à insuline de 0.5ml avec aiguille sertie (0.30mm x 12mm, Aniject 0.5ml INS 100U Pentafine, 30Gx1.2). Les souris seront placées dans le tube de contention de l’appareil illuminateur de queue pour permettre une bonne contention de la queue qui sera placée dans la gouttière prévue à cet effet de façon à ce qu’elle soit éclairée, et forme un angle de 45° entre l’aiguille et la queue. La durée des administrations intraveineuses varie de 30 secondes à 2 minutes. La durée des prélèvements sanguins varie de 10 à 30 secondes.

Impact sur les animaux

Une brûlure de la queue pourrait être induite par l’appareil illuminateur de queue utilisé pour les administrations dans la veine caudale. Cet appareil illumine efficacement la queue mais du fait de la température élevée, la queue ne doit pas être maintenue en continu plus de 2-3 minutes dans la gouttière d’éclairage pour éviter les brûlures

Devenir

Les souris seront mises à mort après le prélèvement d’un volume de sang important qui est requis pour l’ensemble des dosages réalisés pour chacune des procédures du projet (dosage des PFAS, dosage de l’iohexol, évaluation des marqueurs métaboliques).

Remplacement

Pour l’ensemble du projet, il n’est pas possible de s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants car le devenir d’une molécule dans un organisme (pharmacocinétique) n’est pas prévisible par des études in vitro compte-tenu de la complexité des mécanismes mis en jeu (absorption, destruction par la flore intestinale, métabolisme hépatique, diffusion tissulaire, élimination rénale, …).

Réduction

Une réduction très importante du nombre d’animaux sera permise par l’administration des PFAS en mélange. En effet, l’administration simultanée des 10 PFAS permettra d’évaluer sur les mêmes animaux le devenir des 10 PFAS et de réduire d’un facteur 10 le nombre d’animaux. La méthode d'analyse des données qui sera mise en œuvre permettra de réduire à un seul, le nombre de prélèvement par animal. En effet, contrairement aux méthodes classiques d'analyse qui nécessitent d'obtenir un grand nombre de données sur le même animal, cette approche permettra d’analyser simultanément toutes les données obtenues avec des animaux différents. Aucune approche statistique ne sera réalisée.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des milieux enrichis : tunnels et papier pour faire des nids. Excepté lors de l'hébergement en cage à métabolisme, les animaux seront hébergés en groupe. Les animaux seront habitués au contact avec les expérimentateurs et une surveillance accrue des souris par ces mêmes expérimentateurs sera réalisée lors de l’hébergement des souris dans les cages à métabolisme. Les animaux seront également habitués à entrer dans le tube de contention et à séjourner dans une cage à métabolisme afin de les entrainer à coopérer lors des manipulations. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Durant toute l'étude, les animaux seront surveillés deux fois par jour afin de s’assurer de leur prise alimentaire et de leur accès au système de distribution d’eau. Une pesée réalisée toutes les deux semaines permettra de s’assurer de leur prise normale de poids au cours de l’étude. Les procédures n’induisant que peu de souffrance, un animal dont l’état est préoccupant (présentant au moins un des facteurs répertoriés ci-après) serait éliminé et mis à mort car considéré comme anormal par rapport aux autres : mauvais état du pelage, pâleur des yeux ou des extrémités, perte de poids, anorexie prolongée, difficultés respiratoires sévères ou prolongées (particulièrement si accompagnés de cyanose), difficultés digestives (diarrhée prolongées, …), diminution marquée de l’activité ou décubitus latéral, léthargie, hémorragie sévère incontrôlée, déshydratation sévère ou prolongée, signes neurologiques sévères (ex : tête penchée, tremblements, grincement de dents, convulsions, paralysie, incoordination motrice, etc.).

Choix des espèces

La souris est choisie au titre de modèle de référence en toxoicologie. Le choix du modèle des souris femelles C57BL6 s’appuie sur des résultats préliminaires qui montrent la pertinence de ce modèle pour évaluer les effets des PFAS sur le métabolisme énergétique hépatique. Ainsi, une étude récemment réalisée au laboratoire a montré qu’une stéatose hépatique était induite par un traitement par voie orale des souris C57BL6 avec du PFOA à une dose très faible (5 ng/kg.j). De plus, la comparaison des résultats avec ceux précédemment obtenus chez des souris femelles C57BL6 invalidées pour les récepteurs CAR (Constitutive Androstane Receptor) et PXR (Pregnane X Receptor) apportera des informations très importantes sur le rôle de ces récepteurs nucléaires dans les mécanismes de contrôle de la réabsorption rénale des PFAS. Le projet sera réalisée chez des souris adultes âgées de 10 semaines. L’étude toxicocinétique se déroulant sur une période de 120 jours, il est important que les animaux soient au même stade physiologique (adulte) tout au long de l’étude.

45 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit chirurgicalement une plaie cutanée sur toute l'épaisseur de la peau puis on y greffe ou non un substitut dermique, chaque animal étant maintenu isolé en cage pour éviter l'arrachage des pansements. Le porteur compare la fonctionnalité d'un nouveau substitut dermique à base de collagène à un produit commercial. La mise à mort échelonnée sert à analyser la vascularisation et la régénération du tissu cutané.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo chez la souris la fonctionnalité d’un nouveau substitut dermique acellulaire à base de collagène développé selon une nouvelle technique de fabrication brevetée, en comparaison avec un substitut dermique acellulaire commercial également à base de collagène. Les substituts dermiques seront greffés sur des souris possédant un système immunitaire fonctionnel après induction d’une plaie cutanée sur toute l’épaisseur de la peau. Des prélèvements seront effectués à différents temps après réalisation de la greffe de substitut dermique afin d’étudier les interactions se mettant progressivement en place entre les substituts dermiques et l’environnement de l’hôte, plus spécifiquement sa colonisation par les cellules de la souris pour le développement d’un réseau vasculaire et la régénération du tissu cutané à partir donc du tissu environnant de la souris lors des phases précoces de la cicatrisation. Le substitut dermique nouvellement développé devrait en effet permettre d’accélérer la mise en place de ces interactions via une colonisation plus rapide et progressive du substitut dermique et donc d’accélérer le processus de cicatrisation. Un ensemble d'analyses effectuées sur les prélèvements cutanés collectés permettront de caractériser au cours du temps la fonctionnalité du substitut dermique nouvellement développé par rapport à un substitut dermique commercial, et d’appréhender les interactions se mettant progressivement en place au cours du temps entre les substituts dermiques et l’hôte.

Bénéfices attendus

Les substituts dermiques sont des biomatériaux capables de remplacer une partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée. Aujourd'hui, si les greffes autologues (donneur et receveur sont la même personne) sont les greffes de première intention pour la couverture des plaies, elles se heurtent à l’écueil d’une disponibilité limitée de peau, en particulier dans la prise en charge des grandes brûlures et les procédures restent invasives et douloureuses. Des allogreffes (donneur et receveur de même espèce) et des xénogreffes (donneur et receveur d'espèces différentes) peuvent pourvoir au remplacement temporaire de la peau, avant de laisser la place à une autogreffe. Subsiste évidemment les risques de rejet, douleurs et infection, et la formation de cicatrices. Le développement de nouveaux substituts dermiques acellulaires biosynthétiques, ne nécessitant donc pas l’utilisation de cellules humaines ou de prélèvement de peau sur une autre partie du corps, mais permettant d’accélérer le développement d’un réseau vasculaire et la régénération du tissu cutané à partir du tissu périlésionnel de l’hôte constitue une des nouvelles voies envisagée pour traiter les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les greffes de tissus mous chez les patients présentant des brûlures à épaisseur partielle, des plaies chirurgicales, ulcères du pied diabétique, ulcères veineux… La caractérisation des interactions cellulaires se mettant en place entre le substitut dermique et l’hôte sur l’acceptation du substitut dermique, la colonisation du substitut dermique par les cellules de la souris, la rapidité de revascularisation et de régénération du tissu cutané au cours du temps après réalisation d’une greffe cutanée sont des paramètres importants qui vont permettre de mieux appréhender ces phénomènes précoces lors de greffes de substituts dermiques et de valider ou d’améliorer le process de fabrication du substitut dermique acellulaire nouvellement développé.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction de la plaie cutanée et la réalisation ou non des greffes de substitut dermique, effectuée sous anesthésie générale et sous couverture antalgique. La chirurgie sera réalisée en 20 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Le maintien des souris greffées ou non en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles les pansements, la compresse et surtout le substitut dermique.

Impact sur les animaux

L’induction de la plaie cutanée suivie ou non de la réalisation de la greffe de substitut dermique peur engendrer une souffrance des animaux. L’hébergement en cage individuelle des souris greffées ou non, nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le substitut dermique, l’anneau en silicone, les pansements, la compresse et la bande de sparadrap, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 45 souris seront mises à mort à différents temps après réalisation de la greffe ou non de substitut dermique pour la réalisation d'un ensemble d’analyses permettant de caractériser les interactions cellulaires se mettant progressivement en place entre le substitut dermique et l’environnement de l’hôte (réseau vasculaire et régénération du tissu cutané notamment).

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité de substituts dermiques greffés, processus dépendant de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, revascularisation, réépithélialisation…). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études précédentes obtenus sur ce modèle de greffe cutané. D’autre part, la réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permet de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction de la plaie cutanée puis de la réalisation ou non de la greffe cutanée (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) ainsi qu’après réalisation ou non de celle-ci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation et leur poids sera mesuré deux fois par semaine à chaque renouvellement de pansement. Une grille de score et des points limites adaptés à ce modèle d'étude seront suivis avec un arbre décisionnel permettant de mettre fin si nécessaire à toute souffrance des animaux. Des bâtonnets d’ouate seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire une plaie cutanée représentative des plaies à traiter chez l’Homme. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).

14 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisés ensuite pour un autre projet ou placés. Ils reçoivent un probiotique dans leur alimentation pendant 31 jours, avec trois prises de sang sous sédation et des séjours en cage à métabolisme jusqu'à seize heures pour recueillir les fèces. Le porteur évalue l'effet de ce complément, "FlorEquilibre", sur la digestibilité et la flore intestinale. Il affirme que l'effet sur le microbiote peut difficilement être reproduit hors de l'animal.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer l'effet, chez le chat, de la distribution dans l'alimentation d'un probiotique, FlorEquilibre, sur la digestibilité et la flore intestinale. Les paramètres mesurés pour évaluer l'efficacité du probiotique seront la consistance et les analyses chimiques et microbiologiques des fèces, les paramètres hématologiques et biochimiques, la digestibilité, la prise alimentaire et le poids corporel.

Bénéfices attendus

Chez le chat, la flore intestinale peut être perturbée: - lors du sevrage, de la croissance, - lors de changements d'environnement comme l'arrivée dans un nouveau foyer ou un séjour en chatterie, - lors de situations potentiellement stressantes comme un voyage, l'arrivée d'autres animaux dans le foyer, une hospitalisation, - lors d'une vaccination ou de prises de médicaments comme des antibiotiques, - lors d'un changement d'alimentation ou de l'ingestion d'aliments inhabituels par exemple pour les chats qui ingèrent différentes proies. Les animaux âgés, et certaines races prédisposées comme le Sphinx ou le Bengal, ont également une plus grande sensibilité digestive. L'administration de probiotiques présente alors un avantage pour rééquilibrer la flore intestinale et aider l'animal à mieux surmonter ces perturbations.

Procédures

1. Alimentation individuelle pendant toute la durée de l'étude, 1 fois par jour (environ 10 minutes après habituation), 2. Traitement avec un complément alimentaire pour un des groupes, 1 fois par jour pendant 31 jours avec l'alimentation (environ 10 minutes), 3. Examen clinique effectué par un vétérinaire, 1 fois par période x 3 périodes (avant traitement, pendant traitement et post-traitement) (environ 15 minutes), 4. Pesée une fois par semaine (environ 5 minutes), 4. Prélèvement de fèces en cage à métabolisme, 24h maximum x 17 jours (pour la plupart des chats, les fèces seront émises entre 16h la veille et 8h le matin du jour de prélèvement soit 16h en cage à métabolisme), 5. Prélèvements de sang, 1 fois par période x 3 périodes (environ 1 minute).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont: douleur et stress suite aux trois prises de sang (même si le stress sera réduit par une sédation préalable), placement en cage à métabolisme pour le prélèvement de fécès. Les effets indésirables qui pourraient survenir sont des troubles digestifs liés au traitement probiotique même si la formulation est déjà disponible sur le marché et administré à la dose recommandée.

Devenir

Les animaux auront subi une procédure modérée avec un très faible risque d'effet indésirable. Sauf avis contraire du vétérinaire référent de l'Etablissement Utilisateur, les animaux pourront être réutilisés pour un autre projet. Cependant, s'il s'avère qu'un animal a du mal à se laisser manipuler et/ou n'est pas très à l'aise dans un environnement avec plusieurs autres congénères, il pourra être placé.

Remplacement

Il est nécessaire pour déterminer l'efficacité d'un probiotique de déterminer son effet sur le microbiote intestinal, un mélange complexe de micro-organismes qui peut difficilement être reproduit en totalité in vitro. De plus, les interactions avec l'organisme, la matrice alimentaire lors de l'administration conjointe à l'aliment, la variabilité interindividuelle, ne pourraient pas être prises en compte. Enfin, pour des contraintes réglementaires, il est impératif de mener trois études indépendantes sur l'espèce cible. Il n'est donc pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. En revanche, vu que le probiotique est déjà mis sur le marché, il y a peu de risques d'effets indésirables avec un tel traitement.

Réduction

Le nombre de groupes, soit un sans traitement et un traité avec la dose recommandée, est défni par la guideline de l'EFSA (European Food Safety Authority) "Guidance on the assessment of the efficacy of feed additives". Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé lors des deux essais précédents. Ce nombre de 7 animaux par groupe ne peut donc pas être modifié, les trois essais devant obligatoirement être les mêmes. Cependant, compte-tenu de la procédure effectuée sur ces chats et de l'absence d'effets indésirables du traitement, ces chats pourront ensuite être soit réutilisés pour une procédure légère ou modérée, soit proposés à l'adoption à la fin du projet.

Raffinement

Bien que les prélèvements de fèces soitent réalisés en cage à métabolisme, les cages seront aménagées pour réduire au maximum l'inconfort de l'animal : grille des cages recouverte de tapis caoutchouc et de VetBed, litière pour la récolte des fèces nettoyée immédiatement, jouets et brosses dans la cage, possibilité de sortir chaque chat sous surveillance pour qu'il puisse intéragir avec les manipulateurs et d'autres chats. Les chats seront également habitués aux cages à métabolisme pendant la période de pré-traitement. De plus, si un chat n’a pas fait de fèces le matin, il pourra être sorti des cages à métabolisme après le repas et isolé dans une des parties de la volière commune où ils sont hébergés habituellement jusqu’à récupération des fèces. Pendant toute la durée du projet, les chats seront suivis quotidiennement par un vétérinaire. La douleur et le stress qui pourraient être engendrés par les prises de sang seront attenuées par une sédation préalable. Même si le traitement est administré à la dose recommandée, des effets indésirables liés au traitement probiotique pourraient survenir. Cela devrait être essentiellement des troubles digestifs transitoires. Si les troubles persistent plus de trois jours, l'animal sera exclu de l'étude et des soins adaptés seront mis en place le cas échéant par le vétérinaire en charge du suivi quotidien des animaux.

Choix des espèces

L'espèce choisie est l'espèce cible pour laquelle le probiotique est mis sur le marché Les animaux seront des chats adultes âgés de 1 à 7 ans, comme dans les deux essais précédents. La guideline de l'EFSA "Guidance on the assessment of the efficacy of feed additives" recommande en effet que les animaux utilisés pour les essais soient des animaux en bonne santé et appartenant à un groupe homogène. D'où le choix d'écarter les animaux trop jeunes (en croissance avec un microbiote non mature, non stérilisés) et trop âgés (risque de problèmes de santé accrus).

57 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses sous la peau, puis une résection chirurgicale de la tumeur sous anesthésie et un suivi de l'évolution métastatique. Le porteur étudie le rôle de la protéine PTK7 dans le potentiel métastatique du cancer colorectal pour identifier des marqueurs et des cibles thérapeutiques. La mise à mort sert à prélever les organes et à rechercher les métastases par imagerie.

Objectifs

Le cancer colorectal est l'un des plus fréquents en France. Il touche, chaque année, plus de 43 000 personnes et cause 17 000 décès. A l'heure actuelle, nous cherchons toujours à comprendre les mécanismes de développement tumoral et métastatique afin d'améliorer la prise en charge, le traitement et le suivi des patients atteints de cancers colorectaux. L'identification de nouveaux marqueurs prédictifs de l'évolution de la maladie, ainsi que de cibles thérapeutiques qui seraient au coeur des processus tumoraux clés (initiation tumorale, dissémination dans la voie sanguine, colonisation métastatique des organes) constitue un enjeu majeur en terme de lutte contre cette maladie. Chez les patients atteints de cancers colorectaux, la protéine PTK7 a été décrite comme un facteur de mauvais pronostic. On retrouve cette protéine dans les tumeurs primaires (étape initiale) ainsi que les métastases (étape finale) chez les patients atteints de forme aggressive. Nous avons découvert que, chez ces mêmes patients, cette protéine est absente des cellules tumorales qui sont dans le sang (étape intermédiaire de dissémination). De cette observation est né le présent projet qui vise à déterminer le mécanisme de régulation transitoire de PTK7 dans les cellules tumorales. En effet, la perte de PTK7 sur les cellules cancéreuses en circulation sanguine semble primordiale dans le développement métastatique et nous voulons valider cette hypothèse afin de pouvoir déterminer comment mieux cibler cette protéine en terme de stratégie thérapeutique. Pour ce projet, nous voudrions mettre en place un modèle murin de cancer colorectal métastatique qui récapitule les observations que nous avons faites chez les patients concernant la protéine PTK7. Dans cette optique, nous utiliserons une lignée cellulaire humaine de cancer colorectal exprimant un fort taux de PTK7 que nous injecterons à des souris immuno-déficientes. Sur la base de la validation de la régulation de PTK7 dans notre modèle, nous proposons dans un second temps, de déterminer si l'absence de PTK7 est requise au niveau des celulles pour leur survie dans la circulation et la formation de métastases. Récemment nous avons mis en évidence que l'induction de la perte de PTK7 in vitro avait pour effet d'augmenter l'expression de FAK, protéine impliquée dans la survie des cellules cancéreuses. Nous prosposons, dans un troisème temps, de tester l'effet d'inhibiteurs de FAK et sa voie de signalisation sur la dissémination métastatique.

Bénéfices attendus

Au travers de cette étude chez la souris, nous pourrons valider et mieux comprendre un mécanisme nouvellement identifié chez l’homme. Sur la base des données obtenues, nous aurons déterminé l’implication de PTK7 dans la pathologie cancéreuse. Nous espérons, in fine, proposer de nouvelles pistes thérapeutiques dans le but final d’améliorer la prise en charge des patients atteints de cancers colorectaux agressifs.

Procédures

Sur le plan des gestes chirurgicaux prévus dans ce projet, les animaux receveurs de greffe par voie sous cutanée seront soumis à une résection de la tumeur au site initial d’injection. Les procédures expérimentales de transplantation et de résection seront réalisées sous anesthésie, et la mise en place d’une analgésie pré, per et post opératoire sera assurée pour une bonne prise en charge de la douleur chez les animaux. La durée estimée pour la transplantation (de l’induction de l’anesthésie à la greffe) est de 5 minutes par animal. La procédure de résection (de l’induction de l’anesthésie à la phase de réveil sur tapis chauffant) représente 15 minutes par animal. Le retrait des agrafes qui interviendra 10 à 15 jours après l’exérèse des greffons nécessite 5 minutes par animal. En complément de ces approches, dans le contexte du suivi hebdomadaire, les souris feront l’objet d’une mesure du greffon induit. Ce geste basé sur la de préhension nécessite 1 minute par animal. Dans le contexte du suivi des cellules tumorales circulantes, les animaux feront l’objet de prélèvements sanguins, réalisés sous anesthésie. La fréquence des prélèvements respectera un délai de 15 jour minimum entre deux prélèvements (3 prélèvements maximum par animal). Le geste technique ne prend pas plus de 5 minutes par animal (induction de l’anesthésie comprise). Les animaux recevant les cellules tumorales par voie intraveineuse, en vue de mimer la dissémination des cellules à des foyers distants seront injectés (dose unique) dans la veine caudale (durée 2 minutes par animal). L’administration de traitement avec des inhibiteurs se fera par voie orale(gavage) à raison de deux administrations pour chaque animal concerné (durée 1 minute).

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux recevront les cellules par injection en voie sous-cutanée, manipulation pouvant entrainer de la douleur, du stress pour les individus concernés. La greffe de cellules ainsi que le suivi par prélèvement sanguin seront effectués sous anesthésie, procédure technique qui pourra induire une angoisse chez l’animal lors de la phase l’endormissement. De plus, le suivi de l’évolution de la pathologie cancéreuse nécessitera une préhension fréquente des animaux qui pourra également être source de stress. Lors du développement tumoral, la survenue de lésions cutanées est possible au niveau des greffons de croissance avancée. Dans le contexte du suivi de l’évolution métastatique de la pathologie, les animaux développeront des foyers tumoraux distants qui pourront induire des inconforts (tels que perte de poids, difficultés respiratoires) en fonction des sites touchés. L’administration par voie orale de composés pourra entrainer un stress / un inconfort pour les animaux. La prise en compte et l’anticipation de ces nuisances (phases d’acclimatation, d’habituation à la manipulation, enrichissement dans les cages, grille de score de bien-être et soins adaptés) nous permettront d’agir au mieux afin de réduire ces effets indésirables à leur maximum et le plus précocement possible dans le contexte du suivi des animaux, sans mettre en péril les conclusions expérimentales.

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés à la fin de chaque procédure concernée en vue de l'investigation tissulaire ex-vivo. Les organes ainsi prélevés seront analysés par imagerie optique afin d’explorer la présence de métastases. Les foyers tumoraux distants ainsi mis en évidence seront préparés pour l’extraction de matériel biologique en vue de la caractérisation du profil d’expression de notre protéine d’intérêt dans le contexte de la pathologie cancéreuse et de son évolution métastatique.

Remplacement

Dans cet objectif, chaque fois que cela a été possible, nous avons utilisé des approches substitutives in vitro et mis en place des techniques de culture cellulaire. Ces méthodes ont toutefois des portées limitées dans leur capacité à récapituler l’ensemble du processus physiopathologique de la croissance (pousse de la tumeur initiale) à la dissémination métastatique de la maladie. Le recours au modèle in vivo se fera dans la continuité de ces approches in vitro et ne sera utilisé qu’après validation de nos hypothèses au travers de ces méthodes complémentaires.

Réduction

Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, le suivi du développement de la pathologie maligne chez les animaux transplantés se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés non invasifs, tels que la mesure des greffons à l’aide d’un pied à coulisse et le recours à l'imagerie optique in vivo par bioluminescence. Le recours à l’outil statistique nous a permis en outre de déterminer le nombre d’animaux suffisants mais nécessaires pour permettre de fournir des résultats significatifs.

Raffinement

Afin d’améliorer le cadre de vie des animaux, les besoins physiologiques seront respectés (nourriture et eau ad libitum). Nous optimiserons les conditions d’hébergement des animaux par la présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés, lanières de papier et/ou coton) et par leur maintien en groupes de 3 à 5 afin d’éviter le stress de l’isolement. Les procédures expérimentales de transplantation seront réalisées sous anesthésie, et la mise en place d’une analgésie pré, per et post opératoire sera assurée pour une bonne prise en charge de la douleur chez les animaux. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.

Choix des espèces

Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). C’est de plus, le modèle le plus fourni en études pour ce qui concerne le domaine de la cancérologie. Les animaux utilisés dans ce projet seront des animaux à l’âge adulte (8-10 semaines). De par notre expérience et selon les données de la littérature, cette fenêtre d’âge est optimale pour la prise de greffe de cellules tumorales chez le modèle murin dans un contexte de xénogreffe.

1 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur applique un produit allergisant et irritant sur le ventre rasé puis sur les oreilles pour déclencher un eczéma, et jusqu'à huit injections d'anticorps sur trois semaines. Le porteur analyse les mécanismes immunitaires de l'eczéma et sa récidive, maladie qu'il dit toucher plus de 15% de la population. Il affirme qu'aucun test in vitro ne récapitule la complexité de la réaction immunitaire de la peau et que les cellules primaires doivent être prélevées post-mortem sur des souris.

Objectifs

Les eczémas allergiques tels que l’eczéma de contact (colorants, produits chimiques, nickel…) ou l’eczéma atopique (acariens, moisissures, poils de chien/chat…) se caractérisent par des lésions cutanées et sont dues à une réaction allergique. Ces eczémas touchent plus de 15% de la population. La cause des eczémas est complexe et reste mal comprise à ce jour. Ces dernières années, une population de cellules immunitaires, ayant une fonction de mémoire à long terme et résidant dans les tissus, a été mise en évidence. Ces cellules particulières ne re-circulent pas dans l’organisme et patrouillent dans la peau à l’interface entre l’organisme et l’environnement. Il a été montré que ces cellules sont impliquées dans la récidive et la sévérité de l’eczéma. En effet, une des caractéristiques cliniques de l’eczéma est qu’il se développe sous forme de poussées, entrecoupées de périodes de rémission. Lors des poussées, dont la sévérité augmente généralement au cours du temps, les lésions reviennent préférentiellement sur les sites antérieurement atteints. Les traitements actuels préconisés pour ces eczémas consistent notamment en l'application cutanée d'anti-inflammatoires (corticoïdes). Toutefois, ce type de traitement, bien que permettant de soulager les symptômes de l’eczéma, ne permet pas d’empêcher les récidives. Ce projet a donc pour but de tester une nouvelle stratégie thérapeutique pour lutter contre les eczémas et d'évaluer son effet sur la formation, la survie, la prolifération et la réactivation des cellules immunitaires mémoires résidant dans la peau. Ainsi, 6 anticorps, dont l'efficacité et la sureté ont déjà été démontrées dans d'autres modèles, seront testés dans ce projet. Grâce à cette stratégie, une nouvelle solution thérapeutique permettant d’éliminer les cellules responsables de l'eczéma et donc de traiter cette pathologie à sa source, pourrait voir le jour.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de la physiopathologie de l’eczéma et une meilleure compréhension de la biologie des cellules immunitaires mémoires résidant dans la peau. Il pourra servir en outre de preuve de concept de l’intérêt de cibler les cellules immunitaires mémoires résidants dans la peau pour traiter l'eczéma ou d'autres maladies inflammatoires chroniques. Enfin, l'objectif final de ce projet serait de pouvoir proposer une stratégie thérapeutique innovante, permettant de stopper la récurrence des poussées d’eczémas, grâce aux résultats de ce travail.

Procédures

Les animaux recevront une application cutanée de produit allergisant et irritant sur leur ventre rasé au début des procédures. Cette procédure (rasage + application du produit) sera réalisée sur animal vigile et durera au maximum 1 minute. 5 jours après, les animaux recevront une application du même produit sur leurs oreilles, afin d'induire une réaction allergique (inflammation). Cette intervention sera réalisée sous anesthésie générale afin d'éviter que les souris ne lèchent le produit avant qu'il n'ait pénétré dans la peau. L'anesthésie durera environ 40 minutes. Les animaux seront également être traités (8 injections de traitement au maximum) avec un anticorps (ou anticorps contôle) sur une durée maximale de 3 semaines. En effet, dans certaines procédures, 7 injections de traitement sont nécessaires pour observer un effet de l'anticorps, comme démontré dans la littérature. Ce traitement sera réalisé sur animal vigile par injection du produit (durée de la procédure d'injection : 10 secondes). Enfin, les oreilles des souris seront mesurées 5 fois par semaine, pendant 2 semaines, afin de suivre de manière quantitative l'inflammation (l'augmentation de l'épaisseur des oreilles étant un des signes de l'inflammation). Ces mesures seront effectuées sur animaux anesthésiés (durée de l'anesthésie : 2-3 minutes) afin d'éviter de générer un stress trop important chez les souris et pour réaliser les mesures les plus fiables et reproductibles possible.

Impact sur les animaux

Les procédures mises en place ne devraient pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l'état général des animaux. Ce modèle d'eczéma induit chez la souris est parfaitemenent maitrisé dans l'équipe ; nous savons donc que l'induction d'un eczéma chez la souris ne génère pas de signe de douleur apparente. L'eczéma peut conduire les souris à se gratter, mais dans notre expérience, nous n'avons jamais observé de signe excessif de grattage.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir prélever leurs oreilles, leurs ganglions (et éventuellement leur rate et leur sang). Ces différents organes sont ensuite utilisés pour analyser la réponse immunitaire.

Remplacement

Aucun test in vitro ne permet de récapituler de manière satisfaisante la complexité de la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés, dans le cadre de l’allergie. D'une part, les cellules que nous étudions dans ce projet sont des cellules initialement circulantes, qui pénètrent dans le tissu suite à la ré-application de l'allergène sur la peau de l'animal. Malheureusement, les techniques actuelles d'étude in vitro ne permettent pas de mimer cette étape de pénétration dans le tissu. D'autre part, l'utilisation de modèles de peau reconstruite à partir de cellules murines n'est pas envisageable. En effet, ces modèles sont loin d'être fonctionnels puisqu'il n'existe à ce jour aucune lignée de cellules de peau immortalisées. Cela nécessite donc l'utilisation de cellules primaires (récupérées post-mortem sur des souris) qui ne peuvent pas être congelées et qui résistent mal ex vivo. Enfin, les modèles de peau reconstruites à partir de tissu humain en sont à un stade de développement plus avancé que chez la souris mais ils restent malgré tout inutilisables après 2 semaines de culture. Etant donnée que nos expériences durent toutes 3 semaines ou plus, l'utilisation de ces modèles de peau reconstruites ne peut être envisagée dans ce projet. Dès lors, l’utilisation d’un modèle animal est indispensable à la réalisation de notre étude.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. A noter que les expérimentations décrites ici indiquent le nombre maximum d’animaux susceptibles d’être utilisés dans ce projet. Toutefois, le nombre d’animaux nécessaire pourra diminuer en fonction des résultats obtenus. En effet, des statistiques intermédiaires pourront être réalisées afin de déterminer la puissance de nos tests et de revoir à la baisse nos effectifs d’animaux si possible.

Raffinement

Afin d'optimiser le bien-être des souris, nous réaliserons une observation clinique des animaux 5 fois par semaine (durant les 2 premières semaines de chacune des procédures) puis de manière hebdomadaire jusqu'à la mise à mort des animaux. Nous attacherons ainsi une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress ou une douleur pour l’animal, geste invasif ou non. Lors des injections par voie intrapéritonéale, nous veillerons consciencieusement à ne pas toucher les mammelles des souris afin de ne pas blesser les animaux. L'application d'un produit anti-inflammatoire ou cicatrisant n'est pas envisageable pour les souris présentant des lésions d'eczéma car cela risquerait de perturber le déroulé de la réponse inflammatoire et donc d'impacter les cellules étudiées dans cette étude. Dès lors, les animaux présentant des signes de grattage excessif seront immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle très utilisé pour étudier les pathologies inflammatoires telle que l’allergie en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. De plus, de nombreux produits, spécifiques à l'immunologie (ex: anticorps, kits de dosage de cytokines), ne sont disponibles que chez la souris. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de molécules inflammatoires ou l’induction de différentes populations de cellules mémoires. De plus, les travaux de recherche sur les cellules étudiées dans ce projet sont également réalisés chez la souris. Dès lors, dans l’optique de pouvoir confronter nos résultats à ceux obtenus par d’autres, l’utilisation du modèle murin est indispensable à notre étude. Les souris provenant de fournisseurs arrivent à l’âge de 6 semaines et sont acclimatées au sein de notre animalerie avant d'entrer dans nos protocoles. Les souris entrent dans les procédures à 8-10 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.