Procédures modérées
Caractérisation de la composante inflammatoire de 4 modèles in vivo de chondrosarcome
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 56
164 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de cellules de chondrosarcome, tumeur du cartilage, dont le développement est suivi au pied à coulisse avant la mise à mort pour analyses. Le porteur compare quatre modèles de cette tumeur afin de choisir le plus pertinent pour tester ensuite un anti-inflammatoire vectorisé, le projet restant une étape préparatoire sans évaluation thérapeutique. Il affirme que la culture cellulaire ne reproduit pas le microenvironnement tumoral et que le passage in vivo est inévitable pour sa stratégie de vectorisation.
Objectifs
Le chondrosarcome, ou tumeur maligne du cartilage, représente 30 % des tumeurs malignes osseuses. Caractérisé par un microenvironnement peu favorable, il est radio- et chimio-résistant. Actuellement, le seul traitement efficace est la chirurgie pouvant entraîner de lourdes incapacités pour le patient. De plus, le taux de survie à 5 ans est inférieur à 50 % en cas de récidive pour les formes les plus agressives, rendant ce cancer redoutable. Dans le cadre d’un nouveau projet de recherche, notre unité s’intéresse à la composante inflammatoire du chondrosarcome dans le but de proposer une nouvelle prise en charge thérapeutique. La stratégie envisagée consiste à acheminer spécifiquement au niveau du cartilage tumoral anti-inflammatoire, le célécoxib. En effet, bien que peu étudié dans le chondrosarcome, la littérature démontre largement l’efficacité du célécoxib in vitro et in vivo dans les tumeurs tout en soulignant les effets indésirables qui limitent son utilisation. La stratégie que nous développons, pour acheminer spécifiquement le célécoxib, consiste à exploiter deux caractéristiques du microenvironnement du chondrosarcome : (i) sa richesse en protéoglycanes et (ii) la surexpression de certaines métalloprotéinases. Après des résultats in vitro encourageants, nous souhaitons évaluer les molécules développées in vivo. Dans le but de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous souhaitons dans un premier temps définir le modèle in vivo de chondrosarcome le plus adapté pour l’évaluation in vivo de nos dérivés. Ainsi, l’objectif de cette demande de projet sera de comparer 4 modèles de chondrosarcome classiquement utilisés et maitrisés au laboratoire, à différent stade du développement tumoral et d'évaluer l'expression des cibles exploitées pour notre stratégie. Les résultats obtenus nous permettrons de valider le modèle qui sera le plus pertinent pour envisager l’évaluation in vivo par la suite.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de caractériser la composante inflammatoire de 4 modèles in vivo de chondrosarcome et de valider le modèle le plus pertinent pour une évaluation des dérivés développés au sein de notre unité.
Procédures
Innoculation de cellules tumorales en sous cutanée et sous anesthésie (5min) (1 par souris) Suivi du volume tumoral au pied à coulisse et sous anesthésie (5min) (1 à 2 fois par semaine) Procédure chirurgicale (10 min) (1 par rat) Mise à mort (tous les animaux)
Impact sur les animaux
Cette demande de projet n'entraine que très peu de nuisance envers les animaux. L'induction du modèle impliquant une anesthésie peut engendrer un stress. A un stade plus avancé, le développement tumoral pourrait entrainer une légère gène au déplacement.
Devenir
Procédure 1 et 2 : Mise à mort pour analyses mécanistiques
Remplacement
La culture cellulaire ne représente pas la complexité du micro-environnement tumoral et notamment de sa composante inflammatoire. Une évaluation in vitro nous permettra de réaliser un premier screening des molécules développées dans notre unité mais nous ne permettra pas de valider notre stratégie thérapeutique, cette dernière étant basée sur une stratégie de vectorisation. Le passage sur un modèle in vivo est donc inévitable pour juger de façon optimale la stratégie de vectorisation que nous développons.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, chacune de nos études mécanistiques ont été réfléchi afin d’avoir la quantité de matériel tumoral adéquat.
Raffinement
Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale, enrichissement de milieu, surveillance quotidienne). De plus, des injections d’antalgiques pourront être appliqués.
Choix des espèces
Les rongeurs sont classiquement utilisés en expérimentation animale comme en cancérologie. Trois des modèles d’étude sont des chondrosarcomes humains qui de ce fait doivent être implantés chez des souris immunodéprimées. Le dernier modèle d’étude est un chondrosarcome de rat pouvant être implanté directement chez le rat. Les souris seront commandées à 4 semaines afin de permettre le développement tumoral qui est relativement long.* Les rats seront commandés à 150g afin de permettre le développement tumoral qui est relativement long (3 semaines chez le rat).
Rôle des canaux TRP dans l’hypersensibilité viscérale générée par la consommation d’un régime riche en fer héminique chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 72 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 24 modéré. Nourries trois semaines à un régime enrichi en fer héminique, 72 subissent une chirurgie d'une à deux heures pour poser un dispositif de mesure puis une pression douloureuse répétée dans le côlon, les 24 autres passant 24 heures en cage à métabolisme. Le porteur teste l'hypothèse que le fer des viandes rouges et charcuteries active des récepteurs de la douleur intestinale, en vue de futures pistes thérapeutiques contre le syndrome de l'intestin irritable. Il affirme qu'aucune approche in vitro n'évalue la sensibilité viscérale et que seule une approche in vivo intégrée le permet.
Objectifs
Le syndrome de l’intestin irritable est une pathologie intestinale chronique très répandue (10-15% de la population), altérant la qualité de vie des patients par l’inconfort digestif et les douleurs abdominales générées, et une cause majeure de consultations médicales dans le monde occidental. Bien que d’origine multifactorielle, des facteurs nutritionnels contribuent fortement à l’aggravation des symptômes. Les viandes rouges et charcuteries ne sont actuellement pas connues comme des aliments associés à l’exacerbation des symptômes de douleurs viscérales associées à ce syndrome mais une étude suggère que le fer héminique de ces produits carnés, de par le stress oxydatif induit dans le côlon, engendre une sensibilité viscérale accrue en réponse à un stimulus douloureux. Une étude complémentaire est nécessaire pour comprendre comment ce stress oxydatif induit cette hypersensibilité. Sur la base de la littérature scientifique et des métabolites identifiés dans le contenu du côlon de souris nourries avec un régime supplémentés en fer héminique, nous émettons l’hypothèse que les métabolites associés à ce stress oxydatif activent au niveau de l’épithélium intestinal certains récepteurs de la famille des TRP, et plus particulièrement 2 d’entre eux, TRPA1 et TRPV1, pour lesquels des inhibiteurs pharmacologiques sont connus et déjà utilisés chez la souris pour inhiber les voies de signalisation suspectées.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mettre en lumière un nouveau facteur alimentaire à prendre en compte dans le régime des patients atteints du syndrome de l’intestin irritable, à savoir la consommation de viandes rouges et charcuteries. Ces données contribueront par ailleurs à préciser les bénéfices/risques et les recommandations nutritionnelles en fer au sein de la population générale. Enfin et surtout, elles devront permettre, par l’approche mécanistique envisagée, de comprendre comment cet inconfort digestif survient. Il s’agit donc d’un prérequis pour envisager à l’avenir de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
24 souris nourries avec un régime supplémenté ou non en fer héminique pendant 3 semaines seront placées chacune 24 heures en cage à métabolisme. 72 souris nourries avec un régime supplémenté ou non en fer héminique pendant 3 semaines seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (analgésiques/myorelaxants) à raison de 1h-2h par intervention pour placer un dispositif de mesure des contractions abdominales. Le nombre de contractions sera compté en réponse à l’application d’une pression intracolique pendant 10 secondes à 4 reprises par palier. Un inhibiteur pharmacologique ou son solvant sera administré par injection intrapéritonéale 2 heures avant la mesure pour inactiver les récepteurs TRPA1 et TRPV1.
Impact sur les animaux
Le stress modéré induit par la stabulation sur grille en cage à métabolisme pourrait modifier la mesure des contractions abdominales, c’est pourquoi ces 24 souris seront uniquement destinées à la collecte des échantillons. Pour minimiser ce stress, une buchette de bois à ronger est ajoutée dans la cage à métabolisme. Pour les souris dont l’amplitude des contractions abdominales sera mesurée, la douleur sera palliée pharmacologiquement pendant l’intervention chirurgicale et en post-opératoire tout en veillant au maintien de la température corporelle par un hébergement dédié en armoire ventilée chauffée, et à la réhydratation des souris. L'injection intra-péritonéale est un geste, rapide et indolore qui sera conduit après convalescence sur les souris vigiles. La pression intracolique appliquée à 4 reprises est associée à un inconfort, un stress et une mobilité réduite de la souris. L’arrêt entre chaque palier permet de retrouver immédiatement un enregistrement de base, signifiant l’arrêt instantané du stimulus douloureux. Si, comme attendu, le/les inhibiteurs pharmacologiques suppriment les effets induits par le fer héminique du régime des souris, alors le ressenti sera similaire à celui des souris sous régime conventionnel. Un personnel compétent ayant l’expérience de ces procédures fera un suivi quotidien pour leur apporter tous les soins nécessaires et maximiser leur bien-être. Il leur assurera en parallèle des manipulations les moins stressantes possibles avec des conditions d'hébergement les plus optimales.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les souris seront mises à mort et divers prélèvements seront effectués post-mortem pour des analyses histologiques et biochimiques ultérieures.
Remplacement
Les modèles cellulaires ont montré que le stress oxydatif généré dans la lumière colique lors de la consommation d’un régime riche en produit carné, pouvaient induire une cytotoxicité différentielle entre des cellules normales et précancéreuses. Cependant, aucune étude in vitro ou ex-vivo à ce stade du projet nous permet d’évaluer les conséquences d’un régime sur la physiologie digestive et plus particulièrement sur la sensibilité viscérale. Seule une approche in vivo intégrée nous permettra de prendre en compte la complexité des répercussions de l'exposition à ces contaminants d’origine alimentaire.
Réduction
Les études précédentes associées à ce projet nous ont permis d’améliorer la procédure en termes de technicité (expérience de l’expérimentateur) et de bien-être (de l’animal). L’amélioration de la prise en charge de la phase opératoire (technicité) et post-opératoire (augmentation de la température de l’hébergement sur 3 jours en armoire à 26°C) a permis de diminuer le nombre d’animaux requis pour aboutir à des résultats significatifs et fiables : de 15 souris initialement par groupe, 12 souris par groupe sont aujourd’hui considérées comme nécessaires pour compenser une variabilité interindividuelle résiduelle. Étant donné l’expertise technique acquise, la reproductibilité des mécanismes induits pour ce projet jusqu’ici, nous estimons qu’une répétition de cette étude ne sera pas nécessaire, ce qui permet de réduire également le nombre de souris requis.
Raffinement
Pour assurer une fiabilité des résultats tout en limitant le nombre d’animaux utilisés, une attention particulière est accordée au bien-être de l’animal (conditions d’hébergement, libre accès à l’eau et à la nourriture, contrôle de l’environnement, respect du cycle jour nuit, manipulations douces). Des buchettes en peuplier disposées sur la litière leur permettront de satisfaire le besoin de ronger. Un abri en aluminium leur permettra de s’y loger. Une observation quotidienne des animaux sera effectuée pour détecter à temps toute anomalie et minimiser la durée de toute souffrance constatée. Toutes les mesures seront prises pour réduire la douleur (anesthésie, prise en charge de la douleur post opératoire, tapis chauffant, hébergement transitoire en armoire chauffée en période post-opératoire, réhydratation...). En parallèle, une combinaison d'analyses statistiques intégratives permettra d'exploiter l'ensemble des données générées et explorer plus finement les intéractions entre l'hôte et son microbiote.
Choix des espèces
La souris est un modèle rongeur largement utilisé pour la mesure de la sensibilité viscérale. Nous avons choisi la lignée C3H/HeN car les travaux précédents de l’équipe avec cette lignée permettent d’avoir maintenant une bonne base de connaissance de sa barrière intestinale, son microbiote, son système immunitaire et de sa réponse à la sensibilité viscérale. Pour l’analyse de la sensibilité viscérale, les animaux seront âgés de 9-10 semaines car il est indispensable d'avoir un tractus digestif à pleine maturité physiologique.
Evaluation de l’imagerie multiparamétrique et spectroscopique pour localiser la zone épileptogène
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
325 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans l'hippocampe pour déclencher une épilepsie, l'implantation d'une pompe sous anesthésie, jusqu'à quatre séances d'IRM et huit jours de médicaments, avant l'analyse de leur cerveau et de leur sang. Le porteur cherche à mieux localiser par imagerie la zone du cerveau à retirer chez les patients épileptiques opérés, les retombées cliniques étant renvoyées à une évaluation en préparation. Il indique qu'une recherche bibliographique n'a révélé aucune alternative in vitro et que les cultures cellulaires ne reproduisent pas la communication entre cellules.
Objectifs
Un tiers des patients épileptiques ne répondent pas correctement aux médicaments antiépileptiques et, parmi eux, 1/4 peuvent bénéficier d'une chirurgie résective. L'identification des zones du cerveau à enlever par chirurgie (la zone épileptogène (ZE)) est un processus difficile. Il nécessite un ensemble d'outils complexes comprenant des examens cliniques, d'imagerie et neurophysiologiques, y compris des enregistrements électroencéphalographiques intracrâniens. Cependant, même en combinant toutes les informations actuellement disponibles, la chirurgie de l'épilepsie ne fonctionne pas correctement chez 20 à 60% des patients. Il est donc nécessaire développer de nouvelles méthodes pour délimiter la ZE. La neuro-imagerie, non invasive et largement disponible dans le contexte clinique, apparaît comme un candidat naturel pour aborder cette question. A terme, l'objectif est d'améliorer la chirurgie chez les patients.
Bénéfices attendus
Les données recueillies dans cette étude nous permettrons de caractériser l'impact de différents médicaments anti-épeliptique sur les mesures IRM (mqMRI et GABA-MRS). Ces informations seront utilisées pour modéliser l'impact attendus des médicaments chez l'homme lors de l'évaluaton clinique qui est en cours de préparation.
Procédures
- Procédures chirurgicales sous anesthésie : i) Injection intra-hipppocampique (induction de l'épilepsie) : durée maximum 1h30. ii) Implantation d'une pompe osmotique sous anesthésie (durée maximum 30min). Maximum deux procédures / animal. - IRM sous anesthésie : maximum 2h30/session IRM, maximum 4 sessions IRM / animal. - Administration de médicaments : durée de quelques minutes / jours pendant 8 jours.
Impact sur les animaux
i) Douleur modérée au moment de l'induction de l'épilepsie, procédure conduite sous anesthésie, ii) Crises épileptiques pendant la phase d'épileptogenèse iii) Douleur modérée au moment du traitement pharmarcologique iv) Douleur légère au moment de l'examen IRM, procédure conduite sous anesthésie
Devenir
Le tissu cérébral et le sang des animaux utilisés dans ce projet est analysé en fin de projet (sauf pour les animaux utilisés pour l'optimisation des protocoles IRM). Tous les animaux sont mis à mort au court du projet.
Remplacement
Nous avons effectué une recherche approfondie sur Pubmed et Google Scholar afin de nous assurer de l'inexistence d'approches alternatives in vitro qui pourraient être utilisées pour reproduire l'interaction entre malformations du développement corticale, crises épileptiques et fonction de la barrière hémato-encéphalique. Nous avons utilisé des combinaisons de mots-clés tels que épilepsie, crise, électroencéphalographie, dysplasie, cerveau, neurone, modèles animaux, in vitro et tests animaux alternatifs. Cette recherche n'a pas identifié de solution in vitro alternative pour notre étude. En effet les méthodes in vitro basées sur la culture cellulaire ne présentent pas les systèmes de communication multicellulaires nécessaires pour ce projet.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats : 15 animaux par groupe sont prévus ainsi que deux groupes pour l'optimisation du modèle animal et de l'imagerie, pour un total de 325 souris sur 5 ans. De plus, nous commencerons ce projet par un groupe préliminaire qui permettra la mise au point du protocole : si cette étude préliminaire révèle que le nombre de rats par groupe est surévalué, nous le réduirons de façon à atteindre un nombre d'animaux nécessaire et suffisant.
Raffinement
L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance (notamment, suppression de la douleur grâce à l’administration d’antalgiques). Les animaux utilisés pour ce projet sont nés et élevés en Europe. Leur nombre a été réduit au minimum nécessaire afin d’obtenir des données suffisantes pour évaluer l’efficacité de cette stratégie d’imagerie pour définir la zone épileptique en cas de prise de médicaments anti-épileptiques.
Choix des espèces
Notre projet propose l'utilisation de petits animaux in vivo (souris). Les souris ont été choisies à cause de leurs caractéristiques neuro-vasculaires et profils électroencéphalographiques bien étudiés. Ils expriment les mêmes marqueurs neuronaux, gliaux et péricytaires que l'Homme. Ils constituent donc un modèle adapté pour les expériences proposées par notre étude, où l'entité neuro-vasculaire complètement fonctionnelle est requise pour investiguer les effets des malformations corticales et des crises. La littérature fournit des preuves de la fiabilité du monitoring électroencéphalographique in vivo et IRM in vivo pour l'évaluation des modifications pathophysiologiques des tissus. De plus, un fort taux de survie est observé lorsque les rongeurs sont utilisés dans ce type d'étude par rapport à d'autres espèces.
Mise au point d’une méthode d’administration orale non invasive chez le rat
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
52 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 36 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 16 modéré. Ils reçoivent des administrations orales répétées pendant 21 jours, soit par gavage soit par une micropipette à l'excipient sucré, subissent deux tests comportementaux (labyrinthe en croix surélevé et openfield), puis sont tués pour doser dans leur sang les substances et les marqueurs de stress. Le porteur présente le projet comme une amélioration du bien-être des rats de laboratoire, la micropipette étant moins stressante que le gavage. Il affirme que cette mise au point doit se faire chez le rongeur puisqu'elle vise à remplacer une technique déjà pratiquée sur lui.
Objectifs
Les études précliniques sont indispensables au développement et à l’évaluation d’une substance active mais également à la détermination d’éventuels effets indésirables de médicaments. Chez le rongeur, il existe de nombreuses méthodes permettant l’administration de principes actifs. Invasives par nature, ces méthodes peuvent entrainer des infections ou lésions au site d’injection. La probabilité de survenue de telles lésions est d’autant plus vraie que la contention – nécessaire à l’administration du principe actif - est mal maitrisée ou moins bien réalisée. De plus, cette contention entraine un stress chez l’animal – qui peut venir à se répéter lorsque le protocole d’administration est chronique. Dans le cas d’étude pharmacocinétique, les modifications des paramètres cardiovasculaires associés à cet état de stress peuvent biaiser l’analyse des données. L’objectif de cette étude est de mettre au point et de valider une méthode non invasive d’administration orale chez le rat ; cette méthode devra non seulement respecter le bien-être animal et de surcroit être comparable à la voie orale chez l’homme. La méthode que nous allons utiliser s’inspire d’une technique décrite et validée chez la souris qui est appellée MDA pour Micropipette-guided Drug Administration (méthode d’administration orale par micropipette). La validation se fera au travers d’une étude pharmacocinétique comparative (gavage versus MDA) de substances actives aux propriétés pharmacologiques et physico-chimiques différentes (prégabaline et aripiprazole). La compatibilité de la méthode à des régimes chroniques d’administration ainsi qu’avec des études comportementales utilisant un nombre d’animaux important seront vérifiées.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de développer un protocole décrivant une méthode d’administration respectant le bien-être animal pouvant être utilisée plus largement en recherche préclinique (notamment chez le rat). La méthode MDA administre à l’aide d’une micropipette, un excipient suffisamment sucré (lait concentré sucré dilué au 3/10ème) pour que les animaux ingèrent son contenu volontairement et que leur motivation reste constante au cours du temps. Cette méthode d’administration peut donc aussi bien être utilisée pour des administrations aiguës de substances actives que pour des administrations chroniques, et ainsi remplacer les techniques conventionnelles plus à risque et plus stressantes. Les bénéfices attendus par rapport aux méthodes conventionnelles sont la diminution du stress dû à la manipulation des animaux (pas de contention) et au fait que cette méthode n’est pas une méthode invasive, la diminution des risques liés aux lésions/irritations des méthodes conventionnelles. De plus, cette méthode étant une méthode d’administration par voie orale, elle se rapproche de la cinétique d’administration la plus utilisée chez l’homme (la voie orale). Cette méthode permet également de minimiser la manipulation des animaux puisque la micropipette peut être présentée aux rats directement à travers la grille de leur cage.
Procédures
Les gestes techniques qui seront réalisés sur les animaux sont des administrations orales : - Administrations aiguës soit par la méthode MDA (micropipette) soit par gavage - Administrations chroniques (1 administration par jour pendant 21 jours) soit par la méthode MDA (micropipette) soit par gavage chronique. En ce qui concerne le gavage, la durée totale de la manipulation de l’animal est de moins de 3 minutes. Pour la méthode MDA, la manipulation de l’animal durera environ 1 minute. Ces administrations sont précédées d’une pesée des animaux.
Impact sur les animaux
Nous souhaitons comparer la méthode testée à une méthode de référence, le gavage, qui peut entrainer un stress chez les animaux notamment du fait de la contention ; mais également des irritations, voire lésions des voies aéro-digestives supérieures. Deux tests comportementaux seront effectués durant l’étude : labyrinthe en croix surélevé et le test de l’openfield. Ces tests peuvent entrainer un stress chez les animaux. Concernant les molécules utilisées pour les administrations, elles ne devraient normalement peu ou pas engendrer d’effets indésirables (risque d’étourdissement, de somnolence ou de légers effets locomoteurs).
Devenir
La mise à mort d’une première partie des animaux permettra d’obtenir des échantillons sanguins pour doser les concentrations en substances actives et vérifier l’équivalence pharmacocinétique entre la méthode MDA et le gavage. La mise à mort de l’autre partie des animaux permettra d’obtenir des échantillons sanguins pour doser des taux de corticostérone et de glucose afin de comparer les niveaux de stress entrainés par les 2 méthodes citées ci-dessus en aigu et en chronique mais également d’évaluer l’impact de l’utilisation d’un excipient sucré sur la glycémie des rats.
Remplacement
L’objectif de cette étude est d’améliorer le bien-être animal, notamment des rongeurs (animaux les plus utilisés lors des essais pré-cliniques), dans la recherche scientifique médicale : diminution du stress, diminution des risques de lésion/irritations par rapport aux méthodes d’administration conventionnelles chez le rongeur. Cette étude vise à améliorer les conditions de manipulation des rongeurs en laboratoire et doit donc par conséquent être effectuée chez le rongeur. De plus, la méthode MDA a déjà été validée chez la souris mais n’a jamais été décrite chez le rat.
Réduction
Le nombre de rats prévu dans les expérimentations a été réduit à son strict minimum. Un seul sexe sera testé afin de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour la première partie de l’étude (étude pharmacocinétique), des groupes de n=4 rats seront formés (2 méthodes d’administration et 2 molécules testées par méthode) pour un total de 16 rats. Pour la deuxième partie de l’étude, en aigu, 3 groupes de n=4 rats seront également formés (groupe MDA, groupe gavage et groupe témoin). En chronique, il y aura 2 groupes de n=10 pour les groupes MDA et gavage. Le groupe témoin a été, quant à lui réduit à n=4. De plus, en utilisant des rats, nous pouvons réduire le nombre d’animaux utilisés car le rat possède un volume sanguin plus important que celui de la souris et nous permet donc de pouvoir effectuer tous les dosages sanguins en un seul prélèvement.
Raffinement
Diverses mesures seront prises pour raffiner les expérimentations qui ne seront réalisées que par du personnel formé et ayant un livret de compétences à jour. Après leur arrivée au laboratoire, les animaux seront stabulés dans des cages par 2 de surface de 1 092cm2 avec une Longueur de 42cm, une largeur de 26cm et une hauteur de 18,5cm, avec un rouleau en carton et des lamelles de papier kraft afin d’assurer un enrichissement minimum, permettant aux animaux de trouver un abri en cas de conflit et d’avoir une activité minimale (construction de nid). Ils seront laissés au repos sans intervention (hormis la surveillance quotidienne et le change de cage bi-hebdomadaire) durant 1 semaine, ensuite ils seront manipulés quotidiennement (handling) durant 1 semaine afin de les habituer petit à petit au contact humain et à la future expérimentation. Les principaux raffinements de cette expérience concernent les méthodes d’administration. En effet l’objectif de cette étude est de mettre au point une méthode d’administration non stressante qui ne nécessite aucune contention : la méthode MDA (Micropipette-guided Drug Administration). Une partie des animaux sera donc traitée par cette méthode. L’autre sera traitée par gavage (méthode comparative). Afin de raffiner la méthode de gavage, nous utiliserons des sondes de gavage en silicone, qui de par leur souplesse, sont moins susceptibles d’entrainer des irritations et/ou lésions chez l’animal. Les animaux seront pesés tous les jours (suivi de poids individuel). Les méthodes d’euthanasies seront adaptées afin de diminuer au maximum la souffrance chez les animaux. Pour une partie des animaux, l’euthanasie par percussion crânienne sera effectuée, celle-ci est rapide et évitera tout stress. Pour l’autre partie des animaux, l’utilisation d’un anesthésique, le pentobarbital par voie intrapéritonéale sera effectuée pour chaque mise à mort, afin de réduire la douleur de la procédure de dislocation cervicale pour le groupe de rats concerné.
Choix des espèces
L’espèce choisie est la rat (Rattus norvegicus), il s’agit avec la souris, d’espèces très utilisées en recherche pré-clinique. Le rat est une espèce facile à maintenir, en termes de coût et de place, son comportement est bien connu et détaillé dans la littérature et sa proximité génétique avec l’espèce humaine permet d’accéder à des mécanismes cérébraux communs et à des fonctions cognitives et des comportements en beaucoup de points similaires et mesurables (anxiété, locomotion). Du fait de sa taille supérieure, le rat possède un plus grand volume sanguin que la souris et permet donc d’augmenter le nombre d’analyses sanguines réalisées tout en diminuant le nombre d’animaux utilisés. De plus, la méthode que nous cherchons à mettre au point n’a jamais été décrite chez le rat. A leur arrivée, les rats seront âgés de 6 semaines, afin qu’ils atteignent l’âge adulte pour le début de la phase de traitement (après les 2 semaines d’acclimatation).
Incorporation d’acides aminés encapsulés dans l’aliment des porcs et effets sur le microbiote digestif et la santé des porcs en période de postsevrage
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Maladies animales
144 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit trois prises de sang sous contention manuelle, décrite comme stressante, autour du sevrage à quatre semaines, pour tester un aliment enrichi en acides aminés encapsulés censé agir sur le microbiote digestif. 36 porcs sont tués dix jours après le sevrage pour prélever leurs tissus digestifs, les 108 autres partant à l'abattoir pour la consommation humaine une fois le poids d'abattage atteint. Le porteur situe le bénéfice attendu du côté de la réduction des antibiotiques en élevage et affirme que la réponse ne peut se mesurer que sur un animal vivant.
Objectifs
Le développement de solutions nutritionnelles a depuis de nombreuses années mobilisé les acteurs de l’alimentation animale et de la recherche pour accompagner la réduction de l'utilisation des antibiotiques lors du sevrage des porcelets. Parmi ces solutions nutritionnelles, celles ciblant le microbiote digestif et la production de métabolites bactériens d’intérêt peuvent aider à renforcer la santé digestive lors du sevrage. Les acides aminés sont des nutriments essentiels à la croissance et à la santé des porcs. Ce sont aussi des nutriments pour les microorganismes présents dans le tube digestif. La fermentation de certains acides aminés par les micro-organismes produit des métabolites exerçant des propriétés antiinflammatoires, trophiques, anti-oxydantes, etc. sur la muqueuse digestive. L’objectif général de ce projet est d’évaluer l’intérêt d’apporter dans l’alimentation du porc des acides aminés encapsulés dans une structure lipidique (particules) pour ne pas être absorbés par l’intestin grêle et être disponibles pour produire, par fermentation, des métabolites dans le gros intestin. Des effets positifs de ces métabolites sur la physiologie et les défenses intestinales et in fine sur la santé du porcelet au sevrage sont attendus.
Bénéfices attendus
Outre d’être des nutriments pour l’animal, les acides aminés sont aussi des nutriments pour le microbiote digestif. Il est attendu que les acides aminés testés arriveront dans le gros intestin pour y être utilisés par la flore digestive et ne seront pas ou peu absorbés par l'intestin grêle. Il est également attendu que ces acides aminés vont modifier la composition du microbiote et leur fermentation par ce microbiote pour produire des métabolites bactériens qui peuvent exercer des effets bénéfiques sur la physiologie intestinale et ainsi préserver la santé des porcelets au cours du sevrage. Nos résultats permettraient d'accompagner les efforts importants des éleveurs de porcs en termes de réduction de l'utilisation des antibiotiques lors de cette période critique de l'élevage des porcs charcutiers.
Procédures
Trois prises de sang seront effectuées sur les porcelets avant le sevrage, 10 jours puis 4 semaines après le sevrage en utilisant du matériel stérile à usage unique. A chaque fois 8 ml de sang seront prélevés par du personnel expérimenté.
Impact sur les animaux
Ce projet a pour finalité de tester une solution nutritionnelle visant à atténuer les effets du sevrage des porcelets tel qu'il est effectué en élevage commercial de porc: les porcelets sont sevrés à un jeune âge (4 semaines) , un âge où les porcelets sont encore immatures du point de vue immunitaires et digestifs et sont donc particulièrement susceptibles aux troubles digestifs se traduisant par des diarrhées. Trois prises de sang seront réalisées en assurant la contention des porcs manuellement. Cette contention est une action stressante pour les porcs.
Devenir
Les 108 porcs laissés en vie sont destinés à la consommation humaine. A l'issue de la procédure ils seront élevés jusqu'au poids d'abattage, abattus dans un abattoir commercial avant de rejoindre la chaine alimentaire. Les 36 porcs de la procédure 2 seront euthanasiés 10 jours après le sevrage pour réaliser des prélèvements de tissus et de contenus digestifs nécessaires aux mesures prévues par le protocole.
Remplacement
L'objectif de ce projet est d'évaluer in vivo l'intérêt d'utiliser des acides aminés encapsulés pour modifier le microbiote du porcelet après le sevrage. Le projet fait suite à des projets réalisés sur des modèles in vitro afin de sélectionner les acides aminés qui seront testés et leur comportement dans des systèmes digestifs artificiels. Il constitue une première étape permettant de confirmer sur animal vivant la modification du microbiote dans les parties basses de l'intestin (gros intestin). La finalité étant la préservation de la santé et la croissance des porcelets au cours de la période critique du sevrage, notre projet a aussi pour objectif d'évaluer un ensemble de réponses mesurables uniquement sur un animal vivant comme le poids, des concentrations sanguines d'indicateurs de la santé et la prévalence des diarrhées.
Réduction
3 lots de 48 porcs (144 au total) seront impliqués dans ce projet. 108 de ces animaux permettront d'évaluer l'effet des traitements expérimentaux sur la vitesse de croissance et l'évolution d'indicateurs sanguins de la réponse au sevrage (inflammation, statut oxydant, intégrité digestive). De précédentes expériences ont montré qu'entre 20 et 40 porcelets étaient suffisants pour mettre en évidence un effet de l'alimentation sur la croissance et les indicateurs sanguins mesurés en postsevrage. L'effectif utilisé ici est dans la fourchette haute car nous nous attendons à des effets très faibles des acides aminés encapsulés sur la croissance dans la mesure où l'aliment témoin non supplémenté est formulé pour couvrir les besoins les porcs. 36 porcs (3 x 12) seront abattus dix jours après le sevrage pour collecter les contenus et tissus digestifs. La littérature montre des effets de supplémentations nutritionnelles avec des effectifs très variable. Dans nos conditions expérimentales, un effectif de 12 est un optimum pour prendre en compte l'influence de facteurs autres que le lot expérimental (mère, sexe).
Raffinement
Les animaux seront suivis et les actes expérimentaux réalisés par du personnel expérimenté en restectant des points limites pour chaque procédure. Les animaux sont observés quotidiennement pour détecter et corriger, si cela n’interfère pas avec le protocole expérimental, les problèmes de santé par des mesures adéquates (prise en charge médicale et exclusion du protocole ou bien euthanasie). Les prises de sang sont réalisées avec une contention manuelle et du matériel vétérinaire à usage unique conformément aux bonnes pratiques.
Choix des espèces
Ce projet est réalisé sur le porc qui est l'espèce cible du projet. Le projet vise à apporter des éléments scientifiques sur le mode d'action des acides aminés médié par le microbiote. Une finalité est d'utiliser ces connaissances en élevage de porc pour accompagner la réduction déjà très conséquente de l'utilisation des antibiotiques au moment du sevrage des porcelets, l'additif étant supposé limiter le risque de dysbiose favorisant les troubles digestifs et diarrhées infectieuses. Les porcs seront impliqués dans ce projet pendant une période qui correspond à la période dite de postsevrage débutant à l'âge moyen de 4 semaines, âge où les porcelets sont séparés de leur mère, jusqu'à l'âge de 10 semaines. Cette pratique est conforme aux pratiques dans les élevages de porcs.
Étude du rôle des neutrophiles dans la thrombose associée au cancer du pancréas.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 188 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 36 modéré. Elles reçoivent une implantation de cellules cancéreuses, soit sous la peau soit directement dans le pancréas au cours d'une chirurgie de 45 minutes, des prélèvements sanguins, puis des modèles de thrombose déclenchée au laser ou une thrombose veineuse maintenue 48 heures. Le porteur étudie le rôle d'un globule blanc, le neutrophile, dans la thrombose associée au cancer du pancréas, en situant au long terme et au conditionnel un meilleur traitement chez l'humain. Il affirme qu'aucune lignée cellulaire ne produit ces cellules en quantité suffisante et que l'intégrité du vaisseau ne se reproduit pas in vitro.
Objectifs
La principale comorbidité du cancer pancréatique est la thrombose. La probabilité de décés de patients developpant un cancer du pancréas et une thrombose est augmentée de 50%. Un type de globule blanc (le neutrophile) est impliqué dans la thrombose. Ce neutrophile est l'élement initiateur de la thrombose. Il existe plusieurs sous population de neutrophiles présents dans le compartiment sanguin. Le but de cette étude est de déterminer la sous population de neutrophiles impliquée dans la thrombose associée au cancer du pancréas. Pour cela nous utiliserons un modèle de cancer du pancréas murin dans le lequel nous testerons leur impact sur le développement de thrombose. Nous évaluerons également le rôle d'un récepteur porté par les cellules cancéreuses dans la progression tumorale et le développement de la thrombose.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux appréhender le rôle des neutrophiles et du récepteur à l’adenosine diphosphate dans la thrombose associée au cancer et dans l’évolution du cancer du pancréas. A long terme cela pourrait permettre de mieux traiter les thromboses associées au cancer chez l’homme.
Procédures
Les animaux seront soumis à des implantations de cellules cancéreuses. Ces implantations sont realisées soit en sous cutanée et d'une durée de maximum deux minutes d'intervention soit directement dans la tête du pancreas, intervention de 45 minutes. Ces procédures sont realisées sous anesthsesie, les animaux sont surveiller gràce à des grilles specifiques d'evalaution de la douleur et seront traités par des analgesiques si necessaire. Des prélèvements sanguins sont realisés sous anesthesie volatile (durée 5 minutes maximum) et sont espacés d'au moins une semaine. Les modèles de thromboses spontanée et induite par laser sont des expériences sans reveils. Le modéle induit de thrombose veineuse necessite 48 heures de developpement les animaux sont sous analgèsique durant ces 48 heures.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues pour les animaux sont de la douleur pouvant être induite par la croissance du cancer et leurs métastases. Dans le cas des deux types d’implantation les animaux sont étroitement surveillés et la douleur est évaluée grâce à des grilles de scores adaptées à chaque type d’implantation, en fonction du score les animaux sont traités par analgésique à dose croissante. Nous veillions également à ce que les animaux soient bien hydratés, ils reçoivent tous une injection de solution saline en sous cutané après les opérations chirurgicales . Nos points limites qui sont précoces, l’utilisation des grilles d’évaluation de la douleur et notre connaissance de ces modèles nous permettrons de limiter le plus possible la douleur des animaux.
Devenir
Les animaux sont tous euthanasiés à la fin des procédures, différents organes seront prelevées en post mortem.
Remplacement
Les neutrophiles, les plaquettes et les cellules endothéliales sont des cellules clefs dans l’immunothrombose et de l’immonothrombose associée au cancer. A ce jour, Aucune lignée cellulaire immortalisée ne permet de produire dans des proportions satisfaisantes des neutrophiles et de plaquettes. D’autre part, Il n’est pas possible de reproduire à l’heure actuelle l’intégrité du vaisseau, ni l’activation des cellules endothéliales in vitro.
Réduction
Dans une première phase nous testerons plusieurs modèles pour caractériser et produire une sous population de neutrophiles particuliers. en parallèle nous testerons des strategie in vivo. Ces stratégies seront nous l’espérons plus efficace que la production in vitro déjà testée qui ne permet de produire suffisamment de neutrophiles de la sous population recherchée viables à ce jour dans notre laboratoire. Nous ne reproduirons les résultats que pour le groupe présentant les meilleurs taux de neutrophiles recherchés pour les tester sur les modèles de thrombose. D’autre part à résultats identiques entre les deux groupes in vivo nous choisirons le modèle préclinique présentant le moins de sévérité pour réaliser les deux modèles induits de thrombose .
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes de 5, en présence de coton de nidification ; avec boisson et nourriture adlibitum. Une période de 7 jours d’acclimatation sera réalisé pour tous les animaux avant expérimentation. Les animaux sont suivis et pesés quotidiennement après implantations. Les implantations sont réalisées sous anesthésie accompagnées d’analgésique. Les animaux sont observés toutes les 12 heures durant les 48 premières heures suivant les implantations, en cas de signe de souffrance les animaux seront administrés avec un analgesique. La visualisation de la thrombose spontanée est sans reveil et realisée sous anesthesie. Les animaux seront euthanasiés par un excès d’anesthésiques. Le modèle au laser est une expérience sans réveil réalisés sous anesthésie, les animaux seront euthanasiés par un excès d’anesthésique. Dans le cas du modèle de thrombose veineuse, les animaux sont pendant toute la durée de l’expérience jusqu’48 heures sous anagesique et sont euthanasiés par dislocation des cervicales sous anesthésie volatile.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle de choix pour l’étude préclinique de la thrombose. En effet la formation d’un thrombus dans le modèle murin est excessivement proche de celle de l’Homme, aussi bien au niveau des molécules que des cellules impliquées. Le modèle murin offre également la possibilité de travailler sur des animaux transgéniques, pour ce projet nous avons choisi d’utiliser en plus des animaux sauvages des souris transgenique sur le recpteur de l'adénosine diphosphate. Les animaux seront utilisés entre la 5eme semaine et la 12 eme semaine. Les expériences seront effectuées sur des animaux adultes (pancréas mature) puisque les cancers du pancreas se developpent chez l'Homme Adulte.
Evaluation de l’efficacité de plusieurs doses de vecteurs AAV dans le cadre de la mise en place d’une approche de thérapie génique dans un modèle murin de la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
354 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 288 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 66 modéré. Elles subissent une chirurgie du cerveau avec mise en barre d'oreille et craniotomie, l'injection d'un virus AAV dans le striatum, puis des tests moteurs répétés (openfield, rotarod, analyse de la marche) de 4 à 12 mois et un prélèvement de sang et de liquide céphalorachidien avant la mise à mort. Le porteur teste une thérapie génique contre la maladie de Huntington, les retombées pour les patients restant renvoyées à un futur essai clinique. Il affirme que seuls les modèles murins miment fidèlement la pathologie et que la preuve de concept chez les rongeurs est exigée par l'ANSM.
Objectifs
Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington (MH) sont une préoccupation croissante en santé publique. Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe encore aujourd’hui aucun traitement capable de combattre de façon efficace la progression de ce type de maladies. De nouvelles approches thérapeutiques sont essentielles pour améliorer la qualité de vie des patients. Parmi ces nouvelles approches prometteuses se trouve la thérapie génique. Elle utilise l’ADN pour soigner ou prévenir de la maladie. Selon la pathologie, cet objectif peut être atteint en délivrant aux cellules un gène sain qui prendra le relai du gène déficient et un inhibiteur du gène qui permettra de réduire l’expression délétère de ce gène déficitaire. Un virus modifié (AAV) non pathogène nous permettra de délivrer cet ADN avec cette inhibiteur au cœur même des cellules. Nous avons déjà la preuve de concept de notre stratégie dans des modèles murins pour la maladie de Huntington : l’enzyme déficiente à l’origine de la pathologie est remplacée par cet ADN permettant la synthèse d’une enzyme assurant la fonction normale permettant de corriger les anomalies neuropathologiques et comportementales chez la souris malade. Le but est de tester l’efficacité des AAV exprimant un gène témoin ou des gènes thérapeutiques (pour éteindre l’expression de la protéine huntingtine mutée) sous contrôle des promoteurs qui ciblent de façon spécifique les neurones dans différentes régions du cerveau des modèles murins pour la MH
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de tester l’efficacité et de trouver la dose efficace minimale d’un AAV exprimant le gène thérapeutique dans la région cible du cerveau (striatum) du modèle murin pour la MH, en injectant le même lot qui va être utilisé chez les patients atteints de la MH dans le cadre du futur essai clinique.
Procédures
Les animaux commerciaux seront soumis à 8 semaine d’âge à une injection stéréotaxique sous anesthésie générale (durée de 70 min), animal endormi avec une prise en charge analgésique afin d'éviter la douleur, par l'administration d'analgésiques avant et après la chirurgie. A 11 semaines d’âge, les animaux seront euthanasies pour l’analyse post mortem des tissus. A partir de 6 mois d’âge, les animaux modèles de la maladie d’Huntington développeront un phénotype dommageable. Ces animaux seront soumis à 2 mois d’âge à une injection stéréotaxique sous anesthésie générale (durée de 70 min), animal endormi avec une prise en charge analgésique afin d'éviter la douleur, par l'administration d'analgésiques avant et après la chirurgie. Les animaux modèles pour la maladie d’Huntington seront soumis à tests comportementaux des 4 mois d’âge. L’openfield sera réalisé a 4, 6 , 8 et 11 mois avec une session de 10 minutes a chaque fois. Le rotarod est réalisée en 3 session pendant 3 jours et est réalisés a 4, 5, 6, 7 , 8 , 9, 10, 11 et 12 mois d’âge. Enfin le gait analysis est réalisé a 12 mois + 1 semaine et consiste en 3 sessions de 10-30 secondes. A 12 mois d’âge, un prélèvement unique de sang et de LCR seront effectués avant euthanasie pour l’analyse post mortem des tissus.
Impact sur les animaux
Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. Un risque traumatique mécanique local relativement faible peut être également être observe suite l’injection de l’aiguille dans le striatum des souris. Une perte de poids dû a l’injection de AAV pourrait être observé, 5 à 7% du poids total de l’animal, (selon nos précédentes études), bien que les concentrations des AAVs utilisées ont déjà été évaluées in vitro et dans nos précédentes études afin d’éviter toute toxicité chez la souris. L’injection de AAV avec le gène thérapeutique améliore l’état général de l’animal ; améliore les performances motrices, présente un effet trophique au niveau des neurones.
Devenir
Les animaux d’intérêt produits/commerciaux seront maintenus en vie pour la chirurgie stéréotaxique et/ou les tests comportementaux. Les souris seront euthanasiées de 3 semaines a 10 mois après les injections décrites , pour continuer les différentes études moléculaires et cellulaires.
Remplacement
A ce jour, seuls les modèles murins de la MH permettent de mimer suffisamment fidèlement la pathologie et donc d'être utilisés dans des études d'efficacité de nouveaux traitements. Toutes les études in vitro possibles ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des AAVs. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de l’approche thérapeutique chez l’Homme, nécessite une preuve de concept chez les rongeurs (souris modèle). Ces étapes sont requises par l’ANSM pour toute demande d’autorisation d’étude clinique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (354) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. En effet, des travaux précédents ont permis d’établir les doses de vecteur à injecter et les temps d'analyses.
Raffinement
Afin de réduire la douleur lors de la mise en barre d’oreille nous enduisons préalablement les barres d’oreilles de crème analgésique. Le geste réalisé pour la craniotomie est maitrisé au sein de l’équipe et les risques de saignement n’apparaissent que rarement. Pour limiter le risque de traumatisme mécanique local, relativement faible lié à l’injection, nous utilisons des aiguilles fines 32G de type 3 non biseautés acquise avec l’expérience de nos études précédentes).. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance.; 6h après l’acte chirurgical, une première injection d’analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. 24h après une fiche de scoring est remplie pour tout animal et une deuxième est réalisée. 4h/5h après cette injection les animaux seront observés par l’expérimentateur pour examiner les animaux et vérifier qu’aucun signe de douleur est détecté. Si besoin, une injection d’analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. La prophylaxie de la douleur sera donc adaptée à l’examen clinique de l’animal. Le protocole d’analgésie post opératoire a été décidé avec l’accord du vétérinaire. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. L’application de critères d’arrêts en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. Le suivi est renforcé au cours des 48h suivant la chirurgie puis celle-ci est ensuite allégé a 1 fois par semaine sauf a l’approche de points limites. De plus, le suivi du poids et les tests comportementaux étant réalisé de façon mensuelle (période de repose d’une semaine entre chaque test, il favorise un suivi renforcé). Les animaux seront hébergés en groupe et un igloo sera ajouté dans chaque cage stabulée en portoir ventilé.
Choix des espèces
L’objectif de cette étude est d'évaluer l’efficacité et de trouver la dose efficace minimale de notre produit dans la région cible du cerveau (striatum) du modèle murin pour la MH, en injectant le même lot qui sera utilisé par la suite chez les patients atteints de la MH dans le cadre du futur essai clinique. Nous commencerons donc par valider l'expression de notre produit , dans des souris saines avant son utilisation future chez un modèle de souris de la MH. Les souris qui seront utilisées sont des souris âgée de 2 mois, dans lesquelles nous avons déjà optimisé les coordonnées d'injection dans le cerveau.
Facteurs génétiques de régulation de la fonction surrénalienne chez la souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent une injection intraveineuse d'un vecteur réduisant un gène des glandes surrénales, un prélèvement de sang, puis passent deux tests comportementaux, l'exploration d'un nouvel environnement et un test d'enfouissement. Le projet étudie le rôle génétique de la réponse au stress, en vue de cibles thérapeutiques renvoyées au conditionnel. Le porteur affirme que ces boucles de régulation entre cerveau et surrénales se modélisent difficilement en culture.
Objectifs
Une situation physique comme émotionnel perçue comme dangereuse, provoque une réaction de stress de l’organisme pour y faire face. Cela se traduit physiologiquement, notamment, par la synthèse d’hormones par les glandes surrénales. Cette réaction est fondamentale et permet de mobiliser l’organisme pour répondre au danger par des réactions physiologiques et comportementales. La régulation de la synthèse des hormones surrénaliennes est complexe et dépend en partie de la génétique propre à chacun, ce qui peut expliquer en partie pourquoi la réponse au stress peut être différentes d’une personne à l’autre. Le but de ce projet est de mieux comprendre cet aspect génétique, en étudiant les conséquences de la variation d’un gène régulateur de la synthèse hormonale dans les surrénales sur le stress et la réponse au stress. Ce projet sera mené chez la souris adulte, par l’étude d’une lignée de souris transgénique permettant la réduction de l’expression de ce gène dans les surrénales. Ces conséquences seront mesurées sur la synthèse hormonale, le comportement anxieux et l’anatomie surrénalienne.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension du fonctionnement surrénalien, incluant ses dysfonctionnements. En effet, si le stress est un mécanisme de défense indispensable du corps, ses conséquences peuvent être néfastes à long terme. Les connaissances nouvelles que devraient permettre ce projet, en plus des avancées dans la compréhension du fonctionnement des surrénales, pourraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour réguler la réponse au stress. Les résultats obtenus sont mis à la disposition de tous via leur publication dans la presse spécialisée.
Procédures
Ce projet comporte deux procédures, l’une de classe modérée et l’autre de classe légère, qui reposent sur l'invalidation de notre gène d'intérêt sélectivement dans les surrénales par l’administration d'un vecteur par injection intraveineuse, rapide et peu invasive. Nous en étudierons l’impact sur la production d’hormones et le comportement de réponse à un stress léger. Ainsi, 2 semaines après l’injection, un bilan hormonal sera réalisé sur un prélèvement sanguin. 3 semaines après injection, les souris injectées seront incluses dans des analyses comportementales mettant en jeu des comportements naturels et comparées avec un groupe témoin : exploration d’un nouvel environnement et interaction avec des objets inconnus. A l’issue de ces expériences, les souris seront euthanasiées et les surrénales prélevées post-mortem pour corréler les résultats hormonaux et comportementaux avec des analyses histologiques des surrénales.
Impact sur les animaux
Le projet repose sur l'injection intraveineuse d'un vecteur réalisée sous contention. Cette opération est simple, rapide et peu invasive car le volume injecté est très petit (0,1 ml). Le vecteur injecté induira une réduction de la synthèse d’hormones surrénaliennes qui sera quantifiée sur un prélèvement unique d’un petit volume de sang. Les mêmes animaux effectueront également un test d’exploration et un test d’enfouissement, pour évaluer leur stress. Il s’agit de tests rapides reposant sur des comportements naturels de l’animal et ne nécessitant pas d’apprentissage. Ils sont donc peu stressants. L’ensemble de ces nuisances sont réparties en deux procédures, l’une de classe modérée et l’autre de classe légère.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre une analyse à postériori de leurs surrénales prélevés post-mortem. Cela permettra de corréler l'efficacité du vecteur aux conséquences anatomiques et/ou comportementales induites par l'invalidation génique.
Remplacement
L’étude de la réponse au stress par les surrénales implique d’étudier un organe au sein duquel dialoguent différents types cellulaires, qui sont eux-mêmes régulés par des interactions à longue distance avec le cerveau. Ces boucles de régulation physiologiques peuvent difficilement être modélisées, ou reproduites en culture ce qui justifie de réaliser des expériences chez l’animal.
Réduction
Les procédures sont conçues pour réduire le nombre d'animaux inclus dans le projet. La première procédure permet à la fois l’étude de l’effet de l’expression génique sur les surrénales et la recherche de la dose efficace de vecteur à administrer. Cela permettra à la seconde procédure une efficacité optimale des conditions expérimentales pour réduire le nombre d'animaux à inclure en réduisant le risque d’avoir à la répéter. Enfin chaque prélèvement réalisé sera scindé en plusieurs séries, ce qui permettra de réaliser de nombreuses expériences sur chacun des prélèvements, sans avoir besoin de traiter de nouveaux animaux.
Raffinement
Les conditions d’hébergement de nos souris sont prévues pour minimiser le stress pendant la croissance et la période expérimentale : hébergement par fratries de même sexe, présence d'ouate et d’igloos dans les cages pour faciliter la construction de nids. Tout au long du projet, le bien-être des animaux sera évalué quotidiennement selon une grille de scoring multicritères dont les critères seront adaptés à chaque procédure. Cette évaluation individualisée contiendra deux paliers : le premier déclenchant une surveillance renforcée deux fois par jour et le second déclenchant l’arrêt de l’expérience s’il est atteint. Les conditions expérimentales seront optimisées pour causer une douleur minimale et un stress réduit : injection intraveineuse optimisée, prélèvement sanguin de petit volume effectués à une veine superficielle, examen fonctionnel non-invasif analysés sur vidéos, par l’observation de la réalisation de tâches naturelles de la souris (exploration, enfouissement).
Choix des espèces
Ce projet propose d'étudier le rôle de l’expression génique dans les fonctions endocrines des surrénales. -Cette approche génétique nécessite de travailler sur des animaux chez lesquels les outils génétiques sont disponibles et fiables. Notre équipe travaille de longue date sur cette approche. Nous avons développé des outils génétiques et des approches histologiques efficaces. -Notre projet repose en partie sur des analyses hormonales, comportementale, ce qui nécessite une espèce avec des tests validés. Seule la souris remplit l’ensemble de ces critères. En particulier, les tests que nous proposons d’utiliser sont validés par de nombreuses publications.
Etude du taux de néomutations sur des embryons bovins produits selon différentes biotechnologies
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
9 génisses vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées vivantes à l'issue. Chacune subit des synchronisations hormonales, des collectes d'embryons et des ponctions ovariennes répétées sous anesthésie épidurale, jusqu'à six à huit ponctions pour la condition d'édition du génome. Le projet mesure le taux de mutations dans des embryons produits selon trois biotechnologies de la reproduction, dont l'édition génétique. Le porteur affirme qu'aucune autre espèce ni aucun modèle ex vivo ne peut se substituer aux génisses pour cette étude liée à la sélection des bovins.
Objectifs
Depuis plusieurs dizaines d’années, différentes biotechnologies de la reproduction sont développées chez les bovins, principalement pour augmenter le progrès génétique annuel réalisé dans le cadre des schémas de sélection. Encadrés par l’Etat, ces programmes d’amélioration génétique des bovins ont permis d’améliorer considérablement les performances des élevages selon les critères souhaités par la Société (limités initialement aux critères de production, ces critères s’élargissent à la durabilité des systèmes de production intégrant des notions de faible impact environnemental, de bien-être et de longévité des animaux…). Ces biotechnologies de la reproduction comprennent notamment (1) la production d’embryons in vivo consistant en la récupération d’embryons présents dans le tractus femelle 7 jours après insémination d’une femelle donneuse, (2) la production d’embryons in vitro consistant en la récupération d’ovocytes en vue de leur fécondation et de leur développement in vitro ainsi que (3) la technologie d’édition du génome permettant d’effectuer des modifications génétiques ciblées, en particulier dans l’embryon. Si certaines de ces technologies sont utilisées à des fins agronomiques (production d’embryons in vivo et in vitro), d’autres ne sont aujourd’hui étudiées qu’à des fins expérimentales (édition du génome). Les potentialités de cette dernière sont énormes dans le domaine médical ou l’élevage mais son utilisation fait débat, tant sur le plan éthique qu’en termes de biosécurité. En particulier, des questions se posent quant au risque de générer des néomutations hors cible. Au-delà des développements techniques pour améliorer leur efficacité, il convient d’étudier les conséquences de ces technologies plus finement et notamment leurs impacts sur l’intégrité de l'ADN. Le projet présenté vise à étudier le taux de néo-mutations post-zygotiques dans des embryons produits selon trois technologies différentes : in vivo (condition 1), in vitro (condition 2) et in vitro avec édition du génome (condition 3).
Bénéfices attendus
Le projet présenté ici permettra l’acquisition de connaissances fondamentales nécessaires au développement raisonné de ces technologies.
Procédures
La production des embryons selon les 3 biotechnologies nécessitera la répétition, pour chaque génisse du projet, de 1 à 2 collectes d’embryons pour la condition 1, de 1 à 2 ponctions ovocytaires pour la condition 2 et de 6 à 8 ponctions ovocytaires pour la condition 3. Ces collectes d'embryons et d'ovocytes nécessitent un ensemble d'interventions sur les animaux: synchronisation des chaleurs (pose et retrait de dispositifs vaginaux, injection intra-musculaire), ponctions ovariennes mutliples sous contrôle échographique, traitement de superovulation (injections intramusculaires répétées), inséminations animales et lavage non invasif de l'utérus (condition 1 uniquement). Les ponctions ovariennes et le lavage de l'utérus seront effectuées sur animaux vigiles anesthésiés. es productions d'embryons selon les 3 conditions se feront selon un dispositif en carré latin, le premier lot de femelles produisant les embryons selon les conditions 1, 2 puis 3 alors qu'en parallèle, le deuxième lot produira les embryons selon les conditions 2, 3 puis 1 et enfin le 3ème lot selon les conditions 3, 1 puis 2.
Impact sur les animaux
La procédure expérimentale utilisée dans le cadre de ce projet comprend des biotechnologies de la reproduction couramment utilisées (collectes d'embryons et d'ovocytes) par les entreprises de sélection dans le cadre des schémas d'amélioration génétique. De ce fait, le projet présenté n'est susceptible d'engendrer qu'une douleur légère et très ponctuelle chez les génisses. Les collectes d'embryons et d'ovocytes seront réalisées sous anesthésie épidurale. Les animaux seront suivis de façon journalière. En cas d’atteinte du point limite (posture de compensation, station prolongée debout ou couché, difficulté pour manger et boire, modification comportementale induite par stimulation de la zone douloureuse, lésions, modifications neurovégétatives ou physiologiques), la décision sera prise d’euthanasier l’animal en concertation avec le vétérinaire sanitaire de l’élevage. Dans ce cas de figure, l’euthanasie sera effectuée par le vétérinaire sanitaire par injection lente par voie intraveineuse d’une surcharge de barbituriques après une sédation préalable.
Devenir
Toutes les génisses seront gardées en vie à la fin de cette procédure sauf avis contraire du responsable scientifique et du vétérinaire sanitaire.
Remplacement
Compte tenu de l’objectif même de l’étude, le modèle animal ne peut être substitué par un modèle d’étude ex vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été déterminé en fonction du nombre d’embryons à produire à partir d’un mâle (afin contrôler la variabilité introduite par le père, dont le statut physiologique peut influer sur le nombre de mutations germinales mâles) pour étudier la fréquence de néo-mutations post-zygotiques. En effet, si l’on considère qu’il est attendu environ 50 néomutations naturelles (i.e. en condition vivo) et que l’on souhaite détecter une augmentation de 10% (soit 5 néomutations supplémentaires) induite par l’un ou l’autre des conditions expérimentales, il est nécessaire de produire 30 embryons par catégorie pour atteindre le seuil de significativité fixé. L’utilisation de 9 génisses permet de limiter le nombre d’intervention sur chaque animal.
Raffinement
L’étude est mise en place sur 9 génisses qui seront ainsi hébergées dans une stabulation libre avec aire paillée intégrale, facilité d’accès à l’auge et à l’eau. Les génisses donneuses utilisées dans ce projet seront placées sous surveillance quotidienne (activité, comportement) et hébergées dans une stabulation répondant aux normes de bien-être animal chez cette espèce (accès aisé à l'auge et aux points d'abreuvements, présence de tapis caoutchouc derrière pour le confort des aplombs, accès à des brosses latérales et dorsales...). De plus, une anesthésie épidurale sera réalisée préalablement aux collectes d’embryons et aux ponctions ovocytaires. Enfin, dans un objectif de renforcement positif, une récompense alimentaire (concentrés, seau de mélasse à lécher,....) sera donnée aux femelles après chaque passage dans la cage de contention pour les collectes d'embryons et d'ovocytes.
Choix des espèces
Compte tenu de l’objectif même de l’étude, aucune autre espèce animale ne peut être choisie. La race Prim’Holstein choisie est la 1ère race laitière française en effectif, et est particulièrement concernée par les biotechnologies de l’embryon sur le terrain. Afin de produire les embryons du projet, il est nécessaire d'utiliser des génisses, toutes pubères et âgées de 14 à 18 mois. Le modèle génisse a l’avantage, par rapport à un modèle vache, de ne pas présenter de biais expérimentaux liés à l’historique des femelles (conditions de mise bas, interactions avec la production laitière….).
Tests précliniques chez la souris modèle de leucémie
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 2 700 un niveau modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines, des traitements à évaluer et jusqu'à huit prélèvements de sang, avec un suivi de la maladie par imagerie sous anesthésie. Le porteur agit comme prestataire de services pour des laboratoires publics ou privés qui testent leurs candidats-médicaments. Il affirme que le passage au modèle in vivo est "indispensable" et que la souris est le rongeur le plus utilisé pour modéliser cette maladie.
Objectifs
Les leucémies et maladies apparentées, en forte augmentation et affectant aujourd’hui 2,3 millions de patients dans le monde, sont le plus mortel des cancers du sang et touchent environ 9 000 personnes chaque année en France. Ce sont aussi le premier cancer de l’enfant. Le besoin médical insatisfait est donc considérable. Dans ce contexte, notre plateforme propose à ses partenaires de réaliser des tests précliniques chez la souris afin d'évaluer l'efficacité de leurs différentes stratégies thérapeutiques innovantes les plus prometteuses in vitro. L’objectif de cette demande est donc de développer des modèles précliniques robustes, pour évaluer l’effet anti leucémique in vivo de thérapies innovantes en utilisant des modèles de lignées cellulaires et des échantillons de patients leucémiques déjà bien caractérisés.
Bénéfices attendus
En tant que prestataire de services, nous réalisons ces études pour des laboratoires partenaires publics ou privés. Dans ce projet, nous offrons la possibilité à la communauté scientifique de pouvoir évaluer l’efficacité de nouveaux candidats thérapeutiques à l’aide de modèles précliniques dont nous assurons la reproductibilité et la robustesse nécessaires au développement des projets en immuno-oncologie. Bien que ces modèles demandent à être améliorés, ils ont permis de reproduire chez la souris certains aspects des pathologies humaines et, en complément des autres modèles expérimentaux, ils laissent ainsi espérer le développement dans un futur proche de thérapies innovantes.
Procédures
L’ensemble des animaux recevra des administrations de candidats thérapeutiques dont la fréquence et la route seront dépendantes de la pharmacocinétique du composé à évaluer. Unje partie des animaux subiront une transplantation de cellules leucémiques humaines (1 injection durant 1 min / animal) ainsi que des prélèvements sanguins (au maximum 8 sur 6 mois) réalisés sous anesthésie volatile ( 5 min/souris), en alternant les sites de prélèvement et espacés d’au minimum 15 jours afin de favoriser la cicatrisation. Enfin, lorsque possible, le développement de la leucémie sera effectué hebdomadairement par imagerie optique par bioluminescence, un procédé non invasif mais nécessitant l’anesthésie des souris (durée= 6 à 10 minutes/souris).
Impact sur les animaux
Les animaux seront transplantés avec des cellules leucémiques et développeront donc une pathologie humaine potentiellement grave. L'administration des traitements à évaluer constituera une nuisance sur les animaux. L'anesthésie ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de caractériser ex-vivo le développement leucémique en fonction des conditions expérimentales.
Remplacement
Notre projet se fera dans la continuité d'études in vitro. Le passage au modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez les patients. Nous avons besoin d’un modèle permettant de reproduire d’un point de vue phénoménologique toute la complexité de la croissance leucémique. Un organe isolé ou une espèce, autre que les mammifères, ne permettra pas d’évaluer la biodistribution du candidat thérapeutique évalué ni les éventuels phénomènes de résistance. La souris est alors le modèle rongeur le plus utilisé permettant de modéliser cette pathologie humaine et de faire un suivi de croissance leucémique.
Réduction
Ce projet sur 5 ans présente un nombre maximum de 3500 souris, cependant ces études seront menées avec un système de GO/No GO. Une première étape permettra de vérifier l’absence de toxicité des composés à évaluer. Si des problèmes de tolérance sont identifiés, l’étude de cette molécule sera interrompue. Dans le cas contraire, l’étude sur lignées cellulaires leucémiques transplantées sera initiée =étape 2. Pour l’étape 3, s’agissant de l’étude à partir de greffes de prélèvements de patients, seuls les composés ayant des résultats positifs à l’étape 2 seront lancés. Afin de réduire au strict nécessaire le nombre d’animaux, un calcul d’effectif pour chaque groupe sera réalisé sur la base de notre expérience et de la littérature scientifique du domaine. D’autre part, dès que possible, nous procèderons à la mutualisation de groupes contrôles.
Raffinement
Dans un souci de raffinement, le suivi du développement leucémique se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés peu ou pas invasifs (dosages sur prélèvements sanguins ou d'imagerie optique). De même, l’ensemble de ces procédures de prélèvements et d'imagerie sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température ; renouvèlement d’air ; éclairage artificiel avec alternance jour/nuit). Afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés et/ou de coton. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal.
Choix des espèces
Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type de développement chez l’homme en l’absence de données précliniques. Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’un individu d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ce type de modèle d’injection de cellules leucémiques humaines, c’est à dire des souris « jeunes adultes » âgées de 6 à 12 semaines au moment de la greffe.
Analyse du role de Trim47 dans la barriere hémato encéphalique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 039 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie, des nouveau-nés placés avec leurs mères dans un caisson à 75 % d'oxygène, d'autres recevant un agent provoquant une hypertension ou une toxine bactérienne, subissent des injections de virus puis des tests d'apprentissage et de mémoire. Le projet fondamental étudie le rôle du gène Trim47 dans l'atteinte des petits vaisseaux du cerveau. Le porteur affirme que la physiologie complexe des vaisseaux ne peut être reproduite in vitro de façon satisfaisante.
Objectifs
Les récents progrès obtenus en imagerie par résonance magnétique (IRM) ont permis de mettre en évidence des images anormales au niveau du cerveau chez des patients atteints de maladies neurodégenératives : on parle de taches blanches ou de zones d’hyper-signal de la substance blanche. Ceci est le résultat de processus de démyélinisation ou de destruction de la myéline. Ces zones d’hyper-signal de la substance blanche sont associées à un risque accru de dysfonctionnement cognitif et moteur, de démence, de dépression et d’accident vasculaire cérébral. Le développement de ces lésions tissulaires seraient dues à une atteinte des petits vaisseaux cérébraux profonds. Malgré une héritabilité importante, peu de loci génétiques ont été identifiés. Une récente étude génétique a permis l’identification d’un nouveau gène de susceptibilité. Nous voulons dans ce projet fondamental comprendre le rôle de ce gène dans les pathologies neuro dégenératives en utilisant des modèles murins génétiques.
Bénéfices attendus
La prévalence des maladies neurodégenératives présentant des démences vasculaires augmente constamment avec le vieillissement de la population. Les études réalisées à partir de cohorte de patients atteints de troubles de démence ont permis d’identifier des marqueurs génétiques. Il est nécessaire maintenant de comprendre le rôle de ces gènes. La combinaison de modèles murins génétiques et de modèles pathologiques permet d’accroître cette connaissance. Identifier les mécanismes impliqués dans ces altérations du fonctionnement des petits vaisseaux cérébraux constitue aujourd'hui un véritable enjeu de santé publique pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Nous développerons plusieurs modèles pathologiques chez la souris afin de créer (1) un stress hypoxique (modèle d’hypoxie néonatales) (2) un stress d’hypertension systémique (3) stress inflammatoires du cerveau. Nous analyserons les conséquences sur les troubles de comportement, et l’apparition des marqueurs de dégénérescences neuronales et vasculaires. Le modèle d’hypoxie néonatales : Nombre d’animaux : 700. Des souriceaux nouveaux-nés 7 jours après leur naissance ainsi que leurs mères sont mis dans un caisson à 75 % d’oxygène. A P12, les souris retournent à une atmosphère normale avant d’être euthanasiées. Modèle d’hypertension artérielle systémique et trouble cognitif : Nombre d’animaux : 115. Les animaux auront : injection de virus en retroorbitaire sous anesthésie gaseuse, puis 2 semaines après, une implantation en sous cutanée de pompe diffusant un agent hypertenseur sous anesthésie gaseuse puis 3 semaines après ils seront analysés chaque jour pour l’apprentissage d’une tache pendant 5 jours. Une analyse de flux cérébral sera faite sous anesthésie avant euthanasie. Modèle de stress inflammatoires : Nombre d’animaux : 224. Les souris adultes (2 mois) auront : une injection de virus en retroorbitaire sous anesthésie gaseuse. Après 2 semaines, les souris seront inclues pour l’apprentissage d’une tache pendant 5 jours. Puis elles seront injectées avec une solution de toxine bactérienne à faible dose par voie intra péritonéale pendant 5 jours successifs. 6 heures après chaque injection elles seront soumises dans le test de mémoire. Elles seront euthanasiées à la fin du protocole soit pour une analyse histologique des tissus après une perfusion intracardiaque soit pour analyse moléculaire après dislocation. Un ensemble de souris suivront le meme protocole mais sous un régime supplémenté avec t-butylhydroquinone (tBHQ) (1% W/W) (agent anti oxydant) 2 semaines avant le protocole et maintenu pendant tout le protocole inflammatoire.
Impact sur les animaux
Le modèle d’hypoxie néonatale : Les altérations du comportement pourront apparaître entrainant un arrêt de l’expérience : 1/ Altération du comportement de la mère : ne se nourrit plus ; ne bouge plus ; délaisse et ne nourrit plus la portée ; les nouveaux nés sont dispersés dans la cage. 2/ Altération du comportement des nouveaux-nés : immobilité, arrêt de l’allaitement, exclusion du nid par la mère. Le stress inflammatoire : Les complications aigues pourront être l’apparition d’un syndrôme inflammatoire aigu. Cela entraine un arret de la mobilité de l’animal, une prostration, une altération de son apparence avec des poils ébouriffés et une diminution significative de la prise alimentaire. Modèle d’hypertension : les complications aigues pourront être des accidents cérébro vasculaires (l'animal montre des changements de mobilité, souvent déplacement en cercle) ou des infarctus cardiaques (animal reste prostré peu vigile).
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce protocole seront ensuite euthanasiés. Tous les animaux sont euthanasiés pour des prélèvements de sang et et de tissus pour des analyses post mortem.
Remplacement
Ce projet sera réalisé en utilisant des modèles murins qui reproduisent des lésions neuropathologiques avec atteintes des petits vaisseaux du cerveau décrites dans les maladies neurovasculaires, ainsi que les signes cliniques associés à ces maladies, comme les déficits d’apprentissage et de mémoire. L'intégrité vasculaire dépend d'interactions multiples entre différents types cellulaires. Il est encore très difficile d'appréhender in vitro les interactions entre le tissu environnant et les réseaux tridimentionnels des vaisseaux et les altérations du phénotype vasculaire sur la fonction d'un organe (notamment le cerveau). L'expérimentation in vivo en association avec l'utilisation de souris transgéniques délétées spécifiquement dans certain tissu (endothélium...) permet de différencier l'action spécifique de chaque type cellulaire dans le tissu et fournit des informations de mécanismes physiopathologiques impossible à obtenir in vitro. Pour réduire le nombre des animaux aucune expérience déjà publiée n'est reproduite et lorsque cela est possible les études conceptuelles sont réalisées in vitro sur des cellules en culture avant d'être testé in vivo. Cependant la physiologie des vaisseaux est complexe, met en jeu des interactions mutiples entre les composants de la paroi vasculaire et le sang qui ne peuvent pas être reproduites in vitro de façon satisfaisante.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé à partir des expériences préliminaires qui ont permis d’identifier le nombre minimum d’animaux à utiliser par groupe pour permettre une analyse des résultats statistiquement significative. Pour réduire le nombre d'animaux, les animaux seront inclus dans plusieurs protocoles expérimentaux (tests de comportement, suivi des pressions systémiques et flux sanguin cérébral puis euthanasie pour analyse histologique
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions limitant au maximum le stress et la douleur. Ils sont élevés en groupe dans des cages ventilées maintenant une atmosphère saine. Des jouets de carton sont mis à disposition des animaux dans leur cage pour enrichir leur environnement, leur permettre de ronger et de se cacher. Les litières sont dépoussiérées et additionnés de cubes de coton leur permettant de construire des nids. Les opérations chirurgicales sont réalisées sur couverture chauffante, sous anesthésie gazeuse et en présence d’un antalgique. Après chirurgie nous plaçons dans la cage des souris des sachets de nourritures enrichie et hydratée. Les animaux sont surveillés par la visite quotidienne du zootechnicien. En cas de problème de santé des animaux, l'expérimentateur est immédiatement alerté. Il prendra la décision de la mise à mort en fonction de la grille "observation-Action" en annexe.
Choix des espèces
La souris a été choisie en raison de l'existence de souris transgéniques dont les gènes d'intérêt ont été mutés. C 'est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau vasculaire à de forte ressemblance avec celui décrit chez l'homme. Les animaux seront utilisés au stade suivant : - Post natal : Le modèle murin de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR) est un modèle bien caractérisé qui récapitule les caractéristiques de la rétinopathie chez le prématuré. La souris est une espèce nidicole dont la rétine est immature à la naissance à terme. C’est donc un bon modèle pour le suivi de la maturation rétinienne depuis le début de l'exposition à des stress oxydatifs exogènes par des niveaux élevés d'oxygène (comme modèle de la rétinopathie du prématuré humain induite par l’oxygène). Le protocole consiste à introduire des souriceaux nouveaux-nés 7 jours après leur naissance (P7) dans un caisson où l’atmosphère est contrôlée à 75 % d’oxygène pendant 5 jours puis de les replacer en atmosphère à 21% d'oxygène. -Pour la mise en reproduction, tous les animaux seront utilisés au stade adulte soit plus de 8 semaines chez la souris. - toutes les autres expériences (stress inflammatoire, HTA) seront réalisées sur des animaux adultes (2 mois à 6 mois) car la maturation du système vasculaire au niveau du cerveau se fait dans les premier mois en post natal. Pour ne pas avoir de biais dans l’analyse des résultats, nous devons tester des animaux qui ont un réseau vasculaire mature.
Fonction cardiaque (hémodynamique et rythme)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Rats : 1000
Cochons d'Inde : 1000
Lapins : 180
Chiens : 300
Cochons : 200
3 180 animaux non-humains, souris, rats, cobayes, lapins, chiens et cochons, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil. On leur pose des cathéters et des électrodes ou un implant de télémétrie, sous anesthésie, pour enregistrer l'effet de nouvelles molécules sur le cœur avant leur passage chez l'humain. Le porteur indique que 1 750 de ces animaux, soumis à des procédures modérées, peuvent être réutilisés après accord du vétérinaire, tandis que 1 430 sont tués sans réveil. Il conclut que les tests in vitro et in silico ne remplacent pas l'évaluation dans un organisme intact.
Objectifs
Dans le cadre des études précliniques, les nouvelles molécules en voie de développement doivent être étudiées pour leur efficacité par rapport aux cibles thérapeutiques visées. Quel que soit le contexte d’étude de ces nouvelles substances, une difficulté majeure liée aux études de pharmacologie préclinique est de disposer de modèles suffisamment sensibles et/ou prédictifs afin de garantir la pertinence des résultats expérimentaux par rapport à l’utilisation thérapeutique des futurs médicaments. Les études précliniques menées dans le cadre réglementaire de la Pharmacologie de Sécurité ont pour objectifs de déterminer les effets secondaires possibles de nouvelles molécules en développement, avant ou au moment de leur passage en phase clinique et en vue de l’obtention de leur autorisation de mise sur le marché. Les études précliniques doivent au minimum étudier les possibles effets indésirables des nouveaux médicaments sur les trois systèmes vitaux que sont le système nerveux central, le système cardiovasculaire et le système respiratoire. Au niveau du système cardiovasculaire notamment, il est capital de pouvoir dépister toute molécule pouvant présenter un risque arythmogène, détectable par l’allongement de l’intervalle QT. En effet, de nombreux médicaments, anciens ou nouveaux, ont dû être retirés du marché suite à un taux de mortalité inquiétant constaté après administration chez des patients ayant développé des arythmies cardiaques. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets cardiovasculaires de substances dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments ou de s'assurer qu'ils n'induisent pas eux-mêmes des effets secondaires.
Bénéfices attendus
Les modèles mis en place ont pour objectif d’évaluer les effets pharmacologiques principaux de substances en développement par rapport aux cibles thérapeutiques visées ou de s’assurer que ces substances n’induisent pas d’effets secondaires ou inattendus avant leur passage chez l’homme. Ils entrent comme prérequis règlementaires pour obtenir les autorisations de commercialisation des nouveaux médicaments. Avant les tests sur l’animal, les produits sont généralement testés et présélectionnés avec attention dans des tests in vitro.
Procédures
Dans les modèles anesthésiés, les animaux sont anesthésiés jusqu'à la fin de la procédure (sans réveil). Des cathéters et/ou électrode (électrocardiogramme ou ECG) sont positionnés dans/autour d’artères/veines et/ou en sous cutané, pour la mesure de paramètre cardiovasculaire (pressions, fréquence cardiaque, débit sanguins/cardiaque, ECG). Pour les besoins de l'étude, des prélèvements de sang peuvent être réalisés (sous anesthésie) pendant le test et/ou en fin de test (juste avant l'euthanasie). La procédure sous anesthésie n'excède généralement pas 2 heures (rat, cobaye, lapin) ou 6 heures (chien, porc) et les animaux sont immédiatement euthanasiés (sans réveil préalable). Dans les modèles éveillés, les animaux sont dans une première phase équipés (sous anesthésie) d'un implant de télémétrie qui permet l'enregistrement en continu de paramètres cardiovasculaires (pressions, fréquence cardiaque, ECG) par cathétérisme des lits artériels d’intérêt (ou d’une cavité cardiaque) et positionnement d’électrodes pour l’ECG. Après réveil et une période de récupération (généralement une semaine au minimum chez les petits animaux et deux semaines au minimum chez les gros animaux), les paramètres sont enregistrés en continu avant (baseline d'au moins 1 heure) et après administration de la substance à évaluer (classiquement 24 heures par session). Les administrations par bolus rapide (par voie orale, intraveineuse, sous-cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire) ou par perfusion lente (intraveineuse) sont effectuées selon les bonnes pratiques vétérinaires.La durée de la procédure d’administration par bolus est de quelques secondes. Celle d’une administration par perfusion intraveineuse peut durer de quelques minutes à plusieurs heures en fonction des spécificités du candidat traitement. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours (le plus souvent) ou plusieurs semaines, en fonction des spécificités du candidat traitement. La fréquence des administrations (exemple : journalière, hebdomadaire) est variable et également adaptée à la spécificité de la substance testée. Pour les besoins de l'étude, des prélèvements de sang (classiquement 2 maximum par 24 heures, volume et fréquence adaptés à l'espèce) peuvent être réalisés (animal vigile ou anesthésié) pendant le test et/ou en fin de test, selon les bonnes pratiques vétérinaires. La durée de la procédure de prélèvement est de quelques secondes.
Impact sur les animaux
Des effets toxiques majeurs ne sont pas attendus. A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée à l’administration des substances. Dans les modèles éveillés, certaines périodes d'hébergement en cage individuelle (avec enrichissement) sont cependant nécessaires: 1) pendant la phase de récupération post-chirurgicale, afin d'éviter que les animaux ne retirent les agrafes/sutures de leurs congénères (généralement pour un période d'une semaine); 2) pendant les mesures (généralement un peu plus de 24h), car soit le système de télémétrie ne fonctionne qu'avec une fréquence d'émission des signaux (petits animaux, un hébergement groupé ne permet donc pas d'identifier la source d'émission d'un signal ; interférence entre les implants), soit les animaux ne reçoivent pas le même traitement ce qui nécessite l’isolement pour éviter les contaminations croisées et donc un biais dans l’interprétation des résultats de l’étude. Lors de la phase de récupération post-chirurgicale, une attention particulière est apportée (surveillance des cicatrices, état général, poids, température corporelle, appétit…).
Devenir
Pour les procédures modérées, les animaux peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire. Pour les procédures sans réveil, les animaux ne sont pas réutilisables.
Remplacement
En amont des tests in vivo, des tests in silico ou in vitro peuvent être envisagés (ou même requis d'un point de vue réglementaire). Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (permettant ainsi un tri des substances à étudier, et donc réduisant de fait le nombre d'animaux utilisés), ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer les effets dans un environnement biologique et physiologique intact comme cela est possible chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement par rapport à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison). Dans les procédures mises en place chez l'animal anesthésié et dans la mesure du possible (dépend de la durée d'action de la substance testée), plusieurs doses d'une même substance peuvent être testées chez le même animal, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Dans les procédures mises en place chez l'animal éveillé et dans la mesure du possible (dépend de la durée d'action de la substance testée), plusieurs doses d'une même substance peuvent être testées chez le même animal à des jours différents, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Nos analyses statistiques (basées sur des analyses de variances et test de Dunnett) indiquent qu’un effectif de 4-8 animaux par groupe (nombre de groupes variables, 2 en standard) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Dans le but de réduire le nombre d’animaux (dans l’application de la règle des 3R), certains animaux issus des procédures chez l’animal éveillé (étude par télémétrie) sont également réutilisés aux strictes conditions qu’ils n’aient pas subis de procédures sévères et après accord du vétérinaire.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur la fonction cardiaque de rongeurs (rats, souris), de lapins, de cobayes, de chiens ou de porcs est prédictif de leur efficacité et/ou inocuité en clinique. Principalement rongeurs, cobayes et lapins sevrés, âge variant entre 3 semaines et 6 mois, conformément aux données historiques. Chiens adultes et porcs sevrés, conformément aux données historiques.