Procédures modérées

384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle pharmacologique d'épilepsie infantile, elles subissent une chirurgie de 45 minutes pour implanter des électrodes d'électroencéphalogramme, restent isolées en cage individuelle et donnent des prélèvements de sang. Le projet teste si le jeûne intermittent réduit les crises et permet de baisser les doses de médicaments antiépileptiques. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative aux animaux pour évaluer un modèle épileptique.

Objectifs

Historiquement, des changements de régime alimentaire ont été utilisés pour soigner les épilepsies. Notamment, un régime riche en protéine et gras, et faible en sucres, est un traitement de choix pour certains types d’épilepsies pharmacorésistantes. Cependant, ce régime est assez désagréable, surtout pour les enfants, et ses effets secondaires sont très lourds. En nous basant sur des résultats issus d’autres pathologies, nous avons avancé l’hypothèse qu’un régime basé sur le jeûne intermittent (intermittent fasting, IF) consistant à limiter la prise alimentaire à certaines heures de la journée, sans restriction calorique, pourrait avoir des effets bénéfiques sur les épilepsies infantiles: les épilepsies “absence”. Le but de ce projet sera d'évaluer si le régime IF est capable d’améliorer le poids des crises épileptiques (nombre, durée) ainsi que les déficits cognitifs et comportementaux associés. Nous utiliserons 1 modèle pharmacologique d’épilepsie infantile “absence” chez la souris. Ce modèle présente des crises dites "absence atypiques", retrouvées chez des pathologies infantiles graves telle que le syndrome de Dravet ou Lennox-Gastaut. Nous allons aussi examiner si le régime IF permet de baisser la dose efficace de médicaments anti-épileptiques communément utilisés en clinique, en réduisant leurs effets secondaires. En parallèle, nous essayerons de comprendre les régulations des réseaux neuronaux sous-tendant la pathologie, ainsi que les modifications qui accompagnent le régime IF.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à une réduction des crises d’épilepsie et une amélioration des comorbidités comportementales en agissant uniquement sur la fenêtre de la prise alimentaire, pas sur sa quantité ni sur sa composition. Il s’agit d’une approche facilement transposable dans le cadre clinique et qui pourrait aider les patients atteints d’épilepsie dans leur quotidien. De plus, l’administration de médicaments durant le régime IF pourrait permettre de baisser la dose efficace de ces composés, en limitant ainsi leurs effets secondaires.

Procédures

Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale, pour la pose d'un implant afin d'effectuer des enregistrements électroencéphalogramme (EEG), ainsi que deux prélèvements sanguins. L'acte chirurgical dure environ 45 minutes. Le prélèvement sanguin dure 10 secondes max entre la contention et l'acte de prélèvement. Les animaux implantés avec des connecteurs pour enregistrement EEG courent le risque de se les arracher mutuellement. Ils sont donc isolés en cage individuelles pour la durée du protocole et seront surveillé deux fois par jour. Ils auront un enrichissement spécifique (sizzle, nid en carton, coton), ils seront en contact visuel et olfactif avec les congénères et seront manipulés régulièrement.

Impact sur les animaux

Le régime du jêune intermittent ou intermittent fasting (IF) a été prouvé comme étant bénéfique pour la santé chez l'homme et l'animal. A noter que le modèle d'épilepsie que nous utilisons n'induit pas de crises convulsives (motrices) mais de perturbations cérébrales qui induisent un arrêt de l'activité locomotrice pour quelques secondes, plusieurs fois par heure. Les crises ne sont donc pas douloureuses ni fatigantes. La procédure prévoit des prélèvements sanguins ainsi qu'une chirurgie: ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (perte de poids, détachement de l'implant , dégradation de l'apparence physique ou troubles du comportement). C'est pour cela que la procédure est classée modérée. Cependant nous mettrons en place une grille de scores dès l'apparition de signes cliniques. D'autre part, selon notre expérience le type de chirurgie prévue est très bien supporté par les animaux.

Devenir

A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.

Remplacement

Il n'existe d'alternative autre que les animaux pour évaluer avec précision et pertinence un modèle épileptique dans notre projet de recherche.

Réduction

Nous utiliserons un même animal pour l'exploitation de plusieurs tissus, ce qui nous permettra de réduire le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l'étude. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé selon Dell et al. (Samplesize determination, Ilar Journal, 2002, 43 :207) et le logiciel G*power, sur la base de publications précédentes et de notre expérience de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences (niveau de significativité: p=0.05).

Raffinement

Des dispositions seront prises pour le raffinement des conditions d'élevage et d'expérimentation. Le maintien d'enrichissement de la naissance à l'expérimentation sera effectif dans toutes les cages. Un enrichissement supplémentaire de type paille de carton, igloo, ou maison en carton sera mis en place en cas d'isolement des souris pour les besoins des expériences. Le bien-être animal sera au centre de notre projet. Un suivi régulier sera appliqué dès le débuts de nos expérimentations. Les chirurgies seront effectuées en suivant les règles d'anesthésie et analgésie. Une grille de score sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques afin d'intervenir si besoin.

Choix des espèces

L'espèce souris (Mus musculus) est un modèle très étudié dans tout projet de recherche. Les souris fournissent des excellents modèles d'épilepsie de type "absence", au cœur de notre projet. Les autres espèces utilisables ne sont pas envisageables à ce stade de l'étude en vue des contraintes éthiques et/ou d'hébergement requises par ces espèces. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes sur un point de vue médical. Les animaux seront utilisés à 6 semaines d'âge, âge à laquelle les premiers symptômes épileptiques sont visibles sur le modèle d'épilepsie utilisé.

4 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections de tamoxifène pour inactiver un gène, des gavages répétés de vitamine D, et une partie est castrée, avec amputation d'une phalange pour l'identification. Le projet étudie le rôle de la vitamine D dans la progression des tumeurs de la prostate et la résistance à la chimiothérapie, les retombées pour les patients restant au conditionnel. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la formation des lésions précancéreuses et conclut que l'expérimentation in vivo est "nécessaire".

Objectifs

Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer viscéral masculin le plus fréquent. Les traitements actuellement utilisé en clinique inhibent les voies de signalisation et/ou la production d'androgènes et sont couplés à la chimiothérapie (i.e. docetaxel). Ces traitements induisent des resistances, ne sont pas efficaces contre les formes agressives et sont à l’origine de nombreux effets indésirables. Une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires impliqués dans la la progression des tumeurs et dans la resistance aux traitements est donc requise afin de développer des approches thérapeutiques plus efficaces. La forme active de la vitamine D ((calcitriol, VitD) est une hormone qui joue un rôle clé dans la régulation de l’homéostasie calcique, et dont les effets sont relayés par son récepteur VDR. La vitD possède des activités anticancéreuses, et des données cliniques indiquent que des patients avec des tumeurs prostatiques et déficients en vitamine D ont une espérance de vie inférieure à ceux ayant des niveaux de vitamine D suffisants. De plus, nos récents résultats indiquent que la vitamine D permet de lever les résistances au Docetaxel, la chimiothérapie classiquement utilisé en clinique. Ces résultats indiquent que les voies de signalisation de la vitamine D jouent un rôle clé dans l'évolution de la pathologie et la résistance aux traitements, mais les mécanismes restent mal connus. En tirant profit du modèle murin récapitulant la pathologie humaine, les objectifs de ce projet sont: de générer et caractériser des souris ayant une inactivation de VDR dans les cellules épithéliales prostatiques et de déterminer l'effet de la vitamine D sur l'efficacité de chimiothérapies de type alcaloide.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de cartographier l’évolution des lésions précancéreuses et l’implication des voies de signalisation de la vitamine D dans cette évolution ainsi que de déterminer son rôle dans la résistance aux traitements actuels.

Procédures

Chaque animal utilisé dans cette étude sera soumis à 5 injections intrapéritonéales du tamoxifène (15 sec par administration) réalisées au courant d’une semaine, une fois que cet animal aura atteint l’âge adulte (8 à 12 semaines après naissance) afin d'inactiver le gène. Certains animaux seront gavés (15 administrations, 15 sec par administration) et d'autres recevront une administration intra-péritonéale supplémentaire (15 sec par administration) . Parmis ces lots, certaines souris seront castrées (5-10 min par souris) ou subiront la même anesthésie et incision, mais sans enlever les organes (5-10 min par souris) . Les souris qui seront utilisées pour les analyses de cytométries en flux seront traitées avec un marqueur permettant de déterminer la prolifération des cellules (2 injections intrapéritonéales , 15 sec par administration). Une prise de sang juste avant la mise à mort sera réalisée (15 sec par souris).

Impact sur les animaux

Les injections par voie intra-péritonéale pour inactiver les gènes ou administrer du docetaxel, et les administrations par gavage seront réalisées par des personnes agrémentées et aguerries et n'induiront aucune nuissance. L'orchidectomie est une opération rapide qui est bien maitrisée au laboratoire. Après l'inactivation des gènes, l'évolution des lésions prostatiques sera monitorées mais d'après nos expériences, aucun inconfort majeur n'a été observé.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à différents points de cinétique afin de récupérer la prostate et différents organes en vue de la caractérisation.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Pour les analyses moléculaires et de populations cellulaires, plusieurs paramètres seront évalués, notamment les niveaux d’expression des protéines ou des ARN. Pour les études histologiques, les niveaux d’expression des protéines, en plus de leur localisation, seront déterminés par immunofluorescence. Étant donnée l’hétérogénéité phénotypique et la variabilité interindividuelle attendue le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. Afin d’obtenir des résultats significatifs avec une bonne puissance, nous aurons besoin de 20 animaux par groupe. Le nombre d’animaux sera de 4960 souris maximum.

Raffinement

L'expertise du laboratoire dans l'étude de l'évolution des lésions précancéreuses prostatiques permettra la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées (i.e. points critiques étroitement surveillés). Pour l'identification, le nombre d’amputations sera limité à une seule phalange par patte et ne compromettra pas la préhension fine del’animal. Durant la durée de l'étude, les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement. Après injection par voie intra-péritonéale en alternée, une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d’injection pour éliminer tout risque d’infection (rougeur ou présence de pus au site d’injection). Si les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestes (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), l’animal sera retiré de l'étude et mis à mort. En pré-opératoire, une analgésie en injection intrapéritonéale est faite avant l’anesthésie des souris. En post-opératoire, une analgésie est réalisée. Nous surveillerons les animaux par inspection et palpation abdominale, en cas de rougeur ou de voussure, une infection pourra être supposée et une surveillance rapprochée sera effectuée. Lors des gavages succesifs avec la vitamine D, de la nourriture en gel sera proposée pour éviter une diminution de l'alimentation suite à l'irritation de l'oeosophage.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme animal modèle car l’expression des protéines jouant un rôle dans les développements du cancer de la prostate est similaire à celle de l’humain. De plus, l’évolution des lésions précancéreuses dans notre modèle murin récapitule de manière fidèle le développement du cancer de la prostate chez l’homme. Le système immunitaire murin est bien décrit dans la littérature et est proche de celui de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. Enfin, les activités de la vitamine D chez la souris sont similaires à celles chez l'homme. L’ensemble de ces facteurs nous permettra d’étudier l’évolution des lésions de cancer de la prostate (CaP) afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les souris auront un fond génétique enrichi C57BL/6. Les souris mâles seront utilisées de 8 semaines à 17 mois après la naissance, la prostate n'étant mature qu'après puberté. Les injections de tamoxifène se feront sur des jeunes adultes à partir de 8 semaines après naissance.

360 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après pose d'un cathéter dans la veine jugulaire et deux chirurgies cérébrales, ils s'auto-administrent cocaïne ou nicotine sur vingt-cinq sessions, isolés en cage individuelle, pour étudier le rôle du cholestérol cérébral dans la rechute. Le porteur décrit un état de dépendance avec poil hérissé, irritabilité et agressivité, et reconnaît que l'isolement prolongé est source de stress. Les rats sont ensuite tués pour des analyses du cerveau, et le porteur renvoie d'éventuelles thérapies à moyen terme.

Objectifs

Les mécanismes moléculaires impliqués dans la recherche de drogues chez des individus addicts restent mal connus ce qui limite le développement de thérapies efficaces. Quelques études antérieures ont suggéré que le métabolisme du cholestérol jouerait un rôle dans la recherche de drogue et dans la rechute. Ce projet a pour but d’étudier le rôle de ce métabolisme dans l’activité cérébrale déclenchée dans le striatum dorsal, une structure impliquée dans l’addiction, lors de la recherche de drogues. Dans ce projet, nous chercherons à démontrer un lien entre la manipulation du cholestérol dans le striatum dorsal et l’activité neuronale dans cette région lors de la recherche de drogue après une période d'abstinence.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant le rôle du cholestérol cérébral dans la vulnérabilité à la rechute à l'addiction. Ces expériences pourraient conduire à moyen terme au développement de thérapies médicamenteuses pour réduire voire empêcher la rechute.

Procédures

Les rats des groupes cocaïne et nicotine seront soumis à une chirurgie d’implantation de cathéter dans la veine jugulaire sous anesthésie générale de 15 minutes pour pouvoir s’auto-administrer les drogues. Tous les rats seront placés dans les cages d’auto-administration pour suivre des sessions d’entrainement d’auto-administration (25 sessions, 1 session par jour ; durée d’une session : pour cocaïne=6h, nicotine=1h, sucre=4h). Tous les rats subiront un total de deux chirurgies cérébrales (1h30 par chirurgie) : - la première pour placer un senseur de l'activité des neurones avec (groupes cocaïne et nicotine) ou sans (groupe sucre) implantation d’un cathéter intraveineux - la seconde pour injecter une enzyme dégradant le cholestérol et pour implanter à demeure un système d’imagerie qui permettra de mesurer l’activité des neurones pour tous les animaux. Tous les rats auront deux sessions d'’adaptations et de test (30 min et 1h, respectivement) aux dispositifs permettant de mesurer simultanément l'activité de recherche de récompenses et l'activité des neurones du striatum dorsal.

Impact sur les animaux

- Cathéter et Fibre optique : gène, risque d'infection ou de démangeaisons - Auto-administration : La prise de drogue chronique (bien que volontaire) peut causer un stress modéré chez certains rats, ce qui est attendu car, comme chez l’Homme, un état « addict » chez le rat peut être associé à un état émotionnel négatif. Cet état peut se révéler par le poil hérissé, par une certaine irritabilité et agressivité envers l’expérimentateur. Dans la plupart des cas, cet état est transitoire et l’état du pelage et les niveaux d’agressivité reviennent à la normale après quelques semaines. - Isolement : Les animaux sont hébergés individuellement pendant toute la durée de l’auto-administration et jusqu’à la fin de la procédure ce qui peut causer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses moléculaires et histologiques sur le cerveau.

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les bases d'un processus psychobiologique, peut-être uniquement mené sur un animal vivant. En effet, nous étudions les bases comportementales et neurobiologiques impliquées dans le phénomène de rechute. L’étude de ce processus nécessite d’enregistrer l’activité des neurones in vivo, chez l’animal lors du comportement, ce qui implique d’utiliser des modèles d’animaux vivants. Il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Des études statistiques préalables ont permis de définir les effectifs nécessaires à la réalisation de ce projet de façon à mettre en évidence des différences significatives tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles, en ayant recours à des analyses statistiques. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe sera de 18. Deux animaux par lot sont ajoutés en anticipation de possibles pertes liées à la complexité du geste des procédures chirurgicales (la veine peut céder lors de l’insertion du cathéter), à l’expression des virus et/ou à un mauvais placement de la fibre optique. Ainsi 20 animaux par lot, seront nécessaires à notre étude. 18 lots seront nécessaires pour le projet, soit 360 animaux maximum.

Raffinement

Nous avons planifié ce projet en gardant à l'esprit la nécessité de réduire et de soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse des animaux. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal, et pendant la chirurgie le recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques, pendant laquelle l’animal sera placé sur un tapis chauffant pour assurer le maintien de sa température corporelle. Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick de papier ou pièce de bois à ronger ou tunnel) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Avant le début des sessions d’entrainement à l’auto-administration, les animaux auront une période d’habituation aux cages et seront placés dans les cages d’auto-administration pendant 2 jours, 1 heure par jour. Les animaux seront également habitués à être connectés par leur système de fibre optique avant le test de rechute et d’enregistrement. En cas d’atteinte de points limites, des actions correctives sont prises sans délai. Les manipulations sont réalisées par des expérimentateurs formés et compétents à l’expérimentation animale et à la chirurgie.

Choix des espèces

Le rat est, avec la souris, l’animal le plus utilisé pour l’étude de la motivation dans les modèles animaux, car ses réponses neuronales sont proches des réponses neuronales observées chez l'Homme. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est à dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus afin de modéliser au mieux la variabilité inter-individuelle humaine dans le développement d’une addiction. Pour notre étude, le rat est le modèle le plus approprié car il peut s’auto-administrer toutes les drogues, comme l’Homme. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet afin de limiter le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).

218 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent soit une injection dans le cerveau après craniotomie sous anesthésie de 70 minutes, soit une injection rétro-orbitaire, pour comparer ces deux voies d'administration de vecteurs de thérapie génique. Le porteur nomme des atteintes possibles comme un saignement lors de la craniotomie, un risque d'exophtalmie et d'infection oculaire après l'injection rétro-orbitaire, et une perte de poids. Les souris sont tuées quatre semaines après pour des analyses, cette étude servant à valider les vecteurs chez des souris saines avant emploi sur des modèles de maladie.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington (MH) et la maladie d’Alzheimer sont une préoccupation croissante en santé publique. Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe encore aujourd’hui aucun traitement capable de combattre de façon efficace la progression de ce type de maladies. De nouvelles approches thérapeutiques sont essentielles pour améliorer la qualité de vie des patients. Parmi ces nouvelles approches prometteuses se trouve la thérapie génique. Elle utilise l’ADN pour soigner ou prévenir de la maladie. Cet ADN peut être délivré de différentes manières. L’injection intracérébrale est l’approche de référence pour de nombreuses maladies neurodégénératives. Nous souhaiterions tester l’efficacité d’une approche moins invasive qu’est l’injection intraveineuse. Ceci dans le but de prévenir une approche invasive d'injection intracérébrale remplacée par une injection intraveineuse.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet permettrait d’opter pour un mode d’administration de notre produit le moins invasif possible pour l’appliquer chez l’homme et plus précisément chez les patients atteins de la maladie neurodégénératives.

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 semaine d’âge soit : -à une injection stéréotaxique sous anesthésie gazeuse (durée de 70 min), -ou à une injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse (durée de 5 min), Dans les deux cas l’animal est endormi avec une prise en charge analgésique afin d'éviter la douleur, par l'administration d'analgésiques avant et après la chirurgie. Les animaux réaliseront des tests comportementaux (tests de performance motrice et activité locomotrice), les semaines 5, 6 et 7 et 1 jour de repos sera laissé entre ces deux tests. Un des tests de performance de la motricité est réalisé en 3 sessions pendant 3 jours consécutifs et dure 5 minutes maximum par session. Le test de l’activité locomotrice dure 10 minutes par animaux. Un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie avec animal endormi et immédiatement après les animaux seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux. Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. Un risque traumatique mécanique local relativement faible peut être également être observe suite l’injection de l’aiguille dans le striatum des souris. Un risque anesthésique pouvant entrainer des séquelles chez l’animal existe également. Un risque d’infection oculaire et d’hématome peut-être observé après les injections intra-veineuses en retro-orbitales. Une perte de poids dû à l’injection de vecteur viraux pourrait être observée, (5 à 7%) du poids total de l’animal, (selon nos précédentes études), bien que les concentrations des vecteurs utilisées soient déjà été évaluées in vitro dans nos précédentes études afin d’éviter toute toxicité chez la souris. Un risque d’hématome (exophtalmie), au niveau de l’IV peut survenir car l’injection est réalisée en rétro-orbitaire.

Devenir

Les souris seront euthanasiées 4 semaines après les injections (temps d'expression des vecteurs viraux étudiés) - pour les differentes études biocellulaires et biomoléculaires.

Remplacement

Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. De plus, le modèle murin de la maladie de Huntington est bien caractérisé. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (218) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. En effet, des travaux précédents ont permis d’établir les doses de vecteur à injecter et les temps d'analyses.

Raffinement

Afin de réduire la douleur lors de la mise en barre d’oreille nous enduisons préalablement les oreilles de l’animal de crème analgésique. Le geste réalisé pour la craniotomie est maitrisé au sein de l’équipe et les risques de saignement n’apparaissent que rarement. Pour limiter le risque de traumatisme mécanique local, relativement faible lié à l’injection, nous utilisons des aiguilles fines acquises avec l’expérience de nos études précédentes). Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance; 6h après l’acte chirurgical, une première injection d’analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. 24h après une fiche de scoring (fournie en annexe ) est remplie pour tout animal et une deuxième est réalisée. 4h/5h après cette injection les animaux seront observés par l’expérimentateur pour examiner les animaux et vérifier qu’aucun signe de douleur est détecté. Si besoin, une injection d’analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. La prophylaxie de la douleur sera donc adaptée à l’examen clinique de l’animal. Le protocole d’analgésie post opératoire a été décidé avec l’accord du vétérinaire. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. L’application de critères d’arrêts en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. Le suivi est renforcé au cours des 48h suivant la chirurgie puis celle-ci est ensuite allégé a 1 fois par semaine sauf a l’approche de points limites. De plus, le suivi du poids et les tests comportementaux étant réalisé de façon hebdomadaire (période de repos d’un jour entre chaque test, favorise un suivi renforcé). Les animaux seront hébergés en groupe et un igloo sera ajouté dans chaque cage stabulée en portoir ventilé.

Choix des espèces

L’objectif de ce projet est d’évaluer et de comparer des sérotypes de vecteur virauxs modifiés et donc améliorer l’expression des transgènes, étape importante pour maximiser l’effet d’un traitement dans une future thérapie génique après injection d’un vecteur viral exprimant des gènes thérapeutiques dans la structure cible. Nous commencerons par valider nos vecteurs dans des souris saines avant son utilisation future chez la souris modèle. Nous commencerons donc par valider dans la présente demande nos vecteurs dans des souris saines avant son utilisation future chez la souris modèle. En effet à ce jour, seules les souris transgéniques pour la MH ou MA permettent de mimer suffisamment fidèlement la pathologie et donc d'être utilisés dans des études de comparabilité et d'efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques. Les souris qui seront utilisées sont des souris adultes (4 semaines), dans lesquelles nous avons déjà optimisé les coordonnés d’injection dans le cerveau.

384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage quotidien de vitamine D pendant trois jours puis une charge calcique, subissent un jeûne pouvant atteindre 18 heures et un isolement en cage métabolique, avant une prise de sang terminale. Le porteur reconnaît que les gavages peuvent irriter l'œsophage et que le jeûne et l'isolement sont sources de stress. L'objectif est de "mettre en place" un test de charge calcique chez la souris, les animaux étant ensuite tués pour analyser les tissus.

Objectifs

L'homéostasie calcique est un réseau finement régulé impliquant de nombreux organes (i.e. glandes parathyroides, intestin, rein, os). Dans de nombreuses pathologies, dont beaucoup sont encore idiopathiques, les patients pédiatriques ou adultes présentent des hypercalcémies et des hypercalciuries. Ces patients partagent un tableau clinique similaire : des niveaux circulants de vitamine D élevés et ceux d'hormone parathyroidienne effondré. L'ensemble de ces résultats indiquent que bien que la cause ne soit pas toujours connue, les symptômes sont liés à une augmentation des niveaux de vitamine D. Le diagnostique ainsi que l'effet des traitements se basent principalement sur les dosages biochimiques urinaires et sanguins suite à une charge calcique. Le diagnostique ainsi que l'effet des traitements se basent principalement sur les dosages biochimiques urinaires et sanguins suite à une charge calcique. L'objectif de ce projet est de mettre en place un protocole de charge calcique chez la souris sauvage pour déterminer les niveaux de calcium urinaire, et de déterminer les effets de bolus de vitamine D sur ce paramètre.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet se basent sur la mise au point d'un paramètre clinique pertinent pour déterminer les effets de mutations chez la souris et également l'effet de nouvelles options thérapeutiques. Les résultats obtenus permettront d'améliorer l'évaluation clinique des hyperabsorptions calciques et des hypercalciuries et d'ameliorer le diagnostique et la prise en charge clinique des patients.

Procédures

1 administration par jour de vitamine D par gavage (15 sec par administration) pendant 3 jours, puis une administration unique par gavage de solution calcique, et une prise de sang terminale (30 sec). Une mise à jeun de 18H maximum et une mise en cage métabolique pendant 4H.

Impact sur les animaux

D'après nos travaux précédents, le régime de vitamine D administré n'induit pas de nuisances ni de souffrance aux animaux. L'expérience de charge calcique est classiquement réalisée chez les jeunes enfants chez l'humain, et aucun effet indésirable n'a été rapporté. Les gavages réalisés peuvent induire une irritation de l'oesophage et l'isolement dans les cages métaboliques ainsi que le jeun peuvent entrainer un stress.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour étudier les effets sur les tissus.

Remplacement

L'homéostasie phospho-calcique implique un réseau finement régulé impliquant les glandes parathyroides, l'intestin, les reins et les os. Aucune méthode alternative n'est disponible en raison de la compléxicité de ce réseau qui ne permet pas d'étudier les conséquences d'une dysfonction dans des systèmes cellulaires. La souris est un organisme modèle pour l'étude de l'homéostasie calcique, les paramètres biochimiques sanguins et urinaires étant similaires à ceux chez l'Homme.

Réduction

L'expertise du laboratoire dans le phénotypage des souris a permis de déterminer que 12 animaux est le nombre d'animaux optimal afin d'obtenir des résultats avec une puissance statistique supérieure à 80%.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupe afin de préserver les interactions sociales, dans des cages agrémentées avec un nid. Si une souris présente des difficultés pour se nourrir suite à une irritation de l'oesophage induite par les gavages, de la nourriture en gelée sera placée dans le fond de la cage. Les autres points limites sont un pelage terne ou hérissé, un ecoulement lacrymal, l'immobilité, ou une baisse de la température corporelle. Dans ce cas, des mesures appropriées seront prises en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

L'homéostasie calcique est finement régulée par de nombreuses hormones dont la vitamine D. De nombreuses études réalisées chez la souris ont mis en évidence les mécanismes fins régulant les niveaux de calcium sériques et urinaires, et leurs similitudes avec ceux chez l'Homme. Le diagnostique de ce type de pathologie peut se faire soit chez l'enfant ou chez le jeune adulte. Ainsi la moitié des animaux sera utilisé à l'age de 5-6 semaines, l'équivalent du jeune enfant, et entre 12-15 semaines l'équivalent du jeune adulte.

760 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection quotidienne d'halopéridol dans l'abdomen pendant 21 jours pour provoquer des dyskinésies, mouvements involontaires de la mâchoire et de la langue, puis un candidat médicament d'un "sponsor" à évaluer. Le porteur reconnaît que les injections répétées peuvent provoquer une péritonite ou toucher d'autres organes, et que le trouble moteur induit est source de stress. À l'issue, un prélèvement intracardiaque sous anesthésie précède la mise à mort et le prélèvement du cerveau.

Objectifs

L’utilisation de substances antipsychotiques est une stratégie thérapeutique importante pour traiter les troubles liés aux pathologies psychiatriques telles que les psychoses. Cependant, l’efficacité de ces traitements est limitée à certains symptômes et leur utilisation prolongée est associée à de nombreux effets secondaires. En effet, les antipsychotiques agissent en bloquant les voies dopaminergiques induisant sur le long terme, l’augmentation du nombre et de la sensibilité des récepteurs D2 à la dopamine. En conséquence, il est observé, chez plus de 30% des patients, l’apparition de troubles moteurs involontaires et aberrants appelés dyskinésies tardives (TDs). Afin de lutter contre ces effets secondaires, plusieurs modèles précliniques chez le rongeur ont été développés dans le but de comprendre la physiopathologie liée à l’apparition de ces troubles moteurs pour ensuite tester différentes stratégies thérapeutiques visant à les diminuer. Actuellement, les traitements de référence pour soulager les TDs sont basés sur des molécules diminuant la recapture et la libération de dopamine au niveau synaptique telles que les tétrabénazines. Malgré cela, ces substances présentent des inconvénients importants car elles ont une demi vie très courte (10h) et nécessitent donc des doses quotidiennes multiples. De plus, elles n’ont pas un effet spécifique ce qui contribue à induire des effets secondaires obligeant à diminuer le dosage pouvant être administré et donc leur efficacité. Ainsi, l’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de candidats médicaments à plusieurs dosages sur le développement des TDs chez le rat, induites par l’administration quotidienne et prolongée d’halopéridol, un antipsychotique. Pour cela, des rats Wistar subiront une injection quotidienne d’halopéridol par voie intrapéritonéale (i.p) sur une durée de 21 jours. Lors du 21ème jour, ces animaux seront traités à partir d’une administration i.p unique soit du véhicule, soit de tétrabénazines, le composé référence, soit de candidats médicaments à plusieurs dosages. Les effets de ces traitements seront évalués sur les mouvements involontaires de la région orofaciale (i.e. évaluation du nombre d’ouverture de la mâchoire non dirigée vers une cible) et/ou de protrusion de la langue, tous deux très caractéristiques de TDs chez le rat, tout comme chez l’Homme. Pour terminer, le plasma et le cerveau des animaux seront prélevés afin de quantifier la biodisponibilité des candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’apporter plusieurs informations sur l’effet de candidats médicaments sur 1) les troubles moteurs involontaires de la région orofaciale associés aux dyskinésies tardives induites par la prise prolongée d’antipsychotiques, 2) sur la biodisponibilité plasmatique et cérébrale de ces mêmes composés et 3) sur leurs potentielles répercussions thérapeutiques au niveau histologique.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux subissent un maximum de 4 interventions distinctes en fonction des groupes expérimentaux. Durant la 1ère intervention du protocole, des rats mâles (âge : 6 semaines) sont soumis à une administration quotidienne d’halopéridol, un antipsychotique, sur une durée de 21 jours afin d’induire une dyskinésie tardive (mouvement moteur involontaire et aberrant (durée de l’acte d’injection i.p : 1min/rat). Au cours de la seconde intervention, à J21, les 6 groupes d’animaux sont également traités par voie i.p avec soit le candidat médicament administré à 3 différentes doses (une dose par groupe sur 3 groupes), soit avec de l’halopéridol, soit avec un composé de référence, les tétrabénazines soit avec le véhicule (NaCl 0,9%). La 3ème intervention consiste à effectuer l'évaluation comportementale des rats, mesurant les mouvements involontaires de la région orofaciale et les protrusions de langue (durée d’intervention : 10min x 3). Finalement au cours de la dernière intervention, un prélèvement sanguin terminal intracardiaque est réalisé sous anesthésie gazeuse avant la mise à mort des animaux afin de prélever le cerveau (durée de l’intervention de l’anesthésie à la mort : 20 min).

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration du candidat médicament du sponsor. Le personnel est formé et entrainé aux voies d’administration classiques pour réduire tout risque. Cependant, un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. L’administration quotidienne par voie intrapéritonéale est une source de stress puisqu’il est nécessaire d’appliquer une contention chez le rat afin de pouvoir réaliser ce geste. De plus, il est possible que les piqures répétées au niveau du péritoine engendrent une inflammation du péritoine (péritonite) voir une injection au niveau d’autres organes (vessies, intestins.). L’injection i.p peut également engendrer un léger écoulement de sang dans le cas où l’aiguille perfore un vaisseau sanguin. L’induction de TDs représente également une nuisance car elles entrainent une altération de l’activité motrice de la région orofaciale (mouvement aberrants et involontaires) et sont sources de stress. De plus, au cours d’une session permettant d’évaluer les caractéristiques comportementales de la TD, les animaux sont isolés dans un open field durant 3 fois 10 min ce qui peut à nouveau être à l’origine de stress.

Devenir

Tous les animaux de la procédure 1 sont mis à mort à la fin du protocole afin de prélever les organes.

Remplacement

Les dyskinésies tardives sont les principales sources de troubles moteurs résultant de la prise quotidienne d’antipsychotiques. Ainsi, pour ce projet, les candidats médicaments ont comme principal objectif de diminuer ces mouvements moteurs involontaires et aberrants. Ainsi, le modèle in vitro ne permet pas d’induire et d’étudier les répercussions comportementales associées aux antipsychotiques. Il n’est donc pas possible de tester par la suite, l’effet d’un candidat médicament sur l’ensemble de ces mécanismes.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu par groupe (maximun n=10) pour ce projet est basé sur une estimation prenant en compte des études précédentes (n=8) utilisant le même modèle de rat de TDs induites par l’administration quotidienne d’halopéridol sur 21 jours. Cependant, une certaine hétérogénéité entre les animaux a été observée quant à la réussite de l’induction de la TDs. Pour cette raison et le faible recul de ce modèle au sein de l’entreprise nous pousse donc à choisir un N = 10 incluant 2 animaux de sécurité. Cependant, le nombre d’animaux par groupe pourrait être réduit une fois ce modèle maitrisé et validé au sein de l’entreprise.

Raffinement

Les expérimentations sont effectuées par un personnel compétent et entraîné. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites et d’arrêts sont fixés avant le début des expérimentations selon une grille d’évaluation cliniques basées sur des critères d’observations. Les animaux sont familiarisés avec l'ensemble des outils de mesures ainsi qu'aux nouveaux environnements. Le matériel utilisé est adapté à l’espèce. Par ailleurs, les animaux sont hébergés par 3 dans les cages. Pour l’induction de la dyskinésie tardive par administration quotidienne d’halopéridol en i.p: - les administrations sont réalisées dans une pièce attenante aux pièces d’hébergement - les animaux sont pesés chaque début de semaine afin d’adapter le volume et le dosage administré et permettant d’éviter le surdosage - les administrations se font avec une seringue de 1ml et une aiguille de 26G - pour les administrations i.p, l'animal est maintenu en contention et l’aiguille est insérée dans le cadrant ventral inférieur gauche ou droit en évitant la ligne médiane. Les sites d’administration sont alternés chaque jour entre gauche et droite. Une légère aspiration est effectuée avant d’injecter pour confirmer que l’aiguille n’a pas perforé un vaisseau sanguin ou un autre organe. En cas de signe de déhydratation (test du plis de peau) ou de perte de poids, une injection de sérum physiologique est effectuée en s.c. Le prélèvement de sang en intracardiaque ainsi que la thoracotomie précédent la perfusion de l’animal sont réalisées sous anesthésie générale avec un cocktail de Kétamine/médétomidine et sous analgésique systémique.

Choix des espèces

Le rat et particulièrement la souche Wistar, est l’espèce de référence dans l’étude des dyskinésies tardives induites par l’halopéridol. En effet, plus de 68% des études répertoriées dans la littérature utilisent des rats dont plus de 33% sont de la souche Wistar. Afin de pouvoir maximiser la standardisation et donc favoriser la comparaison des données avec la littérature, il est fortement conseillé d’utiliser des rats Wistar sur ce sujet. De plus, les symptômes principaux des TDs au niveau de la région orofaciale observés chez l’Homme, sont également retrouvés chez le rat et à la même fréquence. Pour ce projet, nous utilisons des jeunes rats Wistar mâles adultes (6 semaines, poids 200-280g) car la grande majorité des résultats observés dans la littérature concernant les études sur les dyskinésies tardives induites par l’halopéridol sont obtenus chez cette catégorie d’animaux.

1 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire des épilepsies-absence, elles subissent la pose chirurgicale d'un implant crânien d'enregistrement (EEG) de 45 minutes et des prélèvements sanguins, pour tester si un jeûne intermittent réduit les crises. Le porteur indique que ces crises ne sont ni douloureuses ni convulsives et classe la procédure en modéré à cause de la chirurgie et des prélèvements. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" à l'animal pour évaluer un modèle épileptique.

Objectifs

Historiquement, des changements de régime alimentaire ont été utilisés pour soigner les épilepsies. Notamment, un régime cétogène riche en protéines et gras, et faible en carbohydrates, est un traitement de choix pour certains types d’épilepsies pharmacorésistantes. Cependant, ce régime est assez désagréable, surtout pour les enfants, et ses effets secondaires sont très lourds. En nous basant sur des résultats issus d’autres pathologies, nous avons avancé l’hypothèse qu’un régime basé sur le jeûne intermittent (intermittent fasting, IF) consistant à limiter la prise alimentaire à certaines heures de la journée, sans restriction calorique, pourrait avoir des effets bénéfiques sur les épilepsies infantiles: les épilepsies “absence”. Le but de ce projet sera d'évaluer si le régime IF est capable d’améliorer le poids des crises épileptiques (nombre, durée) ainsi que les déficits cognitifs et comportementaux associés. Nous utiliserons 2 modèles d’épilepsie infantile “absence” chez la souris. Nous allons aussi examiner si le régime IF permet de baisser la dose efficace de médicaments anti-épileptiques communément utilisés en clinique (ex. ethosuximide, valproate), en réduisant leurs effets secondaires. En parallèle, nous essayerons de comprendre les régulations des réseaux neuronaux sous-tendant la pathologie, ainsi que les modifications métaboliques, physiologiques et transcriptomiques qui accompagnent le régime IF.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à une réduction des crises d’épilepsie et une amélioration des comorbidités comportementales en agissant uniquement sur la fenêtre de la prise alimentaire, pas sur sa quantité ni sur sa composition. Il s’agit d’une approche facilement transposable dans le cadre clinique et qui pourrait aider les patients atteints d’épilepsie dans leur quotidien. De plus, l’administration de médicaments durant le régime IF pourrait permettre de baisser la dose efficace de ces composés, en limitant ainsi leurs effets secondaires.

Procédures

Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale, pour la pose d'un implant afin d'effectuer des enregistrements électroencéphalogramme (EEG), ainsi que des prélèvements sanguins à un mois minimum d'interval (voir chronogramme en annexe). L'acte chirurgical dure environ 45 minutes. Le prélèvement sanguin dure 10 secondes max entre la contention et l'acte de prélèvement.

Impact sur les animaux

Le régime IF a été prouvé comme étant bénéfique pour la santé chez l'homme et l'animal. A noter que les modèles d'épilepsie que nous utilisons n'induisent pas de crises convulsives (motrices) mais de perturbations cérébrales qui provoquent un arrêt de l'activité locomotrice pour quelques secondes, plusieurs fois par heure. Les crises ne sont donc pas douloureuses ni fatigantes. La procédure prévoit des prélèvements sanguins ainsi qu'une chirurgie: ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (perte de poids, détachement de l'implant EEG, dégradation de l'apparence physique ou troubles du comportement). C'est pour cela que la procédure est classée modérée. Cependant nous mettrons en place une grille de scores dès l'apparition de signes cliniques. D'autre part, selon notre expérience le type de chirurgie prévue est très bien supporté par les animaux.

Devenir

A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.

Remplacement

Il n'existe pas d'alternative autre que les animaux pour évaluer avec précision et pertinence un modèle épileptique dans notre projet de recherche.

Réduction

Nous utiliserons un même animal pour l'exploitation de plusieurs tissus, ce qui nous permettra de réduire le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l'étude. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé selon Dell et al. (Samplesize determination, Ilar Journal, 2002, 43 :207) et le logiciel G*power, sur la base de publications précédentes et de notre expérience de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences (niveau de significativité: p=0.05).

Raffinement

Des dispositions seront prises pour le raffinement des conditions d'élevage et d'expérimentation. Le maintien d'enrichissement de la naissance à l'expérimentation sera effectif dans toutes les cages. Un enrichissement supplémentaire de type paille en carton ("sizzle"), igloo, ou maison en carton sera mis en place en cas d'isolement des souris pour les besoins des expériences. Le bien-être animal sera au centre de notre projet. Un suivi régulier sera appliqué dès le débuts de nos expérimentations. Les chirurgies seront effectuées en suivant les règles d'anesthésie et analgésie. Une grille de score sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques : dos vouté, poils ébouriffés, comportement anormal, stéréotypies.

Choix des espèces

L'espèce souris (Mus musculus) est un modèle très étudié dans tout projet de recherche. Les souris fournissent des excellents modèles d'épilepsie de type "absence", au cœur de notre projet. Les autres espèces utilisables ne sont pas envisageables à ce stade de l'étude en vue des contraintes éthiques et/ou d'hébergement requises par ces espèces. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes sur un point de vue médical. Nous utilisons les animaux à partir de 6 semaines car c'est l'âge à laquelle les crises d'absence commencent à se manifester. Les animaux seront utilisés à 6 semaines d'âge, âge à laquelle les premiers symptômes épileptiques sont visibles sur nos modèles génétiquement modifiés.