Procédures modérées

99 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime enrichi en graisse pour développer une stéatohépatite non alcoolique, avec une administration orale quotidienne et des prélèvements sanguins étalés, avant des prélèvements d'organes post mortem. Le porteur décrit une étude menée pour un client afin de constituer un dossier d'autorisation de mise sur le marché d'un composé. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'effet d'un composé sur le poids et les troubles métaboliques.

Objectifs

L’étude décrite dans le présent dossier sera réalisée dans le cadre du développement de composés d'intérêt thérapeutique, destinés à l’amélioration des troubles métaboliques, notamment la stéatose hépatique non alcoolique.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de constituer un dossier d'autorisation de mise sur le marché pour commercialiser un composé thérapeutique luttant contre la stéatose hépatique non alcoolique.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une pesée 2 fois par semaine de D-21 à D-1 - une pesée 3 fois par semaine à partir de D1 - une administration orale quotidienne à partir de D-7 - un prélèvement sanguin à la queue à D1, D29 et D57 - un prélèvement sanguin à partir de la veine caudale à D-7, D29 et D57

Impact sur les animaux

L'allopécie peut survenir dans ce modèle murin de stéatose hépatique non alcoolique. Elle semblerait être un conséquence phénotypique de cette maladie métabolique. Du moment que la peau a un aspect normal et est intact de toute lésion, aucun traitement n'est requis. Les souris peuvent être utilisé en expérimentation. Les prélèvements à D-7, D29 et D57 (7.5% du volume sanguin total) sont assez espacés dans le temps afin de permettre aux animaux de récupérer.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements d'organes pour des analyses post mortem.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les troubles métaboliques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages en groupe, de par le caractère social de l'espèce. Les animaux conserverons des contacts visuels avec leurs congénères des autres cages et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dômes en carton et de briquettes en bois. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6NTac est un modèle murin de stéatose hépatique non alcoolique. nourris avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

92 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un régime à 60 % de fructose et une perfusion d'angiotensine II par pompe implantée sous la peau pour installer un syndrome métabolique, avec transplantation fécale par gavage et prélèvements sanguins répétés sur huit semaines. Le porteur cherche à relier la restriction en sel, le microbiote intestinal et la fibrose cardiaque. Il affirme que l'usage d'un modèle de rat est "indispensable" pour une pathologie touchant de multiples organes.

Objectifs

Les maladies liées à la fibrose sont la cause chaque année de 800000 décès dans le monde parmi lesquels la majorité est liée à la fibrose pulmonaire et cardiaque. La fibrose cardiaque est responsable de plusieurs dysfonctionnements cardiaques pouvant éventuellement conduire au décès du patient. Diverses situations pathologiques favorisent la fibrose cardiaque, comme l’hypertension artérielle, l’insulinorésistance, l’obésité et le diabète de type 2, pathologies souvent associées dans le contexte du syndrome métabolique, qui affecte aujourd’hui 25 à 45% de la population dans les pays industrialisés. Plus qu’un simple regroupement de symptômes, le syndrome métabolique rassemble des facteurs de risque, prédisposant aux maladies cardiovasculaires et métaboliques. L’augmentation de ces troubles métaboliques va de pair avec une consommation excessive de sucres et notamment de fructose, très abondant dans le sirop de maïs, utilisé dans les boissons sucrées. Dans ce contexte nous avons pu montrer qu’un régime alimentaire appauvri en sel a des effets bénéfiques tant sur les anomalies métaboliques que cardio-vasculaires/rénales induite par le régime enrichi en fructose, ceci dans un modèle de syndrome métabolique chez le rat Sprague Dawley. Ce modèle animal consiste à nourrir les rats avec un régime alimentaire constitué de 60% de fructose associé à une perfusion sous-cutanée d’angiotensine II qui provoque une hypertension modérée, à l’aide de mini-pompes osmotiques implantées sous la peau. Nous souhaitons à présent étudier l’implication du microbiote intestinal dans la prévention de la fibrose cardiaque au cours du syndrome métabolique. Notre hypothèse est que la restriction sodée serait capable de moduler la composition du microbiote intestinal, ce qui contribuerait à ses effets bénéfiques sur le cœur des rats présentant un syndrome métabolique. En cas d’anomalies métaboliques, les Bacteroides deviennent majoritaires au détriment des Firmicutes et participent à l’installation de la métainflammation. Un régime riche en fructose modifie la composition du microbiote chez l’animal. Plus précisément, deux genres bactériens, Coprococcus et Ruminococcus, sont induits par le régime riche en fructose chez le rat et diminués par un traitement antibiotique ainsi qu’un transfert de fèces provenant d’animaux sous régime standard.

Bénéfices attendus

La restriction sodée a un effet bénéfique sur la plupart des modifications cardiovasculaires/ rénales et métaboliques présentes dans un contexte de syndrome métabolique. Nos travaux permettront ainsi de démontrer que la restriction sodée module la transition endothélio-mésenchymateuse et possiblement la composition du microbiote intestinal, deux phénomènes qui participeraient à ses effets bénéfiques sur la fibrose cardiaque. De plus, cette étude permettra d'identifier de nouveaux acteurs qui pourront conduire à des stratégies innovantes visant à prévenir la fibrose cardiaque s’installant très précocement lors de la dysfonction métabolique et l’hypertension observées au cours du syndrome métabolique.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements sur animaux vigiles (prélèvements sanguins à la queue, procédure d'une durée de 1h30 réalisée une fois dans la vie de l'animal, 7 prélèvements seront réalisés à 15 minutes d'intervalle), à une procédure chirurgicale (insertion de mini pompe osmotique en sous-cutané, incision de 1cm au niveau du dos refermée par 2 points de suture, procédure réalisée une fois dans la vie de l'animal, durée 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront exprimenter de l'inconfort durant le gavage au cours de la transplantation fécale, qui durera le temps de la précédure (quelques minutes par rat) (procédure 1). Les animaux pourraient ressentir une douleur suite à l'insertion en sous cutané de la mini pompe osmotique (incision de 1cm environ, 2 points de suture) (Procédure 2).

Devenir

Les animaux sont maintenus en vie durant les 8 semaines que dure l'expérimentation, puis tous les animaux sont mis à mort.

Remplacement

Notre objectif est d’étudier l’implication du microbiote dans les effets d’un régime appauvri en sodium sur les dommages cardiaques au cours du syndrome métabolique, qui est une pathologie affectant de multiples organes. L’utilisation d’un modèle de rat nous paraît donc indispensable afin d’évaluer au mieux l’impact du régime appauvri en sel sur la composition du microbiote intestinal et les conséquences sur le cœur et les multiples tissus dysfonctionnels dans le syndrome métabolique.

Réduction

Dans une première expérimentation, le nombre de rats s'élèvera à 12 animaux par groupe (total 36 animaux) a pu être réduit à 8 animaux par groupe dans la seconde expérimentation (total 56 animaux) soit une réduction de 28 animaux.

Raffinement

Afin d’assurer leur bien-être, les animaux seront placés dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages) au sein d’une animalerie agréée. Les rats feront l’objet d’une surveillance journalière avec la mise en place d’astreintes pour les samedis, dimanches et jours fériés. Le poids des animaux sera suivi toutes les semaines et les signes d’inconfort ou de souffrance seront recherchés. En particulier, lors de l'implantation des mini pompes, les animaux seront anesthésiés. De la lidocaine en spray sera appliquée pour

Choix des espèces

Dans le domaine des maladies métaboliques, les rongeurs sont les plus utilisés car ces derniers présentent un phénotype relativement proche de la maladie humaine. Le rat Sprague Dawley nourri avec un régime riche en fructose est un modèle établi de syndrome métabolique* sur lequel nous travaillons depuis de nombreuses années. Les rats seront utilisés à partir d’un stade de 6 semaines d’âge. Le régime alimentaire enrichi en fructose débutera à l’âge de 8 semaines, âge où la composition du microbiote se stabilise.

3 840 rongeurs, 1 920 souris et 1 920 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation douloureuse de la vessie est induite par injections répétées de cyclophosphamide, puis les animaux reçoivent des candidats médicaments et subissent des mesures de douleur viscérale et des tests aux filaments de von Frey appliqués entre l'anus et l'urètre. Le porteur reconnaît que la nuisance pour le bien-être des animaux sera importante, le besoin constant d'uriner et la douleur de la cystite interstitielle étant reproduits chez les rongeurs. Il indique qu'aucun modèle in vitro ne prédit la fonction vésicale ni la douleur viscérale.

Objectifs

La cystite interstitielle (CI), désormais appelée « syndrome de la vessie douloureuse » est une maladie inflammatoire de la vessie qui se caractérise par des envies anormales d’uriner (envies pressantes et/ou fréquentes) et par des douleurs importantes dans le bas ventre et la vessie, au niveau de l’urètre ou au niveau du vagin chez les femmes, parfois accompagnées d’une difficulté à uriner. La sévérité des symptômes est variable d’une personne à l’autre mais dans le cas grave la maladie est très invalidante. Alors que la cystite « classique » est une inflammation de la vessie causée par des bactéries, la cystite interstitielle est une affection chronique, c’est-à-dire qu’elle dure dans le temps, dont les causes ne sont pas élucidées. Il est difficile de connaître le nombre exact de personnes atteintes par cette maladie, qui est probablement sous-diagnostiquée. La prévalence (nombre de cas dans une population donnée à un moment précis) varie selon les pays. En Europe, les estimations vont d’une personne atteinte sur 12 500 à une personne sur 1500. Si tout le monde peut être affecté, 90% des patients souffrant de cystite interstitielle sont des femmes. La maladie survient en moyenne entre 30 et 40 ans, et 25% des patients ont moins de 30 ans. On ne connaît pas encore les causes de cette maladie, qui a longtemps été considérée comme d’origine psychologique. Une des hypothèses avancées concerne l’altération de la perméabilité de la paroi vésicale. L’intérieur de la vessie est normalement tapissé par une couche de protéines (glycosaminoglycanes notamment) dont le rôle est de protéger la paroi des composants agressifs et toxiques de l’urine. Or cette couche protectrice est déficiente (et donc perméable) chez 70% des personnes atteintes de cystite interstitielle. Les éléments toxiques (par exemple le potassium concentré) pourraient alors pénétrer la paroi de la vessie, provoquer une inflammation et déclencher la pathologie. La cystite interstitielle, à cause des douleurs qu’elle engendre et l’envie incessante d’aller aux toilettes, nuit énormément à la qualité de vie des personnes atteintes. La communauté des patients et les urologues demandent une recherche plus active sur cette pathologie car les traitements proposés aujourd’hui ne sont pas efficaces. L’objectif de notre projet est de mettre en place un modèle expérimental de cystite interstitielle chez le rongeur, afin de pouvoir tester des candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui le médecin urologue ne dispose pas de médicaments spécifiques pour soigner cette maladie très invalidante. Il utilise donc des thérapies pour soulager la douleur, comme les antalgiques, ainsi que les antispasmodiques, les relaxants musculaires ou encore les anticonvulsivants. Le médecin peut introduire une solution stérile qui contient un ou plusieurs médicaments dans la vessie en insérant un cathéter dans l’urètre. Ces médicaments agissent alors directement sur la paroi de la vessie. Toutefois, l’efficacité de ces traitements est très limitée et de courte durée. Il est donc urgent de mettre au point de nouveau médicaments. Le but ultime de notre projet est de mettre en place un modèle de cystite interstitielle qui sera utilisé pour tester l’efficacité de nouveau médicaments ayant différent mécanismes d’action, afin de contribuer à mettre sur le marché des médicaments plus efficaces.

Procédures

1) Induction de la pathologie. Cette étape expérimentale est réalisée sur 6 jours par des injections intrapéritonéales répétées de cyclophosphamide sous anesthésie générale au jours 0- 3 - 6. La durée de cette procédure est de 5 minutes. 2) Prélèvement de sang: Un échantillon de sang sera prélevé 1 fois par jour pendant 3 jours par la veine de la queue afin de collecter des données de pharmacocinétique. La durée de cette procédure est de 10 minutes. 3) Administrations des candidats médicaments par voie systémique ou intravésicale. Le produit à tester sera injecté 1 fois/jour entre les jours 7 et 9 du protocole expérimental. La durée de cette procédure est de 5 minutes pour les voies systémiques et de 30 min pour la voie intravésicale. 4) Enregistrement des mictions en continu pendant 72 heures dans cage métabolique. 5) Enregistrement des scores de douleur viscérale. Cette procédure ne sera pas appliquée aux animaux utilisés pour les études en cage métabolique. Les rongeurs seront observés par un expérimentateur pendant 30 minutes pour déterminer un score de douleur viscérale. Ensuite un autre test sur animal vigile sera utilisé pour étudier la douleur référée liée à la vessie, par les mono-filaments de Von-Frey appliqués entre l’anus et l’urètre. Les mesures sont prises en utilisant la méthode ascendante avec une série de filaments. Les animaux sont d’abord acclimatés à l’environnement pendant 60 minutes chaque jour pendant 2 jours. Ensuite, après administration de cyclophosphamide, des stimulus sont appliqués. Chaque stimulus consiste en une application de 5 s du filament de von Frey à la région abdominale inférieure à des intervalles de 5 minutes. La durée de cette procédure est de 30 minutes.

Impact sur les animaux

La procédure expérimentale décrite dans ce projet a pour but d’induire une forte inflammation vésicale chez le rongeur qui puisse mimer la cystite interstitielle. Les symptômes de cette pathologie sont le besoin constant d’éliminer de très faibles quantités d’urine. Les patients ressentent la plupart du temps un besoin fréquent d’uriner, et ce jour et nuit. La douleur, constante ou intermittente, peut être très importante dans la CI : généralement elle s’intensifie lorsque la vessie est pleine, et diminue transitoirement après la miction. Il y aura donc les mêmes symptômes chez les rongeurs. La nuisance pour le bien-être des animaux sera donc importante. D'autres nuisances seront liées à l'administration repetée de candidats médicaments à tester, en utilisant différentes voies d'administration, c'est à dire voie orale (gavage) , voie intraperitoneale, voie sous-cutanée, voie intravésicale, voie intra-détrusoriale.

Devenir

A l'issue des Procédures 1 ou 2, tous les animaux seront euthanasiés car il ne sera plus possible de les reutiliser.

Remplacement

Le but de notre étude est de quantifier l’effet de molécules ayant des mécanismes d’actions différents sur la fonction vésicale chez le rongeur éveillé, donc l’étude ne peut se faire que sur des animaux vivants. En effet, il n’y a pas de modèles in vitro prédictifs de la fonctionnalité vésicale dans sa globalité, ni de la douleur viscérale.

Réduction

Le nombre d'animaux pour chaque groupe expérimental sera de 12, étant donné la variabilité interindividuelle de réponse à la cyclophosphamide. Un calcul de puissance statistique basé sur les données de la littérature pour ce modèle, nous a montré que l'utilisation de 12 animaux par groupe nous permettra de détecter une différence de 25% entre les animaux traités avec le solvant (contrôles )et les auimaux traités avec le candidat médicament. Le nombre de lots est déterminé en fonction du nombre des doses à tester pour chaque molécule. Le nombre d'animaux est réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisamment robustes et permettant une analyse statistique appropriée. Du point de vue statistique, les groupes expérimentaux (entre 4 et 8 groupes expérimentaux, nombre d'animaux par groupe égal à 12) seront comparés entre eux en utilisant un test two-way ANOVA, suivi par un post-test.

Raffinement

Tous les efforts seront mis en place afin de minimiser la douleur, l'angoisse et la souffrance animale. Les animaux seront hébergés 2-4 (rats) ou 4-6 (souris) par cage, en fonction de leur poids corporel, avec de l’enrichissement dans les cages (tuyau, igloo, aspen brick et cocoon). Les cages sont de type IVC en surpression et sont rangées sur portoirs ventilés. Les cages resteront à une place fixe sur le portoir et seront bougées le moins possible. Les animaux seront manipulés à des fins expérimentales uniquement dans le laboratoire et non dans leur pièce d’hébergement pour éviter de stresser les autres animaux présents dans la pièce. En cas d’administration de médicaments par voie orale, les animaux seront gavés par un technicien expérimenté. Le jour de l’administration de cyclophosphamide, les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane. L'examen quotidien des animaux permettra d'évaluer plusieurs paramètres de santé et bien-être, notamment changement de couleur et d'aspect des poils (poils hérissés), diminution de la prise de boisson et de nourriture, diminution de l’activité de toilettage et de l'activité exploratoire dans la cage, perte de poids. Si la perte de poids est supérieure à 20 % du poids initial, l'animal sera euthanasié. Dans le cas où un prélèvement de sang est nécessaire, les animaux seront manipulés sous anesthésie générale (isoflurane) afin de minimiser le stress et la douleur. Pendant le séjour dans les cages métaboliques pendant 72 heures, les animaux auront accès ad libitum à l’eau et à la nourriture. Les animaux seront en contact visuel et olfactif entre eux mais le matériel d’enrichissement au niveau du sol de la cage ne pourra pas être utilisé car il peut interférer avec la collecte des fèces et des urines.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont utilisés très fréquemment en recherche préclinique pour l’étude de la fonction vésicale. Les paramètres physiologiques et pathologiques liés à la fonction vésicale sont très bien caractérisés chez les rongeurs, ce qui facilite la comparaison des résultats entre différents laboratoires. Les rats seront de souche Wistar ou Sprague-Dawley, les souris de souche Swiss ou C57Bl/6 car ces souches sont largement utilisées pour les études de la fonction vésicale (nombreuses références bibliographiques). D'autres modèles expérimentaux, notamment chez le chien, le chat et les primates, posent de nombreux problèmes éthiques et d’infrastructures d’hébergement. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines d'âge (adulte) pour avoir une équivalence chez l'Homme.

7 200 larves de poissons zèbres vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime enrichi en graisse pendant huit jours puis une exposition à des polluants, benzo[a]pyrène ou pyrène, pendant sept jours, pour reproduire une maladie du foie gras et ses atteintes cérébrales. Le porteur décrit une nage plus faible ou anarchique comme effet attendu et renvoie au conditionnel un éventuel intérêt chez l'Homme. Il présente le poisson zèbre comme une alternative au modèle rongeur tout en jugeant l'expérimentation animale "indispensable".

Objectifs

Les maladies non-alcooliques du foie (i.e. NAFLD: non-alcoholic fatty liver disease) sont devenues une priorité de santé publique à cause de leur prévalence grandissante (25% de la population générale et plus 70% des personnes obèses). Elles débutent avec la stéatose hépatique (foie gras), stade bénin, qui peut progresser vers la stéatohépatite ou NASH (non-alcoholic steatohepatitis), propice au développement des cirrhoses et cancers du foie et qui peut avoir des répercussions au niveau du cerveau avec le développement d'encéphalopathies. Bien que les causes/mécanismes de cette progression pathologique restent à clarifier, l’exposition aux polluants environnementaux comme les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) est identifiée comme un facteur de risque. L’un de mécanismes suspectés fait intervenir les vésicules extracellulaires comme un moyen de communication crucial participant aux échanges entre le foie et le cerveau et favorisant la progression de ces maladies et l’apparition de dommages aux niveaux de ces organes. Il apparait donc important d’évaluer le rôle de ces vésicules dans ce contexte de NAFLD et d’exposition aux HAPs et en particulier sur les dommages hépatiques et cérébraux. Etant donné la nature complexe de ces pathologies qui dépendent des interactions étroites entre différents organes, dont le foie et le cerveau, et différents types cellulaires, il est indispensable d’avoir une approche intégrative uniquement retrouvée dans les modèles in vivo. Ainsi, nous mettrons en place une approche expérimentale sur un modèle de poisson-zèbre afin de comprendre le rôle des vésicules extracellulaires dans la progression des NAFLD induite par une exposition aux HAPs.

Bénéfices attendus

Cette phase d'expérimentation in vivo devrait permettre de confirmer le rôle des vésicules extracellulaires dans les effets néfastes d'une exposition à un polluant de l'environnement (benzo[a]pyrène ou pyrène) dans les maladies du foie et les dommages cérébraux associés. En outre, l'étude des potentiels effets protecteurs de molécules capables de réduire la production ou la capture de ces vésicules dans le cadre de ces pathologies pourra être une preuve de concept pertinente et permettre d'envisager d'autres études pour une éventuelle utilisation chez l'Homme.

Procédures

Alimentation avec un régime enrichi en graisse (8 jours) Exposition à des polluants de l'environnement (7 jours)

Impact sur les animaux

L'objectif de ce projet est d'étudier l'apparition et la progression de pathologies hépatiques avec des complications au niveau du cerveau. On s'attend donc à un impact sur la santé des poissons : développement d'une steatohépatite et peut-être le développement des premiers signes d'une encéphalopathie hépatique. Cependant cet impact restera modèré puisque qu'à ce stade de maladie, aucun signe de souffrance ne devrait se manifester mais il se pourrait que le comportempent des poissons soit légèrement altéré (nage plus faible ou anarchique; recherche alimenataire plus lente).

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin d'obtenir suffisamment d'échantillons biologiques pour réaliser les expériences envisagées et garantir au maximum l'obtention de résultats significatifs.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est indispensable à l’atteinte des objectifs du projet (3R : Remplacement) puisqu’il s’agit d’étudier le rôle des vésicules extracellulaires, un moyen de communication entre cellules et organes et qui circulent dans le sang. En particulier, l’un des objectifs de ce projet est d’évaluer si des vésicules émises par le foie peuvent induire des dommages au niveau du cerveau. Dans ce contexte, seul l’utilisation de modèles animaux permet d’appréhender la complexité de ces relations entre cellules et organes. Toutefois, l’utilisation du modèle poisson-zèbre reste une alternative au modèle rongeur dans le contexte de l’étude du rôle des vésicules extracellulaires dans les effets délétères des NAFLD.

Réduction

Les plans d’expérimentations ont été réalisés de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats significatifs et d’éviter les réplicats inutiles. En effet, de par l’expérience que nous avons de ce modèle et des expériences que nous voulons réaliser, nous avons pu déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser pour obtenir des résultats significatifs et reproductibles malgré la variabilité liée à l’expérimentation animale.

Raffinement

Les études seront conduites dans le respect des normes les plus strictes en matière de soins des animaux et d’évaluation de la souffrance animale (suivi d’une grille d’évaluation de la souffrance adaptée au modèle). Les animaux seront maintenus dans des installations modernes et agréées pour assurer un confort maximal aux animaux (qualité de l’eau, accès à la nourriture, température, cycle jour/nuit, nombre de poisson par bac…). Si une souffrance excessive venait à être détectée, quelle qu’en soit la cause (hébergement, manipulation, impact des traitements), les expérimentations concernées seront arrêtées et les procédures seront révisées (modifications des conditions d’hébergement, réduction des doses d’exposition aux agents toxiques…). Tout le personnel impliqué dans le travail des animaux a suivi une formation conformément aux réglementations institutionnelles et aux lois nationales relatives à la protection des droits des animaux.

Choix des espèces

Ce projet vise à évaluer l’impact des HAP sur l’appartion et la progression des NAFLD (maladies du foie allant de la stéatose vers un état pathologique, la stéatohépatite et qui peut se traduire également par complication au niveau cérébral). Le modèle de poisson zèbre se positionne comme un modèle d’étude intermédiaire entre les modèles in vitro et les modèles murins et ainsi à l’avenir limiter l’utilisation de ces modèles mammifères. Le modèle zebrafish possède, en effet, de nombreux atouts : une grande similitude physio-pathologique avec l’Homme notamment concernant le foie et les NAFLD (types cellulaires et métabolisme) mais également au niveau de la neurotoxicité ; une grande sensibilité dans la réponse aux agents hépatotoxiques et aux perturbateurs endocriniens ainsi que des avantages méthodologiques (transparence des larves permettant l’observation directe d’organes internes). Les animaux seront utilisés, après éclosion, au stade larvaire entre 4 et 12 jours post-fertilisation. En effet, à partir du 4ème jour, les larves présentent un foie fonctionnel et sont capables de se nourrir de l’alimentation apportée : 2 éléments essentiels à ce projet. D’autre part, de nombreuses études ont montré qu’à cet âge, les larves de poisson-zèbre pouvaient être utilisées comme modèle pour tester la toxicité d’agents chimiques au niveau du foie ou étudier le développement des NAFLD (induite par l’alimentation notamment) mais également pour évaluer la neurotoxicité de différents traitements.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont maintenues dans l'obscurité totale pendant sept jours, exposées à la lumière une à quatre heures, puis euthanasiées par perfusion intracardiaque pour analyser l'activité des interneurones du cortex visuel. Le porteur indique que ce projet sert d'abord à former des étudiants aux techniques, en plus de l'objectif de connaissance. Il affirme que les alternatives non animales ne sont pas encore disponibles et retient la souris pour la modification génétique aisée.

Objectifs

L'exposition soudaine à la lumière, après une période d’obscurité, induit une modification très importante de l’activité de tous les types des neurones du cortex visuel. Cependant, parmi toute la population neuronale de cette région, les interneurones sont les cellules les plus affectées. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les processus cellulaires et moléculaires qui se déroulent lors de l’activation de ce groupe cellulaire. Dans ce but, les souris seront hébergées dans le noir 24 heures/24 pendant 7 jours et seront ensuite exposées à la lumière entre 1 et 4 heures. Après cette exposition, elles seront mises à mort et leur cerveau sera prélevé pour faire des analyses moléculaires post-mortem.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance de ces techniques leur permettra aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche. Ce projet permettra de mieux comprendre les processus cellulaires et moléculaires qui se déroulent lors de l’activation des interneurones du cortex visuel.

Procédures

Les animaux seront hébergés dans le noir 24 heures/24 pendant 7 jours. A la fin de cette période, les souris seront exposées entre 1 et 4 heures à la lumière avant d’être euthanasiées par perfusion intracardiaque.

Impact sur les animaux

Nuisances liées à l'hébergement dans le noir: stress

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront mis à mort et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses moléculaires post-mortem

Remplacement

Pour comprendre l'activité des circuits neuronaux dans le cerveau, il est nécessaire de générer des données biologiques pertinentes. L'utilisation d'animaux est donc inévitable. Les souris sont les modèles animaux de prédilection pour les recherches dans ce domaine en raison de la structure anatomique et de la fonction bien définies de différents cortex cérébraux. La souris est aussi l’espèce de rongeurs qui permet d’obtenir aisément des animaux modifiés génétiquement. Il est important de noter que des alternatives non animales ne sont pas encore disponibles .

Réduction

L’expertise de nos instructeurs sur ces modèles garantit que le nombre d'animaux utilisés est minimisé par une pratique toujours de haute qualité dès le départ. De même il est extrêmement important pour nos objectifs éducatifs de pouvoir démontrer et mettre en pratique les procédures, le nombre d'animaux sera donc adapté en conséquence. Ce projet a aussi pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouveles techniques leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche.

Raffinement

Les souris seront placées en cage de 4-5 souris sur un rack ventilé, placé dans une salle d'hébergement. Un enrichissement de leur milieu (carrés de cellulose, maisons en papier mâché que les animaux peuvent utiliser pour se cacher et/ou ronger) permettra de favoriser les comportements d'exploration et d'empêcher le stress. Les animaux seront observés quotidiennement par le personnel zootechnique formé et compétent. Leur bien-être sera contrôlé par la cellule de bien-être del’animalerie.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle cellulaire et aussi au niveau des circuits neuronaux. Nous utilisons le modelé souris qui est l'espèce de rongeur permettant d'obtenir aisément des animaux modifies génétiquement. Le projet sera réalisé sur des animaux agés de plus de 6 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte pour ces espèces. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène. Les expériences doivent être réalisées sur animauix adultes lorsque les réseaux neuronaux sont mis en place et le système nerveux est mature.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux chirurgies à une semaine d'intervalle pour l'ablation de cinq sixièmes des reins, puis un régime riche en phosphate pendant dix semaines afin d'installer une insuffisance rénale chronique avec calcifications vasculaires. Le porteur décrit une hypertension attendue chez 75 à 80 % des animaux opérés et précise que les prélèvements sont terminaux. Il présente ce projet comme un préliminaire "indispensable" à l'étude des mécanismes de la maladie et affirme que l'expérimentation sur animal entier est "indispensable" pour une pathologie systémique.

Objectifs

Un taux élevé de phosphate (Pi) sérique est associée au développement de calcifications vasculaires (CV) chez les personnes atteintes d'insuffisance rénale chronique (IRC) et dans la population générale, et peut être une situation potentiellement mortelle. En effet, l’IRC aboutit à une hyperphosphatémie qui déclenche la calcification de la paroi des vaisseaux, ce qui entraîne une rigidification du système vasculaire et contribue au développement des maladies cardiovasculaires. Des études sur la population ont montré que plus la fonction rénale est altérée plus les risques de mortalité sont élevés. Cependant, bien que le rôle des niveaux élevés de Pi dans le développement des CV est largement reconnu, son mode d'action est encore inconnu et ne peut donc pas être ciblé de manière appropriée. L'objectif global de notre projet de recherche est de découvrir les mécanismes d'action du Pi qui entraînent le développement des CV dans le contexte de l'IRC, et d'identifier des cibles thérapeutiques putatives capables de contrecarrer ses effets délétères. Les modèles animaux décrits dans la littérature ne sont pas adaptés à la question scientifique que nous posons. Ainsi, la première étape qui fait l’objet de cette demande d'autorisation, consiste à optimiser la mise au point d’un modèle de souris présentant une insuffisance rénale chronique avec CV associées. L’IRC sera induite par ablation de 5/6ème des reins, technique que le chirurgien impliqué dans ce projet maitrise parfaitement. Pour favoriser l’apparition de calcifications vasculaires, les souris ayant subi cette ablation seront soumises à un régime riche en phosphate pendant 10 semaines. L'apparitions des CV sera évaluée par coloration spécifique des arches aortiques prélevés à partir de nos modèles.

Bénéfices attendus

Ce projet est un préliminaire indispensable permettant d’établir un modèle de souris optimisé pour pouvoir par la suite évaluer les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables des effets toxiques de l’hyperphosphatémie chez les patients en IRC. Les connaissances sur les mécanismes responsables de l’évolution de cette pathologie et la gestion de l'IRC ont considérablement augmenté, et le contrôle du niveau de phosphate dans le sang à tous les stades de l'IRC est considéré comme l'un des aspects les plus importants pour améliorer les résultats cliniques de l'IRC. En effet, un taux élevé de Pi sérique est le plus important facteur de risque associé à la CV dans la population générale. Pour faire face à la toxicité du Pi et à ses conséquences sur les risques cardiovasculaires, la compréhension des actions moléculaires et cellulaires du Pi est d'une importance capitale. Elle permettra de contrôler les effets néfastes de la toxicité du Pi et de proposer des recommandations diététiques au niveau sociétal. Cela aura de grandes implications sociales et économiques en matière de bien-être et de vieillissement en bonne santé.

Procédures

Deux chirurgies à une semaine d'intervalle sont nécessaires pour induire l'IRC chez la souris. Deux prélèvements de 2-3 gouttes de sang, avant la chirurgie 1 (2-3 gouttes de sang à partir de la veine de la joue) et en fin de procédure expérimentale (prélèvement terminal sans réveil), seront réalisés.

Impact sur les animaux

L’insuffisance rénale chronique induite par néphrectomie des 5/6 est bien tolérée chez la souris. L’expérience du chirurgien en charge de l’opération porte sur plusieurs centaines d’animaux, sans mortalité observée dans les 3 mois suivant la chirurgie. Les niveaux d’insuffisance rénale obtenus par néphrectomie des 5/6 restent modérées grâce à l’hypertrophie de la portion résiduelle de rein. En effet la concentration plasmatique d’urée (un marqueur classique de la fonction rénale) est de 5-6 mmol/L chez les souris contrôle et de 18-25 mmol/L chez les souris néphrectomisée. Pour faire le parallèle avec la clinique humaine, nous avons par le passé mesuré la clairance de la créatinine chez ces animaux et pu grader l’insuffisance rénale comme correspondant à un stade 3-4 en clinique humaine (stades pour lesquels les stratégies de suppléance rénale ne sont pas encore mises en oeuvre). Les principales manifestations cliniques de l’insuffisance rénale chronique sont une hypertension artérielle qui survient chez 75 -80% des animaux néphrectomisés et une protéinurie. La supplémentation de l’eau de boisson des animaux néphrectomisés avec du bicarbonate de sodium (80 mM) permet d'empêcher les acidoses.

Devenir

des prélèvements terminaux sans réveil pour tous les animaux sont nécessaires pour évaluer l'apparition des calcifications vasculaires dans ce modèle.

Remplacement

S’agissant d’une maladie systémique (insuffisance rénale chronique), l’expérimentation sur animal entier est indispensable pour évaluer le rôle des différents organes impliqués dans cette pathologie

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude (72 souris) a été calculé au plus juste afin d’offrir la puissance statistique maximum. Pour calculer la taille des groupes et les analyses de puissance statistique, nous avons utilisé l'outil G*Power (erreur de type I = 0,05)

Raffinement

Le protocole chirurgical sera réalisé sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane offrant à la fois une bonne sécurité et un bon confort anesthésique. Un protocole d’analgésie (associant anesthésie locale per-opératoire et l’usage de dérivés morphiniques) et un système d'évaluation du bien être et de la douleur permettra, de prévenir et de contrôler efficacement les douleurs post-opératoires. Les conditions d'hébergement sont adaptées aux besoins des souris (regroupement par 5 souris maximum, température, enrichissement du milieu de vie avec du frisotis permettant aux souris de se fabriquer un nid)

Choix des espèces

Nous avons choisi de mettre en place ce modèle d’étude chez la souris car nous utiliserons dans un deuxième temps des souris génétiquement modifiées, toutes sur fond génétiques C56BL/6, pour des gènes importants pour l’homéostasie phosphocalcique afin de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires des effets du Pi dans l’IRC avec CV associées. Des souris adultes de 20 semaines seront utilisées pour pouvoir confronter nos résultats avec d'autres modèles décrits dans la littérature.

240 souris dites humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules immunitaires humaines puis un vecteur de thérapie génique AAV, avec prélèvements sanguins hebdomadaires à la jugulaire pendant douze semaines, injections répétées de LPS, pompes implantées chirurgicalement sous le dos et anticorps injectés trois fois par semaine. Le porteur indique que les souris sont mises à mort par décapitation ou pentobarbital après un prélèvement terminal de sang et d'organes. Il affirme que les méthodes in vitro ou in silico ne rendent pas compte de la réponse immunitaire dans son ensemble et conclut que l'emploi d'un organisme vivant est "nécessaire".

Objectifs

La thérapie génique consiste à introduire un gène thérapeutique dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés (AAVr) constituent des outils de choix. Une seule injection d’AAVr permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Néanmoins, malgré de récents succès, un des facteurs majeurs pouvant limiter l’efficacité du transfert de gène est la réponse immunitaire dirigée contre ce vecteur. Cette réponse immune délétère s'explique, en partie, par le fait que les humains sont naturellement infectés au cours de leur vie par des virus AAV sauvages. Au laboratoire, nous avons récemment développé un modèle animal pour mimer la réponse préexistante anti-AAV. Ce modèle semble reproduire la réponse immune anti-AAV observée chez l’humain. La génération de ce modèle animal ouvre un champ d’applications important pour aider au développement de médicaments de thérapie génique innovants plus efficaces et plus sûrs sur le plan immunologique pour prévenir un rejet du transfert de gène. Ainsi, fort de ces constats, nous proposons de tester, dans notre modèle de souris humanisées, 2 stratégies pour moduler la réponse immunitaire anti-AAV préexistante et ainsi prévenir le rejet lié au transfert de gène. La première stratégie consistera à utiliser l’interleukine 34 (IL-34) pour favoriser l’émergence de cellules immunitaires impliqués naturellement dans la modulation des réponses immunitaires. Dans la seconde stratégie, un anticorps anti- CD45RC sera utilisé pour moduler l’action des cellules exprimant fortement le marqueur CD45RC. L’objectif scientifique de ce nouveau projet est de développer une stratégie pour moduler la réponse immune préexistante dirigée contre le vecteur de thérapie génique.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer une méthode pour prévenir la réponse immunitaire anti-vecteur et permettre ainsi d’améliorer les traitements de thérapie génique à l’aide d’AAVr.

Procédures

Un prélèvement sanguin par semaine sera réalisé pendant 12 semaines. Les animaux seront anesthésiés et le sang sera prélevé au niveau de la jugulaire. La durée totale d’intervention est estimée à environ 3 mn. Chaque animal sera injecté 2 fois en intraveineuse dans la veine caudale sous anesthésie gazeuse. L’une pour l’injection d’AAVr à J 0, l’autre pour les cellules immunitaires humaines à J+1. La durée totale d’intervention est d’environ 5 mn. Les animaux recevront 3 injections en intra-péritonéale de LPS à J+1, J+2, J+3 après l’injection IV du vecteur. Une injection en IP se fait en moins d’une minute. Des injections IP d’IL-15 seront réalisées 2 fois par semaine pendant les 12 semaines de suivi du projet. Pour les animaux inclus dans la première stratégie d’immunomodulation. 48h avant injection de l’AAVr, des pompes Alzet rechargeables-iPrecio seront placées chirurgicalement sous la peau du dos des souris permettant de diffuser de l’IL-34 sur plusieurs jours. Le temps d’anesthésie, de préparation du champ opératoire et de la chirurgie est d’environ 30 mn. La recharge en IL-34, s’effectuera tous les 15 jours après palpation de l’orifice de la pompe rechargeable à travers la peau. La recharge s’effectue en moins de deux minute. Pour les animaux inclus dans la deuxième stratégie d’immunomodulation B, l’anticorps anti-CD45RC ou l’anticorps contrôle seront injectés par voie intraveineuse dans la veine caudale 3 fois par semaine pendant 4 semaines. Compte tenu de la fréquence, les animaux ne seront pas anesthésiés. Les souris seront placées dans un tunnel de contention pendant 2 minutes le temps de l’injection. En cas de stress marqué, dû à la répétition des procédures, les animaux seront anesthésiés en gazeuse.

Impact sur les animaux

Les différents produits ont tous déjà été administrés chez la souris à des doses supérieures ou égales à ce qui est envisagé dans ce projet, sans observation de signe clinique notable. L’utilisation de seringue à insuline équipée d’une petite aiguille de 30 G permet de limiter le désagrément de la piqûre. L’installation d’une pompe rechargeable-iPrecio nécessite une petite chirurgie pour la placer en sous-cutanée. L’animal sera sous analgésie en pré et post opératoire pendant 24h. Au-delà, aucune douleur n’est attendue.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie après chaque procédure et ce jusqu’à la fin du protocole (entre 1 et 3 mois maximum post-injection selon les réponses aux stratégies d’immunomodulations), jour de l’euthanasie et de la réalisation des prélèvements de tissus et d’organes. En ce qui concerne les animaux des différents groupes expérimentaux, notre protocole requiert un prélèvement terminal d'une grande quantité de sang sur lequel s'appuiera certaines analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques, mais également pour éliminer la plus grande majorité de sang des organes ou tissus tels que le foie, le cœur, la rate, les poumons, le cerveau, les reins ou encore les muscles squelettiques qui seront prélevés pour analyses. Les animaux subiront donc une anesthésie gazeuse préalable (isoflurane : induction 5%) suivie d’une décapitation qui sera systématiquement réalisée par du personnel compétent pratiquant cette technique en routine. Tous les animaux sont concernés par cette procédure exceptés les animaux inclus qui entrent dans le cadre de la procédure de perfusion du foie pour isolement des cellules. Dans le présent cas, le sang ne sera pas récupéré après perfusion hépatique, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane et mis à mort par injection de pentobarbital (Euthasol vet à la dose de 140 mg/kg en IV ou IC).

Remplacement

L'utilisation de méthodes alternatives tels que des techniques in vitro ou in silico ne permettent pas de rendre compte de la réponse immunitaire dans son ensemble, l'emploi d'un organisme vivant est donc nécessaire. La souris est un modèle de choix par sa petite taille, ses performances de reproduction et sa durée de vie. Jusqu’à présent aucun modèle animal n’a pu prédire une réponse immune préexistante contre le vecteur AAV car la plupart ne sont pas des hôtes naturels de l’AAV. Néanmoins, dans plusieurs essais cliniques cette réponse a été mise en évidence et a conduit à la perte de l’efficacité du traitement. Le récent développement d’un modèle de souris humanisées nous a permis de reproduire cette immunité préexistante en laboratoire. Ce modèle animal pourra nous permettre de développer des stratégies pour moduler la réponse immune et permettre le maintien de l’expression du gène thérapeutique à long terme.

Réduction

Chez l’humain, l’intensité de la réponse immune est variable, ainsi pour que les résultats soient statistiquement interprétables nous envisageons au maximum d’injecter les cellules de 10 donneurs humains. Au maximum, 240 animaux seront utilisés dans le projet. Si la variabilité de réponse est faible entre les donneurs et donc que les résultats sont statistiquement interprétables avant d’atteindre les 10 donneurs, le protocole sera arrêté pour ne pas mettre à mort des animaux supplémentaires. Ce nombre a été calculé statistiquement et permet de réduire le nombre d'animaux au maximum tout en obtenant des résultats probants.

Raffinement

Le souci du bien-être animal passera par : (i) De bonnes conditions d’hébergements. Par exemple pour les cages comportant plus de 2 souris, une bonne quantité de frisottis en carton est ajouté dans chaque cage pour enrichir l’environnement des animaux. Pour les cages comportant moins de 3 animaux, en plus des frisottis, est ajouté un igloo en cellulose. Des petits morceaux de bois à ronger sont distribués. Les litières sont changées 2 fois par semaine. Un suivi régulier des animaux, chaque cage est inspectée quotidiennement pour vérifier que les animaux se portent bien ainsi que pour contrôler le niveau de nourriture et d’eau. (ii)L’instauration de points limites pertinents et précoces. La détermination des points limites se basera sur la grille d'évaluation ci-dessous, adaptée aux procédures envisagées. En cas de 3 signes cliniques notables ou 1 signe clinique sévère, l'euthanasie sera décidée. -Signes cliniques notables : lésion sans effraction cutanée, agitation, hypomobilité, hyperréactivité, résistance à la manipulation, stéréotypie, poil piqué, gonflement abdominal, perte de 10% à 20% du poids, diminution ou absence de prise de nourriture/d'eau... -Signes cliniques sévères : lésion sévère, saignement incontrôlable, akinésie, convulsions, respiration difficile ou suffocation, absence de fèces ou fèces liquides, déshydratation, perte >20% du poids, douleur à la palpation… (iii)La mise en place de mesures adaptées (anesthésie, analgésie ou mise à mort par des méthodes reconnues).

Choix des espèces

Dans la majorité des études de thérapie génique ou d'immunologie, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. L'utilisation de la souris est justifiée à la fois par l'existence de plusieurs modèles murins humanisés ainsi que par la possibilité de constituer des groupes suffisamment larges pour effectuer des analyses statistiques. Le modèle murin (NOD/SCID/HLA-A2) est couramment utilisé en transfert adoptif de cellules humaines, car il permet une bonne survie des cellules transférées. L'expression de l'allèle du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I HLA-A2.1 est indispensable car les cellules humaines transférées ont un répertoire restreint à cet allèle. La preuve de concept de modélisation de la réponse immune anti-AAV préexistante étant faite chez la souris NSG HLA A2, le développement de stratégies d’immunomodulation dans ce modèle est privilégié. Les souris seront injectées entre 6 et 14 semaines d’âge. À ce stade, les tissus de soutien et les niches nécessaires au support et à la survie de transfert adoptif de cellules sont suffisamment développés pour permettre le succès du transfert adoptif.

240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une pompe osmotique est implantée sous la peau par chirurgie, puis les rats subissent pendant cinq jours des prélèvements sanguins quotidiens représentant 3,5 à 7 % de leur volume sanguin et des injections sous-cutanées, pour tester de nouvelles molécules contre l'hyponatrémie. Le porteur affirme avoir déjà prouvé l'efficacité de sa molécule brevetée et renvoie au conditionnel l'intérêt pour les patients, avec moins d'effets indésirables que le Tolvaptan. Sur le remplacement, il indique qu'il serait "nécessaire" de démontrer l'efficacité chez l'animal avant l'Homme et retient le rat comme modèle reconnu par la communauté internationale.

Objectifs

L’hyponatrémie, c’est-à-dire la diminution de la concentration de sodium du sang, est une pathologie fréquente, en particulier en hospitalisation. C’est un problème de santé publique puisqu’elle augmente la mortalité quelle que soit la pathologie responsable. Le Tolvaptan est un médicament, utilisé en clinique chez l’Homme dans cette pathologie. Toutefois, son utilisation est limitée, notamment du fait d’un risque de correction trop rapide de l’hyponatrémie et d’une toxicité au niveau du foie. Il paraît donc nécessaire de rechercher de nouvelles options thérapeutiques. Une nouvelle molécule a été développée dans notre laboratoire. Cette molécule est plus sélective et plus puissante que le Tolvaptan. De plus, cette molécule est moins toxique pour le foie. Nous avons déjà prouvé l’efficacité de notre molécule chez l’animal contre cette pathologie par de premières expériences. Nous voudrions maintenant valider chez le rongeur des versions de cette molécule optimisées en laboratoire et brevetées en 2021.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l’effet, chez le rat, de nouvelles molécules pour traiter l’hyponatrémie qui devraient présenter moins d’effets indésirables que les traitements actuels, afin d’envisager une utilisation de ces produits chez l’Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale courte (d’une durée d’environ 10 minutes) pour mettre en place une pompe osmotique sous-cutanée. Les animaux vont être placés en cage individuelle permettant de recueillir les urines et les fèces pendant 5 jours. Pendant ces 5 jours, les animaux vont être soumis à des prélèvements sanguins (d’une durée d’environ 3 minutes) quotidiens d’un volume de sang correspondant à environ 3.5-7% de leur volume sanguin total chaque jour. Pendant les 3 derniers jours, les animaux vont être injectés quotidiennement par voie sous-cutanée (d’une durée inférieure à une minute).

Impact sur les animaux

La mise en place du modèle d’hyponatrémie nécessitera l’administration continue sous-cutanée par pompe osmotique d’une molécule, l’apport d’une nourriture semi-liquide et l’hébergement dans des cages spéciales permettant de récupérer les urines. Les effets indésirables relatifs à l’implantation de la pompe osmotique sous-cutanée sont potentiellement une douleur relative à la chirurgie, une infection et/ou une mauvaise cicatrisation au niveau du site chirurgical. Ces effets débuteront lors de la chirurgie et dureront au maximum 2 jours. Les effets indésirables relatifs à l’apport d’une nourriture semi-liquide et à l’hébergement dans des cages spéciales sont potentiellement un stress pour les animaux. Ces effets dureront au maximum 5 jours. Le traitement par les molécules candidates nécessitera des injections sous-cutanées quotidiennes. Les effets indésirables relatifs au geste quotidien d’injections sous-cutanées sont potentiellement une douleur au niveau du site d’injection et un stress lié à la contention des animaux. Ces effets dureront au maximum 5 jours. Les dosages de la natrémie nécessiteront des prélèvement sanguins quotidiens. Les effets indésirables relatifs à ces prélèvements quotidiens sont potentiellement une douleur et une hypovolémie. Ces effets dureront au maximum 5 jours.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés au CO2 à la fin de la procédure afin de réaliser une autopsie.

Remplacement

L’objet de ce travail est d’étudier l’efficacité de nouveaux composés, jamais administrés chez l’Homme. Il existe donc un objectif clinique à court terme. Les expériences in vitro ont déjà été réalisées afin de valider l’affinité et la sélectivité des molécules pour leur cible. Avant d’évaluer l’effet de ces produits chez l’Homme, il est nécessaire de démontrer leur efficacité chez l’animal. Le modèle expérimental que nous avons choisi constitue un modèle pathologique fiable qui a déjà été utilisé pour développer des traitements chez l’Homme dans l’hyponatrémie.

Réduction

Nous allons réaliser notre étude sur un modèle déjà publié et bien décrit dans la littérature, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour la mise au point du modèle. Afin de limiter le nombre d’animaux, nous avons calculé le nombre d’animaux nécessaire par groupe via l’utilisation d’un test statistique. Pour réduire le nombre d’animaux, les doses de molécules thérapeutiques qui vont être étudiées ont été sélectionnées grâce à des études in vitro et in vivo antérieures. De plus, les résultats des expériences seront analysés au fur et à mesure afin de modifier si besoin les doses de produit utilisées et donc ne pas utiliser inutilement des animaux. Au total, 240 animaux au maximum seront utilisés pour ce projet.

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupes dans un milieu enrichi pendant au minimum 8 jours. Une surveillance quotidienne des animaux par des personnes habilitées et formées sera effectuée. Afin de diminuer la douleur occasionnée par les chirurgies, des analgésiques injectables par voie sous-cutanée seront délivrés. Pendant toute chirurgie, les animaux seront maintenus à 37°C, leur rythme respiratoire sera observé avec attention, et ils seront réhydratés. À leur réveil, les animaux seront remis dans une cage propre dans un milieu enrichi et étroitement surveillés pendant au moins 48h. Pour réduire ou supprimer la douleur et le stress relatifs aux prélèvements et administrations sous-cutanées quotidiens, une pommade analgésique sera appliquée sur le site d’injection, 10 minutes avant la piqûre. La localisation du site d’injection variera quotidiennement et les injections seront réalisées dans une pièce au calme sans passage. Les animaux devront être placés dans des cages spéciales permettant le recueil de leurs urines au cours du temps. Le temps passé dans ces cages sera réduit au minimum (5 jours) et une observation quotidienne de tous les animaux sera réalisée. Pour réduire ou supprimer la douleur et le stress relatifs aux prélèvements quotidiens, les animaux seront anesthésiés.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce préalablement utilisée pour des expérimentations in vitro, ex vivo et in vivo dans le laboratoire pour tester l’effet des antagonistes des récepteurs à la vasopressine sur différents paramètres rénaux et cardiovasculaires. Conserver la même espèce animale permet d’éviter de renouveler certaines expériences et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. De plus, le modèle utilisé correspond à ceux préalablement décrits dans la littérature pour évaluer l’effet des traitements dans l’hyponatrémie. Il s’agit du modèle reconnu par la communauté internationale comme le plus adapté aux pathologies humaines. Les rats utilisés dans ce projet seront à un stade de développement similaire à celui utilisé dans les protocoles de la littérature, c’est-à-dire des rats âgés de plus de 6 semaines. Cela permettra la comparaison des résultats expérimentaux obtenus aux données de la littérature.

24 porcs adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Douze subissent une perfusion isolée du rein de six heures pour tester un vecteur de thérapie génique, avec cathétérisme, prélèvements sanguins répétés et mise à mort au bout de deux semaines, les douze autres, jugés non éligibles, étant cédés à un autre établissement pour une formation chirurgicale sans réveil. Le porteur indique des douleurs possibles aux points de cathétérisme, gérées par antalgiques. Il affirme qu'un "organisme entier" au système vasculaire intact est requis et qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité du rein.

Objectifs

Les maladies rénales rares se répartissent en trois groupes principaux : • les anomalies congénitales du développement rénal, • les maladies rénales monogénétiques identifiées, • les syndromes néphrotiques. Ces maladies ont en commun un phénotype variable selon l’âge, pouvant progresser jusqu'au stade final qui est incurable et exige un traitement soit de substitution avec la dialyse, soit une transplantation rénale. Les maladies rénales monogénétiques, comme les tubulopathies, maladies kystiques, tubulo-interstitielles ou glomérulaires, peuvent toucher n’importe quelle structure du néphron et nécessitent une prise en charge spécifique précoce. A ce jour il n’existe aucun traitement curatif. L’objectif final de ce projet est de traiter ces maladies rénales chez l’homme, et plus particulièrement celles d’origine génétique. L’approche par thérapie génique qui a pour but de suppléer le gène défectueux dans les maladies monogéniques, c’est à dire liée au dysfonctionnement d’un seul gène, est très prometteuse. Elle doit pouvoir permettre l’administration en toute sécurité de vecteurs thérapeutiques (« moyen de transport » pour apporter du matériel génétique dans les cellules cibles) dans le rein, et d’en cibler l’action au rein en limitant l'exposition à d'autres organes. Les vecteurs de thérapie génique de choix aujourd’hui sont les vecteurs de type AAV (virus adéno-associé), car ils permettent un transfert de gène efficace dans beaucoup de tissus. Une Perfusion LocoRégionale (PLR) du rein, dans laquelle le rein est isolé de la circulation générale de façon transitoire tout en étant oxygéné, pourrait assurer un ciblage spécifique de ce tissu d’intérêt.

Bénéfices attendus

Les maladies rénales ciblées, ont en commun une présentation phénotypique variable selon l’âge, un risque d’évolution vers l’insuffisance rénale, d’une hypertension artérielle, et des répercussions possibles sur la croissance chez l’enfant. Toutes ces maladies rares nécessitent donc une prise en charge adaptée et précoce, gage d’une évolution ralentie ainsi qu’un suivi prolongé et pour un grand nombre d’entre elles tout au long de la vie adulte. Par rapport aux thérapies classiques, la thérapie génique permet de cibler directement le gène défectueux responsable des maladies rénales géniques. L’identification d’un vecteur de thérapie génique avec un fort tropisme pour le rein, couplée à la technique de PRL optimisée en terme de durée de perfusion et de quantité de vecteur injectée pourra permettre une transduction maximale du vecteur au niveau du rein, avec donc une correction du gène défectueux, et sans avoir à subir les effets secondaires liés à une transduction du vecteur dans les autres organes.

Procédures

Le projet se déroulera selon les étapes suivantes (cf annexe 1) : 1- CT-Scan Chacune des 4 Phases du projet devra être constituée de 3 porcs (2 minimum). 6 porcs seront soumis au CT-Scan, afin de vérifier la compatibilité avec une PLR. L’examen sera réalisé sous anesthésie générale avec monitoring et sera d’une durée d’environ 2h. Cette étape sera répétée pour chacune des Phases du projet, pour un total maximum de 24 porcs. 2- PLR du rein Cette intervention concerne les animaux éligibles à une PLR du rein suite au résultat du CT-Scan. La PLR sera réalisée en établissant une perfusion localisée et isolée du système vasculaire rénal. La mise en place de la PLR se fera par une méthode peu invasive : cathétérisme de la veine jugulaire et de l’artère fémorale pour accéder respectivement à la veine rénale et à l’artère rénale. Cette mise en place se fait en percutanée sous angiographie. La PLR sera réalisé sous anesthésie générale et analgésie adaptée ainsi qu’un monitoring constant. Le vecteur testé sera injecté au niveau du système PLR à une dose donnée et pendant le temps déterminé L’intervention est estimée à 6h. Cette étape sera répétée pour chacune des Phases du projet, pour un total maximum de 12 porcs (3 animaux maximum /Phase, 4 Phases maximum) 3- Prélèvements Sanguins Des prélèvements sanguins seront réalisés pendant la PLR à D0 sous anesthésie générale, sur sang périphérique et au niveau de la PLR (détermination de l’infectiosité et dissémination du vecteur) : - sang périphérique à D0 avant le début de la PLR (baseline) pour toutes les analyses citées ci-après. - au niveau du système de la PLR à D0 puis +5min, +10min , +15min , +20min, +25min , +30min , +45min, +60min, +75min, +90min, +105min et +120min après le démarrage de la PLR Des prélèvements sanguins seront réalisés au niveau de la veine jugulaire sous anesthésie générale à D3, D5, D10+/-1, D14+/-2 pour sérologie anti-AAV, dosages des paramètres biochimiques, numération sanguine et hémostase, marqueurs rénaux, évaluation immunologiques et biodistribution. Tous les animaux inclus dans chacune des Phases du projet : 12 porcs max (3 animaux max/Phase, 4 Phases max.). 4- Mise à mort Suite à un suivi de 14±2 jours, les animaux inclus seront euthanasiés sous anesthésie générale et analgésie, pour prélèvements post-mortem. Avant l'euthanasie, des prélèvements sanguins ante-mortem sont effectués. Tous les animaux inclus dans chacune des Phases du projet : 12 porcs max (3 animaux max / Phase, 4 Phases)

Impact sur les animaux

La mise en place de la PLR se fera par méthode peu invasive. L’accès veineux du système vasculaire rénal sera réalisé à partir du cathétérisme de la veine jugulaire ou fémorale et l’accès artériel à partir de l’artère fémorale. La PLR sera réalisée dans un premier temps sur l’un des 2 reins, isolé de la circulation générale par une approche hémodynamique basée sur l’oxygénation d’une membrane extra-corporelle (ExtraCorporeal Membrane Oxygenation, ou ECMO). Lors d’une précédente étude identique menée sur le cœur, « Etude de tolérance, toxicité et biodistribution d’un vecteur thérapeutique à 2 semaines après perfusion locorégionale (PLR) du coeur battant chez le porc domestique », APAFIS#26250-2020062915381908, quelques animaux ont montré de douleurs post-LRP au niveau des points de cathétérisme avec difficulté de mobilité durant 3 jours maximum. Des traitements antalgiques et antibiotiques supplémentaires ont été mis en place et ont permis de résoudre ces effets indésirables. Lors du présent projet, les mêmes observations peuvent être attendues et anticipées, et le traitement suivant sera mis en place en fin de PLR du rein : un traitement antibiotique sera réalisé par injection IV de 20 mg/kg de Céfazoline (Rilexine®, Cefovet®). En fin de procédure de PLR, une antibiothérapie sera mise en place, 1g d’ampicilline/ulbactam (Unacim®) et 0.4mg/kg de meloxicam (Metacam®)) par voie IV. Pour anticiper toute douleur, 0.2mg/kg de Morphine sera administré en intramusculaire. Si besoin, avec accord du vétérinaire de l’UE, un traitement analgésique (ex : Buprénorphine ou Perfalgan si douleur) pourra être mis en place dans les jours suivant la procédure.

Devenir

Au cours de ce projet, les animaux subiront différents actes expérimentaux du début à la fin de la procédure dans laquelle ils seront inclus. Avant chaque Phase du projet, une imagerie CT-Scan sera réalisée sur un maximum de 6 porcs (nombre maximal compte tenu des statistiques de compatibilité avec une PLR afin d’obtenir 3 animaux (2 minimum) /Phase) afin de déterminer les animaux éligibles à une PLR de rein. Un total maximum de 24 porcs sera donc soumis à une imagerie (6 porcs/Phase, 4 Phases maximum). Sur ces 24 animaux, 12 maximum seront retenus pour la réalisation de la PLR du rein, et seront suivis durant 14±2 jours durant lesquels différents prélèvements sanguins seront effectués, avant euthanasie pour prélèvements post-mortem afin de déterminer la tolérance, la toxicité et la biodistribution du vecteur testé. Les 12 autres animaux non éligibles seront réutilisés par un autre établissement utilisateur pour des formations de procédures chirurgicales, procédure sans réveil.

Remplacement

Différents modèles cellulaires in vitro comme des lignées de cellules épithéliales rénales, ou plus récemment d’organoïdes rénaux différenciés à partir notamment de cellules souches pluripotentes induites sont disponibles et permettent l’étude des maladies rénales. Il est cependant très difficile d’obtenir dans ces modèles une structure vascularisée. L’expérimentation animale proposée vise à établir la PLR du rein, un organisme intact avec un système vasculaire est requis pour sa mise en oeuvre. En effet, compte tenu de la complexité du rein, tant structurelle (vascularisation, structure cortico-médullaire) que fonctionnelle (contrôle de la pression rénale), les paramètres issus de processus complexes qui doivent être contrôlés lors de la PLR ne peuvent pas être simulés par des modèles in vitro. D’autre part, l’étude de la transduction du rein par les AAVs en comparaison avec la transduction d’autres organes non-ciblés (biodistribution) permettant d’évaluer l’efficacité et la sécurité du futur produit thérapeutique ne peut être réalisée que sur un organisme entier, et donc sur animal vivant.

Réduction

Un total maximum de 24 porcs sera nécessaire, afin d’obtenir 3 animaux (2 minimum) éligibles à la procédure PLR pour chacune des 4 Phases. Ce nombre requis s’explique par le fait que l’un des critères d’inclusion est que la structure vasculaire rénale de chaque animal inclus ne doit pas présenter d’anomalies. Cette structure vasculaire rénale sera analysée par imagerie médicale, CT-scan Computed Tomography Scan, ou tomodensitométrie). Selon les données préliminaires du Sponsor, seul 1 animal sur 2 présentera une structure vasculaire rénale adaptée à le PLR et pourra donc être finalement inclus pour l’approche PLR du rein. D’autre part, les reins sont des organes très vascularisés et une quantité importante de sang y afflue. Aussi, toute intervention chirurgicale, même peu invasive, reste délicate et entraine un risque accru pour l’animal. Il en résulte la possibilité d’une interruption prématurée de l’expérience en cas par exemple d’une hémorragie ou encore une altérations des structures cellulaires en cas de pression et d’oxygénation non contrôlées. Le nombre d’animaux inclus dans chaque phase (3 porc) a été défini en tenant compte de ces 2 points de façon à obtenir le nombre minimal requis d’animaux ayant été soumis à la procédure PLR complète, à savoir 2 porcs + 1 animal « backup ». L’enchainement des 4 Phases est lié à des « GO/NO GO », cf. Annexe 1, c’est à dire avec un enchaînement dépendant des résultats obtenus à une dose d’AAV donnée et un temps de perfusion donné. Un « GO » sera donné lorsque une transduction maximale et spécifique du rein sera obtenue à une dose donnée. La Phase suivante consistera alors à réduire le temps de perfusion, afin de vérifier si une efficacité similaire est obtenue avec un protocole PLR plus réduit. Au contraire, en cas de « NO GO » (transduction insuffisante et/ou non spécifique du rein), la phase suivante consistera à tester une dose de vecteur plus haute. Un tel enchaînement permet de minimiser le nombre total d’animaux inclus. Et dès lors que l’objectif de transduction maximale du rein sera atteint durant une des Phases, le projet sera stoppé, minimisant là aussi le nombre total d’animaux inclus. Des analyses statistiques de type non paramétriques seront utilisés pour comparer les données obtenues entre les différents groupes expérimentaux.

Raffinement

- De bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur : Deux à 3 porcs par hébergement permettant des interactions sociales entre les animaux. L’hébergement est organisé sur 2 box attenants dont un seul avec copeaux de façon à garantir une propreté maximale. Un enrichissement du milieu et mise à disposition d’objets (Box équipés de planche anti-démangeaisons, balles, Kong dental…). Interactions sociales, en dehors des gestes inhérents au protocole, avec des soignants par le biais d'échanges quotidiens avec un technicien animalier. - Intervention de personnels formés spécifiquement à l’espèce - Suivi observationnel et clinique régulier des animaux - Toutes les interventions seront réalisées sur animal anesthésié. Les procédures d’anesthésie légère (prélèvements sanguins) ou profonde (chirurgie), sont détaillées dans les procédures expérimentales. - Un traitement peri-opératoire avec analgésiques sera mis en place pour limiter la douleur. - Un suivi post-chirurgie par un vétérinaire et technicien animalier sera réalisé - Une grille de scoring de la douleur sera mise en place afin de détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates.

Choix des espèces

En raison de la configuration expérimentale avec une membrane extracorporelle (ECMO), seul le modèle grand animal peut être utilisé pour les expériences prévues. Puisqu'un rein suffisamment grand est important pour réaliser l'expérience de perfusion avec son propre circuit de perfusion extracorporelle, les petits modèles animaux ne sont en effet pas compatibles avec cette étude. Le porc est un modèle animal répandu dans la recherche médicale de par certaines caractéristiques physiologiques, anatomiques et génétiques proches de celles de l’être humain. C’est notamment le cas de ses fonctions cardiaques, pulmonaires et rénales. Le choix du porc est donc optimal pour le développement d'une méthode de PLR, qui est transférable à l'homme du fait de son anatomie, de sa taille et de la possibilité d’utiliser un matériel identique à celui utilisé chez l’homme et donc permettant de favoriser rapidement son utilisation thérapeutique potentielle chez le patient. Le porc domestique à l’âge adulte a été choisi pour cette étude en raison de son poids et des similitudes avec le rein humain. En effet un poids de 80-90kg lors de la procédure PLR est nécessaire pour se rapprocher d’une future évaluation chez l’humain adulte. Les animaux seront donc injectés à l’âge adulte, puis seront suivis durant 14±2 jours post-injection maximum.