Procédures modérées

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est implantée sous la peau, puis elles reçoivent par voie intraveineuse des formulations d'un photosensibilisateur avant prélèvement de sang et d'organes après mise à mort, pour comparer la diffusion de deux formes liposomales au produit de référence. Le porteur indique que les souris maintenues à l'obscurité jusqu'à 48 heures subissent un stress, la lumière étant évitée pour prévenir la photosensibilisation. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne peut être maintenu assez longtemps pour étudier cette diffusion dans l'"organisme entier".

Objectifs

La thérapie photodynamique est un traitement employé en cancérologie pour éradiquer les tumeurs de petite taille accessibles à la lumière. Le principe repose sur l’activation, en présence d’oxygène et de lumière, d’une molécule appelée photosensibilisateur qui se localise préférentiellement dans la tumeur. La meta-tétra(hydroxyphényl)-chlorine (mTHPC) connue sous le nom de Foscan® est approuvée en clinique pour le traitement alternatif à la chirurgie des tumeurs des voies aéro-digestives supérieures mais étant peu soluble dans l’eau, elle persiste longtemps au niveau du site d’injection, freinant sa distribution aux organes et notamment à la tumeur, et entrainant des problèmes de photosensibilisation cutanée. Les objectifs de ce projet sont d’étudier le devenir au cours du temps dans le sang (pharmacocinétique) et la biodistribution au niveau tissulaire et intratumoral par imagerie de fluorescence de 2 nouvelles formulations liposomales à base de mTHPC en comparaison avec le Foscan® comme référence, administrés par voie intraveineuse chez la souris après induction d’une tumeur sous-cutanée. Lorsque la taille de la tumeur aura atteint le volume requis, les souris recevront par voie intraveineuse l’une des deux formulations liposomales ou le Foscan®. Les prélèvements de sang réalisés sous anesthésie, d’organes (peau, muscle, foie, reins, cœur, poumons et intestins) et de tumeurs réalisés après la mise à mort des animaux, seront effectués à différents temps après injection des 2 nouvelles formulations liposomales à base de mTHPC ou du Foscan®, avec 5 souris par temps de prélèvement et par produit injecté.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet va permettre d’évaluer la pharmacocinétique et la biodistribution tissulaire et intratumorale de 2 nouvelles formulations liposomales à base de mTHPC en comparaison avec le foscan®, composé à base de mTHPC utilisé en clinique. Le Foscan® est en effet utilisé pour le traitement alternatif à la chirurgie des tumeurs des voies aéro-digestives supérieures mais étant peu soluble dans l’eau, il persiste longtemps au niveau du site d’injection, freinant sa distribution aux organes et notamment à la tumeur, et entrainant des problèmes de photosensibilisation cutanée. Les 2 nouvelles formulations liposomales à base de mTHPC développées devraient permettre une meilleure diffusion dans l’organisme au cours du temps afin de mieux cibler la tumeur et de limiter son accès aux organes, notamment au niveau de la peau pour limiter les problèmes de photosensibilisation cutanée. Les données issues de ce projet permettront d’envisager des études cliniques chez l’Homme avec l’une et/ou l’autre des 2 nouvelles formulations liposomales à base de mTHPC testées.

Procédures

Les 180 souris nécessaires à la réalisation de ce projet seront soumises à l’induction d’une tumeur sous-cutanée par injection d’une suspension de cellules tumorales effectuée une seule fois en moins d’une minute et sous anesthésie générale. Un suivi de la croissance tumorale sera effectué par mesure tous les 2 jours sur animal vigile de la taille de la tumeur, à l’aide d’un pied à coulisse, mesure effectuée en moins d’une minute. Une injection intraveineuse de formulations liposomales à évaluer ou du produit de référence utilisé (Foscan®) sera effectuée sous anesthésie générale sur les 180 souris, une seule fois et en une minute environ, lorsque la tumeur aura atteint un volume défini (350 à 400 mm3), à la dose de 0,3 mg/kg pour 105 souris, et à la dose de 7,0 mg/kg pour 75 souris. Un prélèvement de sang de 0,5 ml sera effectué sur 105 des 180 souris par prélèvement intracardiaque sous anesthésie générale effectué une seule fois et en une minute environ, avant leur mise à mort, afin d’étudier le devenir au cours du temps dans le sang des formulations liposomales injectées par rapport à celui du composé de référence (Foscan®), puis d’étudier leur distribution dans différents organes et la tumeur qui seront prélevés après la mise à mort. Une injection intracardiaque d’un produit de contraste permettant de visualiser les vaisseaux sanguins au niveau de la tumeur sera effectuée sur 75 des 180 souris, une seule fois et en une minute environ, sous anesthésie générale, 7 minutes avant leur mise à mort.

Impact sur les animaux

Un stress des animaux utilisés dans ce projet sera induit par le placement à l’obscurité après la réalisation de l’injection intraveineuse de formulations liposomales à base de mTHPC ou de Foscan® jusqu’à leur mise à mort, rendu nécessaire afin d’éviter les problèmes de photosensibilisation cutanée. Ce stress induit concernera les animaux qui seront mis à mort aux temps prolongés de la cinétique réalisée, correspondant donc aux temps 18 heures, 24 heures et 48 heures, soit 45 des 105 souris utilisées pour la partie pharmacocinétique et biodistribution tissulaire, et 30 des 45 souris utilisées pour la partie biodistribution intratumorale. Les autres animaux qui seront mis à mort aux temps courts de la cinétique réalisée, entre 30 minutes et 6 heures, le seront au cours du cycle normal jour/nuit auquel ils sont soumis. Pour ces raisons, et le fait également d’induire une tumeur sous-cutanée, de réaliser des injections de produits, sous anesthésies générales répétées mais de courte durée, la procédure expérimentale a été classée en sévérité modérée.

Devenir

A l’issue de l’unique procédure expérimentale, après ou non réalisation d’un prélèvement de sang, les souris seront mises à mort afin de permettre le prélèvement d’organes et de la tumeur, et de pouvoir ainsi réaliser un ensemble d’analyses permettant d’étudier la distribution au cours du temps des formulations liposomales et du produit de référence (Foscan®) qui auront été préalablement injectés.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro (culture de cellules) ou ex vivo (organes isolés) qui ne pourraient d’ailleurs pas être maintenus dans un état physiologique pendant une durée prolongée, afin d’étudier la diffusion dans l’organisme entier au cours du temps (pharmacocinétique) et dans des organes cibles (biodistribution) de composés injectés par voie générale. L’étude de la distribution intratumorale de molécules d’intérêt est nécessaire pour optimiser l’intervalle de temps entre l’injection et l’irradiation lumineuse (IDL = Intervalle Drogue-Lumière). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études antérieures, pour certaines publiées, ayant permis d’ajuster les temps de cinétique de prélèvements et montrer que 5 animaux par temps de prélèvement et par groupe de traitement était nécessaire et suffisant. D’autre part, l’objectif étant de comparer 2 nouvelles formulations liposomales à base de mTHPC au Foscan®, il n’est pas nécessaire d’utiliser de groupe d’animaux témoins recevant une formulation liposomale neutre, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les injections sous-cutanée de cellules tumorales et intraveineuse de formulations liposomales à base de mTHPC et de Foscan®, ainsi que le prélèvement sanguin, seront effectués sous anesthésie générale. Les souris seront observées quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré tous les 2 jours, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint ou de 15% entre 2 pesées est observée, ou si des signes de toxicité des traitements, de déshydratation, de prostration prolongée, de non réponse à l’activité externe ou des modifications de leur comportement sont observés (difficultés à se déplacer, cachexie, vocalises, convulsions…), elles seront mis à mort dans des conditions éthiques. Une attention toute particulière sera portée aux animaux qui seront maintenus dans l’obscurité et mis à mort aux temps prolongés de la cinétique, 18 heures, 24 heures et 48 heures après injection des formulations liposomales à base de mTHPC et de Foscan®. Des boules de coton seront placées dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière

Choix des espèces

La souris Nude, présentant un système immunitaire déficient, est le modèle animal le plus approprié pour des études en cancérologie expérimentale, très utilisée et largement décrite dans la littérature scientifique, permettant d’injecter chez l’animal des cellules tumorales d’origine humaine sans risque de rejet. D’autre part, les études de pharmacocinétique et de distribution tissulaire et intratumorale sont principalement réalisées chez la souris car sa petite taille nécessite d’utiliser moins de composé à évaluer, composé dont le coût de développement peut être très important. Les animaux seront de jeunes souris âgées de 8-9 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 9-10 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge moyen de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études de pharmacocinétique et de biodistribution, et de souris utilisées lors d’études précédentes menées dans notre laboratoire selon le même protocole expérimental et ayant donné des résultats probants.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque jour du D-galactose par voie intrapéritonéale pendant huit semaines pour induire un vieillissement accéléré, avec prélèvements sanguins, traitements et mesures cutanées, avant mise à mort pour analyse des tissus. Le porteur indique des effets indésirables possibles des molécules testées, perte de poids et irritations cutanées. Sur le remplacement, il affirme que le modèle animal est "incontournable" et qu'aucun modèle in vitro ne rend compte du vieillissement de l'"organisme entier".

Objectifs

À l’échelle mondiale, la proportion de personnes âgées de 60 ans et plus est en constante augmentation depuis plusieurs années. En France, d’après les projections de l’Institut national de la statistique et des études économiques (Insee), un individu sur trois aura 60 ans et plus en 2050 (ils étaient un sur cinq en 2005). Accompagner ce vieillissement de la population est donc devenu un enjeu de santé publique mais aussi socio-économique. Ces dernières décennies, de nombreux modèles animaux de vieillissement ont été développés. Dans ce projet, on utilisera un modèle murin de vieillissement accéléré induit par le D-galactose avec pour objectif d'évaluer l'efficacité de nouvelles approches à visée thérapeutique. Le D-galactose est un nutriment physiologique, il s'agit d'un sucre réducteur qui, lorsqu'il est administré en excès chez la souris, contribue à la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), à un dysfonctionnement mitochondrial, à la formation excessive de produits glyqués et est associé à de l'inflammation et à un déclin progressif des capacités cognitives. Ces changements miment le processus de vieillissement dans différents tissus et organes incluant le cerveau, le coeur, les poumons,le foie, les reins, le système reproducteur, la peau, les os, les muscles squelettiques, la réponse immunitaire et dans le sérum. Ainsi, ce modèle présente des caractéristiques mimant la senescence du vieillisement naturel et est adapté à l'évaluation d'efficacité de nouvelles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le vieillissement est un processus physiologique qui intervient chez tous les êtres vivants. Il correspond à un déclin qui altère, à l’échelle moléculaire et cellulaire, les capacités fonctionnelles de l’individu et ses possibilités d’adaptation face à un évènement aigu auquel il est confronté (une maladie, un stress). Dans le contexte biologique, le vieillissement se caractérise par l’accumulation d’évènements qui détériorent les fonctions des organes, et par une augmentation, avec le temps, des risques de décès ou de développer des maladies (cancer, diabète, troubles cardiovasculaires ou cérébraux, etc.). La recherche biologique sur le vieillissement s’intéresse, par définition, à l’étude de cette accumulation d’innombrables évènements inévitables qui apparaissent au cours de la période comprise entre la conception et le décès de l’individu. Il est donc important d'avoir un modèle préclinique prédictif du vieillissement afin d'évaluer de nouvelles thérapeutiques dans le but d'appréhender le vieillissement de manière à "vieillir mieux".

Procédures

Les animaux seront administrés quotidiennement par voie intrapéritonéale (durée d'intervention

Impact sur les animaux

Dans la littérature, il n'y a pas d'effet indésirable décrit pour ce modèle de vieillissement accéléré. Des effets indésirables peuvent être observés lors de l'administration des molécules thérapeutiques : mauvaise tolérance pouvant entraîner une perte de poids, irritation en cas d'application topique...

Devenir

A l'issue de la procédure tous les animaux seront mis à mort afin de prévlever les tissus et réaliser des analyses ex vivo (histologie, dosages de cytokines, dosages enzymatiques...) pour l'évaluation d'efficacité des traitements testés.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux est incontournable afin d’étudier les mécanismes du vieillissement, mais aussi afin d’améliorer la compréhension des processus impliqués dans la survenue des syndromes de vieillissement accéléré. Il est indispensable d'améliorer les connaissances sur le vieillissement et les pathologies qui y sont associées. La complexité du vieillissement physiologique repose en fait sur la globalité de son impact : il intéresse l’ensemble des organes ; il est modulé par des facteurs qui peuvent être internes (c’est-à-dire physiologiques) mais aussi externes (environnementaux). Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro ou mathématique capable de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du vieillissement. L’utilisation de modèles murins déjà établis dans la littérature et décrits pour leur pertinence dans ce domaine de la recherche biomédicale est une étape nécessaire pour valider l’efficacité thérapeutique et la tolérance de nouvelles molécules ou thérapies candidates en clinique humaine.

Réduction

La stratégie d'expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées (étude longitudinale). Cette approche expérimentale permet d'appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées (ANOVA) et permet d'avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle car une observation est réalisée avant d'initier les phases de traitement. Le nombre d'animaux sera de 8 par groupe (groupe d'animaux traités avec excipient de la molécule à tester ou la molécule à tester). Ce nombre est le minimum pour avoir une significativité acceptable avec une variation de 15%, une puissance de 70% et une différence à souligner de 20% entre groupes témoins et tests comparativement à l'approche classique. Cette approche permet donc de réduire le nombre d'animaux de 50% au moins. Des analyses post mortem sur les tissus seront réalisées (histologie/immunohistologie/ PCR/ cytométrie et approches "omiques") afin d'obtenir le plus d'informations possibles relatives à l'efficacité des molécules administrées sur les animaux.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement par l’expérimentateur afin de s'assurer de leur bien-être (alimentation, boisson, comportement...). Plusieurs sources d’enrichissement dans la cage (tunnel, igloo, cotons,bâtonnets de bois) permettront d'améliorer leur environnement et leur confort d'hébergement. Leur poids sera évalué au 2 fois par semaine, cette mesure aidera à déceler une quelconque souffrance et/ou détresse. De la nourriture humidifiée ou du gel diététique pourra être ajouté dans leur cage. Au moindre signe de déshydratation, les animaux recevront une injection intra-péritonéale de sérum physiologique (20mL/kg). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien-Etre Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - Défaut d'alimentation et /ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation; - Perte de poids >20% du poids normal maintenue sur 72h; - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger; - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication au site d'injection (présence de plaie, douleur...) Si un de ces points limites est atteint, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les rongeurs se sont rapidement imposés au cours du temps comme des modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. L’essentiel de la littérature est obtenue chez ces deux espèces pour diverses raisons (i) scientifiques, les mécanismes moléculaires et cellulaires décrits dans ces espèces sont retrouvés chez l’homme et (ii) pour un intérêt pratique (faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de manipulation et très bonne adaptation aux conditions expérimentales) ; l’intérêt majeur étant en premier lieu, l’historique de la connaissance de ces animaux, chez lesquels l’essentiel des traitements utilisés en clinique humaine aujourd’hui ont été évalués et validés. Des animaux adultes de plus de 8 semaines d'ages seront utilisés dans ce projet (cf Parameshwaran K et al, Rejuventation Research, 2010).

96 poissons marins, daurades, loups et saupes, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poisson est marqué d'une puce sous anesthésie puis soumis à des tests d'effort et de tolérance au réchauffement en tunnel de nage et en bassin, pour évaluer si la résistance à la chaleur diminue avec la taille. Le porteur indique que les poissons sont euthanasiés pour retirer la puce, dangereuse si l'animal est mangé. Une grande partie des individus sont prélevés dans les lagunes côtières méditerranéennes avant d'être tués en fin d'expérience.

Objectifs

L’objectif est d’évaluer les relations entre la masse d'un individu et sa tolérance au réchauffement, chez trois espèces de poissons marins côtiers, la daurade royale (Sparus aurata), le loup (Dicentrarchus labrax) et la saupe (Sarpa salpa). Une récente étude a montré, chez une espèce de poisson, que la tolérance au réchauffement diminue avec la taille des individus. Ce phénomène a été mis en évidence avec un test de tolérance qui évalue la capacité des poissons à nager contre un courant pendant qu’ils subissent des augmentations progressives de la température. L’étude a montré une forte relation négative entre masse corporelle et température à laquelle un individu a arrêté de nager. Ces résultats soulèvent une problématique : Cette influence de la taille sur la tolérance est-elle un phénomène universel chez les poissons ? Les trois espèces choisies utilisent les lagunes côtières méditerranéennes comme des nourriceries et zones d’alimentation. Les lagunes semblent être des habitats clefs pour ces espèces mais sont très sensibles aux effets des changements globaux, en particulier un accroissement en fréquence et sévérité d’évènements climatiques extrêmes tels que les canicules estivales. Les vagues de chaleur représentent un risque majeur pour les poissons, il est donc important de comprendre si, chez les espèces de poissons qui utilisent les lagunes, la résistance aux canicules diminue avec l’augmentation de la taille des individus.

Bénéfices attendus

L’hypothèse est que la tolérance au réchauffement va diminuer avec la taille des individus chez les trois espèces ciblées. Le projet montrera si une diminution de la tolérance thermique avec la taille est un principe physiologique universel chez les poissons. Les informations obtenues seront très utiles dans le développement de modèles pour prédire les impacts du réchauffement global et des canicules sur les populations de poissons. Les informations sur les individus sauvages seront utiles pour les plans de gestion des trois espèces, qui sont exploitées par la pêche.

Procédures

Chaque poisson subira quatre interventions : un marquage avec une puce sous anesthésie, un test d'effort en tunnel de nage sur 24h, un test de tolérance au réchauffement en tunnel de nage sur 12h, et un test de tolérance au réchauffement en bassin sur 12h.

Impact sur les animaux

Les nuisances et les effets indésirables devraient être limités, les procédures sont d'une sévérité modérée. Les procédures en tunnel de nage impliquent un confinement mais sont de relativement courte durée et ne sont pas douloureuses. Les réchauffements progressifs représentent des nuisances transitoires d’une sévérité modérée, qui ne menacent pas la survie des animaux. La fatigue dans le tunnel de nage est une nuisance transitoire, d’une durée de moins de 5 minutes.

Devenir

Les poissons seront euthanasiés pour récuperer la puce RFID (PIT-tag) intramusculaire, qui est recouvert de verre et donc dangereux si le poisson est mangé par un prédateur ou par un humain.

Remplacement

Il est impossible de remplacer les poissons sauvages par des autres modèles, l'intêrét du projet étant justement de regarder l'impact sur ces espèces.

Réduction

Le nombre total d'individus sauvages testés sera limité à n = 24 de chaque espèce, plus n = 24 individus domestiqués. Ce nombre limité d’individus permettra, néanmoins, d’établir des relations entre masse corporelle et seuils de tolérance thermique en utilisant des approches de régression. Ce nombre permettra aussi de calculer des moyennes de taux de consommation d’oxygène à chaque température pendant les protocoles, pour évaluer les effets de la température et le comparer entre espèces, en utilisant des modèles linéaires mixtes ou des analyses de variance.

Raffinement

Tout sera mis en oeuvre durant les procédures pour limiter la souffrance et le stress des animaux afin d'obtenir des mesures valides et fiables de la physiologie des individus qui ne soient pas influencées par un état préalable de souffrance, de stress ou d'agitation. Un protocole d'anesthésie optimisé pour ces espèces sera utilisé pendant le marquage. Les poissons sont à l’abri de toute nuisance visuelle et sonore pendant la récupération et les expériences. Les protocoles expérimentaux en tunnel de nage sont bien établis chez les poissons. La phase de capture et de placement dans les dispositifs empêche toute exposition à l’air, et est suivi par une période d'acclimatation d'une durée minimale de 4 heures. Le rechauffement en bassin est aussi une technique largement maîtrisée et utilisée par l’ensemble de la communauté scientifique. Pendant les procédures en bassin les poissons seront observés avec une camera, au moment où un poisson montre des signes de stress comportemental (réponses de fuite, léthargie, perte d’équilibre), il sera enlevé très rapidement et placé dans un deuxième bassin rempli d'eau aérée et à température d'acclimatation, à l’abri de toute nuisance visuelle et sonore.

Choix des espèces

La daurade royale, le loup et la saupe sont des espèces côtières emblématiques en Méditerranée. De nombreux aspects de la physiologie environnementale restent inconnus pour les populations sauvages de ces trois espèces. L’acquisition des connaissances sur leur tolérance thermique pourrait être un appui aux mesures de gestion de ces espèces, dans un contexte des changements globaux. L’utilisation de trois espèces, de familles taxonomiques différentes, permet de montrer si les effets de la taille (masse corporelle) sur la tolérance thermique est un phénomène universel chez les poissons. Pour le fait que l’objectif du projet est l’évaluation des effets de la masse corporelle, les individus auront des stades de développement qui varient de juvéniles immatures à des adultes reproducteurs, avec une gamme de masse entre 30 et 800g.

432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un régime riche en sel leur induit une hypertension, puis elles reçoivent des molécules dans l'eau de boisson, des injections intraveineuses ou intrapéritonéales et des échographies cardiaques sous anesthésie, pour tester l'effet antihypertenseur des polyamines. Le porteur indique que l'hypertension induite provoque un stress et un inconfort, et que tous les animaux sont euthanasiés pour prélever leurs organes. Sur le remplacement, il affirme que le recours aux animaux vivants est "indispensable" car l'hypertension ne peut être reproduite in vitro.

Objectifs

L’hypertension artérielle est une maladie chronique, parmi les plus fréquentes en France. Cette pathologie est caractérisée par une pression anormalement élevée du sang dans les vaisseaux sanguins. Elle constitue, lorsqu’elle n’est pas contrôlée, l’une des principales causes de complications cardiovasculaires, cérébrovasculaires ou neurodégénératives (infarctus du myocarde, AVC…). A ce jour, pour normaliser la pression artérielle, les traitements thérapeutiques impliquent des mesures hygiéno-diététiques seules ou associées à certains médicaments. Nous avons montré que l'apport alimentaire en polyamines est inversement proportionnel aux niveaux de pression artérielle chez l'homme. De plus, les animaux traités avec les polyamines (dans l'eau de boisson) sont moins sensibles à l'hypertension. Dans ce projet, nous allons poursuivre ces observations et étudier si les effets antihypertenseurs des polyamines dépendent de l'induction de l'autophagie ou d'autres mécanismes moléculaires en utilisant un modèle murin d'hypertension, induite par un régime riche en sel, cliniquement pertinent.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour traiter l’hypertension artérielle, qui est le principal facteur de risque évitable de maladies cardiovasculaires et de mortalité chez les hommes et les femmes. En effet, l'hypertension artérielle systolique est à l'origine de plus de 10 millions de décès et touche au moins 874 millions de patients dans le monde. De plus, cette pathologie représente un défi majeur pour la santé publique étant la plus coûteuse de toutes les maladies cardiovasculaires.

Procédures

Tous les animaux du projet seront soumis une seule fois à l’induction de l’hypertension via un régime riche en sel (régime suivi pour environ 20 jours). Tous les animaux recevront 2 molécules administrées dans l’eau de boisson (4 semaines). 144 animaux recevront 1 injection i.p. et 144 animaux recevront 1 injection i.v. (animaux vigiles). La durée des injections i.p. et i.v. sont de quelques secondes. 144 animaux seront soumis à un prélèvement sanguin (quelques secondes). Tous les animaux seront soumis à la mesure hebdomadaire de la pression artérielle (animal vigile) (environ 20 min). Tous les animaux seront soumis (3 fois) à l’examen d’échocardiographie sous anesthésie (30 min par examen). L'échocardiographie et la mesure de la pression artérielle sont les méthodes de diagnostic les plus utilisées en cardiologie chez l’homme. Ces pratiques de routine ne sont pas invasives.

Impact sur les animaux

L’hypertension, qui est induite, est modérée. Elle va cependant provoquer un stress et un inconfort chez la souris. Les injections intra-péritonéales et intraveineuses ne provoquent pas de symptômes majeurs et seront effectués sur l’animal vigile.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, les conséquences et les effets sur l’organisme de l’hypertension artérielle vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 432 souris. Sur la base de notre expérience précédente, nous avons effectué un calcul de la taille de l'échantillon de 12 souris par groupe afin d'atteindre une puissance statistique. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs tests statistiques seront utilisés pour comparer les divers groupes de traitements.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie des animaux, utilisation de tapis chauffantes...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 12 semaines car l'âge a un impact sur la production neuronale de neurotransmetteurs et du métabolisme.

150 souris gestantes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de 30 minutes pour injecter de l'ADN dans le cerveau de leurs embryons par électroporation in utero, avant d'être tuées au CO2 et leurs embryons décapités pour analyse. Le porteur présente le projet comme une formation de chercheurs aux techniques d'étude de l'expression génétique embryonnaire. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier ce développement, qui ne peut selon lui se faire que chez l'animal vivant.

Objectifs

Le système nerveux central est composé de différents types de neurones dont la morphologie et la physiologie varient considérablement. Cette diversité commence au cours du développement embryonnaire et elle est déjà observée dans les cellules immatures qui donneront naissance à des neurones. Il est proposé que la hétérogénéité neuronale dépende, en plus que d'autres facteurs, de l'expression spécifique d'un ensemble de protéines de ces cellules. Pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui régissent la différenciation et la maturation des cellules pendant le développement, nous procèderons à transférer des gènes dans le cerveau embryonnaire grâce à la transfection par électroporation in utero menée chez la souris gestante. Nous proposons de former de nouveaux chercheurs sur les méthodes qui permettent d’étudier l’expression génétique pendant le développement embryonnaire. Une meilleure connaissance de nouvelles techniques leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ce genre d'expérimentations techniques pour leurs besoins de recherche.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance de nouvelles techniques leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ce genre d'expérimentations techniques pour leurs besoins de recherche.

Procédures

Les souris arriveront à notre animalerie au cours de leur 8ème ou 9ème jour de gestion (E8/E9). Entre 4 et 5 jours plus tard, les souris suivront une intervention chirurgicale d’une durée de 30 minutes. Pendant cette procédure, une solution contenant de l’ADN sera injectée dans le cerveau des embryons. Deux jours après, les souris gestantes sont mises à mort par inhalation de CO2. Les cerveaux de tous les embryons seront prélevés pour effectuer des analyses post mortem.

Impact sur les animaux

Nuisances liées aux procédures chirurgicales : douleur abdominale post opératoire, risque mineur d’infection de la cicatrice. Dans de très rares cas, les souris enceintes pourraient avoir des problèmes de mobilité après la chirurgie.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les souris gestantes seront mises à mort par inhalation de CO2. Tous les embryons seront mis à mort par decapitation et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses post mortem.

Remplacement

N'existant pas de modèle in vitro permettant d’étudier le développement embryonnaire de différents types de neurones, cette étude ne peut être réalisée que chez l'animal in vivo.

Réduction

L’expertise de nos instructeurs sur ces modèles garantit que le nombre d'animaux utilisés est minimisé par une pratique toujours de haute qualité dès le départ. De même il est extrêmement important pour nos objectifs éducatifs de pouvoir démontrer et mettre en pratique les actes de préparation chirurgicaux, le nombre d'animaux sera donc adapté en conséquence. Ce projet a aussi pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche. Le nombre d'animaux est adapté́ a nos objectifs éducatifs. Nous devons démontrer et mettre en pratique les procédures pendant nos formations. Lors de la formation, les instructeurs réalisent une démonstration de la procédure puis les étudiants auront l’occasion de pratiquer la procédure sous-couvert des instructeurs.

Raffinement

Pour diminuer le stress lié au transport, les souris sont stabulées, habituées, et manipulées quotidiennement dans une animalerie aux paramètres environnementaux contrôlés où leur entretien sera pris en charge par le personnel zootechnique formé et compétent. Les souris seront placées en cage de 4-5 souris sur un rack ventilé, placé dans une salle d'hébergement. Un enrichissement de leur milieu (carrés de cellulose, maisons en papier mâché que les animaux peuvent utiliser pour se cacher et/ou ronger) permettra de favoriser les comportements d'exploration et d'empêcher le stress. Nos mesures mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales impliquent une induction et suivi de l'anesthésie, une mise en place d'analgésie, une installation tout au long des procédures chirurgicales de contrôle de la température par tapis chauffant. Les animaux opérés seront observés quotidiennement par le personnel responsable de notre animalerie pendant la période qui suit le réveil (2h) ainsi que pendant les 2 jours suivants. L'évaluation des points limites se fera selon une grille d'évaluation (Annexe 1). Si l’animal atteint un score >11 au cours de l’observation sur une journée ou si la perte de poids est > 20% l'animal sera mis à mort. Après la procédure chirurgicale nous rajouterons de la nourriture humidifiée au fond de la cage

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine Nous devons cibler les cellules progénitrices en une période embryonnaire précise, nous utiliserons des gestantes à 13 jours de gestation. Il s’agit d’un stade où les embryons sont facilement accessibles pour l'électroporation (à des temps plus tardifs les embryons sont plus gros et difficiles à manipuler au sein de la corne utérine).

2874 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur pancréatique sous la peau ou dans le pancréas par chirurgie abdominale, puis un produit radioactif par voie intraveineuse et des séances d'imagerie, pour tester le diagnostic et la radiothérapie du cancer du pancréas. Le porteur indique une surveillance de la croissance tumorale et une mise à mort dès qu'un seuil de volume ou une perte de poids de 20 % est atteint. Il affirme qu'il n'existe "pas de modèles in vitro et in silico" reproduisant la complexité du milieu tumoral.

Objectifs

L'adénocarcinome ductal pancréatique (PDAC) représente 90% des cancers du pancréas. Il se classe à la 4ème place des causes de mortalité par cancer et la survie à 5 ans est aujourd’hui inférieure à 10%. Ce cancer souffre aujourd’hui de méthodes diagnostiques invasives et d’options thérapeutiques très limitées. Ce projet a pour objectif d’évaluer différents vecteurs biologiques pour la délivrance de radionucléides pour un diagnostic non-invasif et une thérapie ciblée du PDAC. Ce type d’approche a déjà été appliqué par l’équipe dans le cadre du cancer ovarien et fait l’objet de nombreux essais cliniques. Nous évaluerons le ciblage d’un récepteur exprimé à la surface des cellules de PDAC, ayant été validé sur des échantillons de PDAC humains et dont le potentiel clinique pour l’imagerie et la thérapie est établi. Nous souhaitons tester sur des modèles murins de PDAC, différents vecteurs biologiques afin d’évaluer l’impact de la taille du vecteur sur la distribution et la pénétration dans la tumeur. Cette étude permettra d’identifier le vecteur permettant d’identifier les sites tumoraux avec la meilleure définition et de détruire les cellules tumorales avec la plus grande efficacité.

Bénéfices attendus

Ce projet validera au stade préclinique l'utilisation de radiopharmaceutiques pour l'imagerie et la radiothérapie du cancer pancréatique. Le développement d’une telle approche à fort potentiel de transfert clinique pourrait favoriser le diagnostic précoce et la thérapie ciblée des 14’000 patients atteints de PDAC diagnostiqués chaque année en France. Une translation clinique est envisagée à la fin de cette étude avec le soutien d'un industriel (co-financeur du projet).

Procédures

Pour l’ensemble de ce projet, nous avons prévu un nombre de 2874 souris sur une durée de 5 ans. Des souris saines et des souris porteuses de tumeurs pancréatiques seront utilisés. Les tumeurs pancréatiques seront implantés soit sous la peau des souris par une injection sous-cutanée soit directement dans le pancréas de la souris lors d'un chirurgie abdominale sous anesthésie générale. Les animaux recevront par voie intraveineuse un radiopharmaceutique. Une partie des animaux sera alors utilisé pour valider le potentiel diagnostic de l'approche, les animaux seront anesthésiés et imagé par une technique d'imagerie non-invasive. Une deuxième partie des animaux sera utilisé pour quantifier la concentration du radiopharmaceutique dans 15 organes différents. Enfin, la dernière partie des animaux sera utilisé pour valider le potentiel thérapeutique de cette approche. Après l'injection du radiopharmaceutique, la croissance des tumeurs des animaux sera surveillée quotidiennement et plus particulièrement de manière bi-hebdomadaire par une mesure au pied à coulisse ou par une technique d'imagerie non-invasive.

Impact sur les animaux

Effets indésirables direct: - douleur associée à une injection sous-cutanée - douleur associée à une injection intrapéritonéale - douleur associée à une injection intraveineuse - douleur associée à une laparotopie et injection intrapancréatique. Effets indérisables indirect conséquence des produits injectés: - croissance tumorale - perte de poids.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés selon une méthode adapté pour l'animal (non anxiogène, indolore, perte de connaissance instantanée), pour l'expérimentateur (sans danger, sans risque de choc émotionnel), pour l'expérience (pas de modification des tissus nécessaire à l'expérimentation).

Remplacement

Ils n’existent pas de modèles in vitro et in silico reproduisant la complexité du milieu tumoral et permettant de déterminer la biodistribution d’un radiopharmaceutique.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en conservant une puissance statistique suffisante pour le traitement du résultat (analyse statistique préliminaire). L’évaluation de la pharmacologie de radiopharmaceutiques nous contraint à l’utilisation de plusieurs groupes contrôles. Néanmoins, le suivie par une technique d’imagerie non invasive, nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les protocoles expérimentaux puisqu’il n’y a pas de sacrifices à chaque temps d’imagerie.

Raffinement

Toutes les expériences suivent les recommandations du Gircor (Guide l'évaluation éthique), la "Charte pour une éthique de l'expérimentation animale" et le "Guidelines for the welfare and use of animals in cancer research "(Workman et al ; British Journal of Cancer ; 2010) . Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les mêmes membres du personnel. Un suivi quotidien des signes de souffrance sera effectué. Dans le cas où un animal présenterait des signes de souffrance ou perte de poids excessive (>20% du poids initial), ses douleurs ou sa détresse seront soulagées ou supprimées si les signes persistent plus de 24h selon des méthodologies adaptées au maintien du bien-être animal. Quand le volume tumoral dépassera un seuil limite défini pour chaque protocole l'animal sera sacrifié.

Choix des espèces

Il n’existe pas de méthodes alternatives aux expériences envisagées qui reposent sur les paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques in vivo des radiopharmaceutiques. Seule une étude in vivo permettra d’avoir des informations sur la biodistribution en temps réel et l’efficacité thérapeutique des radiopharmaceutiques. Age 6-8 semaines, animal adulte. Les cancers pancréatiques étant dominants dans la population adulte, les animaux utilisés seront donc en age adulte.

440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-cutanées répétées et jusqu'à sept prélèvements sanguins par semaine, pour tester la tolérance et l'efficacité de molécules visant une maladie de la densité osseuse. Le porteur indique que toutes les souris sont mises à mort pour des analyses ex vivo, quarante-quatre animaux surnuméraires pouvant être réutilisés pour une formation aux gestes techniques. Sur le remplacement, il affirme qu'un "organisme entier" est nécessaire et qu'aucune méthode in vitro validée n'existe.

Objectifs

Le but de ce projet est d’évaluer le profil d’élimination, l’efficacité́ et la tolérance sur un modèle rongeur (souris) de molécules à visée thérapeutique dans le cadre de traitement des problèmes de fragilité et densité osseuse. Dans ce projet, nous allons tester des molécules candidates en développement qui ont montré un potentiel thérapeutique élevé in vitro.

Bénéfices attendus

Les maladies touchant la densité osseuse sont des pathologies lourdes, pouvant être létales. Elles se caractérisent par des fractures répétées et sévères. On observe chez les patients, de nombreuses complications associées dont des complications respiratoires. Il n’existe actuellement aucun traitement curatif, c’est pourquoi il est nécessaire de développer de telles thérapies. Ce projet permettra de sélectionner des molécules candidates d’intérêts pour des études pré-cliniques et cliniques.

Procédures

- Prélèvement de sang sur animal vigile (maximum 1 fois par semaine pour les prélèvements compris entre 20 et 130µL (pour une souris de 25g) jusqu’à 7 fois par semaine maximum pour des micro-prélèvements

Impact sur les animaux

Seuls des animaux WT seront utilisés dans ce projet, sans phénotype dommageable. Cependant, du fait du peu d’information disponible à cette étape du développement sur la tolérance des molécules testées sur des modèles in vivo, des effets indésirables pourraient être observés. Une attention accrue sur les animaux en cours de traitement sera apportée tout au long de l’étude : comportement, sites d’injection, sites de prélèvement, poids corporel, signes cliniques…

Devenir

Tous les animaux utilisés dans l’étude sont mis à mort afin de réaliser des analyses ex vivo. Les animaux surnuméraires pourront être utilisés dans un projet de formation aux gestes techniques.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer le profil d’élimination, la tolérance et l’efficacité d’une molécule à visée thérapeutique en développement pour une utilisation chez l’Homme. Pour cela un organisme entier est nécessaire. Il n’existe aucune méthode in vitro validée scientifiquement qui offrirait une alternative à l’expérimentation animale pour répondre aux questions adressées dans ce projet.

Réduction

Les molécules évaluées dans ce projet auront été auparavant testées in vitro afin de n’administrer que les molécules présentant un potentiel thérapeutiques élevé sur les animaux et ainsi réduire leur nombre. Des groupes de maximum 8 animaux sont réalisés, puisqu’il a été observé lors d’études préliminaires (réalisées dans une autre CRO) que ce nombre permettait d’avoir des résultats statistiques significatifs.

Raffinement

Dans un but de raffinement des expériences, nous réalisons une évaluation précise de l’état de santé des animaux au cours des procédures expérimentales grâce à des grilles de suivis et l’établissement de points limites précoces. Les conditions d’hébergement et de soins et les méthodes utilisées ont été choisies et conçues de manière à réduire au maximum toute douleur, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Le suivi des animaux sera effectué quotidiennement sans exception (week end & jours fériés inclus) par du personnel compétent et qualifié. Le bien-être des animaux sera évalué par l’observation des signes cliniques, la pesée des animaux après la période d’acclimatation et lors des injections.

Choix des espèces

La finalité de ce projet est d’évaluer l’efficacité d’une thérapie sur un modèle animal récapitulant la pathologie. Ce modèle est en cours de « réalisation » et s’agira de souris transgéniques, c’est pourquoi cette espèce WT est utilisé dans ce projet visant à évaluer dans un premier temps la tolérance de molécules sélectionnées au préalable. Les animaux seront utilisés à partir de 8 à 10 semaines d’âge minimum et jusqu’à 14 à 16 semaines. En effet le pic de densité osseuse chez les souris C57Bl6/J (maturité du squelette) est atteint à l’âge de 4 mois. Nous choisissons d’évaluer l’efficacité des molécules sur la densité osseuse sur des animaux entre 8/10 et 14/16 semaines (durée du traitement) afin d’inclure la période de puberté. Lors d’une étude pilote (réalisée dans une autre CRO), il n’y a pas eu d’effet observé de cette classe de molécule sur des souris jeunes (2 semaines) contrairement à l’utilisation de souris de 8 semaines.

30 souris et 30 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis proposés à l'adoption. Ils servent à entraîner le personnel d'animalerie aux injections, aux prélèvements sanguins et à la pose de cathéter, chaque animal étant réutilisé jusqu'à six fois sur trois mois. Le porteur indique que ces manipulations répétées peuvent provoquer un stress, et que les gestes sont réalisés sous anesthésie à l'isoflurane. L'objet déclaré du projet n'est pas de produire des connaissances mais de maintenir les compétences techniques des soigneurs.

Objectifs

Au cours des différentes procédures, le personnel qualifié de l’animalerie pourra maitriser et s’entrainer régulièrement aux injections, prélèvements de sang et pose de cathéter sur animaux vigiles et/ou anesthésiés couramment pratiquées au sein de l’établissement utilisateur. Cela inclu la préparation de l’animal, l’analgésie, l’anesthésie, l’asepsie, la maîtrise et le contrôle des paramètres physiologique pendant toute la durée de l’intervention et le réveil de l’animal.

Bénéfices attendus

Grâce a cet entrainement, le personnel qualifié de l’animalerie aura les compétences adéquates pour réaliser des administrations et prélèvements de sang principalement demandés par les utilisateurs de l’établissement utilisateur. Le temps d’anesthésie générale sera raccourci avec l’entrainement ce qui limitera le stress chez l’animal.

Procédures

Liste des interventions effectuées sur tous les animaux (rats et souris) à une fréquence de 1 fois toute les 2 semaines sur 3 mois maximum : - Anesthésie par injection intrapéritonéale (IP) d’un cocktail anesthésique et analgésique de Ketamine et de Xylazine (64.5/5.4 mg/kg ; 0.15-0.2 ml/100 g de poids vif). - Injection en intra-musculaire et en sous-cutanée de sérum physiologique - Prélèvements de sang dans la veine mandibulaire, la veine sublinguale et la veine caudale (pose de cathéter).

Impact sur les animaux

Les animaux d’entrainement seront utilisés à plusieurs reprises (maximum 6 fois sur une durée de 3 mois) afin de limiter le nombre d’animaux, donc un stress chez l’animal peut être observé.

Devenir

Proposé à l’adoption

Remplacement

Le personnel concerné s’entraine dans un premier temps sur des animaux euthanasiés. Lorsque la technique est acquise sur animal euthanasié, il est nécessaire de travailler sur des animaux anesthésiés afin d’appréhender les éventuelles complications que l’animal vivant peut présenter au cours d’une anesthésie et d’une chirurgie (ex : arrêt respiratoire, hémorragie).

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour toute la durée du projet est le nombre minimum nécessaire permettant l’entrainement de 3 personnes : nous prévoyons au maximum 30 rats et 30 souris sur les 5 ans du projet : 60 animaux au maximum sur la totalité du projet.

Raffinement

Les injections via les différentes voies décrites dans ce projet (IP, SC etIM) seront réalisées sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane à 4%, administrée dans une boite en plexiglas prévue à cet effet. Après l’induction de l’anésthésie, le personnel s’entrainera aux injections dans les minutes qui suivent afin de limiter le stress de l’anesthésie (si l’animal se réveil, il sera replacé dans la boite en plexiglas). Les prélèvements de sang et pose de cathéter seront réalisés sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane à 4%, administrée dans une boite en plexiglas prévue à cet effet. Pour la pose de cathéter en veine caudale, l’anesthésie sera maintenue sous masque à isoflurane à 2-3%. Pour le prélèvement de sang via la veine mandibulaire et la veine sublinguale, l’anesthésie sera maintenue par injection intrapéritonéal (IP) d’un cocktail anesthésique et analgésique de Ketamine et de Xylazine. Les différentes voies d’injections et les différentes voies de prélèvement ne seront pas toutes effectuées sur le même animal. Entrainement à une seule voie de prélèvement de sang par animal. L’animal sera réutilisé que 2 semaines après avoir été manipulé et au maximum 6 fois sur une durée de 3 mois si son état général le permet afin de laisser le temps à l’animal de récupérer et d’éviter un stress trop récurrent. Tout au long de l’expérimentation, les rats/souris seront observés et les paramètres physiologiques contrôlés (température, respiration). Des points limites sont définis dans la partie procédure expérimentale afin de préserver le bien-être des animaux Une phase d’acclimatation de 5 jours minimum est appliquée après réception et les rats/souris sont hébergés en groupes sociaux harmonieux, dans un environnement enrichi afin de limiter les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement : tunnels en carton, sizzle pads et bûchettes de peuplier. La taille des aiguilles et des cathéters est adaptée à la taille de l’animal afin d’éviter toute douleur inutile.

Choix des espèces

Le rat a été choisi car cette espèce est la plus couramment utilisée dans les différentes procédures pratiquées au sein de l’établissement utilisateur. Adulte : 8-12 semaines, 160-300 g, ce qui permettra de travailler sur des poumons entièrement développé et fonctionnel pour la procédure 1 et sur un système cérébral stable, mature pour la procédure 2.