Procédures modérées

48 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur mammaire humaine leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent sur huit semaines quinze gavages et quinze injections de docétaxel, avec des prélèvements de sang à la face sous contention renforcée. Le porteur décrit le gavage comme "inconfortable et relativement stressant" et prévoit une mise à mort si les nuisances deviennent trop importantes. Il teste un dérivé du cholestérol d'origine algale, dont l'effet antitumoral reste selon lui "peu documenté".

Objectifs

Ce projet fait suite à des travaux préliminaires obtenus avec le 4-Cholestène-3-one, un métabolite du cholestérol produit par le microbiote intestinal et par une algue (Laurencia Papillosa). Notre équipe a montré́ que ce dérivé stéroïde provoquait une diminution de la prolifération des cellules cancéreuses du sein, associée à des effets prometteurs sur le métabolisme lipidique des cellules tumorales. Par ailleurs, le 4-Cholestène-3-one induit l'augmentation du transport cellulaire du cholestérol des cellules tumorales. Les objectifs de cette étude sont d’évaluer le potentiel anti-tumoral in vivo d’un apport nutritionnel de 4-Cholestène-3-one, associé ou non à un traitement par le docetaxel, dans un modèle de souris nude xénogreffées avec des cellules tumorales mammaires humaines. Pour cette expérimentation, nous utiliserons un total de 48 souris (souris nude = immunodéprimées, adultes femelles de 8 à 10 semaines) correspondant au total à 4 groupes de 12 souris par lot de condition expérimentale. En parallèle, nous envisageons des études biochimiques d’analyse du métabolisme lipidique (sur les tumeurs xénogreffées). Les résultats de ce projet devraient permettre de valider in vivo les effets du 4-Cholestène-3-one observés récemment in vitro et de confirmer l'intérêt potentiel de ce stérol dans le traitement pharmaco-nutritionnelle du cancer du sein.

Bénéfices attendus

Suite aux résultats de ces expérimentations le rôle potentiel du 4-cholestène-3-one, dont l'effet est actuellement peu documenté permettra d'envisager une approche pharmacologique et/ou nutritionnelle de prévention des cancers du sein. De plus, notre projet devrait aussi nous permettre de valider d'éventuels nouveaux biomarqueurs reliant la consommation du 4-cholestène-3-one au devenir des tumeurs. Enfin, en plus de son existence dans les algues, il est maintenant connu que le 4-cholèstene 3-one est un métabolite du microbiote intestinal (Chen et al., 2017), ce qui laisse entrevoir des stratégies possibles d'utilisation de probiotiques afin d'augmenter sa production.

Procédures

Injection par voie sous cutanée de 100 µL d’une suspension cellulaire. L’injection sera réalisée sous anesthésie par inhalation d’un mélange air isoflurane v/v sous un débit d’air de 1 L/min (à 4% pour l’induction et 2% pour le maintien). Les cellules seront injectées au niveau du flanc. Prélèvements sanguins de 100µL au niveau de la veine faciale à l’aide d’un capillaire. Réalisation de trois prélèvements de sang au niveau de la veine faciale (100µL/souris de 25g) pour réaliser une NFS (numération de la formulation sanguine) et la récupération du sérum pour congélation avant l’analyse biochimique. Traitement des animaux pendant 8 semaines : 2 fois par semaine : Gavage avec huile d'olive enrichie avec 0,03% de 4-C-3-One volume de gavage ≤ 250 µl pour une souris de 25g) Injection IP de Docetaxel (15mg/kg) (volume total injecté < 500µl pour une souris de 25g). En bilan, chaque animal recevra : - Une Injection par voie sous cutanée de 100 µL d’une suspension cellulaire. - Deux prélèvements sanguins - Quinze injections intrapéritonéales à raison de deux fois par semaine pendant 8 semaines - Quinze gavages à raison de deux fois par semaine pendant 8 semaines - Trois séances d'anesthésie genérale gazeuse d'une durée de cinq minutes chacune.

Impact sur les animaux

- L’injection par voie sous-cutanée d’une suspension de cellules MDA MB231 sera réalisée sous anesthésie générale. - Traitement des animaux pendant 8 semaines : 2 fois par semaine : Le gavage des souris sera réalisé par une personne formée et expérimentée (madame Chauvet, technicienne en expérimentation animale). L’émulsion d’huile d'olive enrichie avec 0,03% de 4-C-3-One sera administrée par voie orale via un gavage utilisant une sonde flexible dédiée aux souris. Un volume maximal de 0,25ml/souris de 25g sera respecté. Cette procédure bien qu’inconfortable et relativement stressante ne devrait pas engendrer de douleur chez les animaux. Les administrations répétées de Docétaxel (15mg/kg) par voie intrapéritonéales seront-elles aussi réalisées par un personnel compétent et expérimenté. Le volume maximal injecté sera inférieur à 0,3ml pas souris. La cicatrisation au point d’injection entre deux injections successives sera possible vu la cinétique d'administration. - Les 3 prélèvements sanguins seront réalisés au niveau de la veine faciale à l’aide d’un capillaire dédié. Cette technique sera réalisée sur animal vigile avec une contention renforcée (ne nécessitant pas l'anesthésie gazeuse ni l'ajout d'un anesthésique local). La quantité de sang prélevée peut être gérée par le relâchement de la contention. Une goutte de sang correspond entre 60 et 100µL et ce qui respecte les 20% de la volémie d'une souris de 25g. Cette procédure réalisée très rapidement ne devrait pas engendrer de douleur chez les animaux. - Mesure de la taille des tumeurs à l'aide d'un pied à coulisse électronique sous une courte anesthésie par inhalation d’un mélange air isoflurane v/v sous un débit d’air de 1 L/min (à 4% pour l’induction et 2% pour le maintien). Cela ne devrait donc pas générer de douleur /nuisance chez les souris. - Les nuisances attendues chez l'animal seront donc éventuellement les effets secondaires liés au traitement antitumoral testé. Une observation attentive quotidienne du comportement général des animaux, de leur mobilité ainsi que de leur réactivité permettra de détecter les animaux en souffrance du fait des injections réalisées ou du développement des masses tumorales au niveau du flanc. Un ensemble de paramètres sera mesuré pour obtenir une estimation relativement précise de l’impact de la douleur. Une mise à mort de l'animal sera réalisée si les nuisances s'avèrent trop importantes.

Devenir

A la fin de la procédure les animaux seront mis à mort car des expériences d'analyses biologiques, biochimiques et de toxicologiques seront ensuite réalisées sur les tumeurs prélevées.

Remplacement

La mise en évidence du "potentiel" antitumoral du 4-cholestène-3-one a été évalué in vitro sur lignées tumorales cellulaires issues de tumeurs mammaires (MCF-7, MDA-MB231). Pour confirmer les effets observés in vitro, un passage in vivo s'avère nécessaire afin de pouvoir étudier l'effet antitumoral du 4-cholestène-3-one. Le cancer étant une pathologie complexe, il n’existe pas à l’heure actuelle, de méthodes alternatives permettant d’éviter ou remplacer l’utilisation des animaux pour l’approche thérapeutique abordée dans ce projet.

Réduction

Pour nos expériences, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et avoir le nombre nécessaire d’animaux contrôles tout en limitant le nombre total d’animaux utilisés. Les tests de Mann Whitney/Student et Kruskal Wallis/ANOVA seront utilisés pour la comparaison statistique entre lots. Pour calculer le nombre total d’animaux et le nombre d’animaux par lot, nous avons utilisé le logiciel Gpower et la méthode basée sur l’analyse de la puissance. Nous avons considéré les paramètres suivants : Alpha : 0.05 ; Puissance : 80 ; effet de la taille de l'échantillon : 0.5 (moyen) Le nombre minimal d’animaux nécessaire est de 48 souris souris, 12 souris par lot. Ce nombre d’animaux est un nombre minimal pour la validation statistique des résultats (Kruskal- Wallis One-Way ANOVA) et il tient compte d’un taux de prise de greffe > à 90%. Par ailleurs, ce nombre de souris par lot permet d’obtenir suffisamment de matériel biologique pour les analyses biochimique et histologique ultérieures, nécessaires à la caractérisation de l’activité anti-tumorale de la molécule testée.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Elles seront réparties à raison de 4 à 5 souris par cage avec un enrichissement physique (copeaux de litière, frisottis) permettant aux souris de satisfaire leurs besoins comportementaux (exploration de leur environnement, confection de nid…). Si des cas de bagarre apparaissent on veillera à augmenter l'enrichissement avec des abris, tunnels supplémentaires dans la cage. Les litières seront changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. L'expérience a été́ conçue pour éviter toute souffrance inutile aux animaux. Cependant tout animal montrant des signes de gravité sera euthanasié conformément aux critères indiqués dans les procédures : Les animaux seront mis à mort par élongation cervicale après anesthésie par inhalation d’un mélange air isoflurane v/v dans une cage à induction (à 4% sous un débit d’air de 1 L/min).

Choix des espèces

Pour ce projet, nous utiliserons des souris balbc nudes femelles. Les cellules MCF-7 et MDA MB 231 étant des lignées tumorales humaines, il est nécessaire d’utiliser de souris immunodéficientes afin de permettre la prise de greffe. Il s'agit donc de l'espèce classique pour cette première étape de l'évaluation pharmacologique antitumorale in vivo d'une molécule. Des adultes de 8 à 10 semaines seront utilisés, car la prise tumorale est relativement homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse anti-tumorale, et donc un stade tumoral différent.

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intra-péritonéales répétées, jusqu'à seize semaines pour certaines, et un régime provoquant une accumulation de graisses dans le foie, pour tester un inhibiteur de l'autophagie contre la toxicité hépatique. Le porteur indique que l'induction de la toxicité peut provoquer douleurs abdominales, fatigue et diarrhée. Il juge "indispensable" le recours à l'animal vivant, la complexité de la toxicité hépatique étant selon lui impossible à reproduire in vitro.

Objectifs

L’autophagie (AP) est un processus physiologique qui régule l’homéostasie cellulaire. L’AP est aussi un mécanisme d’adaptation cellulaire en condition de stress et son absence est souvent observée dans des maladies neurodégéneratives et cancers. On connaît les effets bénéfiques de l'augmentation du flux autophagique dans différentes pathologies, notamment les maladies du foie. L’objectif de ce projet est de déterminer l’implication de ce processus dans la prévention et le traitement de la toxicité hépatique chez des modèles murins appropriés.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour palier à la toxicité hépatique, qui entraîne un déclin progressif de la fonction hépatique, la fibrose, la cirrhose et souvent un carcinome hépatocellulaire.

Procédures

Tous les animaux du projet seront soumis à des injections intra-péritonéales (i.p). Les injections i.p. ne provoquent pas de symptômes majeurs et seront effectués sur l’animal vigile par du personnel formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Selon les différentes procédures du projet : (i) les animaux seront euthanasiés 6h et/ou 24h après le traitement (3/4 injections totales); (ii) les injections hebdomadaires dureront 16 semaines ; (iii) les animaux seront soumis à un régime alimentaire (de 4 semaines) permettant l'accumulation de triglycérides et cholestérol, mais qui n'est pas un régime alimentaire obésogène. Les traitements i.p. seront journaliers jusqu’à 6 semaines. La durée de chaque injection sous-cutanée et intra-péritonéale est de quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les procédures de ce projet prévoient seulement des injections intra-péritonéales. Les injections intra-péritonéales ne provoquent pas de symptômes majeurs et seront effectués sur l’animal vigile. Des douleurs abdominales, une fatigue, une diarrhée peuvent survenir lors des procédures d’induction de la toxicité hépatique.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, les conséquences et les effets sur l’organisme de la toxicité hépatique vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 1440 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs tests statistiques seront utilisés pour les analyses pour comparer les divers groupes de traitements.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, analgésie des animaux, utilisation de tapis et lampes chauffantes, ...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du crâne d'environ une heure pour poser une fenêtre ou un implant d'imagerie, puis des séances d'imagerie cérébrale sous contention, non pour produire des connaissances mais pour former des chercheurs à ces techniques. Le porteur signale des douleurs postopératoires et le stress lié au maintien sous le microscope. Il avance que cette formation réduira le nombre d'animaux utilisés plus tard par les stagiaires dans leurs laboratoires.

Objectifs

Nous proposons de former de nouveaux chercheurs sur les méthodes modernes de mesure d’activités neuronales impliquées dans la codification des informations sensorielles. L’imagerie biphotonique ainsi que l’imagerie calcique sont deux techniques qui permettent d’observer et mesurer l’activité de neurones en temps réel. Grâce à ces techniques nous pouvons étudier le rôle que jouent différentes populations de neurones dans l’apprentissage et l'exécution d’une tâche comportementale. Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche.

Procédures

- Le groupe A suivra: une chirurgie stéréotaxique (1 heure) pour implanter une fenêtre crânienne qui permet de mettre en place un couvercle transparent au-dessus d’une région corticale d’intérêt. Grâce à cette fenêtre certains types de neurones du cerveau sont visibles en microcopie. Deux semaines plus tard, les animaux seront habitués à rester sur le microscope bi photonique ensuite l’activité neuronale sera imagée chez les animaux éveillés. Les séances d’imagerie auront une durée de 30 minutes et elles seront faites 1 fois par jour pendant 5 jours. A la fin de la dernière séance, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses post mortem. - Le groupe B suivra: Une chirurgie stéréotaxique (1 heure) qui permet de rapporter dans certains types de neurones une molécule fluorescente visible en microcopie et d’installer un implant. Deux semaines plus tard, les souris seront connectées au niveau de la fibre optique vers un système d’enregistrement de l’activité neuronale et leur comportement spontané sera évalué. Chaque séance aura une durée de 20 minutes et chaque souris suivra 3 séances. Pendant une des séances, les souris recevront une injection intrapéritonéal (1minute) contenant, soit une molécule qui permet d’activer les neurones dopaminergiques soit de la saline. A la fin de la dernière séance - Le groupe C suivra : Une chirurgie stéréotaxique (1 heure) qui permet d’implanter un système d’imagerie. Deux semaines plus tard, les séances d’imagerie seront réalisées pendant la procédure comportementale. Chaque séance aura une durée de 20 minutes et chaque souris suivra 3 séances ( une séance par jour). A la fin de la dernière séance , les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses post mortem.

Impact sur les animaux

- Nuisances liées aux procédures chirurgicales : douleur post opératoires, risque mineur d’infection de la cicatrice, risque mineur de détérioration des implants crâniens - Nuisances liées à la connexion des animaux aux niveau du système de fixation, fibre optique ou appareillage d’imagerie calcique : stress de la contrainte du maintien sous l’objectif du microscope auquel l’animal doit s’habituer - Douleur légère liée aux différents injections intrapéritonéales

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses immuno-histologiques.

Remplacement

Pour comprendre l'activité des circuits neuronaux dans le cerveau, il est nécessaire de générer des données biologiques pertinentes. L'utilisation d'animaux est donc inévitable. Les souris sont les modèles animaux de prédilection pour les recherches dans ce domaine en raison de la structure anatomique et de la fonction bien définies de différents cortex corticaux. La souris est aussi l’espèce de rongeurs qui permet d’obtenir aisément des animaux modifiés génétiquement.

Réduction

L’expertise de nos instructeurs sur ces modèles garantit que le nombre d'animaux utilisés est minimisé par une pratique toujours de haute qualité dès le départ. De même il est extrêmement important pour nos objectifs éducatifs de pouvoir démontrer et mettre en pratique les actes de préparation chirurgicaux, le nombre d'animaux sera donc adapté en conséquence. Ce projet a aussi pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche. Par an, 20 étudiants et 10 instructeurs suivront les projets décrits dans cette DAP. Dans ce context, lors de la formation, les instructeurs réalisent une démonstration de la procédure puis les étudiants auront l’occasion de pratiquer la procédure sous-couvert des instructeurs. Nous utiliserons un animal (C57BL6) par étudiant et par instructeur soit 30 souris/an. Avant le début de la formation, toutes les souris transgéniques suivront les chirurgies stéréotaxiques. Les séances de comportement, d’imagerie et d’électrophysiologie seront réalisées pendant la formation. - Souris DAT-Cre: Le taux de réussite de la chirurgie ( expression correcte du virus et fibre optique fonctionnelle ) est de 60%. Pour pouvoir évaluer l'effet de l’agoniste dopaminergique nous avons besoin d'au minimum 3 souris par groupe. Nous avons besoin donc de 10 souris DAT-Cre par formation/an. - Souris C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6f)GP5.17Dkim: a. Imagerie 2-photon sur animal éveillé: Le taux de réussite de la chirurgie ( fenêtre crânienne de bonne qualité pour la microscopie) est de 25%. Une souris sur 5 ne s’habitue pas au système de fixation. Pour pouvoir analyser les images provenant d'au minimum 4 souris, nous devons utiliser 20 souris par formation/an. b. imagerie calcique avec des miniscopes : Le taux de réussite de la chirurgie est de 25-30%. Une souris sur 5 ne s’habitue nt pas à la connexion au niveau de la miniature au crâne. Pour pouvoir analyser les images provenant d'au minimum 4 souris, nous devons utiliser 20 souris par formation/an.

Raffinement

Nos mesures mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales impliquent une induction et suivi de l'anesthésie, une mise en place d'analgésie, une installation tout au long des procédures chirugicales de contrôle de la température par tapis chauffant. Les souris seront placées en cage de 4-5 souris sur un rack ventilé, placé dans une salle d'hébergement. Un enrichissement de leur milieu (carrés de cellulose, maisons en papier mâché que les animaux peuvent utiliser pour se cacher et/ou ronger) permettra de favoriser les comportements d'exploration et d'empêcher le stress. Les animaux opérés seront observés quotidiennement par l’expérimentateur pendant la période qui suit le réveil (2h) ainsi que pendant les 4 jours suivant. L'évaluation des points limites se fera selon une grille d'évaluation incluant le poids de l'animal, l'état de la plaie, l'état du pelage, la mobilité de l'animal et les signes de douleur. Si l'animal présente un score qui le justifie, une seconde injection d'un médicament anti-inflammatoire sera effectuée et reconduite toutes les 24h si les signes persistent lors des observations suivantes. Si l’animal n’a pas repris de poids au bout de 4 jours, ou si des signes de souffrance sont observés, le traitement sera étendu de 2 jours supplémentaires. Si la récupération ne s’effectue pas bien et si le score des critères de la grille d’évaluation dépasse un certain stade de gravité l’animal sera euthanasié par l'expérimentateur par dislocation cervicale. Dans des cas très rares, les implants (fibre optique, appareillage d'imagerie calcique, un système de fixation) peuvent se détacher du crâne. Dans cette situation, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle cellulaire et aussi au niveau des circuits neuronaux. Nous utilisons le modelé souris qui est l'espèce de rongeur permettant d'obtenir aisément des animaux modifies génétiquement. Le projet sera réalisé sur des animaux agés de plus de 6 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte pour ces espèces. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une bonne reproductibilité des procédures chirurgicaux.

176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont jointes chirurgicalement deux par deux par parabiose, opération d'environ 45 minutes créant une circulation sanguine commune, puis reçoivent des injections et des prélèvements de sang au sinus rétro-orbital sous anesthésie. Le porteur décrit un protocole "parfaitement maîtrisé" et une "absence de signes quantifiables de souffrance". Il étudie la circulation de cellules immunitaires liées à l'asthme et renvoie les applications thérapeutiques au long terme.

Objectifs

Le système immunitaire permet de se défendre contre les agressions des pathogènes, mais sa dérégulation est aussi impliquée dans le développement diverses maladies telles que l’asthme. Le système immunitaire est partagé en deux grandes parties : la partie innée, préexistante, et reconnaissant des caractéristiques partagées entre différents pathogènes, et la partie adaptative, qui comme son nom l’indique s’adapte en fonction du pathogène rencontré, par des jeux de sélection et de prolifération de cellules extrêmement spécifiques du pathogène en question. Les cellules innées de groupe 2 (ILC2s) sont des lymphocytes innés résidents des tissus (poumons/intestin). Elles participent à la défense contre les parasitique, à la réparation tissulaire mais aussi aux processus physiopathologiques comme l’asthme. Les ILC2 se développent dans la moelle osseuse puis se maintiennent à long terme dans les tissus, avec la capacité de proliférer et répondre in situ en cas d’inflammation. Des résultats récents indiquent cependant qu’il existe des sous-populations ILC2s circulantes stimulées par l’inflammation et impliquées dans le maintien de l’intégrité d’un tissu, selon un axe intestin-poumon et/ou axe moelle osseuse-poumon. La fonction de ces ILC2s est encore peu connue (inflammation/régénération). Seules des expériences de parabioses peuvent permettre dans un même tissu de différencier les cellules ILC2s circulantes du sous-groupe des cellules résidentes. Les objectifs du projet sont donc 1- de déterminer les situations inflammatoires qui aboutissent à une circulation d’ILC2 2- comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans cette circulation 3- déterminer le stade de développement auquel les ILC2s circulent (progéniteur ou cellule mature) 4- déterminer l’importance physiologique de ce recrutement sur la situation inflammatoire et la régénération tissulaire. Cliniquement, il est important de comprendre ces processus car dans les cas d’allergies et asthme, la présence d’ILC2 en circulation corrèle avec une évolution défavorable ; déterminer leur rôle et mode de migration nous permettra d’envisager de bloquer leur migration chez les patients à risque.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet scientifique permettra de comprendre ce qui régit la circulation des ILC2 en détaillant les mécanismes moléculaires mis en jeu par cette population pour se propager dans les tissus en inflammation. Le mode de circulation de populations cellulaires initialement considérées comme résidentes est encore peu compris mais des données préliminaires indiquent que leur rôle serait crucial pour obtenir une réponse adaptée du tissu. A long terme, ces données moléculaires de la circulation de sous-populations d’ILC2s pourrait représenter une source importante de moyen d’actions supplémentaires pour lutter contre les crises d’asthme ou d’allergies non résolues par les corticoïdes. Ces cas sont nombreux et en constante augmentation au vu du nombre croissant d’allergies dans le monde. Il est clairement établi que ces ILC2 seraient « trop » inflammatoires dans le cas d’inflammation chronique de type 2 et donc qu’un moyen d’empêcher la mise en place d’un recrutement constant de cellules supplémentaires dans les voies aériennes des patients pourraient représenter une chance thérapeutique de deuxième intention.

Procédures

• Chirurgie de parabiose : 1 chirurgie par animal, environ 45 minutes d’anesthésie générale • Prélèvements de sang au sinus rétroorbital sous anesthésie, 1 fois 5 minutes. Si le chimérisme n’est pas effectif, les animaux pourront être prélévés de la même manière à 4 semaines et à 6 semaines • Des injections de molécules non toxiques seront réalisées dans l'abdomen des animaux anesthésiés à raison de 3 à 7 fois sur une semaine. Des administrations de molécules non toxiques seront réalisées en intranasale sur des animaux anesthésiés à raison de 2 à 3 fois. Pour ces interventions les anesthésies sont de l’ordre de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Le protocole de parabiose est parfaitement maîtrisé dans notre laboratoire tant au niveau réalisation qu'au niveau de la gestion de l'analgésie pré et postopératoire avec une absence de signes quantifiables de souffrance animale, sans réduction de la mobilité. Injections de cytokines et d’anticorps antagonistes. Toutes les injections sont réalisées par voie intrapéritonéale ou intranasale après anesthésie des animaux en utilisant l’isoflurane, le dépôt dans la première narine est réalisé en sortant la souris une minute de la chambre à induction suivi d’un retour et du dépôt dans la seconde narine de façon identique. Ces injections n’induisent pas de douleur perceptible chez les animaux traités (pas de perte de poids, pas de changement de comportement alimentaire, pas de perturbation du comportement social ou nerveux (mobilité, interactions, agressivité ou prostration).

Devenir

les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Aucune data préliminaire in vitro ne peut être réalisée pour motiver cette étude de circulation. La présence d’une fréquence de cellules ILC2s non négligeable dans le sang de patients asthmatiques contrairement aux contrôles sains est une motivation importante pour décider de comprendre ce qui génère des cellules circulantes à partir de populations résidentes et le mécanisme de circulation mis en place. La circulation des populations immunes à travers les différents organes est très contrôlée. Les cellules passent par une circulation sanguine et lymphatique qui sont des environnements complexes et impossible à mimer sur des tests in vitro. Afin de pouvoir conclure sur des fonctions différentielles de nos cellules circulantes versus celles résidentes et de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu, les expériences in vivo sont absolument essentielles et aucun système in vitro n’existe pour obtenir des résultats préalables.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires, l'étude des mécanismes moléculaires (anticorps bloquants) ne sera réalisée que si le taux circulation des ILC2s est significativement différent entre les conditions testées. De plus, les données de la littérature et celles déjà générées au laboratoire nous permettent de limiter le nombre d’hypothèses à tester. Enfin, le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Seulement dans les conditions adéquates où l'augmentation du taux circulant des ILC2s est validé, une étude du blocage des molécules de circulation se fera par l’injection des anticorps bloquants. Nous vérifierons ainsi en étudiant le tissu cible si les populations ILC2s bloquées avaient plutôt un effet inflammatoire ou réparateur. Appliquer les bloquants uniquement dans le cas d’une circulation statistiquement signifiante permet de réduire les effectifs requis et visera à réduire le nombre de souris nécessaires pour maintenir une interprétation biologique robuste.

Raffinement

Les animaux seront manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences afin de les habituer et de limiter leurs stress. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement lors de la première semaine post-chirurgie, puis deux à trois fois par semaine afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Une grille de score a été établie afin d’évaluer régulièrement la souffrance des souris, et des points limites ont été définis. Une fiche d’observation tout au long des procédures permettra de vérifier leur état (pelage, poids, respiration, mobilité…) et des scores seront tenus afin de vérifier que le traitement n’induit pas de modifications des habitudes et du bien-être animal. En cas de changement des scores, des points limites sont établis (perte de poids rapide, modification aspect pelage/alopécie, déshydratation, changement de consistance/couleur des selles) et le suivi rapproché des animaux permettra de définir s’il est nécessaire de - diminuer la dose et/ou d’administrer des antalgiques selon la gravité des changements de comportement. Ces conditions s’appliquent à toutes les procédures.

Choix des espèces

Une circulation d’ILC2s chez l’homme est corrélée à la sévérité des allergies/crises d’asthme. La souris est un modèle de choix par la forte similitude des systèmes immunitaires humains/murins. Elles sont les plus facilement manipulables (chirurgie ici et génétiquement modifiées) pour comprendre la circulation (système sanguin/lymphatique et production des cellules immunes). Nous avons besoin de travailler avec différents types de souris depuis longtemps utilisées dans les laboratoires et qui ne présentent pas de signe de souffrance. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6 à 10 semaines après la naissance, afin d’avoir un système immunitaire mature). Nous n’attendons pas d’effet lié à l’âge des souris. Cependant, des animaux plus âgés ont aussi une peau plus épaisse. Nous éviterons donc de les utiliser.

Deux défauts osseux sont creusés sous anesthésie dans la voûte crânienne de chaque rat pour y tester des implants en titane destinés à reconstruire le crâne. 20 rats de plus de 22 semaines vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et passent six scanners sous anesthésie en douze semaines. Le porteur présente le rat comme l'espèce animale la moins évoluée parmi celles assez grandes pour la chirurgie, puis comme "très proche de la physiopathologie humaine". Il affirme aussi, avant toute expérience, que ces implants permettent une reconstruction complète "sans complications". Tous les rats sont tués à la fin pour l'analyse histologique de l'os reconstruit.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'étudier le potentiel de nouveaux implants en titane pour aider à la reconstruction osseuse du crâne.

Bénéfices attendus

Les implants en titane permettent une reconstruction osseuse complète du defect, sans complications. Ils limiteront également les complications de reconstruction liées aux infections post-opératoires.

Procédures

Les animaux subiront une création de défauts osseux au niveau de la voûte crânienne (sous anesthésie chimique). La durée de l'intervention est estimée à 20-25 minutes. Il y aura deux defauts osseux par rat. La reconstruction osseuse sera suivie, par imagerie tomodensitométrique, pour tous ces animaux à 2, 4, 6, 8, 10 et 12 semaines après l'opération (sous anesthésie volatile). La durée de l'imagerie est estimée à 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables qui pourraient être observés sont : douleurs post-opératoires, infections locales de la zone opérée, ulcération de la plaie. L'intégrité de la dure-mère sera particlulièrement surveillée lors de l'intervention. A la moindre atteinte, l'animal sera écarté de l'étude. Si des effets non attendus surviennent, ils seront évalués et pris en charge par l'expérimentateur.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en vue d'effectuer des analyses histologiques de l'os reconstruit et de la zone environnante.

Remplacement

Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de structuration à tester et d'évaluer le risque potentiel d'inflammation post-implantation. Les informations de biocompatibilité et d'efficacité de reformation osseuse sont obtenues uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques.

Réduction

Afin de limiter le nombre de lots expérimentaux, deux implants seront testés sur un même animal. L'expérimentation se déroulera en 2 séries d'animaux successives. La première série comprendra 3 animaux de chaques paire de configuration (i.e. Two-tier+vide; Two-tier+poli; HTE+vide; HTE+poli). Le nombre d’animaux total pourra être réduit si l’effet attendu est suffisamment important, pour obtenir des résultats statistiquement exploitables, après la première série. Les groupes expérimentaux sont constitués de n = 10 individus afin de disposer d’une puissance statistique suffisante pour l’évaluation des différentes structurations. Si la normalité est respectée (test de Shapiro), le test statistique utilisé sera soit un Test T soit une ANOVA. Si l’ANOVA est significative (p < 0,05), elle sera suivie d’un post hoc de Tukey. Si la normalité n’est pas respectée, un test de Mann-Whitney ou un test de Kruskal Wallis sera effectué.

Raffinement

Le rat est une espèce animale très proche de la physiopathologie humaine et de taille suffisante pour permettre des études de chirurgie. Les différentes étapes de chirurgie seront réalisées sous anesthésie chimique profonde. La douleur post-opératoire sera gérée par l’administration de substances antalgiques de façon systématique pendant les 48h suivant la chirurgie, puis de façon optionnelle en cas de signes de douleurs observés. Les animaux seront anesthésiés par anesthésie volatile pendant les sessions d'imagerie tomodensitométrique. Les points limites seront particulièrement surveillés dans les 48 à 72h qui suivront les expérimentations. Parmi ceux-ci le poids et le comportement seront les premiers contrôlés. Ceci permettra d’intervenir immédiatement en cas de souffrance (administration de substances antalgiques), et/ou d’appliquer les critères d’arrêt prédéfinis de l’étude le cas échéant. Tous les résultats obtenus lors de ces études seront exploités.

Choix des espèces

Le rat est l’espece animale la moins evoluee et de taille suffisante pour permettre des études de chirurgie. En effet, la physiologie de la reconstruction osseuse et des réactions inflammatoires chez le rat sont proches de celles de l’humain. Ce modele permet ainsi la realisation d’etudes precliniques de chirurgie reconstructrice avec evaluation radiologique et histologique. Rats matures, âgés de plus de 22 semaines pour exclure un effet potentiel de croissance.

Trois à quatre heures de chirurgie pour poser deux pontages entre carotide et veine jugulaire, puis aucun anti-inflammatoire après l'opération : les brebis de ce projet sont privées de ce traitement parce que l'étude porte sur leur réaction inflammatoire. 10 brebis adultes, âgées d'au moins 13 mois, vont être utilisées, toutes tuées à 4 ou 8 semaines, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, avec des échographies sous anesthésie générale toutes les deux semaines et, pour le groupe suivi huit semaines, une ponction du pontage à l'aiguille. Le projet compare un vaisseau tissé à partir de matrice produite par les cellules d'autres moutons à une prothèse synthétique du commerce, et le porteur dit avoir choisi le mouton parce que ses cellules sont les seules, selon ses travaux, à produire des feuillets proches de ceux des cellules humaines. Les procédures décrivent huit brebis implantées, pour un effectif déclaré de dix, sans expliquer l'écart.

Objectifs

Les substituts vasculaires entièrement biologiques d’origine humaine issus d’une approche basée sur la synthèse de matrice par les cellules in vitro dite de « Cell-Assembled extracellular Matrix-CAM » ont été implantés chez l'Homme avec succès. Pour pallier les limites des prothèses vasculaires synthétiques, l’approche CAM permet la production de feuillets entièrement biologiques grâce à des cellules extraites à partir de peau humaine adulte saine. Des greffons de vaisseaux sanguins obtenus par roulage de ces feuillets ont été implantés avec succès chez des patients montrant une remarquable biocompatibilité. Cependant, leur méthode d’assemblage est longue pour permettre la fusion des différentes couches du vaisseau. Pour réduire le temps de production, ces feuillets sont transformés en fils qui, une fois montés sur un métier à tisser, permettent l’obtention d’un substitut vasculaire par tissage. Une implantation dans un modèle de gros animal ayant une anatomie proche de celle de l’humain est indispensable pour évaluer le comportement mécanique des produits d’ingénierie tissulaire tissés issus de l’approche CAM. Ainsi, l’objectif de ce projet est d’étudier le comportement mécanique ainsi que le remodelage in vivo de nos substituts vasculaires biologiques tissés à partir de fils de CAM face à une hémodynamique propre à l’hémodialyse, un contexte clinique pertinent, et ce dans un contexte de greffe allogénique, c’est-à-dire dans un contexte où un tissu d’un individu d’une espèce est implanté chez un autre individu d’une même espèce. Cela permettra d’étudier les réactions immunitaires innées et adaptatives, et de mettre en évidence que notre substitut peut être implanté en tant qu’accès vasculaire artérioveineux et subir/s’adapter à une hémodynamique importante et subir un remodelage adapté. Cela permettra également de mettre en évidence la faible réponse immunitaire à court terme de l’hôte suite à l’implantation. Ces résultats permettront d’envisager la réalisation d’une étude à plus long terme (jusqu’à 1 an) pour évaluer la viabilité à long terme du greffon et ce à terme pour utiliser cette technique chez les patients.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples. Ce projet permettra de mettre en avant la possibilité d’utiliser des substituts vasculaires tissés à partir de CAM allogénique. En effet, ce projet permettra de mettre en avant la faible réponse immunitaire de l’hôte à notre substitut allogénique. Ces réponses supporteront l’idée que des vaisseaux allogéniques tissés dévitalisés peuvent être utilisés avec efficacité et peuvent pallier à la limite des substituts autologues. Également, les études du comportement mécanique et du remodelage du substitut apporteront des réponses essentielles qui permettront de modifier les paramètres de tissage des substituts afin d’adapter leurs propriétés mécaniques et structurelles de l'organisme. Les adaptations mises en place suite à ces résultats permettront ainsi d’obtenir un substitut dont les propriétés répondront au mieux à une situation clinique donnée.

Procédures

Toutes les interventions dans cette étude seront faites sur des animaux anesthésiés. Premièrement, les implantations d’un substitut vasculaire tissé ainsi que d’un contrôle avec une prothèse synthétique commercialisé et actuellement utilisée en clinique, seront effectués dans un modèle bilatéral sur chacune des huit brebis, après anesthésie et avec des protocoles pré, per et post opératoires adaptés. Cette procédure chirurgicale est prévue une fois par animale pour une durée estimée à 3 à 4 heures. Les animaux seront soumis à des contrôles échographiques post-implantation et à des temps de 2 et 4 semaines (pour le groupe de 4 semaines), et post-implantation et à des temps de 2, 4, 6 et 8 semaines (pour le groupe 8 semaines). Chaque échographie sera réalisée sur animal anesthésiée pour réduire le stress des animaux. Chaque échographie ne durera pas plus d’une heure et chaque animal sera anesthésié pour une durée maximale d’une heure. Pour le groupe de 8 semaines, une ponction de l’abord vasculaire sera effectuée avec une aiguille 16G afin de simuler un contexte d’hémodialyse. Cette ponction sera réalisée à 4 semaines, lors de l’échographie de contrôle, sur animal anesthésié. La ponction et l’échographie ne dureront pas plus d’une heure et chaque animal sera anesthésié pour une durée maximale d’une heure.

Impact sur les animaux

La phase déterminante pour le bien-être de l’animal repose sur un temps d’intervention court. En effet, chaque brebis sera sous anesthésie générale pour effectuer la chirurgie d’implantation du greffon. Plus le temps passé sous anesthésie est court, mieux c’est pour le bien-être de l’animal et la réduction des effets indésirables de l’anesthésie. Nous estimons la durée de la chirurgie de 3 à 4 heures. Une fois implanté, des effets indésirables liés au greffon pourraient apparaître. Si des problèmes d’hémorragie ou d’écoulement à travers le greffon apparaissent, le protocole d’anticoagulation pourra être revu et adapté. Un autre effet indésirable potentiel est le déchirement du greffon, suite à un mouvement brusque de la brebis ou un coup porté sur l’implant par un autre animal. Si un déchirement est observé et est attribué directement au greffon, le design de ce dernier pourra être adapté pour les brebis suivantes. Afin de gérer le stress des animaux et d’éviter un endommagement du greffon et/ou une blessure de l’animal, les contrôles échographiques se feront sous anesthésie générale. De plus, cela permettra d’analyser le greffon avec plus de précision que si la brebis est vigile et en mouvement. Ces contrôles et l’anesthésie générale dureront une heure maximum. Une des nuisances pour l’animal au sein de cette étude est également l’absence de traitement anti-inflammatoire en post-opératoire. En effet, ce projet repose sur l’étude de la réaction inflammatoire de l’hôte suite à l’implantation des substituts vasculaires. Ainsi, aucun traitement anti-inflammatoire ne sera administré suite à l’implantation Au cours de cette étude, un protocole précis de prémédication, d’analgésie et d’anesthésie sera mis en place et le bien-être des animaux sera suivi constamment par le personnel dédié.

Devenir

A l’issu des contrôles terminaux, tous les animaux seront mis à mort aux différents temps définis (4 et 8 semaines). En effet, nous étudierons la réponse immunitaire ainsi que le remodelage des allogreffes par les cellules ; cette étape nécessitant le prélèvement du substitut vasculaire préalablement implanté entre la carotide et la veine jugulaire, la mise à mort de celui-ci est inévitable.

Remplacement

Un modèle de vaisseau humain peut être largement étudié in vitro d’un point de vue mécanique grâce à des bancs d’essais. Cependant, ces plateformes de tests ne permettent pas d’étudier la réponse immunitaire ou l’intégration d’un greffon dans des conditions réelles d’utilisation. Il ne sera donc pas possible de remplacer l’utilisation d’animaux. Ainsi l’utilisation d’un modèle animal de grande taille possédant un système cardiovasculaire proche de l’homme (porcin, ovin, canin ou primate) est souhaitable pour ce projet. En effet, l’objectif du projet est d’évaluer la fonctionnalité, la réponse immunitaire et l’intégration du substitut vasculaire dans l’organisme vivant et entier et ce, dans un contexte clinique pertinent (pontage artérioveineux), afin d’envisager à terme une utilisation chez les patients.

Réduction

Ces expérimentations sont conçues pour avoir recours à un nombre minimal d’animaux permettant l’obtention de résultats exploitables sur le plan statistique. Huit brebis seront implantées avec le même nombre de conditions expérimentales. Un modèle bilatéral sera utilisé ; ainsi, chaque animal sera son propre contrôle, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux impliqués dans l’expérimentation.

Raffinement

Le raffinement sera pris en compte tout au long du projet. Le projet sera mis en place dans des locaux agréés avec du personnel dédié et expérimenté. De l’enrichissement sera mis en place pour répondre au besoin des animaux (pierre à sel, foin, hébergement en groupe sociaux, paille). Un protocole précis de prémédication, d’analgésie et d’anesthésie sera mis en place lors des différentes phases et le bien-être des animaux sera suivi constamment par le personnel dédié et formé à l’espèce étudiée. Si nécessaire, des actions adaptées seront appliquées et le vétérinaire désigné de l’établissement sera sollicité.

Choix des espèces

Ces expérimentations chez le gros animal sont nécessaires pour évaluer la faisabilité et la durabilité de greffons vasculaires de diamètres qui correspondent à ceux utilisés en clinique, notamment en pontage artérioveineux. Le modèle ovin a été choisi car il fait partie des modèles animaux couramment utilisés dans le domaine vasculaire (comme le modèle canin et le modèle porcin). En revanche, d’après nos études menées au laboratoire, ce modèle est le seul dont les cellules permettent la production de feuillets de CAM qui ressemblent à ceux produits avec des cellules humaines. Les animaux seront implantés à partir de 13 mois d’âge afin d’avoir des brebis adultes, à ce stade les brebis possèdent un système immunitaire et un système vasculaire mature.

364 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intra-abdominales cinq jours par semaine pendant trois semaines, une greffe de fragments tumoraux ou une injection de cellules cancéreuses, puis des prélèvements sanguins sous anesthésie. Le porteur indique une possible altération de l'état général aux doses les plus fortes, les souris atteignant les points limites étant mises à mort. Les retombées, une nouvelle classe d'anticancéreux, sont renvoyées au long terme et au conditionnel, et il affirme qu'aucune méthode in vitro ne peut remplacer la souris.

Objectifs

Les nouveaux traitements anticancer mis au point ces vingt dernières années reposent sur l’activation de la réponse immunitaire, qui est ensuite capable d’attaquer la tumeur. C’est ainsi que fonctionnent les inhibiteurs de points de contrôle, qui ont révolutionné la prise en charge des patients. Mettre au point de nouvelles molécules capables de booster le système immunitaire contre les tumeurs est donc une approche thérapeutique prisée, que ce projet se propose d’explorer. Ce projet propose d’étudier si nos molécules d'intérêt (les inhibiteurs de l’ARNi) pourraient être utilisés comme anticancéreux dans les tumeurs et boosteraient l’immunité antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de tester la capacité d’inhibiteurs de l’ARNi à booster l’immunité antitumorale. À long terme, cela pourrait aboutir à l’utilisation d’une nouvelle classe d’anticancéreux.

Procédures

Dans une première procédure qui vise à évaluer la toxicité et l’efficacité de 2 traitements, les animaux vigiles recevront des injections directement dans l’abdomen à raison de 5 jours par semaine pendant 3 semaines (temps d’injection : quelques secondes) Dans une seconde procédure qui vise à évaluer le rôle anti-cancéreux de nos traitements d’intérêt, les animaux seront greffés avec des fragments tumoraux (animaux anesthésiés – durée de l’anesthésie < 10 min) ou injectés avec des cellules tumorales (animaux vigiles). Les souris seront ensuite traitées à raison de 5 injections directement dans l’abdomen par semaines pendant 3 semaines ou d’une injection tous les 3 jours pendant 3 semaines (temps d’injection : quelques secondes). Deux prélèvements sanguins seront réalisés sur ces animaux anesthésiés avant la greffe des tumeurs puis à la fin de la première semaine de traitement (durée de l’anesthésie

Impact sur les animaux

Dans un premier temps, nous allons tester différents régimes de traitement aux inhibiteurs d’ARNi. Au vu de la littérature, nous n’attendons pas de toxicité particulière à faibles doses. Il est possible que nous observions une altération de l’état général des animaux recevant des doses plus élevées. Les souris seront alors mises à mort si elles atteignent les points limites. Dans la suite du projet, nous nous placerons à une concentration de drogue efficace sans effets adverses. Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Les animaux seront mis à mort dès atteinte d’un point limite

Devenir

Les animaux sont mis à mort à des temps déterminés pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Après des premières étapes d’analyse et de validation in vitro, le projet a pour but d’étudier le rôle anticancéreux d’inhibiteurs de l’ARNi chez la souris, organisme vivant intégré et autonome. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini a minima pour obtenir des résultats statistiquement significatifs

Raffinement

Les souris sont manipulées sans stress par des personnels compétents. Le bien être des souris sera suivi quotidiennement. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie avec une prise en charge de la douleur per et post-opératoire. Une grille de score est mise en place pour évaluer de manière objective l'état des animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche en cancérologie : souches murines parfaitement définies et modèles génétiquement modifiés, avec de grandes similarités entre les systèmes immunitaires humains et murins qui permet de transposer nos découvertes dans le modèle murin chez l’humain. Des souris adultes seront utilisées (âge supérieur à 6 semaines). Souris adultes, au système immunitaire mature