Procédures modérées

2 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris, d'une lignée fortement immunodéprimée, reçoit un conditionnement au busulfan puis des injections de cellules souches sanguines humaines, avant d'être tuée pour prélever moelle osseuse, rate et thymus. Le porteur indique que le busulfan entraîne une perte de poids et que de rares animaux développent une réaction du greffon contre l'hôte conduisant à leur euthanasie. Sur le remplacement, il affirme que le nichage des cellules souches dans l'organisme ne peut être reproduit in vitro.

Objectifs

Notre laboratoire a pour mission le développement et la conservation des greffons contenant des cellules souches sanguines humaines. Ces greffons sont utilisés pour le traitement par thérapie cellulaire de patients atteints de pathologies hématologiques telles que certaines leucémies, mais aussi dans certains cas, pour le traitement de cancers solides tels que le cancer du sein. Les procédures de greffe mises en oeuvre nécessitent une recherche permanente visant à améliorer et faciliter les procédures de greffe et à accroître l'efficacité de la greffe. L’objectif de ce projet vise l’optimisation de la qualité des greffons ainsi que le développement d'une nouvelle génération de greffon de cellules souches. Il s’agit principalement de préserver, voire augmenter, la capacité fonctionnelle (capacité de greffe) des greffons au cours des différentes étapes de préparation de ces greffons du donneur au receveur et notamment lors des protocoles de conservation, protocoles d’expansion, ou de manipulation géniques de ces greffons. Pour atteindre ces objectifs, il est indispensable de pouvoir analyser les cellules qui composent les greffons et notamment les cellules souches, et de pouvoir les étudier d'un point de vue fondamental.

Bénéfices attendus

Nos recherches sur les greffons hématopoïétiques et sur les cellules souches hématopoïétiques en particulier permettront une meilleure connaissance des mécanismes de régulation des CSH (survie, autorenouvellement, différenciation) d'un point de vue fondamental. Ces connaissances seront appliquées afin de (i) optimiser les conditions de conservation des greffons hématopoïétiques avant leur infusion aux patients, (ii) optimiser les protocoles d'expansion des greffons hématopoïétiques, et (iii) développer une nouvelle génération de greffons (à partir d'une source de cellules encore inexploitée (cellules du sang périphérique en homéostasie)).

Procédures

Les souris utilisées dans se projet seront soumises à des injections réalisées à l'aide d'une seringue et d'une aiguille. Il s'agit de piqûres réalisées en quelques secondes (minimum 5 secondes - maximum 90 secondes). Chaque souris subira un maximum de 3 piqûres réalisées à au moins 24h d'intervalle.

Impact sur les animaux

L'administration de bulsulfan pour le conditionnement des souris induit une légère perte de poids (

Devenir

A l'issue de la procédure, il est nécessaire de récupérer les moelles osseuses, la rate et le thymus des souris afin d'évaluer la prise greffe par les cellules injectées initialement. L'ensemble des souris est donc euthanasié afin de procéder à ces analyses et à l'obtention des résultats expérimentaux.

Remplacement

L’absence d’alternative à l’expérimentation animale pour l’ensemble de ces études est justifiée par le fait que la greffe des cellules souches du sang (« nichage » et développement chez l’hôte) fait intervenir des micro-environnements cellulaires et moléculaires extrêmement complexes et impossibles à reproduire en culture in vitro. Néanmoins, dans le cadre de ce projet, toutes les expérimentations in vitro (notamment analyses phénotypiques ciblant des populations cellulaires enrichies en CSH) seront réalisées chaque fois que possible.

Réduction

Pour chaque greffon utilisé et pour chacune des conditions expérimentales testées, le nombre d’animaux injectés est fixé à 7 afin d’obtenir les valeurs minimales nécessaires à la réalisation de tests statistiques lors de l’analyse des animaux. Afin d'éviter toute utilisation inutile d'animaux, les greffons sont testés pour leur contenu en cellules immatures (contenant potentiellement les cellules souches) sur des critères phénotypiques et/ou métaboliques afin d’estimer la qualité du greffon et d’éviter des injections inutiles en cas de greffons dont la qualité est jugée insuffisante.

Raffinement

Afin de respecter la notion de raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort. Les souris recevront notamment de la nourriture enrichie dès le départ de l'expérimentation qui est marquée par la 1ère injection de busulfan (conditionnement des animaux avant greffe). Cette nourriture a pour but de limiter la perte de poids liée à la perte d'appétit elle-même liée à l'administration du busulfan. Ainsi pour une perte de poids attendue de 20% sans nourriture enrichie, cette perte est limitée à 10% grâce à l'utilisation d'une nourriture enrichie. Les souris seront hébergées en animalerie A2, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques. Elles seront hébergées en cages de type 2L en présence de leur congénères (à raison de 5 souris par cage) afin de maintenir leurs relations sociales. Les conditions d’hébergement sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de « woodwoll ». S'agissant des animaux qui reçoivent une injection de cellules par voie intrafémorale sous anesthésie générale, une analgésie préventive est également administrée quelques minutes avant l’anesthésie générale afin de limiter toute éventuelle douleur au réveil. Tous les animaux concernés par l’injection intra-fémorale sont suivis avec une attention particulière jusqu’à leur réveil et jusqu’à la reprise d’une activité normale (locomotion, prise de boisson, relation avec les congénères…) qui intervient généralement dans les 5 à 10 minutes suivant le réveil.

Choix des espèces

Pour cette étude seront utilisés des souris NSG. Cette souche de souris est très largement utilisée dans la recherche sur les cellules souches hématopoïétiques en raison de sa capacité à permettre la génération d'une hématopoïèse humaine à partir des cellules souches injectées. Cette capacité est obtenue grâce à la forte immunodépression de cette souche de souris. Elle représente donc un modèle pertinent et efficace pour l'étude et la mise en évidence de cellules souches humaines ; ce modèle permet d'extrapoler la greffe chez l'humain. Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 semaines à 12 semaines de vie. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l´inoculation de cellules.

73 macaques à longue queue vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est infecté par le virus de la grippe puis par la bactérie Streptococcus pneumoniae pour reproduire une surinfection pulmonaire, avec prélèvements sanguins répétés, puce implantée sous la peau, imagerie scanner et PET, et parfois biopsies de ganglions, de moelle osseuse et de poumon. Le porteur indique que les animaux infectés seront tués pour analyse et que douze animaux non infectés pourront être réutilisés dans d'autres procédures. Sur le remplacement, il affirme que la réponse immunitaire ne peut être étudiée in vitro et conclut qu'un modèle animal est "nécessaire".

Objectifs

Streptococcus pneumoniae (ou S. pneumoniae) est une bactérie pathogène qui provoque des pneumonies pouvant évoluer en bactériémie (présence de bactéries dans le sang). Le plus souvent, chez l’adulte, l’infection à S. pneumoniae a lieu à la suite d’une infection pulmonaire par des virus, comme le virus de la grippe. Cette surinfection est responsable d’une augmentation significative de la morbidité et de la mortalité chez les patients doublement infectés, notamment lors d’épidémie de grippe. Les souches cliniques de S. pneumoniae sont souvent résistantes aux antibiotiques, ce qui complique la prise en charge des patients. A ce titre, S. pneumoniae fait partie de la liste émise par l’OMS en 2017 des 12 agents pathogènes prioritaires contre lesquels il est urgent d'avoir de nouveaux antibiotiques. En l'absence de nouveaux antibiotiques à moyen terme, une des voies de recherche pour combattre ces infections est l'activation de la réponse immune par des traitements immunostimulants. Plusieurs études montrent que la flagelline (une protéine du flagelle d'une autre catégorie de bactéries) peut activer la réponse inflammatoire. L'action adjuvante de la flagelline en supplément d'un antibiotique a été démontrée dans le cas d'infection à S. pneumoniae chez la souris, avec une augmentation de la résistance à la pneumonie aiguë grâce à une réponse immunitaire stimulée. Dans ce projet, nous étudierons l'action de la flagelline sur les infections à S. pneumoniae chez le primate non-humain, pour confirmer l'intérêt de cette protéine comme adjuvant dans ce type d'infection avant les études cliniques chez l'Homme.

Bénéfices attendus

L’augmentation de souches résistantes aux antibiotiques de S. pneumoniae rend urgente la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce projet doit déterminer le potentiel thérapeutique de la combinaison d'un traitement antibiotique avec une molécule immunostimulante, la flagelline. Les résultats, obtenus dans un modèle animal proche de l’Homme, fourniront les informations réglementaires nécessaires pour envisager de rendre ce nouveau traitement disponible chez l’Homme. À terme, l'objectif est de mettre en place des traitements similaires contre d’autres bactéries résistantes aux antibiotiques.

Procédures

Toutes les interventions et prélèvements sur animaux seront réalisés sous anesthésie. Tous les prélèvements et interventions réalisés le même jour seront effectués au cours de la même anesthésie. Les animaux seront exposés au virus de la grippe et à la bactérie S. pneumoniae au début de l’étude, pour reproduire la surinfection observée chez les patients. Pour cette exposition, les animaux seront anesthésiés pendant 30-45 min. Des prélèvements sanguins seront effectués régulièrement tout au long de l’étude, qui durera environ 1 mois. Les premiers animaux seront prélevés 1-2 fois avant l’infection grippe puis tous les 1-3 jours à partir de l’infection grippe jusqu’à la fin de l’étude (20 jours), afin de suivre au plus près la progression de l’infection . Pour les animaux suivants, la fréquence des prélèvements sera ajustée grâce aux données obtenues sur les premiers animaux, afin de limiter les interventions sur l’animal tout en assurant un bon suivi de l’infection. Pour chaque prélèvement, les animaux seront anesthésiés 10-15 min. Des puces de suivi de la température seront implantées en sous-cutané au début de l’étude, en même temps que les prélèvements. Ceci rajoutera environ 30-45 min d’anesthésie. Elles seront extraites à l’euthanasie des animaux. Des séances d’imagerie (scan des poumons aux rayons X (CT), tomographie par émission de positons (PET)) seront réalisées en baseline, juste après l’infection grippale (J-3), au pic de l’infection bactérienne et plus tardivement , en même temps que les prélèvements. Les séances de CT rajouteront 30-45 min d’anesthésie et les séances de PET-CT environ 2h. Certains animaux recevront un traitement antibiotique par injection intramusculaire ou intraveineuse une fois par jour tout au long de l’infection bactérienne . Pour chaque traitement, l’anesthésie durera entre 5 et 10 min par animal. En cas de résultats inattendus lors des premières infections, des biopsies tissulaires (ganglions, moelle osseuse, biopsie pulmonaire) pourront être mise en place lors des infections suivantes pour approfondir l’étude de la réponse immunitaire. Dans ce cas, chaque type de biopsie sera réalisée deux fois : une fois avant l’étude et une fois au cours de l’étude. Ces interventions rajouteront environ 30 min à 1h d’anesthésie.

Impact sur les animaux

L’infection grippale peut causer de la fièvre, de la toux et un encombrement bronchique. La surinfection par S. pneumoniae exacerbe ces symptômes. L’état des animaux sera observé quotidiennement, les signes cliniques seront suivis à chaque intervention grâce à une grille de scoring et des critères d’arrêt sont prévus dans le projet en cas de progression de la maladie ou d’éventuels effets inattendus du traitement. Les animaux non-infectés seront hébergés en groupe. Afin d’éviter des contaminations croisées, les animaux infectés seront hébergés en cages individuelles dans des modules contigus permettant des interactions sociales. Ils bénéficieront d’un programme défini par la cellule « bien-être animal » de l’établissement pour l’enrichissement de leur milieu de vie, qui sera renforcé lors des phases d’hébergement individuel.

Devenir

Tous les animaux infectés seront euthanasiés afin de réaliser une analyse histopathologique et des dosages sur les tissus. Les animaux non-infectés pourront être inclus dans d’autres procédures compatibles avec l’historique de l’animal, après récupération complète de l’animal et sur avis favorable du vétérinaire.

Remplacement

Ce projet vise à évaluer l’apport d’une molécule immunomodulatrice au traitement contre les infections à S. pneumoniae résistantes aux antibiotiques. Ceci nécessite un modèle expérimental permettant d’étudier les différentes composantes des réponses immunitaires et les changements induits suite à l’infection et aux traitements. A ce jour, ces différents éléments ne peuvent pas être étudiés in vitro puisque la mise en place de la réponse immunitaire a lieu dans différents organes (ganglions, organes lymphoïde secondaire) et son évaluation se fait à la fois au niveau systémique et au niveau local (muqueuse). De plus, pour des raisons éthiques, les évaluations de nouveaux traitements thérapeutiques ne peuvent avoir lieu directement chez l'Homme. L’utilisation de modèles animaux est donc nécessaire pour ce projet.

Réduction

Lors des étapes de mise au point (du modèle d’infection, du traitement), les différents paramètres seront testés sur un petit nombre d’animaux, suffisant pour faire des comparaisons qualitatives. Les conditions seront testées séquentiellement afin d’ajuster les protocoles des expériences suivantes en fonction des résultats obtenus. Le raffinement de la dose de bactérie se fera selon un procédé itératif déjà publié dans la littérature scientifique, ce qui nous permettra d’optimiser l’utilisation des animaux et donc de réduire les effectifs. Pour l’évaluation de l’efficacité du traitement, le nombre d’animaux par groupe est le minimum permettant une analyse statistique fiable des résultats (cliniques, hématologiques, réponse humorale, réponse cellulaire).

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes avant exposition aux pathogènes et en hébergements individuels contigus permettant des interactions sociales pendant la phase d’infection (conservation du contact sensoriel avec plaques translucides entre les cages latérales, et cages face à face séparées par 2 m). L’enrichissement sera augmenté pour les animaux hébergés individuellement (distribution 2 fois/semaine d’enrichissements destructibles au lieu d’une fois). Cet hébergement individuel est nécessaire pour éviter les biais lors de l’évaluation de la température par puces électroniques implantées en sous-cutané dans le dos de l’animal (diurne et nocturne) et pour éviter les contaminations croisées amenant à une surexposition virale ou bactérienne. Les prélèvements et interventions sur les animaux seront effectués sous anesthésie pour éviter le stress et d’éventuelles douleurs. L’état général des animaux sera observé quotidiennement, les signes cliniques seront suivis à chaque intervention grâce à une grille de scoring, et le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Le recours à des techniques d’analgésie et d’antalgie pourra être envisagé si nécessaire. Les points limites seront raffinés en fonction des résultats obtenus au cours de la mise en place du modèle.

Choix des espèces

Dans ce projet, le modèle primate non-humain est choisi pour sa proximité génétique et physiologique avec l'Homme, ce qui en fait le modèle le plus pertinent pour l’évaluation de traitements immunostimulants. Les réponses immunitaires chez le primate non-humain sont similaires à celles de l’Homme, et les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire sont disponibles et maitrisés chez cette espèce. De plus, l’appareil respiratoire des primates non-humains est très proche de celui des hommes par sa structure et ses dimensions. Enfin, les macaques sont susceptibles aux infections par le pathogène S. pneumoniae. Ces études seront réalisées sur des animaux adultes de plus de 2 ans, d’environ 2,5 à 8 kg. Le traitement à tester étant destiné principalement à la population adulte et le système immunitaire évoluant en fonction du stade de développement et de l’âge individus, des animaux au système immunitaire mature seront donc utilisés dans ce projet.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris, modèle de la maladie d'Alzheimer, subit sous anesthésie une injection de molécules directement dans le cerveau après incision du crâne et pose d'agrafes, puis des prélèvements sanguins, avant d'être tuée pour découper le cerveau en tranches. Le porteur indique que ces lignées développent plaques, déficits de mémoire, troubles moteurs et mort prématurée dès l'âge de six mois. Sur le remplacement, il affirme que les cultures cellulaires ne conviennent pas et que l'étude des réseaux neuronaux exige un "organisme entier".

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie qui, en entrainant la mort des neurones du cerveau, altère la mémoire. L'objectif de ce projet est de permettre une meilleure compréhension des modifications de l’activité des neurones associés à la MA et d’évaluer l’efficacité / toxicité de molécules en développement sur ces modifications. Pour cela, nous utiliserons différents modèles de souris qui miment la maladie. Ce projet de 5 ans comporte 1 procédure qui consiste à administrer directement au niveau du cerveau, sur animal préalablement anesthésié et analgésié, des molécules en développement afin d’évaluer leur action contre les symptômes de la MA.

Bénéfices attendus

Ce projet scientifique associé à notre plateforme d’enregistrement de l’activité des neurones sur des coupes de cerveau permettra de mettre en évidence les modifications de l’activité des neurones associés à des modèles de la MA et de tester les effets protecteurs de molécules en développement sur les modifications du réseau de neurones impliqués dans la MA. Ce projet permettra ainsi d'approfondir les connaissances actuels sur les déficits neuronaux liés à la MA et ainsi de permettre le développement de nouvelles molécules chez l'Homme afin de traiter ces déficits.

Procédures

Procédure chirurgicale: -Administration d’anti inflammatoire (par exemple, Type Carprofene, 10 mg/Kg SC) ou de morphinique (Type Buprénorphine, Buprecare, 0,03 mg/kg; SC) 30 minutes avant l’anesthésie. (maximum 5 minutes) -Anesthésie de la souris par inhalation (induction : 4-5% isoflurane sous 1 litre d'air et maintien 0.5-1.5% d’isoflurane sous 1 litre d'air) (maximum 5 minutes) -Application d’un gel ophtalmique (type Ocrygel) dès que l’animal est endormi afin d’éviter le dessèchement de la cornée. (maximum 2 minutes) -Injection d’un analgésique local en sous-cutané au niveau de la zone à inciser (maximum 2 minutes) -Placement de la souris profondément endormie dans le cadre stéréotaxique dont les barres d’oreilles ont été enduites d’un analgésique local (maximum 5 minutes). -Vérification du niveau d’anesthésie de l’animal en permanence en observant son rythme respiratoire et en testant le réflexe du retrait (maximum 2 minutes) -Incision de la peau (envion1.5 cm) au-dessus du crâne et nettoyage/désinfection de l’épicrâne (Type Vétédine) (maximum10 minutes). -Fermeture de la plaie à l’aide d’agrafes (maximum 5 minutes) Lors de l’expérimentation, des prélèvements sanguins pourront être effectués 1 fois par semaine maximum sur animal vigile ou anesthésié selon les méthodes réglementaires (au maximum 5 minutes).

Impact sur les animaux

Le premier modèle de souris utilisé pour ce projet présente une accumulation spontanée et progressive d’un peptide dans le cerveau, formant des plaques. Jusqu'à l'âge de 8-9 mois, les plaques ne sont pas observées au niveau du cerveau. Au cours de cette période "pré-plaque" de la maladie, un déficit de mémoire a été mis en évidence dans ce modèle. A l'âge de 11-12 mois les plaques commencent à apparaitre dans le cerveau. Les 2 autres modèles de souris utilisés pour ce projet sont caractérisés par une modification progressive de la composition d’une protéine présente dans le cerveau dès l'âge de 3 mois, entraînant des déficits de mémoire. Ces souris développent progressivement des problèmes de locomotion, une perte de poids, et un décès prématuré dès l'âge de 6 mois. Suite à l’administration des molécules en développement dans le cerveau, les animaux peuvent présenter des signes de douleur malgré les précautions prises pendant la phase de chirurgie (analgésiques, anesthésiques) et en post-opératoire (anti-douleurs et antibiotiques si besoin). Dans ce cas, les points limites préalablement définis permettront d’assurer un suivi de l’état général des animaux et de mettre en place des interventions précoces.

Devenir

Les animaux inclus dans une procédure expérimentale seront tous mis à mort à la fin de la procédure afin de réaliser les coupes cérébrales et procéder aux enregistrements de l’activité cérébrales sur ces coupes.

Remplacement

L'organisation des réseaux neuronaux peut être étudiée sur des coupes cérébrales de rongeurs par électrophysiologie. Ces expériences ne peuvent pas être reproduites, ni étudiées dans des modèles de cultures cellulaires in vitro. Une meilleure compréhension des pathologies du système nerveux central nécessite donc l’étude des réseaux neuronaux sur un organisme entier. Toutes les expériences sont réalisées dans le respect éthique de la règle des 3 R.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté. Les résultats seront analysés par des test statistiques. Nous adapterons les tests statistiques en fonction des observations.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages collectives avec un environnement enrichi (nids végétaux, copeaux de bois à grignoter, contact visuel et olfactif entre les animaux, commutation progressive de la lumière et interactions fréquentes avec les humains…). Avant la chirurgie, une période d’acclimatation des animaux d’au moins 5 jours sera respectée. Pendant la chirurgie, des mesures seront mises en place afin de réduire au maximum la douleur : anesthésiques (en pré-opératoire) et analgésiques (en pré- et post-opératoire), gel ophtalmique, maintien d'une température constante (tapis chauffant)...Si besoin, les animaux recevront une antibiothérapie adaptée. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé après la phase d’opération pendant 3 jours. Une période de récupération post-chirurgicale d’au moins 10 jours sera respectée. Dès réception des animaux, une observation journalière sera mise en place. Des points limites préalablement définis et adaptés permettront d’assurer un suivi de l’état général des animaux (souffrance, angoisse…) et de préserver leur bien-être. En cas d’altération de l’état de l’animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérite de la douleur observée. L'atteinte d'un point limite entraînera la mise en place d'interventions précoces et adaptées et des procédures de modifications de soins pourront être mises en oeuvre en cas de besoin comme détaillé dans la fiche de suivi et dans la procédure expérimentale. Les animaux exprimant des signes permanents de douleur seront exclus de l’étude et mis à mort immédiatement, sur décision du directeur de l'étude et/ou du vétérinaire désigné

Choix des espèces

Nos expérimentations sont réalisées chez la souris, petit rongeur dont l’étude est extrêmement répandue au sein des laboratoires de recherche en Neurosciences, rendant les résultats pertinents pour une large communauté scientifique nationale et internationale. Ces rongeurs, de petite taille et d’élevage facile, possèdent un système nerveux dont le développement est extrêmement proche de celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est suffisamment complexe. Pour l'étude des déficits de la maladie d'Alzheimer, la souris représente un modèle de choix pertinent car il existe des modèles transgéniques, bien décrits dans la littérature et couramment utilisés pour tester l'effet de composés en développement sur le fonctionnement cérébral. Les animaux seront utilisés de l'âge de 4 semaines à 40 semaines afin de couvrir tous les âges, du jeune à l'adulte et tous les stades de la pathologie.

15 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont élevées pour porter des maladies osseuses humaines comme le syndrome de Marfan ou l'ostéogénèse imparfaite, qui provoquent selon le porteur fractures spontanées, déformations de la colonne, dilatation de l'aorte et mort prématurée. Les seuls gestes décrits sont une biopsie d'oreille pour le génotypage et un tatouage, la souffrance venant surtout de la pathologie que ces lignées expriment. Le porteur indique que les animaux sont tués faute de pouvoir se reproduire ou être adoptés, et qu'aucune analgésie particulière n'est prévue.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’élever des souris atteintes de pathologies osseuses dans le but d'étudier ces pathologies : Dysplasie congénitale spondylo épiphysaire (SEDc), Syndrome de Marfan, Aggrécanopathies, Ostéogénèse Imparfaite, Dysplasie Diastrophique et Syndrome d'osteolyse carpotarsien multicentrique (MCTO).

Bénéfices attendus

Ce sont des maladies rares sévères pour lesquelles il n’existe pour l’heure actuelle peu ou pas de traitement. Si ces approches fonctionnaient cela permettrait de développer des traitements efficaces pour les patients et apporter un bénéfice éventuel à long terme pour les patients.

Procédures

1 Biopsie d’oreille sur animal vigile pour le génotypage (10s) ; 1 Tatouage sur les coussinets plantaires sur animal vigile (30s)

Impact sur les animaux

Les modèles de souris utilisés sont malades. En effet, les animaux atteints de collagénopathies présentent des complications qui surviennent de façon chronologique et si les souris survivent les premières semaines, elles restent modérément atteintes. Une attention toute particulière est apportée à ces animaux qui sont surveillés quotidiennement dès leur naissance. En ce qui concerne les souris Marfan, ce modèle présentent des troubles cardiovasculaires, en particulier une dilatation progressive de l’aorte (entraînant une baisse significative de l’espérance de vie), une hyperlaxité des articulations et une déformation de la colonne vertébrale et du thorax. Ces symptômes sont également associés à des troubles de la vision. En ce qui concerne les souris Aggrécanopathies, d’après leur description scientifique, les souris présentent avec le temps des difficultés pour s’alimenter à cause d’un mauvais alignement des vertèbres cervicales. En ce qui concerne les animaux Ostéogénèse imparfaite, d’après leur description scientifique, ce modèle présente une diminution de la densité osseuse provoquant des fractures spontanées. En ce qui concerne les souris MCTO, d’après leur description scientifique, ce modèle présente une perte osseuse progressive, concernant généralement les os des pattes, entraînant une déformation et un handicap, ainsi qu'une insuffisance rénale chronique dans de nombreux cas. En ce qui concerne les souris Diastrophique dysplasia, d’après leur description scientifique, ce modèle présente une ostéoporose des os longs, une déformation de la colonne vertébrale sévère entraînant une posture caractéristique avec tête fléchie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure car ils ne seront plus en âge de reproduire et le fait que les lignées soient génétiquement modifiées et mutantes empêche tous replacement/adoption.

Remplacement

Globalement, la construction des traitements nécessaires à l’expérimentation (qui fera l’objet d’un autre PEA) et leur optimisation se sont faites et continuent à se faire en se basant sur des publications scientifiques et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés. Cependant, l’utilisation du modèle murin de la maladie est inévitable afin de déterminer le bénéfice thérapeutique ainsi que d’évaluer les potentiels effets toxiques du traitement.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé de manière à produire les animaux nécessaires pour la partie expérimentation. Plusieurs de ces modèles étant nouveaux, il est possible que le nombre d’animaux nécessaire pour les expérimentations soit amené à changer et donc en conséquence le nombre d’animaux nécessaire en élevage.

Raffinement

Chaque cage contient une tige en papier, un igloo et une buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les malocclusions des incisives. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance inattendue, les animaux seront mis à mort dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude et/ou d’un vétérinaire.

Choix des espèces

Les modèles de souris choisis ici sont tous détaillés dans la littérature scientifique pour mimer la maladie humaine. Les croisements seront effectués à partir de 8 semaines d’âge (âge de maturité sexuel). Les femelles seront gardés jusqu’à 10 mois et les mâles 12 mois.

2 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit des injections répétées d'antigènes, parfois avec l'adjuvant complet de Freund, et subit un ou plusieurs prélèvements sanguins à la veine sous-mandibulaire, pour produire des anticorps destinés à des tests de diagnostic et à des médicaments. Le porteur décrit comme nuisances les injections, les prélèvements et l'euthanasie au CO2 en fin d'étude. Sur le remplacement et la réduction, il renvoie à un engagement écrit du client, qui atteste sous-traiter seulement ce qui ne peut être réalisé in vitro et n'utiliser que le nombre d'animaux "nécessaire".

Objectifs

Ces études d’immunisation sont utilisés à des fins scientifiques et médicales. Les applications de ces études peuvent être diverses comme : -Fabrication de tests de diagnostic permettant la détection de maladies en médecine humaine -Préparation de médicaments pour usage en médecine humaine (médicaments biologiques) -Applications diverses en recherche et développement

Bénéfices attendus

Ces études d’immunisations sont utilisées à des fins scientifiques et médicales. Les applications de ces études peuvent être diverses – comme : -Fabrication de tests de diagnostic permettant la détection de maladies en médecine humaine -Préparation de médicaments pour usage en médecine humaine. Les bénéfices sont donc : Fabrication de tests de diagnostic permettant la détection de maladies en médecine humaine -Préparation de médicaments pour usage en médecine humaine (médicaments biologiques) -Applications diverses en recherche et développement.

Procédures

Injections auxquelles les animaux vigiles pourraient être soumis (voies et volumes) : Sous cutanée : volume maximum sans adjuvant : 0,5ml, 4 sites max volume maximum avec adjuvant, injection primaire : 0,1ml/site, 4 sites max volume maximum avec adjuvant, injection subséquente (*) : 0,5ml/site, 4 sites max (*) : le nombre d’injection subséquentes peut varier en fonction du projet (durée du projet, demande du scientifique et type de produit). Par expérience, la nécessité de pratiquer plus de 4 injections subséquentes est très peu fréquente. Intra musculaire (*) : volume maximum sans adjuvant : 0,05ml/site, 2 sites max volume maximum avec adjuvant, injection primaire : 0,05ml/site, 2 sites max volume maximum avec adjuvant, injection subséquente (**): 0,05ml/site, 2 sites max (*) Si utilisation de l’adjuvant complet de Freund (CFA), le scientifique devra justifier par écrit avant le début de la procédure. (**) : le nombre d’injection subséquentes peut varier en fonction du projet (durée du projet, demande du scientifique et type de produit). Par expérience, la nécessité de pratiquer plus de 2 injections subséquentes est très peu fréquente. Intra péritonéale : volume maximum sans adjuvant : 1ml Intra veineuse : volume maximum sans adjuvant : 0,2 ml Voie de prélèvements possible sur animaux vigiles : Veine sub-mandibulaire. Un ou plusieurs prélèvements sanguins pourront être réalisés en cours de protocole, en respectant les règles suivantes : Prélèvement unique par jour : % du sang total circulant prélevé / Durée approximative de récupération 0.75 % / 24 heures 7,5 % / 1 semaine 10 % / 2 semaines 15 – 20 % / 4 semaines. Prélèvements multiples par jour : % du sang total circulant prélevé en 24 h / Durée approximative de récupération 0.75 % / 24 heures 7,5 % / 1 semaine 10-15 % / 2 semaines 20 % / 3 semaines

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : Les injections des antigènes +/- d’un adjuvant, Les prélèvements sanguins pour permettre l’obtention de sang, de plasma ou de sérum, L’euthanasie des animaux en fin d'étude.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés par inhalation d’une concentration progressive de CO2 en fin d'étude ou en cas d'atteinte de points limites.

Remplacement

Le scientifique s’engage par écrit avant chaque étude à nous sous-traiter que les études d’immunisation ne pouvant être réalisées in vitro dans l’état de l’art.

Réduction

Le scientifique s’engage par écrit avant chaque étude à utiliser le nombre d’animaux nécessaire et suffisant à la quantité d’anticorps désirée.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux, avec du matériel de nidification comme enrichissement. Elles sont observées chaque jour par du personnel formé et compétent et des points limites sont mis en place. Avant les injections intra-veineuses les souris sont positionnées dans une enceinte chauffante à 38°C pendant 10 minutes pour faciliter l’injection intra-veineuse.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus adaptée pour les études d'immunisation et en quantité suffisante pour répondre aux demandes spécifiques du scientifique.

2 280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit dans le cerveau des injections de toxines qui détruisent des voies nerveuses pour reproduire la maladie de Parkinson, certains recevant en plus une canule intracérébrale, puis subit des tests comportementaux incluant une restriction alimentaire et un choc électrique de 0,7 mA. Le porteur indique que les lésions provoquent un déficit moteur ou cognitif et une perte de poids chez les animaux les plus atteints, et que tous seront tués après les évaluations d'imagerie. L'objectif est d'identifier des marqueurs en IRM, les retombées cliniques restant renvoyées au conditionnel.

Objectifs

La maladie de Parkinson (MP) se caractérise par les classiques signes moteurs permettant le diagnostic mais également par des troubles cognitifs et comportementaux, plus variables dans leur apparition et leur expression, mais ayant un impact considérable sur l’autonomie et la qualité de vie des patients ainsi que sur les décisions thérapeutiques. Pourtant, leur prise en charge reste limitée et requiert une meilleure compréhension des mécanismes impliqués, notamment via l’identification de biomarqueurs. Les biomarqueurs sont des indicateurs des processus pathogènes et sont des outils précieux tant pour faciliter le diagnostic précoce, que pour suivre l’évolution de la pathologie ou l’efficacité d’un traitement. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) avec ses explorations anatomiques et fonctionnelles, combinée à des méthodes spécifiques d’analyse a récemment permis de mettre en évidence des marqueurs de certains des troubles observés en pratique clinique. Cependant son utilisation reste encore marginale notamment pour le diagnostic, et le lien entre ces marqueurs d’imagerie et l’histologie reste à établir. Cette corrélation est indispensable tant à la compréhension des mécanismes sous-jacents qu’à la validation de ces marqueurs en tant que Biomarqueurs de la pathologie. L’utilisation de modèles animaux est le moyen le plus adapté pour mener ce type d’études. Cependant, ils ne miment que partiellement la pathologie humaine et chaque modèle présentent des avantages et des limites. Il convient donc de valider les résultats obtenus sur plusieurs modèles complémentaires pouvant représenter les différents aspects physiopathologiques de la maladie. Le présent projet vise d’abord à étudier plusieurs de ces modèles afin de reproduire les différents troubles moteurs et non moteurs associés à la pathologie (Caractérisation comportementale). Les objectifs seront ensuite d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en imagerie in vivo (IRM) et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent (Histologie). Enfin, en fonction des résultats de cette première partie (et des résultats in vitro fait en parallèle), certains de ces modèles seront reproduits afin de tester l’effet de stratégies thérapeutiques (Administration intra-cérébrale ou périphérique). Un modèle de démence induite par une déplétion cholinergique centrale sera aussi utilisé comme contrôle positif de déclin cognitif sévère afin de contrôler l’efficacité de ces stratégies.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en imagerie in vivo (IRM ou TEP) et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent (Histologie). Ces biomarqueurs pourraient être validés et utilisés en clinique pour aider au diagnostic de certains troubles, le suivi non invasif de l'évolution de la pathologie et/ou de l'effet des traitements. L'étude des mécanismes sous jacents permettra l'idenitfication de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dont l'efficacité sera testée.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales visant à injecter des toxines pour induire des lésions cérébrales (30 minutes). Certains d'entre eux subiront à nouveau une procédure chirurgicale pour l'implantation d'une canule d'administation cérébrale (30 minutes). Certains animaux subiront des injections sous-cutanées ou intra-péritonéales (Maximum 2/jours pendant 4 semaines). Tous les animaux subiront une série de tests comportementaux dont certains nécessitent une restriction alimentaire avec rationnement, ou la délivrance d'un choc electrique (0,7 mA - 2 sec, 1 seule fois)

Impact sur les animaux

Les toxines injectées induisent une dégénérescence des voies cérébrales dopaninergiques et/ou cholinergiques, un déficit du contrôle moteur et/ou cognitif est donc attendu et étudié dans ce projet. Une perte de poids corporel peut aussi être observée chez certains animaux plus sévérement lésés. L'anesthésie subie lors de la chirurgie ou de l'imagerie en IRM pourrait être mal tolérée par certains animaux. Les évaluations comportementales n'induisent pas de perturbation en elles-mêmes. La restriction alimentaire associée au touchscreen pourrait être mal tolérée par certains animaux. La pose de canule intracérébrale et les injections de traitments pourraient être mal tolérées.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin des évaluations en imagerie in vivo ou après l'evaluation des effets thérapeutiques sur ces variables

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à l’utilisation d’animaux pour étudier la physiopathologie de troubles cognitifs et comportementaux. Cependant pour limiter l’utilisation d’animaux, l'étude de la potentielle toxicité, des mécanismes d'action et l’efficacité des molécules thérapeutiques testées seront étudiés en parallèle sur un modèle cellulaire (Remplacement).

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé au minimum sur la base d'un test de puissance. L'analyse statistiques des données débutera par une étude de la normalité et de l'homogénéité des variances. Selon la distribution des valeurs, des tests paramétriques (ANOVA puis Test de Fisher pour la compariason 2 à 2) ou non paramètriques (Kruskal-Wallis et Wil-Coxon test pour la comparaison 2 à 2) seront utilisés. Les mêmes animaux seront réutilisés pour l'analyse comportementale et l'imagerie cérébrale à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem. Les animaux seront réutilisés pour différentes évaluations (Comportement et Imagerie) à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem.

Raffinement

Le raffinement est assuré par un hébergement collectif, de l’enrichissement dans les cages, des sessions d’acclimatation aux expériences, une manipulation expérimentée des animaux. De plus, un suivi quotidien du bien-être des animaux sera effectué pour surveiller l'apparition éventuelle de souffrance ou de points limites pour lesquels des décisions adaptées seront prises (Raffinement).

Choix des espèces

Parmi les petits rongeurs, le rat est l’espèce la mieux adaptée pour l’évaluation des troubles cognitifs et psycho-comportementaux. Par ailleurs, les modèles expérimentaux choisis ont été décrits chez le rat. Les rats utilisés auront 8-10 semaines. Cet âge a été choisi en raison de la référence utilisé pour l’ATLAS cérébral de rat et la précision de localisation des repères stéréotaxiques pour les injections cérébrales.

Greffés d'un lenticule de cornée lyophilisé sur chaque œil, 24 lapins New Zealand adultes sont gardés en vie trois mois, puis tous tués pour le prélèvement de leurs cornées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'opération, menée sous sédation profonde et anesthésie locale par collyre, dure dix minutes par œil, et les yeux sont photographiés chaque semaine pour suivre l'intégration du greffon. Le projet vise à vérifier qu'un stroma cornéen décellularisé et lyophilisé, stockable à température ambiante, s'intègre et reste transparent, en vue de greffes chez l'humain, notamment dans les pays qui manquent de cornées. Pour justifier l'opération des deux yeux, le porteur la qualifie de "totalement indolore en post opératoire", alors qu'il annonce une vision floue pendant 72 heures et une douleur possible les 24 premières heures.

Objectifs

La cornée est la membrane transparente située en avant de l’oeil. Elle est constitué de plusieurs couches : - L’épithélium, qui constitue la couche la plus externe - La membrane de Bowman - Le stroma - La membrane de Descemet - L’endothélium, la couche la plus interne Les atteintes de la cornée peuvent toucher son épaisseur sur la totalité ou en partie (épithéliale, stromale ou endothéliale). Ces atteintes génèrent une opacité ou une déformation, dans ce cas l’individu devient non voyant et il est nécessaire de réaliser une greffe de cornée, soit sur toute l’épaisseur, soit sur une partie de son épaisseur. Cependant, le nombre de cornées disponibles pour les greffes, le mode de conservation et sa durée reste limités. Dans le but de surmonter les pénuries et les contraintes, d’autres alternatives sont mises en places. Dans le cas où il est nécessaire de réaliser une greffe lamellaire antérieure (stromale) de la cornée, la mise au point de stroma cornéen décellularisé et lyophilisé serait extrêmement intéressante. Cela permettrait de répondre plus aisément aux différents problèmes de conservation, transport, urgence de greffes et disponibilité. En France, le mode de conservation de la cornée d’origine humaine est l’organoculture à +31°C. Cette méthode nécessite des conditions de stockage volumineux et contraignant. Une alternative à l’organoculture est la lyophilisation de la cornée qui permettra une facilité de stockage ( à température ambiante). Ce projet s’inscrit également dans un but humanitaire pour faciliter l’accès à la greffe lors de perforation dans les pays n’ayant pas les capacités d’approvisionnement en cornées. Les méthodes d’analyses permettent d’évaluer la conservation de l’intégrité structurale avant et après réhydratation ainsi que sa transparence. Cependant, il reste nécessaire de confirmer la bonne intégration de ces greffes in vivo (chez le lapin) avant une application chez l’homme.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est d’évaluer la compatibilité, l’intégration ainsi que la transparence au sein de la cornée du lapin du lenticule de stroma décellularisé lyophilisé. L’objectif est à terme une application pour la greffe chez l’humain. Ce projet s’inscrit également dans un but humanitaire pour faciliter l’accès à la greffe lors de perforation dans les pays n’ayant pas les capacités d’approvisionnement en cornées.

Procédures

Chaque lapin suivra une procédure chirurgicale sur chaque œil d'une durée de 10 minutes soit un temps opératoire de 20 minutes maximum. Cette intervention consiste à greffer des lenticules lyophilisés au niveau de la cornée. Ce geste est réalisé par un chirurgien ophtalmologiste hautement qualifié.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables de la greffe de corné chez le lapin sont les même que chez l'humain. Une vision légèrement floue durant les premiers 72h. Une légère douleur pourrait apparaitre durant les 24 premières heures due à l'inflammation engendrée par le geste opératoire.

Devenir

Tous les animaux sont gardés vivant pour une période de 3 mois à la fin de la procédure de greffe des lenticules, puis ils seront mise à mort pour l'evaluation des greffes.

Remplacement

Remplacement : la technique de lyophilisation de des cornées a été mise au point dans notre laboratoire et testée dans de nombreuse conditions in vitro. Aujourd’hui, nous devons confirmer la bonne intégration et la transparence des greffons stromaux lyophilisés sur la cornée animale avant de pouvoir l’utiliser chez l’homme. La dimension et la composition de la cornée du lapin est proche de celle de l'homme, cela permet une insertion plus facile par le chirurgien. De plus, le stroma cornéen sera préalablement décellularisé pour faciliter l’intégration dans la cornée du lapin.

Réduction

Dans le cadre de la règle des 3Rs : Réduction : Chaque lapin sera opéré des deux yeux. Cette intervention n’est pas cécitante, elle est régulièrement pratiquée en médecine humaine et totalement indolore en post opératoire ce qui nous permet de réduire de moitié le nombre d’animaux utilisés : - L’oeil droit recevra un lenticule dans l'épaisseur du stroma cornéen (INLAY) - L’oeil gauche recevra un lenticule à la surface du stroma cornéen (OVERLAY) Le nombre de lapins utilisé fait référence aux études antérieures et est nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement fiables et interprétables. Nous utiliserons un test de Wilcoxon ou un test Q de Cochran pour l'interprétation de statistique de nos résultats.

Raffinement

L’ensemble des procédures seront effectuées sous sédation profonde monitorée, couplée à une anesthésie locale médiée par un collyre ophtalmique. Les temps opératoires seront très courts maximum 10 minutes par oeil et pratiqué par un chirurgien qualifié. Afin de garantir une parfaite transposition chez l’humain les soins post opératoire seront les mêmes qu’en médecine traditionnelle : -Injection sous conjonctivale d’anti-inflammatoire en fin d’intervention. -Pommade ophtalmique deux fois par jour jusqu’à cicatrisation totale soit 5 à 7 jours. Chaque semaine, des photos seront réalisées sur les yeux afin de suivre la bonne intégration du greffon cornéen. A 3 mois post-greffe les cornées seront prélevées pour analyses histologiques. La manipulation des lapins sera facilitée par des séances d’entrainement récompensée (Fruity bites) durant les deux semaines d’acclimatation pré-opératoire. Des Bunny Block, des briquettes de bois et de luzerne seront disposés dans la cage de façon alterné afin d'assurer l'enrichissement du milieu et de la musique douce sera diffusée quotidiennement. Les points limites seront déterminés en se basant sur le Rabbit Grimace Scale et essentiellement sur l’Orbital tightening.

Choix des espèces

L’espèce choisie est le lapin new zealand. L’expérimentation proposée est relativement facile chez le lapin car la dimension de la cornée est proche de celle de l’homme et permet à un chirurgien d’insérer les lenticules de 7-8mm de diamètre avec facilité. Les lapins peuvent sous sédation être facilement examinés au biomicroscope pour la réalisation de photos post-opératoires et sont de très bons candidats pour cette mise au point. L’intervention réalisée chez l’homme sous forme de greffe de cornée n’est pas douloureuse et ne nécessite habituellement aucun antalgique. Stade adulte afin que l'oeil de l'animale ait atteint sa taille maximale. Soit 2kg à 2.5 kg 24 lapins seront utilisés 12 pour une correction à 2 lenticules et 12 pour une correcrtion à 3 lenticules.