Procédures modérées

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris immunodéprimées reçoivent sous la peau une greffe de tumeur colorectale issue de patients, maintenue le temps d'obtenir le matériel biologique, avant d'être tuées pour prélever la tumeur. Le porteur indique que la nuisance tient à la présence de la tumeur sur le flanc et décrit des travaux en cours pour reproduire le phénomène in vitro et se passer de la greffe. Sur le remplacement, il affirme que seule la souris permet aujourd'hui de conserver les propriétés des tumeurs de patients.

Objectifs

Chez certains patients atteints de cancer colorectal, des cellules tumorales s'échappent de la tumeur en groupes sphériques pour coloniser d'autres organes, formant des métastases. Nous avons observé que certains de ces groupes de cellules sont capables d'adhérer à l'environnement qui les entoure et interagir avec, tandis que d'autres y sont insensibles. Des tumeurs humaines, maintenues en souris puis récupérées après chirurgie, nous permettent de reproduire in vitro ces deux comportements. Ce projet vise à caractériser au niveau cellulaire et moléculaire l'impact des propriétés de ces groupes de cellules tumorales sur leur migration à travers les tissus.

Bénéfices attendus

Les tumeurs humaines maintenues en souris ont des propriétés très proches de celles tumeurs des patients. Après les avoir récupérées, leur étude in vitro participera de manière fiable à la compréhension de nouveaux mécanismes par lesquels les cellules tumorales se déplacent à travers les tissus des patients. Les résultats seront publiés dans des revues scientifiques. Cette étape de migration est une étape clé dans la formation de métastases, dont décèdent aujourd'hui la majorité des patients. Ainsi, sa compréhension permet d'envisager à plus long terme de nouvelles options thérapeutiques, en particulier pour les patients atteints de cancer colorectal, et de mieux anticiper leur pronostic.

Procédures

Implantation unique de greffe de tumeurs de patients sous la surface de la peau, sous anesthésie générale, d'une durée de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Nuisances liées à la présence d'une tumeur unique sur le flanc (sous-cutanée) de taille modeste.

Devenir

Suite à la greffe de tumeur en sous-cutané opérée sur l'ensemble des animaux, l'ensemble des souris seront mises à mort afin de procéder au prélèvement des tumeurs, ou en cas de dégradation importante de leur état de santé.

Remplacement

Aujourd'hui, seul le maintien sur souris de ces tumeurs dérivées de patients permet par la suite de reproduire le phénotype de polarité épithéliale des sphères de patients. Des études sont en cours au laboratoire visant à reproduire in vitro le phénotype de polarité des sphères issues de rumeurs dérivées de patients afin de pouvoir se passer de la xénogreffe en souris. La durée prévue pour ce projet prend en compte le fait que nous y parviendrions rapidement. Nous avons par ailleurs identifié dans le projet "collamoeboid" financé par l'ANR que certaines propriétés (migration, plasticité) sont partagées par les tumeurs dérivées de patients et des groupes de cellules issus de certaines lignées cellulaires. Ce projet prend donc en compte que certains axes de recherche seront désormais effectués sur des lignées cellulaires plutôt que des tumeurs dérivées de patients greffées sur souris.

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d'animaux par groupe ainsi que le nombre de modèles de tumeur choisis pour l'étude, grâce à un projet précédent . De plus les souris seront suivies chaque semaine afin de s'assurer de leur bonne santé et bonne cohabitation, et ainsi minimiser le taux d'échec.

Raffinement

Les animaux seront suveillés quotidiennement. L'intervention de greffe sera effectuée sous anesthésie générale. Des points limite ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux bénéficeront de nourriture et d'eau ad libitum ainsi que d'un environnement enrichi.

Choix des espèces

Dans notre projet d’étude, nous allons réaliser des greffes de tumeurs de patients rendant indispensable l’utilisation d’animaux immunodéprimés pour s’assurer du non rejet de la tumeur par l’animal. De plus, les tumeurs de patients utilisés sont issues du consortium CREMEC où des banques de stockage ont été réalisées suite aux passages des tumeurs en souris. Pour ces raisons, ajoutées à l’expérience du personnel animalier dans la manipulation des rongeurs, l’animal le plus pertinent est la souris immunodéprimée pour nos expérimentations. Les souris seront utilisées à l’âge de 5-6 semaines pour ne pas interférer avec les processus de vieillissement.

5 000 rongeurs, 4 500 souris et 500 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils servent à entraîner le personnel d'un prestataire de recherche préclinique à des gestes techniques, chaque animal recevant jusqu'à quinze administrations par injection ou gavage et cinq prélèvements sanguins avant d'être tué. Le porteur présente le projet comme un moyen de réduire à terme la souffrance des animaux en fiabilisant les gestes, et indique employer en priorité des animaux surnuméraires. Sur le remplacement, il affirme utiliser d'abord une formation théorique et des supports non vivants pour limiter le recours aux animaux vivants.

Objectifs

La bonne pratique d’expérimentation nécessite une bonne connaissance de la biologie des espèces utilisées et aussi les connaissances théorique et pratique des méthodes expérimentales sur le modèle animal. Ce projet de formation vise à réutiliser les animaux surnuméraires non-utilisés ou non -randomisés dans des études dans un souci de réduction. L’objectif de ce projet est de fournir les connaissances indispensables et d’enseigner les bonnes pratiques d’expérimentation animale. Cette formation s’adresse aux personnes réalisant les procédures expérimentales dans le cadre des expériences précliniques réalisées par notre société – prestataire de services en recherche préclinique. Le vétérinaire ou son délégué assure la formation théorique en anesthésie, analgésie, euthanasie et sur le suivi clinique et notamment sur la reconnaissance des signes de souffrance. Les responsables formation qui ont la délégation du responsable de l’établissement assurent la validation des compétences en anesthésie, analgésie et euthanasie. Chaque technicien de recherche suivra un programme de formation, dont une partie nécessite l’utilisation d’animaux vivants. Dans le cadre de ce programme, chaque technicien doit prendre connaissance et maitriser les techniques d’administration des produits, les techniques de prélèvement sur rongeurs (souris et rats) et les techniques d’imagerie. La formation de chaque technicien sera encadrée par le personnel formé (tuteur) avec les compétences reconnues. Pour chaque geste technique enseigné, une session de validation devra confirmer que le tutoré est apte à réaliser le geste technique en autonomie. La bonne maitrise des procédures expérimentales non-invasives et invasives appliquées sur les rongeurs permettra d’améliorer le bien-être des animaux et d’obtenir des résultats scientifiques fiables et reproductibles.

Bénéfices attendus

Le tutorat pour chaque compétence et la validation du tutorat sont indispensables pour la bonne réalisation de procédures expérimentales. Ils permettent de diminuer le temps de manipulation des animaux, de diminuer le stress/souffrance de l’animal, d’éviter les dérives techniques dans le temps, de prendre connaissance des évolutions techniques, d’améliorer la fiabilité des résultats, d’éviter de recommencer des études suite à un biais initié par une mauvaise manipulation technique, ... Ce projet permet à notre établissement utilisateur de se conformer à la réglementation et de valider les compétences de son personnel impliqué en expérimentation animale. De plus, la formation continue des techniciens nous permet de maintenir un niveau de qualité des gestes techniques et également la mise en place de nouvelle procédure/technique dans le but d’un raffinement.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales, intraveineuses, sous-cutanées, des gavages et des prélèvements sanguins. Le nombre d’actions est limité : • 2 gestes différents maximum par jour • 15 Administrations ou utilisations autres (tonte, imagerie, tatouages) • 5 Prélèvements Les animaux engagés dans le projet de formation seront euthanasiés après les limites d’utilisation ci-dessus et en l’absence de points limites atteints. Les gestes d’administrations ou de prélèvements pourront durer jusqu’à une dizaine de minutes, induction de l’anesthésie exclue, chez une personne non expérimentée en début de tutorat. L’objectif est de pouvoir réaliser ces gestes en moins de 30 secondes. Les procédures non-invasives et faiblement invasives comme le gavage, les injections intrapéritonéales et sous cutanées sont réalisées sur les animaux vigiles. Si la technique le permet, le tutoré commencera sa formation sur les animaux anesthésiés avant de passer sur animaux vigiles à l’appréciation de son tuteur. Certaines procédures (injections intra-veineuse, intra-musculaire, intra-rectale, prélèvements de sang), nécessitent l’anesthésie gazeuse (isoflurane) pour la contention des animaux.

Impact sur les animaux

La réalisation de procédures expérimentales non maitrisées peut induire une augmentation du stress, une angoisse ou une douleur.

Devenir

A l’issue de cette procédure les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Application du principe de Remplacement : Avant toute manipulation d’animaux, une formation théorique avec des modes opératoires et des vidéos permettra de limiter l’utilisation des animaux. Pour certaines, des supports non vivants pourront être utilisés afin de mimer un animal. L’utilisation de support non vivant dans les premières étapes d’apprentissage d’un geste technique permet d’étendre la période d’apprentissage tout en limitant le nombre d’animaux vivant utilisés et une éventuelle souffrance liée à l’application d’un geste encore mal maitrisé.

Réduction

Application du principe de Réduction : Pour former le personnel, nous utiliserons principalement et en priorité les animaux de réforme des études de gravité légère ou modérée, ou des animaux surnuméraires. Plusieurs procédures faiblement invasives, telles que injections et prélèvements, seront réalisées sur les mêmes animaux dans les limites éthiques prédéfinies (Voir 5.6.1 et les documents de référence validés par le comité éthique)

Raffinement

Application du principe de Raffinement : Pour cette formation seront utilisés exclusivement les animaux en bon état général. L’état des animaux sera régulièrement évalué, si besoin par le vétérinaire ou par la personne chargée du bien- être des animaux. Toutes les procédures réalisées sur chaque animal seront enregistrées et les délais de repos définis seront respectés. Le nombre de gestes techniques est limité à 15 injections et 5 prélèvements au total pour chaque animal. Dans les heures qui suivent la formation, les animaux seront observés par le tutoré et/ou le tuteur préalablement formés à reconnaître les signes de souffrance d’un animal. En cas de procédure entraînant des effets indésirables inattendus et une souffrance qui peut perdurer, le tuteur ou la SBEA pourra prendre la décision d’euthanasier l’animal. Les administrations seront avec du sérum physiologique parfois supplémentés par un colorant compatible avec les injections pour les validations de la bonne administration. Les prélèvements sanguins respecteront les recommandations du comité d’éthique. Pour les gestes réalisables sur animaux vigiles, l’anesthésie sera privilégiée lors de la réalisation des premiers gestes. Pour les procédures à réaliser sous anesthésie et analgésie, les documents de référence du comité d’éthique seront appliqués.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont des espèces couramment utilisées dans la recherche et pour la réalisation d’expérience précliniques. L’apprentissage des bonnes pratiques permettra aux utilisateurs de réduire la souffrance et les dommages subis par les animaux au cours de la réalisation de ces expériences. Animaux adultes. L’objectif de formation est d’apprendre la réalisation de ces procédures sur des animaux adultes, les mêmes que ceux utilisés dans le cadre des expériences précliniques réalisées par notre société

3 092 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'une heure, un protocole de défaite sociale où chacune est mise cinq minutes par jour pendant dix jours au contact d'un agresseur pouvant la blesser, et un test de peur conditionnée, pour étudier l'effet des oméga-3 sur les suites d'un stress chronique. Le porteur reconnaît que la défaite sociale et la chirurgie peuvent nuire aux animaux, ensuite tués pour prélever des structures cérébrales. Sur le remplacement, il affirme que l'étude des régimes alimentaires et des comportements exige des animaux vivants et vigiles.

Objectifs

Le rôle des oméga-3 sur le fonctionnement cérébral et la santé mentale est étudié depuis presque 10 ans. Le laboratoire a notamment démontré qu’une carence en oméga-3 exacerbe les comportements de type anxieux et dépressif chez l’animal, tandis qu’une supplémentation en oméga-3 les diminue. Ces études précliniques sont en accord avec les données chez l’homme, des essais cliniques montrant qu’une supplémentation en oméga-3 améliorerait certains symptômes dépressifs. Ainsi, une supplémentation en oméga-3 peut constituer une alternative intéressante dans la prévention des troubles de l’humeur, mais les mécanismes qui sous-tendent les effets positifs des oméga-3 dans les troubles de l’humeur restent encore très mal connus. Notre laboratoire a récemment ouvert une nouvelle hypothèse, en démontrant que les apports en oméga-3 avaient un impact direct sur la plasticité synaptique ainsi que l'arborisation dendritique. La plasticité synaptique regroupe les phénomènes qui confèrent au cerveau sa capacité de s’adapter à l’environnement, par des modifications de la connectivité entre les neurones, au niveau des synapses. Les différentes formes de plasticités synaptiques sont indispensables aux mécanismes d’apprentissage et d’évolution. De plus en plus d’études suggèrent que les troubles de l’humeur sont associés à des dysfonctionnements dans les processus de plasticité synaptique et ces dysfonctionnements pourraient être à l’origine des symptômes neuropsychiatriques des troubles de l’humeur. Les oméga-3 sont des modulateurs importants des fonctions synaptiques, car, faisant partie des éléments structurels des membranes plasmiques, ils modulent la dynamique membranaire ainsi que la fonctionnalité et le trafic des protéines transmembranaires présentes à la synapse.

Bénéfices attendus

L’objectif de notre projet est désormais d’aller plus loin dans la compréhension des mécanismes neurobiologiques par lesquels les oméga-3 contenus dans l’alimentation permettent de protéger les animaux. L’objectif à long terme de ce projet est de transférer les connaissances acquises chez le rongeur à l’homme pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et nutritionnelles. Ces données pré-cliniques nous permettrons de comprendre un peu plus en quoi la nutrition influence les fonctions cognitives et la physiologie de la transmission synaptique. De plus, des applications thérapeutiques peuvent être envisagées, en particulier pour déterminer si une thérapie nutritionnelle peut atténuer les pathologies liées au stress chronique, comme par exemple les troubles de stress post-traumatiques. De façon similaire, des stratégies préventives, liées à une nutrition adaptée et équilibrée en lipides, pourraient être envisagées afin de limiter, réduire ou même d'endiguer l'apparition de troubles dépressifs et/ou anxieux.

Procédures

1 - procédures chirurgicales - durant 1h d'opération / 2 - protocole de défaite sociale - 5 minutes pendant 10 jours / 3 - test de peur conditionnée - 5 minutes par jour pendant 3 jours.

Impact sur les animaux

Le protocole de défaite sociale ainsi que les interventions chirurgicales sont susceptibles d'induire des nuisances sur les animaux. Au cours de la défaite sociale, les 5 minutes en contact avec l'agresseurs représentent un délai conséquent pouvant être source de blessures. L'attention des expérimentateurs est tout particulièrement maximale à ce moment là, et en cas d'attaques trop fortes mettant en danger la vie de la souris, les animaux sont séparés. Au cours de la chirurgie tous les moyens sont mis en oeuvre pour respecter les conditions d'aseptie mais le risque d'infection n'est pas négligeable, justifiant un suivi post-opératoire strict. Le test de peur conditionné est une source de stress pour les animaux, une attention particulière est apportée au animaux avant, pendant et après l'expérience. Le reste des procédures ne représente pas de nuisances pour les animaux. Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas de stress majeur induisant une altération de l’état général des animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou cellules nécessaires pour les études cellulaires et moléculaires.

Remplacement

L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les conséquences d’une carence nutritionnelle en omega-3 sur la physiologie neuronale et microgliale chez la souris pendant le développement. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, bien que certaines études soient développées sur des modèles cellulaires pour traiter les aspects neurobiologiques, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, les animaux qui passeront les tests comportementaux serviront également pour récupérer les cellules ou structures centrales nécessaires pour les études de lipidomiques et/ou moléculaires et protéomiques, évitant donc de générer une nouvelle cohorte pour ces analyses biochimiques et moléculaires. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude et de ne pas euthanasier des animaux pour rien.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupe sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille et peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. Les expériences de comportement et d’électrophysiologie sont facilement mises en œuvre d’un point de vue technique sur les souris. La souche de souris utilisée (C57/Bl6J) constitue un modèle d’étude particulièrement intéressant et informatif dans le cadre de la défaite sociale notamment car c’est la souche communément utilisée pour les protocoles de défaite sociale, et de ce fait les résultats de ce projet seront donc plus faciles à intégrer dans la littérature déjà existante. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat car de nombreuses souris transgéniques sont disponibles ce qui n’est pas le cas chez le rat, ce qui peut s’avérer nécessaire pour la poursuite à long terme de notre projet. Les souris C57Bl6/j arriveront dans notre animalerie à l’âge de 3 semaines, juste après le sevrage. Les régimes alimentaires démarreront après 3-7 jours d'acclimatation et se poursuivront pendant 8 semaines jusqu'aux expériences de comportement. Les souris CD1 seront d’anciens mâles reproducteurs et arriveront donc à l’âge adulte. Les souris issues de la reproduction intramuros seront sevrées à l'âge de P21. Tous les animaux seront utilisés à l'âge adulte. Les expériences de comportement démarreront sur des animaux âgés de 12 semaines afin de voir les effets à long terme des différentes expériences.

16 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris porteuse d'une tumeur du foie reçoit cinq injections intraveineuses et neuf séances d'imagerie sous anesthésie sur quatre semaines, pour vérifier si des nanoparticules atteignent la tumeur. Le porteur indique que la croissance de la tumeur constitue une source de souffrance possible, se traduisant par la prostration et une grosseur abdominale, les souris étant ensuite tuées pour prélever le foie. Sur le remplacement, il affirme que les essais in vitro sur lignées cellulaires doivent être complétés par un test in vivo qu'il juge "indispensable".

Objectifs

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) représente 95% des types de cancer du foie. Il est au cinquième rang mondial en terme d’incidence et au deuxième en terme de décès par cancer et son incidence est en augmentation constante. L’introduction de l’immunothérapie dans le traitement du CHC à un stade avancé a récemment permis d’augmenter la survie globale de certains patients. Néanmoins, le sorafenib, un médicament utilisé depuis 15 ans, reste toujours une option thérapeutique. Le sorafenib limite la croissance de la tumeur. Malheureusement, des phénomènes de résistance au sorafenib apparaissent souvent. Identifier des molécules qui permettraient de lutter contre l’apparition de ces phénomènes de résistance est donc un enjeu très important pour améliorer la survie des patients atteints de CHC. Plusieurs molécules jouant ce rôle ont été identifiées in vitro, parmi lesquelles, des petits ARN, dits ARN interférants (siRNA). Comme la preuve en a été faite avec les vaccins contre le coronavirus, les ARN peuvent être transportés vers et délivrés à des cellules de l’organisme à l’aide de nanoparticules. Ils ont l’avantage 1) de présenter en général une plus faible toxicité que les médicaments classiques in vivo et 2) d’avoir également montré leur efficacité dans d’autres types de cancer. Le but du projet est de vérifier que l’on peut apporter des siRNA encapsulés dans des nanoparticules (LNP) au sein d’un CHC chez la souris. Si la réponse est positive, l’étape suivante consistera à déterminer si la combinaison sorafenib – siRNA permet d’augmenter l’effet du sorafenib seul et donc, d’entraîner la régression, voire la disparition des tumeurs.

Bénéfices attendus

Les siRNA encapsulés dans des nanoparticules (siRNA-LNP) sont de plus en plus utilisés dans la thérapie du cancer. De nombreux essais cliniques sont en cours et un siRNA avait déjà reçu l’autorisation de mise sur le marché de l’administration américaine (FDA) en 2018. Déterminer s’il est possible d’utiliser cette technologie dans un modèle de cancer du foie chez la souris est important pour pouvoir ensuite valider la capacité de siRNA sélectionnés à réduire, voire à faire disparaître des tumeurs du foie, en combinaison avec le sorafenib, médicament de référence dans le traitement de ce cancer, mais qui permet essentiellement de ralentir la croissance de la tumeur, quand il est employé seul.

Procédures

Les animaux seront endormis par anesthésie gazeuse avant les 5 injections intraveineuses (30 secondes par injection) et les 9 examens d’imagerie (5 à 10 minutes par examen) qu’ils subiront pendant les 4 semaines de l’expérience, de façon à limiter au maximum la douleur et l’angoisse. Pour améliorer les conditions d’anesthésie, la chambre d’accueil dans laquelle se trouve l’animal durant l’acquisition des images est chauffée à 37°C.

Impact sur les animaux

Le développement des tumeurs du foie pendant la durée de l’expérience constitue une source de souffrance possible. Elle se traduit généralement par un état de prostration et une grosseur abdominale. Concernant l’expérience elle-même, les injections par voie intraveineuse et les scanners seront effectués sous anesthésie gazeuse, par le personnel de la plateforme d’imagerie formé à ces gestes techniques, ce qui réduira l’angoisse et la douleur des animaux. Les produits injectés n’ont pas de toxicité décrite. Néanmoins, les souris seront particulièrement surveillées dans les 48 heures suivant l’injection des LNP pour détecter l’apparition éventuelle de signes de toxicité (ulcération cutanée, prostration, dyspnée).

Devenir

Les souris seront mises à mort à la fin de la procédure, leur foie prélevé pour vérifier l’absence de lésions hépatiques causées par l’administration des siRNA encapsulés dans des nanoparticules et pour confirmer la présence de la fluorescence dans la tumeur.

Remplacement

Des expériences in vitro sur des lignées cellulaires de cancer du foie ont montré l’efficacité des siRNA encapsulés dans des nanoparticules (siRNA-LNP) seuls et surtout en combinaison avec le sorafenib. Pour se rapprocher de conditions plus physio-pathologiques, il est indispensable de tester leur efficacité sur des modèles in vivo.

Réduction

Lors d’une précédente expérience, les bons résultats obtenus en cours d’expérience nous ont permis de ne pas utiliser tous les animaux prévus au départ. Ce sont ces animaux restants que nous utiliserons dans le présent projet. D’autre part, les effectifs définis ont été déterminés sur la base de notre connaissance de ces souris, en particulier de la cinétique de développement de leurs tumeurs du foie.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe de 2 à 5 souris de même sexe par cage. Les cages contiennent du coton pour permettre la formation d’un nid. L’acquisition des images aura lieu sous anesthésie gazeuse dans une chambre chauffée à 37°C, pour réduire l’inconfort et l’angoisse des animaux

Choix des espèces

Les souris transgéniques sont souvent le seul modèle dont on dispose en cancérogenèse, pour se rapprocher au mieux du développement tumoral chez le patient. C’est en particulier le cas du cancer du foie. Les souris utilisées dans le présent projet développent des tumeurs du foie aux alentours de 20 semaines. C’est donc à cet âge que les souris rentreront dans la procédure.

398 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une invalidation du gène Bmp9 reproduisant la maladie de Rendu-Osler, sont isolées seize heures par mois pendant quatre mois pour recueillir leur urine et reçoivent des injections sous anesthésie sans être réveillées. Le porteur indique qu'environ 40 % des mâles peuvent perdre du poids rapidement et présenter des atteintes du foie et du rein, et que l'isolement peut les angoisser, tous les animaux étant tués pour prélever organes et tissus. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reconstitue une maladie touchant plusieurs organes et s'aggravant avec l'âge.

Objectifs

La maladie de Rendu-Osler est une maladie génétique héréditaire qui fragilise les vaisseaux sanguins et qui se manifeste par des hémorragies, l’élargissement des vaisseaux sanguins au niveau de la peau et des muqueuses ainsi que des malformations entre les artères et les veines. Cette maladie peut conduire à des complications sévères touchant différents organes (atteinte du foie pouvant nécessiter une greffe, rupture de vaisseaux au niveau du foie, des poumons et dans des cas très rares dans le cerveau). Le diagnostic est souvent tardif car les symptômes se manifestent autour de 40 ans avec une grande variété de symptômes. Il s’agit d’une maladie rare (1 cas sur 6000 naissances) dont la prise en charge et le contrôle des symptômes est difficile. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la maladie pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. Des gènes responsables de cette maladie ont été identifiées chez les patients atteints de Rendu-Osler. Le modèle de souris du laboratoire permet de reproduire la plupart des symptômes des patients. L’objectif du projet est de comprendre comment les vaisseaux sont perturbés chez les patients et à partir de nos observations de proposer de nouvelles pistes de traitement pour une meilleure prise en charge. Nous étudierons les vaisseaux de différents organes, et notamment ceux touchés dans la maladie de Rendu-Osler (poumons, foie, cerveau).

Bénéfices attendus

Notre étude vise à identifier et caractériser des manifestations phénotypiques chez les souris Bmp9-KO s’apparentant à celles de la pathologie humaine (dilatations de petits vaisseaux sanguins au niveau de la peau et des muqueuses, malformations artério-veineuses dans les différents organes fréquemment touchés par la pathologie). Il est attendu que ces éléments apparaissent et s’intensifient sur les animaux vieillissants comme c’est le cas dans la pathologie humaine. Ces résultats apportent des connaissances fondamentales sur le développement de la maladie. Actuellement les patients ne bénéficient que de traitements pour limiter les symptômes ou leurs effets (traitement contre les saignements de nez, transfusion sanguine pour limiter les effets des hémorragies…) mais il n’y a pas de traitement curatif de la maladie. Les attendus de ce projet sont d’apporter des connaissances scientifiques en recherche fondamentale, publiées pour être rendues accessibles à l’ensemble de la communauté scientifique. A plus longue échéance, l’objectif est, en étroite collaboration avec des cliniciens, d’élargir le champ des possibilités thérapeutiques pour les patients en ciblant des mécanismes de la pathologie qui n’avaient pas été explorés auparavant.

Procédures

Dans une des procédures, une fois par mois pendant 4 mois, les animaux vigiles sont isolés pendant 16h pour le recueil de leur urine. Pour toutes les autres procédures de ce projet, les animaux seront anesthésiés avant toute intervention (5 à 10 minutes avant tout geste invasif). Dans certaines procédures, les animaux recevront en plus un analgésique 30 minutes avant l’anesthésie. Après anesthésie, les animaux peuvent recevoir par injection un produit qui diffuse dans l’organisme pendant 10 à 15 minutes selon les procédures. Les animaux ne sont pas réveillés à l’issue des procédures. Dans une seule des procédures, le groupe d’animaux vigiles recevra une injection d’un réactif (durée du geste n’excédant pas quelques secondes), qui diffusera pendant 3h avant l’euthanasie.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont variables en fonction de la procédure. 1) Dans la procédure d’élevage, environ 40% des mâles peuvent présenter une perte de poids rapide. Les animaux mâles et femelles peuvent aussi présenter de manière variable et non prévisible des atteintes sur différents organes : foie et rein. 2) Dans la procédure de recueil des urines, les animaux peuvent être angoissés par l’isolement pendant 16h.

Devenir

Les protocoles nécessitent qu’à la fin de chaque procédure, sauf pour celle qui concerne le suivi métabolique, tous les animaux soient euthanasiés , afin de récupérer les organes, les tissus ou les cellules. A l’issue de la procédure de suivi métabolique, les animaux seront inclus dans la procédure «Etude de la prolifération cellulaire et collecte d’organes » au cours de laquelle ils seront euthanasiés pour récupérer les organes.

Remplacement

Il est possible d’obtenir des cellules de patients ayant les mutations responsables de la pathologie. Ces cellules sont utilisées pour des études sur la voie de signalisation in vitro. En revanche, il n’est pas possible à partir de ces cellules isolées (qui sont des cellules de poumon ou de foie) d’étudier la manière dont les jonctions anormales entre les veines et les artères se forment, ni d’étudier le retentissement de ces malformations sur différents organes tels que le cœur, ou les saignements intestinaux par exemple. Il n’existe pas de modèle in vitro pouvant reconstituer la pathologie de Rendu-Osler qui affecte différents organes et dont les symptômes s’intensifient avec l’âge. Il est également très difficile, pour des raisons éthiques, d’obtenir des cellules de foie ou de poumon d’individus sains.

Réduction

Nous avons effectué une analyse précise permettant de déterminer la taille des groupes nécessaires. 10 souris par groupe seront nécessaires. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, tous les animaux ayant été utilisés dans la procédure pour le recueil des urines, pourront être utilisés dans une autre procédure. De la même manière, les animaux reproducteurs seront également réemployés dans d’autres procédures.

Raffinement

Afin de surveiller le bien-être des animaux, la mise en place de points limites et une visite quotidienne pour évaluer les différents points seront effectuées. Les points limites décrits sont des signes qui pourraient être observés pendant l’élevage de l’animal dans l’animalerie. L’ensemble des interventions sera effectué sous anesthésie.

Choix des espèces

Les souris utilisées dans ce projet seront des souris qui présentent une mutation génétique donnant les mêmes symptômes que les patients de Rendu-Osler. Ce modèle murin est le seul existant actuellement permettant d’analyser le rôle de ce gène dans le développement de la maladie de Rendu-Osler. Les souris sont suivies tout au cours de leur vie. La maladie de Rendu-Osler est une maladie dont les symptômes apparaissent avec l’âge. Pour évaluer l’évolution des symptômes chez les souris, des groupes d’animaux seront constitués et analysés à différents âges pour comprendre le développement des anomalies et les premiers mécanismes qui se développent avant même l’apparition de symptômes.

48 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des ions perchlorates dans l'eau de boisson pendant huit semaines, puis une colite est provoquée par instillation intrarectale d'un mélange d'acide et d'éthanol, l'animal étant maintenu allongé quinze minutes, avant une mise à mort trois jours plus tard. Le porteur teste l'hypothèse d'un lien entre pollution aux perchlorates et maladie de Crohn, et qualifie de "très modérée" la colite obtenue. Sur le remplacement, il affirme l'absence de méthode alternative et juge "indispensables" douze rats mâles par groupe.

Objectifs

Ce projet vise la réalisation d’une étude exploratoire de l’effet pro-inflammatoire des ions perchlorates sur la muqueuse digestive du rat.

Bénéfices attendus

Nous n'avons pour le moment aucune information concernant un potentiel effet pro-inflammatoire au niveau intestinal des ions perchlorates chez l'Homme ou dans un modèle expérimental. L’hypothèse testée trouve son origine dans la corrélation spatiale très significative entre pollution des sols et des nappes phréatiques par les perchlorates et prévalence de la maladie de Crohn, qui est maximale en région Hauts de France. D’autre part, le registre EPIMAD sur les maladies inflammatoires du tube digestif apporte un certain nombre d’arguments épidémiologiques compatibles avec cette hypothèse.

Procédures

Les animaux seront soumis pendant 8 semaines à des ions perchlorates administrés par le biais de l'eau de boisson ou non dans le cas des contrôles. Au bout de 8 semaines, une inflammation expérimentale du colon (colite) sera induite par administration d'un mélange d'acide et d'éthanol 50% par voie intrarectale (n=24 animaux au total). L'administration intrarectale du mélange d'acide et d'éthanol se fait très progressivement pendant environ 1 min. Les animaux doivent ensuite être maintenus allongés sur le dos, le tête orientée vers le bas, pendant 15 min supplémentaires afin de prévenir une éjection rapide du produit. Les animaux témoins "colite" (groupes Contrôles et Perchlorates) recevront 100µl en intrarectal d'un mélange sérum physiologique/éthanol. Tous les animaux seront mis à mort 3 jours après l'induction de la colite ou leurs témoins respectifs (solvant).

Impact sur les animaux

Nous n'attendons aucune nuisance particulière sur les animaux. Les ions perchlorates à la dose utilisée ne doivent induire aucun effet particulier sur l'état général des animaux sur une durée de 8 semaines. Le modèle de colite expérimentale à la dose utilisée est un modèle de colite très modérée. Les modèles de colite expérimentale sont parfaitement maîtrisés par le responsable de projet et ce modèle a déjà été pratiqué dans un précédent projet et hormis une diminution de la prise alimentaire et une perte de poids modérée les 2 premiers jours de la colite, aucune autre altération du comportement des animaux n'a été observée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la période d'administration des ions perchlorates et l'induction de la colite expérimentale.

Remplacement

Le recours au modèle animal rat est justifié par l’absence de méthodes alternatives pour les études physiologiques et comportementales telle que des modèles in vitro. De plus, nous étudions des paramètres liés à la survenue de l'inflammation intestinale ainsi que son intensité. impossible à modéliser autrement que par une étude chez l'animal de laboratoire. De plus, les interactions entre différentes fonctions physiologiques et organes (système digestif, microbiote, foie...) est impossible à reproduire par un modèle in vitro. Nous savons également que l’inflammation colique peut produire une élévation de la température corporelle qu’un organisme vivant peut compenser par la mise en place de mécanismes d'adaptation par le biais de certaines fonctions telle que le sommeil ou la prise alimentaire, contrairement à des cellules en culture. De plus le modèle d’induction de la colite expérimentale chez le rat est bien décrit dans la littérature et maîtrisé par l’expérimentateur du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet (n=48; n=12/groupe expérimental, 4 groupes) a été estimé sur la base de nos précédentes expériences sur le même modèle ou des modèles différents utilisés les années précédentes. S’agissant d’une étude exploratoire « preuve de concept », aucun résultat expérimental n’est disponible à ce jour. Nous avons décidé de ne pas travailler sur des femelles gestantes comme ce fut le cas dans nos précédents projets et explorer ensuite les effets sur la descendance mâle et femelle. Dans le cadre de ce projet nous souhaitons commander spécifiquement des animaux mâles juste sevrés de façon à limiter le nombre total d'animaux impliqués. En fonction des résultats que nous obtiendrons dans cette étude préliminaire, nous déposerons un projet plus complet et de plus grande envergure dans lequel les populations mâles et femelles seront étudiées. En conséquence, 12 animaux mâles par groupe expérimental seront indispensables pour s'affranchir de la variabilité des réponses et pour obtenir des données exploitables tant sur l'aspect variabilité physiologique qu'analyse statistique.

Raffinement

Dans la mesure où nous travaillons sur un modèle expérimental de colite, nous ne pouvons utiliser d'antalgique et d'anti-inflammatoire qui auraient pour conséquence de modifier les réponses physiologiques rendant nos résultats inexploitables mais ces traitements pourront être administrés avant induction de la colite si nécessaire. Nous fournissons en annexe une grille d'évaluation de la douleur qui sera scrupuleusement respectée. De par l'expérience que vous avons de ce modèle inflammatoire, nous savons que la dose utilisée est une dose faible permettant d'induire une colite très modérée n'entrainant aucun décès prématuré d'animaux et que très peu d'effets visibles chez le rat sont observés, excepté une perte de poids et quelques selles molles sur les 2 premiers jours expérimentaux après induction de la colite. Dans le cas d'un dépassement d'un score de 9, l'animal sera isolé de ses congénères et mis à mort par une injection d'euthanasiant chimique. En ce qui concerne les conditions d'hébergement, les animaux seront stabulés en groupe (nombre en fonction du poids conformément à la règlementation en vigueur) tout au long du projet. Un enrichissement sera apporté par des tunnels en carton et des frisettes de papier. Des points limites ont été mis en place, ainsi qu'une méthode d'évaluation pour la prise en charge des animaux.

Choix des espèces

Le modèle d’étude sera le rat pour les raisons suivantes : - il est un bon indicateur des effets éventuellement observés chez l’Homme de par la similitude des réponses physiologiques et comportementales mises en jeu lors de l’exposition à différents types de polluants environnementaux, - il s’agit d’un modèle de référence pour l’étude de l’inflammation intestinale comme référencé dans la littérature - l’hébergement au sein de l'animalerie est adapté depuis plusieurs années à cette espèce. Les animaux mâles commandés seront des animaux juste sevrés de façon à pouvoir débuter l'administration orale des ions perchlorates vers l'âge de 5 semaines de vie maximum et pour une durée de 8 semaines consécutives.

6 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal, juvénile de 2 à 3 ans, reçoit une injection d'un vecteur de thérapie génique dérivé du VIH et subit des imageries sous anesthésie, des prélèvements sanguins répétés et deux ponctions de moelle osseuse que le porteur présente comme le seul acte douloureux, avant une mise à mort au pentobarbital à six semaines. Le projet compare deux voies d'injection en vue d'un éventuel passage chez des patients atteints d'une maladie osseuse rare. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'il est "nécessaire" d'administrer le produit à un "organisme entier" et que le primate non-humain fournit les données les plus transposables à l'humain.

Objectifs

La Dysplasie Spondyloépiphysaire Congénitale (DSEC) est une maladie osseuse génétique rare, présente dès la naissance et associée à des déformations du squelette qui s'aggravent avec l'âge, certaines pouvant mettre la vie en danger et nécessiter des interventions chirurgicales répétées. Il s'agit d’un trouble du collagène de type II, causé par des mutations dans le gène COL2A1, qui empêche les os et les autres tissus conjonctifs de se développer correctement. Le produit thérapeutique à tester dans cette étude est un vecteur de thérapie génique de type lentiviral, conçu pour restaurer la fonction du gène COL2A1 dans les chondrocytes et les plaques de croissance osseuses. Leur accès par des injections directes dans le cartilage n'est pas possible en raison de leur grand nombre dans tout le corps, de la douleur de telles injections et du risque supplémentaire d'inhibition de la croissance osseuse suite à la rupture du cartilage et de l'augmentation des réponses inflammatoires locales. L’injection systémique du vecteur thérapeutique est donc la voie d'administration proposée. Des études réalisées avec ce vecteur thérapeutique dans un modèle de souris spontané de la DSEC, ont montré son efficacité avec une correction à long terme des anomalies histologiques, radiographiques et cliniques. L'innocuité et la biodistribution du vecteur thérapeutique a également été montrée sur des mini-porcs. Une observation intéressante et inattendue, tant chez la souris que chez le mini-porc, est que la voie d'administration systémique du vecteur thérapeutique semble avoir de l'importance : une administration intrapéritonéale (IP) améliore la distribution du vecteur thérapeutique dans les plaques de croissance (les tissus ciblés), alors que, au moins chez le mini-porc, elle réduit d'environ 100 fois sa distribution dans le foie et la rate (des tissus non ciblés), par rapport à une administration intraveineuse (IV) classique. Il n'existe aucune description publiée de l'administration IP de vecteurs lentiviraux dans des modèles animaux de grande taille. Avant un transfert en clinique, il est donc important de documenter, dans le modèle de primate non humain (PNH) proche de l’Homme au niveau phylogénétique et anatomique, si la supériorité du vecteur thérapeutique par voie IP par rapport à la voie IV est confirmée. Outre la biodistribution du vecteur, l’utilisation du modèle PNH nous permettra également d’évaluer la biosécurité et l'immunogénicité du vecteur thérapeutique.

Bénéfices attendus

Le DSEC est le trouble du collagène de type II le plus courant, entraînant une petite taille disproportionnée et plusieurs autres complications graves, notamment une croissance osseuse irrégulière, une insuffisance respiratoire, des douleurs articulaires, des déformations de la hanche et de la colonne vertébrale et l'apparition précoce de l'arthrose. Aucun traitement n'est actuellement disponible pour la DSEC. Le traitement des complications nécessite des interventions chirurgicales pour réduire le risque de paralysie et la mise en place de soins à long terme pour réduire la douleur et restaurer la fonction. Cette prise en charge précoce et prolongée est très lourde pour les patients, et ne fait que limiter les gage d’une évolution ralentie. Par rapport aux thérapies classiques, la thérapie génique permet de cibler directement le gène défectueux (COL2A1) responsable de la pathologie. Cette étude pilote a pour but de mesurer la biodistribution, la bio sécurité et l'immunogénicité post-aiguës du vecteur de thérapie génique chez les PNH après administration IP ou IV. Les résultats permettront de choisir la voie d'administration IP ou IV pour les études toxicologiques réglementaires ultérieures et le développement clinique de ce produit de thérapie génique pour le traitement des patients atteints de DSEC.

Procédures

Chaque animal de cette étude sera soumis aux interventions suivantes: - Dans les 3 semaines avant injection: . Un examen d’imagerie (CT-scan et radiographie) sous anesthésie (maximum une heure) . Un à 2 prélèvements sanguins et un prélèvement de moelle osseuse, sous anesthésie (maximum 30 à 45min) - La veille de l’injection : . Un traitement immunosuppresseur appliqué par voie IV, sous anesthésie (maximum 30min) - Le jour de l’injection (J0) : . Un traitement immunosuppresseur appliqué par voie IV . Une injection du vecteur thérapeutique, par voie IV ou IP . Un prélèvement sanguin Le tout sous anesthésie (maximum 1h) - Le jour de l’injection (+6h) : . Un prélèvement sanguin, sous anesthésie (maximum 30min) - A J+1, J+3, J+7, J+15, J+30 : . Un prélèvement sanguin, sous anesthésie (maximum 30min) - Entre 5 et 6 semaines post-injection: . Un examen d’imagerie (CT-scan et radiographie) sous anesthésie (maximum une heure) - A 6 semaines post-injection: . Un prélèvement de moelle osseuse . Un prélèvement sanguin Le tout sous anesthésie (maximum 45min), avant euthanasie par injection IV d’une dose léthale de pentobarbital.

Impact sur les animaux

- La majorité des gestes réalisés sur ces animaux seront non ou peu invasifs (imagerie médicale, injection du vecteur thérapeutiques par voie IP ou IV et prélèvements sanguins par ponction veineuse). Ils seront réalisés sur animaux anesthésiés. Le seul acte douloureux par lui-même sera la ponction de moelle osseuse (dans l’os d’une hanche) qui sera réalisé avant injection puis juste avant euthanasie. Cet acte sera également réalisé sous anesthésie, et une injection de morphine sera réalisée avant l’acte afin de garantir une analgésie. Si besoin, avec accord du vétérinaire de l’UE, un traitement analgésique (ex : Buprénorphine ou Perfalgan si douleur) pourra être mis en place dans les jours suivant la procédure. - L’injection systémique d’un vecteur lentiviral (dérivé du HIV) peut induire, au moment de son injection, une réaction inflammatoire et allergique transitoire, avec une augmentation légère des enzymes hépatiques, de certaines cytokines circulantes, ainsi qu’une leucopénie transitoire. Une telle réaction a été décrite dans une étude précédemment réalisée dans l’UE. Cette réaction, asymptomatique chez les animaux, est limitée grâce à l’administration d’un traitement immunosuppresseur à base d’un corticostéroïde et d’un antihistaminique. - Enfin, il n’est pas attendu que l’expression de la protéine COL2A1 (exprimée par le vecteur lentiviral thérapeutique) pendant une durée de 6 semaines soit associée à des phénomènes toxiques ou délétères provoquant des symptômes sévères chez l’animal. Malgré tout, un suivi rapproché des paramètres cliniques (observations quotidiennes et examens cliniques) et des paramètres sanguins (hématologie et chimie clinique) des animaux sera mis en place afin de pouvoir détecter toute anomalie.

Devenir

A l'issu des 2 procédures décrites dans ce projet (à 6 semaines post-injection), tous les animaux de cette étude seront euthanasiés afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront analysés pour déterminer l'efficacité de la transduction et de l'expression du vecteur dans les différents plaques de croissance osseuses du squelette, ainsi que la biodistribution du vecteur dans les autres tissus de l’organisme, et la potentielle toxicité dans les différents tissus (analyses histopathologiques). Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l'animal.

Remplacement

Compte tenu des objectifs du protocole expérimental portant sur la biodistribution du vecteur de thérapie génique en comparant 2 modes d’administration, il est nécessaire de l’administrer à un organisme entier. Cette étude n’est ainsi pas réalisable sur un modèle in vitro. D’autre part, compte tenu des différences phylogéniques et anatomiques majeures entre les rongeurs et l’Homme, la réalisation d’une étude préclinique relative au mode d’administration ne peut s’envisager chez la rat ou la souris, communément utilisés en laboratoire. Le primate non humain est l’espèce qui apporter les données les plus pertinentes et les plus transposables en termes de biodistribution et de tolérance, permettant d’envisager de futurs essais cliniques chez l’Homme.

Réduction

La détermination du nombre d’animaux a été réalisée sur la base de l'expérience d'études similaires en thérapie génique. La constitution de groupes de 3 animaux permettra d’obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Cela semble être un nombre minimal qui permette d’assurer la robustesse des résultats sans être excessif. Ce nombre d’animaux permettra une analyse statistique.

Raffinement

Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. L'état de santé des animaux est surveillé tout au long des expériences afin d’éviter l'apparition éventuelle d'une souffrance. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation et les animaux disposent de nourriture et d'eau ad libitum. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage (dans la limite réglementaire) dans un milieu enrichi comprenant de enrichissements alimentaires, physiques, sonores et visuels variés et l’enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. L'application de critères d'arrêts nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés ou de décider d'une euthanasie anticipée.

Choix des espèces

Les études préalables menées chez la souris et le porc ne peuvent être translatées de façon sûre et efficace à l’homme sans passer par une étude intermédiaire dans une espèce présentant une anatomie comparable à celle de l’homme comme c’est le cas chez les cercopithécidés. Le choix de macaca fascicularis se trouve pleinement justifié par la proximité phylogénétique et anatomique (bipédie notamment) des macaques fascicularis avec l'Homme, qui les rendent les plus pertinents à l’évaluation de la transduction et de la biodistribution des vecteurs lentiviraux dans l'organisme dans le cadre d’une étude pré-clinique. En effet, les primates (humains et non humains) sont des hôtes naturels du virus HIV, dont est dérivé le vecteur lentiviral utilisé dans cette étude. Finalement, le système immunitaire des macaques fascicularis comparable à celui de l'Homme en fait également l'espèce de choix pour évaluer la tolérance immunitaire au produit de thérapie génique testé. Les animaux seront inclus à un stade juvénile (entre 2 et 3 ans). En effet, le traitement appliqué ciblant les plaques de croissance osseuse et les chondrocytes, l'application du traitement doit se faire avant que la croissance du squelette ne soit complètement achevée. Par conséquent, tester le produit thérapeutique chez des patients adultes serait futile et sans bénéfice direct possible. Par conséquent, la population de patients cible est exclusivement pédiatrique et les études non cliniques se concentrent sur les jeunes animaux pendant la période de croissance du squelette, du néonatal aux individus juvéniles.

108 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat subit un amincissement du crâne d'une heure puis deux injections dans le cerveau avec perçage bilatéral du crâne, avant des séances d'imagerie cérébrale par ultrasons ou par TEP, pour étudier le rôle des astrocytes dans une neuroinflammation provoquée. Le porteur signale comme nuisances possibles une hémorragie lors de la chirurgie et une mise à jeun de quatre heures, et indique qu'une perfusion intracardiaque tue tous les animaux en fin de procédure pour les analyses. Sur le remplacement, il affirme qu'un modèle in vitro ou mathématique n'est "pas pertinent" pour construire cet outil d'imagerie préclinique.

Objectifs

Les besoins thérapeutiques liées aux maladies du système nerveux central ne sont que partiellement couverts par les médicaments actuels. Il est nécessaire de revisiter certains concepts pharmacologiques afin d’ouvrir le champ à de nouvelles stratégies thérapeutiques, notamment en ciblant des cellules autres que les neurones. Ainsi, les cellules gliales, composant 50% des cellules cérébrales de l’Homme, sont dorénavant considérées comme des acteurs à part entière dans la transmission des signaux chimiques et la régulation des neurones. Parmi les cellules gliales, les astrocytes contribuent à cette ‘gliotransmission’, représentant ainsi une nouvelle cible pharmacologique d’intérêt pour l’élaboration de nouveaux médicaments. Le projet aura pour but d’exposer le potentiel des modalités de neuroimagerie (tomographie par émission de positons (TEP), et imagerie par ultrasons à haute résolution (fUS) dans l’exploration des contributions des réseaux neurogliaux dans un modèle de neuroinflammation in vivo. D’un point de vue métabolique et moléculaire, la TEP représente une technique d’imagerie de pointe pour l’étude pharmacologique relatif au fonctionnement cérébral. Elle repose sur l’utilisation de radiotraceurs intégrés à des molécules cibles tels que le glucose et permet l’étude de la distribution ainsi que de la cinétique des molécules étudiées. L’imagerie fUS récemment développée, est basées sur l’utilisation d’ondes ultrasonores et nous permet d’évaluer et de cartographier l’activité cérébrale par la mesure des variations du volume sanguin cérébral local. L’expertise dans ces différentes méthodes d’imagerie, et leurs associations dans le cadre d’études pharmacologiques, permettent d’envisager des perspectives de recherches innovantes. Plusieurs molécules seront utilisées à la fois pour créer une inflammation cérébrale locale mais également pour moduler l’activité des astrocytes. En bref, l’objectif principal sera d’identifier et de caractériser la modulation astrocytaire dans les données d’imagerie multimodale fUS et TEP obtenues chez le rat présentant une neuroinflammation locale.

Bénéfices attendus

La gliopharmacologie (par analogie à la neuropharmacologie) est un nouvel enjeu pour les médicaments de demain, il est primordial d’avoir à disposition des approches in vivo permettant l’étude de l’activité de ces cellules. Ainsi ce projet permettra de caractériser les contributions des astrocytes dans les données de neuroimagerie dans un contexte d’inflammation cérébrale et d’élaborer des nouveaux outils permettant le développement de nouveaux médicaments, plus spécifiques présentant moins d’effets secondaires.

Procédures

Procédure 1 (Deux interventions + deux acquisions d’imagerie fUS) : 1) Amincissement du crâne (durée : 60 minutes) -Réalisé sous anesthésie générale (isoflurane) -Sur les animaux impliqués dans la procédure 1 uniquement : soit 60 rats -Chaque animal subit cette chirurgie qu’une seule fois 2) Injections stéréotaxiques (durée : 45 minutes) : -Réalisées sous anesthésie générale (isoflurane) -Sur la totalité des animaux décrits dans cette procédure : soit 60 rats -Chaque animal subira deux injections stéréotaxiques comprennant 15 min de préparation de l’animal (placement dans le cadre, anesthésie, et perçage bilatéral du crane)+ 15 min par côté nécessaire à l’injection). 3) Sessions d’imagerie fUS (durée : 80 minutes) – Réalisées sous anesthésie générale (isoflurane+médétomidine) – Sur la totalité des animaux décrits dans cette procédure : soit 60 rats. Chaque animal subit cette session d’imagerie deux fois. Procédure 2 (Deux interventions + une acquisition d’imagerie TEP) : 1) Injections stéréotaxiques (durée : 45 minutes) : -Réalisées sous anesthésie générale (isoflurane) -Sur la totalité des animaux décrits dans cette procédure: soit 48 rats -Chaque animal subira deux injections stéréotaxiques comprennant 15 min de préparation de l’animal (placement dans le cadre, anesthésie, et perçage bilatéral du crane) + 15 min par côté nécessaire à l’injection. 2) Mise à jeun 4h avant l’imagerie TEP pour la totalité des animaux décrits dans cette procédure : soit 48 rats. 3) Session d’imagerie TEP (durée : 75minutes) – Réalisée dans un état éveillé pour l’injection et la captation du radiotraceur et sous anesthésie générale (isoflurane) pour l’acquistion TEP – Sur la totalité des animaux décrits dans cette procédure : soit 48 rats. Chaque animal subit cette session d’imagerie une seule fois.

Impact sur les animaux

Les procédures d’imagerie fUS nécessiteront chez le rat de réaliser une fenêtre d’amincissement afin de visualiser les structures d’intérêt. De plus, les animaux subiront des injections de molécules modulatrices dans un état d’anesthésie générale. Une nuisance possible serait l’apparition d’hémorragie lors de la chirurgie. Le protocole est alors optimisé pour que les risques de ces complications soient minimes (zone opérée réduite au maximum). Pour les procédures d’imagerie TEP, une mise à jeun (4h avant l’acquisition) est nécessaire et constitue également une nuisance potentielle pour l’animal.

Devenir

A la fin de chaque procédure, l’ensemble des animaux subiront une perfusion intracardiaque nécessaire pour l’analyse immunohistochimique et biochimique post-mortem.

Remplacement

L’ensemble du projet et des procédures ont été choisis après une lecture minutieuse de la littérature actuelle, avec une comparaison détaillée des données expérimentales mises à notre disposition. S’agissant d’un projet dont l’objectif final est de construire un outil préclinique in vivo, l’utilisation d’un modèle in vitro ou d’un modèle mathématique n’est pas pertinente, ni cohérente avec l’état actuel des connaissances.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé sur la base de calcul de puissance statistique compte tenu de la taille des effets observés et de la variabilité connue. Dans le cadre de l’imagerie fUS, les animaux réaliseront deux passages, ce qui permettra d’obtenir des informations importantes avec un aspect longitudinal sur un même individu, en limitant ainsi le nombre d’animaux, sans compromettre les résultats. De plus, pour l’imagerie TEP, contrairement à l’imagerie fUS, l’accumulation des interventions et des anesthésies est moins importante ; ce qui nous permet de réduire le nombre d’animaux par groupe dans la procédure correspondante à cette modalité.

Raffinement

Les animaux seront surveillés quotidiennement grâce à une grille de score et des points limites adaptés. La douleur sera réduite au maximum par l’administration d’analgésiques dès l’apparition de signes. En cas de signe de détresse, la procédure serait interrompue et si nécessaire, la mise à mort serait effectuée. L’environnement sera enrichi avec morceaux de bois, boîtes ou cylindres.

Choix des espèces

Souvent préconisé pour l’utilisation des dispositifs d’imagerie, le rat constitue un modèle animal pour lesquelles ils existent déjà des données précliniques impliquant l’utilisation des molécules utilisées et des différentes modalités d’imagerie utilisés au sein de ce projet. De plus, la taille du cerveau du rat est plus favorable en imagerie (TEP et fUS) que d’autres modèles animaux. Rats adultes afin d’étudier les contributions astrocytaires et neuronales au sein de réseaux neurogliaux pleinement développés.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc puis une injection de cellules Natural Killer dans le sinus rétro-orbitaire, avec une mesure quotidienne de la tumeur, pour étudier l'activité antitumorale de ces cellules immunitaires. Le porteur indique que les souris sont tuées quand la tumeur atteint 15 millimètres ou dès qu'un point limite est atteint, comme une gêne au déplacement ou une prostration. Sur le remplacement, il affirme que le nombre d'acteurs cellulaires et moléculaires en jeu rend la modélisation in vitro impossible et que les cellules NK n'existent que chez les mammifères.

Objectifs

Les cellules immunitaires Natural Killer (NK) appartiennent à la première ligne de défense du corps contre les agents pathogènes. En effet, ces cellules sont capables de reconnaître et d’éliminer les cellules infectées par des virus mais également les cellules cancéreuses. Ces cellules sont également douées d'une certaine mémoire, ce qui signifie que leur réponse sera amplifiée lors d'un second contact avec une cellule infectée ou tumorale. Ainsi, chez des souris porteuses de tumeurs, il a été montré une diminution de la taille des tumeurs et une meilleure survie des souris quand celles ci sont traitées avec des cellules NK pré-activées. Cette pré-activation consiste en une incubation de 16h de cellules NK purifiées avec un cocktail de cytokines. Les cellules NK ainsi pré-activées sont dites cellules NK mémoires car elles montrent une meilleure survie et de meilleures fonctions effectrices in vitro et in vivo lors d'un second contact avec des cellules tumorales. Le but de ce projet et de mieux comprendre l'interaction et l'importance de chaque cytokine prise séparément et en cocktail sur la préactivation des cellules NK. Il permettra notamment d'évaluer l'importance de différentes voies moléculaires en aval de ces cytokines pour la génération de NK mémoires. Afin d'évaluer leur rôle anti-tumoral in vivo, les cellules NK seront traitées avec différentes combinaisons de cytokines en présence d'inhibiteurs de ces voies. Ces cellules NK seront ensuite injectée à des souris porteuses de 4 types de tumeurs afin d'établir l'importance de ces voies moléculaires sur l'activité anti-tumorale des NK mémoires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l'impact des cellules NK préactivées sur la pousse tumorale et de caractériser les voies essentielles à leur fonction in vivo. Il pourra permettre d'affiner les méthodes de pré-activation des NK, méthodes potentiellement transposable en immunothérapie contre le cancer.

Procédures

Injection de cellules tumorales en sous cutanée sur le flanc droit, anesthésie sous isoflurane, quelques minutes, une fois . Injection de cellules NK purifiées préactivée en intra veineuse au niveau du sinus retro-orbital, anesthésie sous isoflurane, quelques minutes, une fois. Mesure de la tumeur, anesthésie sous isoflurane, quelques minutes, journalier.

Impact sur les animaux

Le transfert de cellules NK par injection intra veineuse au niveau du sinus retro-orbatal ne devrait créer aucun stress particulier. Les cellules tumorales seront injectées en sous cutané au niveau du flanc droit ce qui conduit à une gêne associée à la pousse de la tumeur, c'est pourquoi la mesure de la tumeur sera journalière.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude ou avant si un point limite est atteint.

Remplacement

Ce type de projet nécessite l'utilisation de modèles animaux, le nombre d'acteurs cellulaires et moléculaires mis en jeu étant trop nombreux et leurs interactions trop complexespour pouvoir être modélisés in vitro. D'autre part, les cellules NK ne sont présentes que chez les mammifères ce qui exclut le recourt à d'autres modèles animaux non mammifères.

Réduction

Une étude bibliographique appuyée par nos expériences relevant d'autres projets nous ont déjà permit de définir les doses de cellules tumorales et NK à injecter ainsi que la cinétique de croissance des tumeurs ce qui limite les études préliminaires. Le nombre d'animaux nécessaires a été calculé de façon à apporter des réponses statistiquement fiables tout en évitant des mises à mort inutiles (test de LogRank pour les statistiques reliées à la survie, nombre d'animaux par groupe calculé par epiR package version 0.9-030). Afin d'optimiser le nombre d'animaux utilisés de nombreux paramètres sur la pousse de la tumeur, la fonction des cellules NK et leur phénotype à la fin de l'expérimentation seront analysés sur un même animal.

Raffinement

Lors de cette procédure, un suivit des animaux et des mesures journalières de la tumeur seront réalisées. Ainsi l'animal sera mis à mort lorsque le plus grand diamètre de la tumeur atteint 15 mm (Workman et al, BJC, 2010). D’autre part, les animaux seront mis à mort dans l’un des cas suivants : blessure au niveau de la tumeur, gène dans le déplacement, prostration, absence d’interaction avec le groupe. Dans le cas où l'œil montrerait des signes d'inflammation après l'injection, il sera soigné par l'application d'une pommade vétérinaire ophtalmique associant un corticostéroïde et un antibiotique jusqu'à disparition des symptômes.

Choix des espèces

Les cellules NK ne sont présentes que chez les mammifères. Parmi ceux-ci, la souris est un modèle de choix. D'une part, et bien qu'il existe certaines différences entre l'immunologie murine et humaine, d'innombrables découvertes chez la souris sont transposables chez l'homme. D'autre part, la richesse des souches murines génétiquement modifiées (KO, KI, possibilité d'utiliser la technique CRISPR/cas9) et des réactifs disponibles permet une compréhension très approfondie des phénomènes mis en jeu du niveau moléculaire au niveau de l'organisme, un atout déterminant dans notre projet. Des souris âgées de 8-12 semaines seront utilisées pour les expérimentations. Cet âge correspond, selon la courbe de croissance des souris C57BL/6, à un poids de 19-21 grammes à jeun. A cet âge, les souris ont un système immunitaire mature.

Greffées sous la peau du flanc de cellules tumorales, 372 souris reçoivent ensuite des injections d'un virus candidat médicament dans leur tumeur et deux prises de sang d'environ 20 minutes chacune. Toutes sont tuées au 60e jour ou à l'atteinte d'un point limite, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le virus est testé sur des tumeurs plus ou moins rapides selon le nombre de cellules greffées, et le porteur écrit que la greffe "déclenchera une altération de la capacité de mouvement", alors qu'il ne prévoit un antalgique qu'au conditionnel, "Si une douleur est présente". Le résumé ne précise ni le nombre d'injections de virus, ni les conditions testées qui aboutissent à 372 souris par groupes de 12.

Objectifs

Dans le domaine de la recherche en oncologie, l'utilisation de virus thérapeutiques est devenue l'une des principaux axes de recherche. En effet, cette stratégie permet une approche ciblée sur des marqueurs spécifiques des tumeurs et ainsi une attaque focalisée des cellules malades. Dans ce cadre, de nombreux candidats viraux sont testés afin de déterminer l'approche la plus efficace. Ce projet vise ainsi à mettre en évidence l'effet d'un candidat virus sur une lignée de tumeur greffées en sous-cutanée dans un modèle de Souris. Les effets seront suivis sur la croissance tumorale mais aussi sur les facteurs circulant au niveau sanguin. Les données générées nous permettront d'améliorer notre compréhension des mécanismes d'action dans un organisme complexe et de poursuivre le développement de ce candidat en déterminant sa chronologie d'action et son efficacité en fonction de la vitesse de croissance tumorale. Cette dernière sera liée à la quantité de cellules tumorales que nous allons greffer.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer notre compréhension des effets de candidats virus sur une lignée tumorale. Nous pourrons ainsi comprendre leurs capacités d'action et l'impact de leur injection sur des lignée tumorales déjà installées. Cette connaissance nous permettra de mettre en place des virus thérapeutiques permettant de soigner certaines tumeurs chez l'Homme.

Procédures

Les animaux subiront une greffe de cellules tumorales par injection sous-cutanée. Celle-ci déclenchera une altération de la capacité de mouvement et une potentielle dégradation de l'état général des animaux. Par la suite, des injections tumorales de virus seront pratiquées. Ces différentes injections sont effectuées en quelques minutes. Deux prélèvements sanguins seront aussi effectués, chacun durant environ 20 minutes.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous anticipons l'apparition de tumeurs sous-cutanées, qui pourra déclencher une éventuelle perte de poids, une mobilité réduite, un mauvais toilettage. Ce protocole aura une durée maximale de 60 jours.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à J60 ou à l'atteinte d'un point limite. Ils ne sont pas réutilisables du fait de la présence de cellules tumorales et de virus thérapeutiques dans leur organisme.

Remplacement

L'étude de l'effet thérapeutique de candidats médicaments sur des processus complexes tels que l'oncologie ne peut se faire sans l'utilisation de modèles animaux. En effet, il n'existe pas actuellement de modèle non animaux permettant de récapituler l'ensemble des mécanismes physiologiques complexe à l'oeuvre dans la mise en place de tumeurs ou la réponse immunologique associée.

Réduction

Ce projet a été mise en place en réduisant autant que possible la taille des groupes expérimentaux. Ainsi, nos connaissances des modèles tumoraux sous-cutanés chez la Souris nous permettent de dimensionner une première étude avec des groupes de 12 animaux par condition. Cet effectif nous permettra de disposer de conclusions statistiquement relevantes. Nous mesurerons les tailles de tumeurs et le poids de manière répétées. Grâce à ces données, nous réaliserons ensuite les études successives impliquant les virus thérapeutiques avec un nombre d'animaux optimal. Le maximum sera de 12 animaux mais si l'étude statistique nous permet de réduire ce nombre, nous essaierons autant que possible d'y procéder.

Raffinement

Les animaux seront placés dans les conditions optimales d'hébergement. Nous injecterons les cellules tumorales sur le flanc. Ensuite l'apparition de tumeurs et leurs croissances seront mesurées trois fois par semaine afin de suivre la progression ainsi que l'effet possible du virus candidat sur celle-ci. Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique à température. Nous suivrons à chaque pesée l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation, les sites d'injection et l'aspect des tumeurs. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer la mise à mort de l'animal pour éviter toute souffrance.En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. Le cas échéant, des soins locaux par spray de dermidine(R) seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommendations vétérinaires.

Choix des espèces

Le modèle Souris constitue un bon modèle pour l'étude de modèle tumoraux. En effet, il s'agit de mammifère au système immunitaire assez proche de l'Homme pour disposer d'une approche translationnelle valide. Nous analyserons des animaux âgés de 8 semaines au moment de l'injection. A cet âge, le système immunitaire est suffisamment développé.